CA2274011A1

CA2274011A1 - Sequence nucleotidique codant pour une flavine mono-oxgynase, proteine correspondante et leurs applications dans les domaines du diagnostic et de la therapie

Info

Publication number: CA2274011A1
Application number: CA002274011A
Authority: CA
Inventors: Marta Blumenfeld; Ilia Tchoumakov; Henri-Jean Garchon; Jean-Francois Bach
Original assignee: Individual
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 1998-06-11
Also published as: EP0941341B1; FR2756845A1; CY2605B2; AU746293B2; DE69737293T2; US20060154295A1; DK0941341T3; ATE352635T1; PT941341E; WO1998024914A1; EP0941341A1; AU5327198A; JP2001505430A; DE69737293D1; ES2279552T3; US6551792B1; US7037709B2; US20030203463A1; JP4062638B2; FR2756845B1

Abstract

La présente invention concerne notamment la flavine mono-oxygénase 2 humaine (hFMO2), ainsi qu'une autre enzyme humaine de la famille FMO, hFMOx, leurs séquences nucléotiques et polypeptidiques. La présente invention concerne également des vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant lesdites séquences nucléotidiques et des cellules transformées par ces vecteurs ainsi que des méthodes de préparation desdits polypeptides. L'invention comprend aussi des méthodes de sélection de composés et de diagnostic de prédisposition à des pathologies et/ou des déficiences liées aux FMOs ainsi que des compositions pharmaceutiques comportant lesdits composés destinés au traitement et/ou à la prévention de ces pathologies.

Description

Séquence. nucléotidique codant pour une flavine mono-oxygénase, protéine correspondante et leurs applications dans les domaines du diagnostic et de la thérapie La présente invention concerne notamment la '~ 5 flavine mono-oxygénase 2 humaine (hFM02), ainsi qu'une autre enzyme humaine de la famille FMO, hFMOx, leurs séquences nucléotidiques et polypeptidiques. La présente invention concerne également, des vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant lesdites séquences nucléotidiques et t0 des cellules transformées par ces vecteurs ainsi que des méthodes de préparation desdits polypeptides. L'invention comprend aussi des méthodes de sélection de composés et de diagnostic de prédisposition à des pathologies et/ou des déficiences liées aux FMOs ainsi que des compositions 15 pharmaceutiques comportant lesdits composés destinés au traitement et/ou à la prévention de ces pathologies.
Les flavines mono-oxygénases (FMOs) (Lawton et al., 1994) forment une famille d'enzymes microsomales catalysant l'oxydation NADPH-dépendante de nombreux 20 composés organiques exogènes (xénobiotiques) possédant un hétéroatome nucléophile comme en particulier l'atome d'azote, de soufre, de phospore ou de sélénium (Ziegler, D.M., 1988 ; Ziegler, D.M., 1993), qu'il s'agi.sse de médicaments, de pesticides ou autres substances 25 potentiellement toxiques. La cystéamine est le seul substrat endogène actuellement connu des FMOs.
Les FMOs r-eprésentent une famille multigénique.
L'expression de formes différentes de FMOs est dépendante à
la fois du tissu et de l'espèce considérés.
30 Les FMOs ont été localisées dans différents ~ types de tissus, en particulier le foie, les poumons et les reins.
A ce jour, cinq isoformes des FMOs ont été
caractérisées dans l'espèce de référence, le lapin. Leur 35 homologie est de 50-60 %. Quatre de ces isoformes, FMO1, FM03, FM04 et FM05 ont été identifiées chez l'homme WO 98/24914 ~ PCT/FR97102226

2 (séquences GeneBank M64082, M83772, 211737 et L37080 respectivement). Parmi les espëces mammifères, l'homologie entre FMO orthologues est supérieure à 80 ~. L'existence d'une FM02, voire d'autres isoformes, chez l'homme, peut être raisonnablement postulée.
Les FMOs sont associées au réticulum endoplasmique et sont impliquées dans la détoxification de composés xénobiotiques, la mono-oxygénation permettant de transformer le xénobiotique en substance plus polaire, l0 êtape préliminaire avant son excrétion. Elles peuvent êgalement être impliquées dans l'activation métabolique de différents composés toxiques et/ou carcinogènes présents dans l'environnement.
Le mécanisme de la réaction FMO a été décrit de manière détaillée (Poulsen, L.L. et al., 1995). Par opposition à toutes les autres oxydases ou mono-oxygénases connues, les FMOs ont la propriété unique de former une enzyme intermédiaire stable 4a-hydropéroxy flavine, NADP(H)- et oxygëne-dépendante, en l'absence de substrat oxydable. Parce que l'énergie de catalyse est déjà présente dans l'enzyme FMO avant le contact avec son substrat potentiel, l'adéquation du substrat n'a pas besoin d'être aussi précise que pour d'autres types d'enzymes. Cette caractéristique spécifique de la FMO est responsable de la grande variété de substrats acceptés par les FMOs (incluant par exemple les alkyl- et aryl-amines tertiaires et secondaires, de nombreuses hydrazines, thiocarbamides, thioamides, sulfides, disulfides, thiols).
De nombreuses molécules, composés actifs de médicaments, sont reconnues comme substrats des FMOs, soit pour une N-ox~.-dation, soit pour une S-oxydation (casser, 1996), parmi lesquels on trouve notamment des anti dépresseurs, des antipsychotiques, des anti-ulcéreux, des vasodilatateurs et des anti-hypertenseurs.
Bien que certains substrats de FMO soient oxydés en dérivés moins actifs, de r~ombreux composés nucléophiles WO 98/24914 ~ PCTlFR97/02226

3 peuvent tre mtaboliss en intermdiaires pouvant tre plus ractifs et/ou potentiellement toxiques ; plutt que d'tre excrts, de tels produits peuvent induire des rponses toxiques par fixation covalente des - 5 macromolcules cellulaires, ou par d'autres mcanismes. Par exemple, les mercaptopyrimidines et les thiocarbamides peuvent tre activs de manire prdominante par une activit FMO (Hines et al., 1994). De manire plus prcise, il a t montr que la nphrotoxicit associe au conjugu glutathion de l'acroline est lie son mtabolisme mdi par la FMO rnale ; la FMO forme un S-oxyde qui est ensuite libr, par raction d'limination catalyse en milieu basique, sous forme d'acroline cytotoxique (Park, S.B. et al., 1992). Ainsi, les FMOs peuvent jouer un rle important aussi bien dans les premires tapes de toxicit chimique que dans la dtoxification de composs xnobiotiques.

Comme dcrit ci-dessus, un grand nombre de mdicaments aujourd'hui en phase d'essais cliniques, ou largement prescrits, contiennent des fonctions caractre nuclophile de type azote, soufre, phosphore ou autres. Le rle de la FMO dans le mtabolisme oxydatif des mdicaments et des composs chimiques endognes chez l'homme est cependant mal connu.

Cashman et al. (1996) ont rcemment tudi les contributions des enzymes FMOs dans le mtabolisme physiologique de la cimtidine et de la S-nicotine in vivo.

La plus grande partie de leurs rsultats confirme le fait que l'activit FM03 du foie d'adulte est responsable de l'oxygnation de la cimtidine et de la S-nicotine, cette oxygnation tant strospcifique. Les auteurs montrent en - outre que la strochimie des mtabolites principaux de la cimtidine et de la S-nicotine chez des petits animaux d'exprimentation est distincte de celle observe chez l'homme, et suggrent que diffrentes isoformes de FMOs pouvant tre prdominantes selon les espces, ceci peut avoir des consquences importantes quant au choix des

4 PCT/FR97/02226 animaux d'expérimentation pour les programmes d'élaboration et de développement de médicaments chez l'homme.
La FMO1 est connue pour être exprimée chez l'homme dans les reins, mais pas dans le foie. La FM02 est exprimée majoritairement dans les poumons chez toutes les espèces de mammifères testées. La FM03 a été isolée chez l'homme dans le foie où elle est prédominante chez l'adulte. La FM03 est l'isoforme majeure impliquée dans la sulfoxydation de la méthionine et dans l'oxygénation l0 stéréospécifique de la cimétidine et de la S-nicotine. La FM03 présente une spécificité pour son substrat plus grande que celle des FMO1 trouvées dans le foie de la plupart des espèces animales étudiées. La FM04 est une isoforme mineure dont la fonction et la spécificité de substrat sont peu connues. Elle est présente dans le foie humain et est aussi exprimée dans le cerveau où elle pourrait être impliquée dans l'oxydation de médicaments antidépresseurs comme l'imipramine. La FM05 est exprimée dans le foie de l'homme de manière moins importante que la FM03. Son apparent manque d'efficacité en tant qu'enzyme impliquée dans le métabolisme de médicaments, suggère qu'elle pourrait être impliquée dans une fonction physiologique.
Les différents profils d'expression des isoformes de FMO selon les tissus et/ou espèces constituent 2S donc probablement un facteur significatif contribuant aux différences d'activités FMO observées entre les tissus et/ou entre espèces.-Ainsi, la variété des formes de FMOs pourrait avoir un impact significatif sur la différence des réponses de tissus et/ou espèces à l'exposition à un composé xénobiotique. En effet, les différences observées entre les tissus et/ou espèces dans la réponse aux composés xénobiotique5 et dans leur toxicité sont liées pour une part importante aux variations d'activité et de spécificité
impliquées dans le métabolisme de ces substrats par les FMOs. Facteurs génétiques et spécificité tissulaire dans l'expression des FMOs sont des facteurs importants de ces variations.
Concernant les facteurs génétiques, il a été
décrit par exemple que la triméthylaminurie, pathologie -~ 5 présente chez 1 % de sujets blancs britanniques et qui se manifeste par une forte odeur de poisson avarié dans l'air expiré, la sueur ou l'urine, est liée à une déficience d'origine génétique du fonctionnement d'une FMO hépatique.
Pour les raisons évoquées précédemment, il existe donc aujourd'hui un besoin important d'identifier de nouvelles isoformes de FMO ainsi que les polymorphismes génétiques éventuellement associés, présentant des spécificités quant à leurs substrats et/ou leur profil d'expression tissulaire, qui pourraient être impliquées dans le métabolisme de xénobiotiques, tel que le métabolisme de médicaments ou de substances exogènes présentes dans l'environnement comme par exemple les pesticides, ou encore qui pourraient être impliquées dans une fonction physiologique. Ceci est précisément l'objet de la présente invention.
Plusieurs gènes de la famille des FMOs humaines ont été localisés sur la région 1q23-25 du chromosome 1 par hybridation in situ du chromosome en métaphase.
Dès lors qu'une telle région candidate a été
définie, il est nécessaire d'avoir accès au fragment du génome couvrant l'intervalle où se situent) le(s) gènes) recherché(s). Cette étape passe par l'établissement d'une carte physique, à savoir le recouvrement de la région par un ensemble de fragments clonés et ordonnés. Aujourd'hui, grâce aux données de la carte intégrée CEPH/Gênéthon du ~ génome humain, environ 80 % du génome est recouvert par des clones de YACs, sous clonés en BACS dont la localisation sur les chromosomes se fait par l'intermédiaire de marqueurs polymorphes et génétiquement ordonnés (Chumakov et al., 1995). Cette carte physico-génétique permet de gagner un temps considérable, notamment par l'utilisation du séquençage exhaustif des régions d'intérêt.
Ainsi selon la présente invention, il a étë
établi, après localisation du BAC 123H04M sur le locus S génétique 1q24-25 précédemment cité, que l'insertion qu'il porte contient les parties 3' de hFM03, 5' de hFM0l, ainsi que la séquence complète de hFM02, et celle d'un autre nouveau gène membre de la famille FMO, le hFMOx.
En outre, grâce à l'utilisation de banques l0 d'étiquettes 5', on peut vérifier l'expression des gènes candidats identifiés comme prêcédemment . l'identification d'une étiquette hybridant à l'une des séquences candidates indique, puisque celle-ci est issue d'une banque d'ADNc, la présence d'ARNm et donc d'une expression des séquences en 15 question dans les tissus considérés.
C'est pourquoi la présente invention concerne notamment un polynucléotide isolé, dont la séquence SEQ ID
N° 1 est partiellement représentée sur la Figure 2, et qui 20 code pour un polypeptide de séquence SEQ ID N° 3 représentée sur la Figure 1.
La présente invention concerne également un polynucléotide isolé, dont la séquence SEQ ID N° 4 est partiellement représentée sur la Figure 10, et qui cade 25 pour un polypeptide de séquence SEQ ID N° 6.
Ces deux séquences nucléotidiques sont celles de deux gènes codant pour de nouvelles enzymes de la famille des mono-oxygénases à flavine (FMO) humaines, 30 respectivement hFM02 et hFMOx. Ceci a été établi par comparaison des séquences identifiées aux séquence: déjà
connues de FMO . des homologies structurales très fortes entre les deux séquences étudiées et celles des FMO, des homologies très fortes entre la première séquence et les 35 FM02 connues) notamment celle de macaque (FM02 de macaque .
séquence GeneBank U59453), ainsi qu'une homologie non WO 98/24914 ~ PCTlFR97/02226 suffisante de la seconde séquence avec aucune des FMO déjà
répertoriées chez l'homme ont permis de conclure.
La structure exonique des gènes de la famille FMO déjà connus est entiêrement conservée dans la séquence nucléotidique hFM02 selon l'invention. Les séquences de chacun des 9 exons du polynucléotide selon l'invention (Figure 3) présentent des degrés d'homologie variant de 95 % à 98 % en ADN avec la séquence correspondante de l'ARN
messager de la FM02 de macaque (Figure 4) . Les divergences entre les deux séquences nucléotidiques, ainsi que leur signification envers la séquence peptidique, sont présentées sur la Figure 5. La séquence polynuclëotidique SEQ ID N° 1 selon l' invention code pour un polypeptide de séquence SEQ ID N° 3 de 535 acides aminés (Figure 1) ; la séquence SEQ ID N° 2 de l'ARN messager prédite, ainsi que la séquence polypeptidique de la protéine humaine sont homologues â 97 ~ avec celles de la FM02 de macaque (Figures 6 et 7), ce qui a permis l'identification du polypeptide selon l'invention comme étant la FM02 humaine.
Le polypeptide de séquence SEQ ID N° 3, représenté à la Figure 1, présente également un haut degré d'homologie avec d'autres flavines-mono-oxygénases 2 de mammifêres ; ses degrés d'homologie avec d'autres protéines de la famille des flavines-mono-oxygénases sont moins forts.
Comme mentionné précédemment, l'absence d'homologie suffisante entre les séquences correspondant à hFMOx séquences génomique ~SEQ ID N° 4), d'ARN messager (SEQ ID
N° 5) , et peptidique (SEQ ID N° 6) - et les séquences des FMOs connues, a permis de conclure qu'il s'agit d'une nouvelle isoforme de FMO.
~ La présente invention concerne donc les séquences d'ADN ou d'ARN, l'ADN pouvant être génomique, ADN
complémentaire ou synthétique, des FMOs, notamment de hFM02 et hFMOx, ainsi que les protéines correspondantes.
La présente invention concerne en outre des vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant lesdites séquences nucléotidiques, des cellules transformées par ces vecteurs ou des animaux contenant lesdites cellules, ainsi que des méthodes de préparation desdits polypeptides sous la forme de polypeptides recombinants.
L'invention comprend aussi des méthodes de sélection de composé capable de moduler l'activité FMO.
L'invention concerne également des méthodes de diagnostic de prédisposition à des troubles liés à FMO
ainsi que des compositions pharmaceutiques destinêes au traitement et/ou à la prévention de ces troubles.
Un premier exemple de tels troubles pourrait être le glaucome primaire à angle ouvert (GPAO). En effet, d'une part Sunden et al. (1996), ainsi que les inventeurs (Belmouden et al., 1996), ont identifié la région chromosomique GLC1A, qui porte entre autres séquences de gènes celles connues de la famille des FMOs, en 1q23-25, comme liée à la survenue du GPAO juvénile (GPAO-J). D'autre part, un rôle possible des mono-oxygénases dans l'étiologie du glaucome a précédemment été suggéré (Schwartzman et al., 1987}. En effet, des métabolites de réactions d'oxydation, en inhibant l'activité Na+, K+ ATPase dans la cornée, contribueraient à la régulation de la transparence de la cornée et de la sécrétion humorale oculaire ; or, une opacité de la cornée et une hypertension oculaire sont les 2~ deux critères majeurs de diagnostic de glaucome.
Ainsi, un site d'hétérozygotie, présentant une ségrégation d'ordre -qénotypique dans une famille étudiée pour la présence en son sein de nombreux membres atteints de GPAO-J, a été identifié par les inventeurs dans l'exon 8 du polypeptide hFM02 selon l'invention.
En poursuivant la recherche des pclymorphismes présents dans des populations choisies de façon adéquate, et situés dans des séquences correspondant à celles portées par l'insertion du BAC 123H04M, ou plus généralement par 3S les séquences FMOs, on pourra identifier notamment les mutations associées aux pathologies ou troubles liés à une altération de FMO.
Les différentes isoformes des FMOs semblent moins se distinguer par la spécificité tissulaire de leur expression, que par les substrats dont elles catalysent la transformation. Comme indiqué précédemment, l'expression des FMOs a été mise en évidence dans le foie, les poumons, les reins ou le cerveau.
L'effet pathogène d'un déficit fonctionnel d'une l0 FMO pourrait rêsulter d'une capacité diminuée des tissus où
elle s'exprime à résister au stress oxydatif.
Plus généralement, par leur rôle dans le métabolisme oxydatif et leur fonction de détoxification, les FMOs pourraient être impliquées dans toute pathologie dégénérative ou toxique, démontrée au à prouver, notamment celles où une mort cellulaire programmée peut être mise en évidence, et les maladies dégénératives du système nerveux central.
De façon générale, les pathologies liées au fonctionnement des FMOs, sont rassemblées sous le nom de « troubles liés à FMO ».
Parmi les troubles liés à FMO, on peut citer par exemple, mais sans s'y limiter .
- oxydation de médicaments, substrats de FMO, en dérivés moins actifs, impliquant une perte d'efficacité dudit médicament ;
- non métabolisation- de médicaments actifs sous forme de métabolites, perte d'efficacité dudit médicament ;
- non métabolisation de xénobiotiques toxiques et/ou carcinogènes, dont des substances exogènes présentes . naturellement dans l'alimentation, telles que des alcaloïdes végétaux, ou des substances toxiques - présentes dans l'environnement, telles que les pesticides ou les herbicides ;

WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 - métabolisation de médicaments en intermédiaires pouvant être plus réactifs, impliquant un surdosage avec possibilité d'effet secondaire ;
- métabolisation de xénobiotiques, dont les médicaments ou

5 autres substances exogènes, en intermédiaires pouvant être potentiellement toxiques ; et/ou - altération de la fonction physiologique dans laquelle est impliquée la FMO ; en particulier, l'altération du fonctionnement de FMO, pourrait être impliquée dans la 10 symptomatologie du glaucome.
Par « FMO », on entendra désigner l'une quelconque des FMOs humaines connues, FMO1, FM03, FM04 et FM05, ou nouvellement décrites dans la présente demande de brevet, à savoir FM02 ou FMOx.
Certains de ces troubles pourront avoir une origine multigénique mais pour tous, les modifications d'une ou plusieurs FMOs contribuent à la survenue du trouble ou à son aggravation.
Les séguences nucléotidiques 2o La présente invention concerne, tout d'abord, une séquence nucléotidique isolée, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi .
a) les séquences codant pour les protéines FM02 ou FMOx humaines et leurs variants protéiques, 2, b) les séquences codant pour un fragment de ces protéines et ayant au moins 10 bases, c) les séquences génomiques FM02 ou FMOx humaines et leurs allèles, d) les séquences présentant au moins 80 ~, et de préférence 30 au moins 90 %, d'homologie avec les séquences (a) et (c), e) les fragments des séquences (c) ou (d) ayant au moins 10 bases, f) les séquences qui s'hybrident avec une séquence de (a) à
(e) .
35 I1 doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques génomiques WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel, il s'agit de séquences qui ont été
isolées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie (ADNc), leur environnement ayant été au moins partiellement modifié .
Ainsi, il peut s'agir aussi bien d'ADNc que d'ADN génomique partiellement modifié ou porté par des séquences au moins partiellement différentes des séquences lo les portant naturellement.
Ces séquences pourront également être qualifiées de « non naturelles ».
Par « séquence nucléique », on entend un fragment d'ADN et/ou d'ARN naturel isolé, ou de synthèse, 15 désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment, un segment ou une région d'un acide nucléique.
Par « allëles », on entend désigner les séquences mutées naturelles correspondant à des 20 polymorphismes pouvant exister chez l'être humain et, notamment, ceux qui peuvent conduire au développement de troubles liés à FMO.
Par « variant protéique », on entend dêsigner l'ensemble des protéines mutées pouvant exister chez l'être 25 humain, qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'amino-acides, ainsi que les variants artificiels qui seront néanmoins également appelés « variants protéiques ».
Dans le cas présent, les variants sont liés en partie à la 30 survenue de troubles liés à FMO.
Selon l'invention, les fragments de sêquences nucléiques peuvent notamment coder pour des domaines de la - protéine ou bien être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection ou d'identification ou 35 d'amplification. Ces fragments prêsentent une taille minimale_de 10 bases et on préférera des fragments de 20 bases, et de préférence 30 bases.
Selon l'invention, l'homologie est uniquement de type statistique, elle signifie que les séquences présentent au minimum 80 %, et préférentiellement 90 %, de nucléotides en commun.
Pour ce qui concerne les séquences (f), les conditions d'hybridation doivent permettre, selon l'invention, d'assurer au moins 95 % d'homologie.
l0 Plus particulièrement, la présente invention concerne une séquence nucléotidique choisie parmi .
a) les sêquences codant pour un polypeptide comprenant les amino-acides selon la séquence SEQ ID N° 3, ou selon la séquence SEQ ID N° 6, b) les séquences nucléiques de SEQ ID N° 1 ou N° 2, ou les séquences nucléiques représentées Figures 2 et 1, ou les séquences nucléiques de SEQ ID N° 4 ou N° S, ou les séquences nucléiques représentées Figure 10, ou les séquences nucléiques codant pour les polypeptides correspondants, c) un fragment d'une séquence selon (a) ou (b) comportant au moins 10 bases, et d) une séquence qui comporte par rapport aux séquences (a), (b) ou (c) au moins une mutation ponctuelle, e) une séquence complémentaire des séquences (a), (b), (c) ou (d) .
La Figure 1 représente la séquence SEQ ID N° 3 , la Figure 2 représente partiellement la sëquence SEQ ID
N° 1 de FM02, la Figure 10 représente partiellement la séquence SEQ ID N° 4 de FMOx, telles qu'elles ont été
séquencées sur un génome d'un individu ne présentant pas de troubles FMO visibles.
La structure du gène de hFM02 est identifiée dans la Figure 3.
La séquence SEQ ID N° 4 de FMOx est partiellement représentée sur la Figure 10.

_ Pour ce qui concerne les remarques particulières sur (a), (b), (c), (d) et (e), les remarques précêdentes s'appliquent.
L'invention concerne également des fragments de ces séquences, en particulier des séquences codant pour des polypeptides ayant gardé tout ou partie de l'activité de la protéine FMO.
Certaines de ces séquences peuvent être identifiées en se reportant notamment à la Figure 3 qui schématise l'organisation de hFM02.
Ces séquences partielles peuvent être utilisées pour de nombreuses applications, comme cela sera décrit ci-après, notamment pour effectuer des constructions protéiques de type FMO ou de types différents, mais également pour réaliser par exemple des protéines FMO-like.
Si les séquences dêcrites sont, en général, les séquences normales, l'invention concerne également les séquences mutées dans la mesure où elles comportent au moins une mutation ponctuelle et de préférence au plus 10 %
de mutation.
De préférence, la présente invention concerne des séquences nucléotidiques mutées dans lesquelles les mutations ponctuelles sont non muettes, c'est-à-dire qu'elles conduisent à une modification de l'amino-acide codé par rapport â la séquence normale. De façon encore préférée, ces mutations portent sur des amino-acides qui structurent les protéines FMO ou les fragments correspondants de celles-ci, notamment dans les régions correspondant aux sites catalytiques, aux sites régulateurs ou aux sites de fixation des cofacteurs ; les mutations peuvent également porter sur les séquences impliquées dans le transport et l'adressage ; elles peuvent aussi en particulier supprimer les cystéines ou, au contraire, en faire apparaître, mais également changer le caractère de la protéine, soit sur le plan de la charge, soit sur le plan de l'hydrophobicité.

La prêsente invention concerne également les mutations pouvant intervenir dans les séquences promotrices et/ou régulatrices des gènes FMO humains, lesquelles peuvent avoir des effets sur l'expression de la protéine, notamment sur son taux d'expression.
De façon générale, la présente invention s'intêresse aussi bien aux protéines FMO normales qu'aux protéines FMO mutées, ainsi qu'à leurs fragments.et aux séquences d'ADN et d'ARN correspondantes.
~ Parmi les fragments nucléotidiques pouvant être intéressants, notamment pour le diagnostic, il faut citer également les séquences génomiques introniques du gène FMO, par exemple les séquences jonctions entre les introns et les exons.
L'invention comprend les séquences nucléo-tidiques selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins la mutation G.1263mac.A, telle qu'elle sera définie ci-après dans les exemples.
L'invention comprend également les séquences nucléotidiques selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles comportent au moins l0 bases ainsi que lesdites séquences nucléotidiques, utilisables notamment comme amorce spécifique d'un allèle.
L'invention comprend également les séquences nucléotidiques selon l'invention, utilisables notamment comme amorce nuclêique, de préférence caractérisées en ce que lesdites séquences sont choisies parmi les séquences SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 et SEQ ID
N° 10.
L'invention concerne en outre les séquences nucléotidiques selon l'invention, utilisables notamment comme sonde spécifique d'un allêle, de préférence caractérisées en ce que lesdites séquences sont choisies parmi les séquences SEQ ID N° 11 , SEQ ID N° 12 , SEQ ID
N°
13 et SEQ ID N° 14.

L'invention a ëgalement pour objet les séquences nucléotidiques selon l'invention, caractérisées en ce gue ' lesdites séquences codent pour l'un des domaines de FMO.
Les polypeptides codés par les séquences 5 nucléotidiques selon l'invention, notamment les polypeptides de séquence SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 6, font bien entendu partie de l'invention.
Dans la présente description, les termes de protéine, polypeptide ou peptide sont interchangeables.
10 La présente invention concerne l'ensemble des amorces qui peuvent être déduites des séquences nucléotidiques précédentes et qui peuvent permettre de les mettre en évidence en utilisant une méthode d'amplification telle que la méthode PCR.
15 La présente invention concerne également les séquences nucléotidiques qui peuvent comporter des nucléotides non naturels, notamment des nucléotides soufrés ou de structure a ou (3.
Enfin, la présente invention concerne, bien entendu, aussi bien les séquences ADN qu'ARN, ainsi que les séquences qui s'hybrident avec elles, de même que les ADN
double brin correspondants.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut citer en particulier les oligo nucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. I1 faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression.
Comme cela sera décrit ci-après, pour certaines applications, il peut être nécessaire de prévoir des constructions mixtes, protéine/ADN/composé chimique, notamment l'utilisation d'agents intercalants par exemple ;

il doit être compris que de tels composés sont couverts par le brevet comme comportant une séquence selon l'invention.
Les protéines et polypeptides La présente invention concerne également les protéines, polypeptides ou peptides correspondant aux séquences mentionnées précédemment, sous forme non naturelle, c'est-â-dire qu'elles ne sont pas prises dans leur environnement naturel mais qu'elles ont pu être obtenues par purification à partir de sources naturelles ou bien obtenues par recombinaison génétique, comme cela sera dêcrit ci-après.
L'invention concerne également les mêmes polypeptides ou protéines obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des amino-acides non-naturels.
La présente invention concerne les protéines recombinantes ainsi obtenues aussi bien sous forme glycosylée que non glycosylée et pouvant présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Les vecteurs et les cellules La présente invention concerne également des vecteurs de clonage et/ou d'expression comportant une séquence nucléotidique telle que décrite précédemment.
Ces vecteurs de clonage et d'expression pourront comporter des éléments assurant l'expression de la séquence dans une cellule hôte, notamment des séquences promotrices et des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule. _ Le vecteur en cause pourra être à réplication autonome ou bien destiné à assurer l'intégration de la séquence au sein des chromosomes de la cellule hôte.
Dans le cas de systèmes à réplication autonome, en fonction de la cellule hôte, procaryote ou eucaryote, on utilisera de préférence des systèmes de type plasmidique ou des systèmes viraux, les virus vecteurs pouvant être notamment des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des rêtrovirus, des poxvirus ou des virus herpétiques (Epstein WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 et al., 1992). L'homme de métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces virus.
- Ainsi, il est connu d'utiliser comme vecteur viral des virus dêfectifs dont la culture est effectuée - 5 dans des cellules de complémentation, ceci évitant les risques éventuels de prolifération d'un vecteur viral infectieux.
Lorsque l'on souhaitera l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, il sera 1o nécessaire de prévoir de part et d'autre de la séquence nucléotidique à intégrer une ou plusieurs séquences provenant de la cellule hôte afin d'assurer la recombinaison. I1 s'agit là également de procédés qui sont largement décrits dans la technique antérieure. On pourra, 15 par exemple, utiliser des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus seront, par exemple, les rétrovirus (Temin 1986) ou les AAV, Adenovirus Associated Virus (Carter 1993).
L'invention concerne également les cellules 20 procaryotes ou eucaryotes transformées par un vecteur tel que décrit précédemment et ceci afin d'assurer l'expression d'une protéine FMO naturelle ou variante ou bien, par exemple, d'un de ses domaines.
Les animaux, caractérisés en ce qu'ils 25 contiennent une cellule transformée selon l'invention, font également partie de l'invention.
L'inventior3 comprend en outre un procédé de production d'un polypeptide selon l'invention, caractérisé
en ce qu' on cultive une cellule selon l' invention et en ce 30 que l'on récupère 7.a protéine produite.
Comme cela a été indiqué précédemment, la présente invention concerne également les polypeptides, obtenus par culture des cellules ainsi transformées et récupération du polypeptide exprimé, ladite récupération 35 pouvant être effectuée de façon intracellulaire ou bien de façon extracellulaire dans le milieu de culture lorsque le vecteur a été conçu pour assurer la sécrétion du polypeptide par le biais, par exemple, d'une séquence leader », la protéine étant exprimée sous forme d'une pré-protéine ou pré-pro-protéine. Les constructions permettant la sécrétion des polypeptides sont connues, aussi bien pour des systèmes procaryotes que pour des systèmes eucaryotes. Dans le cadre de la présente invention, certains des polypeptides FMO pourront comporter leur propre systême de sécrétion ou d'insertion l0 membranaire.
De préférence, l'invention concerne les polypeptides spécifiques de formes mutées des protéines selon l'invention, caractérisés en ce que leur séquence est choisie parmi les séquences polypeptidiques comprenant au moins une mutation.
Parmi les cellules utilisables pour la production de ces polypeptides, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifère (Edwards et Aruffo, 1993) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993).
Les cellules ainsi obtenues peuvent permettre de préparer des polypeptides naturels ou variants FMO, mais également des fragments de ces polypeptides, notamment des polypeptides pouvant correspondre aux diffêrents domaines en cause.
L'invention comprend également les anticorps mono- ou polyclonaux dirigés contre les polypeptdides selon l'invention, de préférence, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par réaction immunologique d'un organisme humain ou animal avec un agent immunogène constitué par un polypeptide selon l'invention, notamment un polypeptide recombinant ou synthétique selon l'invention ; de-WO 98!24914 PCTIFR97/02226 préférence l'agent immunogène sera constitué par un polypeptide spécifique de la forme mutée de la protéine obtenue selon le procédé précédemment décrit, la séquence dudit polypeptide étant choisie parmi les séquences polypeptidiques comprenant au moins une mutation.
L'invention concerne également les anticorps selon l'invention, caractérisés en ce qu'il s'agit d'anticorps marqués, notamment pour l'imagerie.
Ces anticorps monoclonaux ou polyclonaux marqués et correspondant notamment à tout ou partie des protéines mutées pourront être utilisés par exemple comme agent d'imagerie, in vivo ou ex vivo sur des prélêvements biologiques (imagerie à l'aide d'anticorps couplés à une molécule détectable en imagerie de type PET-scan, par exemple).
Les modèles cellulaires Les cellules transformées telles que décrites précédemment pourront également être utilisées à titre de modèle afin d'étudier les interactions entre les FMOs et les partenaires, composés chimiques et protéiques, impliqués directement ou indirectement dans l'activité FMO, et afin d'étudier les différentes interactions mises en cause selon qu'il s'agit d'une FMO normale ou d'un variant.
Mais surtout ils pourront être utilisés pour la sélection de produits interagissant avec les FMOs, normales ou variantes, â titre d'agoniste, notamment d'activateur enzymatique, ou d'antagoniste, notamment d'inhibiteur enzymatique.
Une autre application potentielle de la 3U caractërisation de ces gènes est donc la possibilité
d'identifier des composés, notamment protéiques, interagissant avec ces FMOs. I1 peut s'agir aussi bien d'inhibiteurs que d'activateurs, de substrats ou de cofacteurs, par exemple. Leur identification permettra de les utiliser en fonction de leurs interactions avec la protéine normale ou la protéine variante. En particulier, WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 on pourra chercher à isoler des agents ayant des effets différents sur les FMOs normales et variantes.
On pourra aussi utiliser ces modèles cellulaires pour étudier le métabolisme de xénobiotiques, médicaments 5 ou autres, par une FMO, normale ou variante. Ceci pourra être mis en oeuvre dans l'identification du pouvoir toxique de certains composés, dans la sélection et le développement de composés à toxicité réduite, ou à activité accrue, ou dans celui de FMOs modifiées, ayant un meilleur pouvoir de t0 métaboliser les composés d'intérêt.
Ce type de modèle cellulaire peut être réalisé
en mettant en oeuvre des techniques de génie génétique. I1 s'agit, suivant le type de cellules que l'on désire utiliser, de cloner le gène en question sous sa forme 15 normale ou sous sa forme mutée dans un vecteur d'expression, qu'il s'agisse d'un vecteur à réplication autonome ou d'un vecteur d'intégration, ledit vecteur comportant l'ensemble des éléments permettant l'expression du gène dans la cellule en cause, ou celle-ci ayant 20 l'ensemble des éléments permettant l'expression de la séquence en cause.
On obtient ainsi des cellules eucaryotes ou procaryotes exprimant la ou les protéines FMO, normales ou variantes, qui pourront alors constituer des modèles permettant de tester tout à la fois les interactions de différents produits avec les protéines FMO ou leurs variants, ou de tester des composés, notamment des produits chimiques de synthèse, pouvant interagir avec le produit du gène FMO, normal ou muté, et ce en les ajoutant dans le milieu de culture desdites cellules.
I1 faut, en particulier, remarquer gue les produits en question pourront aussi bien être des agents à
activité antagoniste qu'agoniste.
L'utilisation de modèles cellulaires en vue de tester des composés pharmaceutiques est bien connue, là
encore il n'y a pas lieu de détailler ce type de modèle. On peut cependant citer, parmi les techniques utilisées, le « Phage Display » (Allen et al., 1995), et les méthodes de double-hybride (Luban et Goff., 1995).
Ces modèles peuvent être de type in vitro, par exemple des cultures de cellules humaines, soit en culture normale, soit éventuellement sous forme d'organe isolé.
La présente invention concerne également des organismes tels que les animaux, en particulier des souris, exprimant le phénotype correspondant à la FMO normale ou variante d'origine humaine. Là encore, ces animaux pourront être utilisés comme animaux modèles pour tester l'efficacité de certains produits pharmaceutiques.
La présente invention concerne également les produits obtenus par la mise en oeuvre des modèles cellulaires précédents.
Méthode de diagnostic La présente invention concerne, comme cela a été
dit précédemment, plus particuliêrement des mêthodes de diagnostic de prédisposition â des troubles liés à FMO chez un patient, caractérisées en ce qu'on détermine à partir d'un prëlèvement biologique dudit patient la présence d'une mutation dans au moins une séquence codant pour une FMO par l'analyse de tout ou partie d'une séquence nucléique correspondant audit gène, la présence d'au moins une telle mutation étant indicative d'une prédisposition dudit patient à des troubles liés à FMO.
I1 est important de préciser que la présente invention ne décrit en détail que hFM02 et hFMOx, mais les méthodes de diagnostic et les compositions à visées thérapeutiques concernent aussi bien les FMOs précédentes que FMO1, FM03, FM04 et FM05. En effet, les FMOs en génëral interviennent dans le métabolisme des xénobiotiques et les troubles qui y sont associés, tels que, par exemple, les xénobiotiques et les troubles liês à FMO cités précédemment.

WO 98124914 ~ PCT/FR97/02Z26 Parmi les mutations qui sont recherchées, il faut citer plus particulièrement la mûtation G.1263mac.A.
(localisée sur la Figure 6).
Les séquences d'acides nucléiques analysées pourront être aussi bien de l'ADN génomique, un ADNc ou un ARNm.
Comme cela a été dit prêcédemment, parmi les troubles liés à FMO qui peuvent être mis en évidence, on entend plus particulièrement les pathologies associées au l0 métabolisme de xénobiotique telles que citées précédemment, ou associées à la fonction biologique de FMO, mais il peut exister d'autres troubles qui pourraient être liés à une anomalie des FMOs.
Les outils de diagnostic basés sur la présente invention, bien qu'ils puissent permettre un diagnostic positif et différentiel chez un patient pris isolément, seront de préférence intéressants pour un diagnostic présymptomatique chez un sujet à risque, notamment avec antécédent familial, et il est possible également de prévoir un diagnostic anté-natal.
En outre, la mise en évidence d'une mutation spécifique peut permettre un diagnostic évolutif, notamment quant à l'intensité du trouble ou à l'époque probable de son apparition.
Les méthodes permettant de mettre en évidence la mutation dans un gène par rapport au gène naturel sont, bien entendu, très nqmbreuses. On peut essentiellement les diviser en deux grandes catégories, le premier type de méthode est celui dans lequel la présence d'une mutation est détectée par comparaison de la séquence mutée avec la séquence correspondante naturelle non mutée, et le second type dans lequel la présence de la mutation est détectée de façon indirecte, par exemple par la mise en évidence de misappariements dus à la présence de la mutation.
Dans les deux cas, on préférera en général les méthodes dans lesquelles tout ou partie de la séquence WO 98124914 PCTIFR9'7/02226 correspondant à FMO est amplifiée prëalablement à la mise en évidence de la mutation, ces méthodes d'amplification pouvant être réalisées par des méthodes dites PCR ou PCR-like. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription réverse. I1 existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA
« Nucleic Acid Sequence Based Amplification » (Compton 1991), TAS « Transcription based Amplification System »
(Guatelli et al., 1990), LCR « Ligase Chain Reaction »
(Landegren et al., 1988), « Endo Run Amplification » (ERA), « Cycling Probe Reaction » (CPR)) et SDA « Strand Displacement Amplification » (Walker et al., 1992), bien 2o connues de l'homme du métier.
Le Tableau 1 présente des séquences d'amorces utilisables pour amplifier les séquences intéressant la mutation G.1263mac.A.
Le réactif utilisé pour détecter et/ou identifier une mutation du gène FMO dans un échantillon biologique comprend une sonde dite de capture et/ou une sonde dite de détection, l'une au moins de ces sondes comportant une séquence selon la présente invention dêcrite précédemment.
Recherche de mutations ponctuelles De façon générale, plusieurs méthodes de détection peuvent être appliquées ou adaptées si nécessaire, après amplification des séquences d'intérêt par PCR. A titre d'exemples, on peut citer .

1) Séquençage . comparaison des séquences de plusieurs individus et/ou repérage d'un site d'hétêrozygotie chez un seul individu.
2) « Single nucleotide primer extension » (Syvanen et al., 1990). Des exemples d'amorces utilisables pour détecter la mutation G.1263mac.A par cette méthode figurent dans le Tableau 2.
3) RFLP « Restriction Fragment Length Polymorphism ». Un exemple d'enzyme de restriction utilisable pour détecter la mutation G.1263mac.A. par RFLP est présenté sur le Tableau 3.
4) Recherche de « Single Strand Conformation Polymorphisms » (SSCP) .
5) Méthodes basées sur un clivage des régions misappariées (clivage enzymatique par la S1 nucléase, clivage chimique par différents composés tels que la pipéridine ou le tétroxide d'osmium, etc.

6) Mise en évidence d'hétéroduplex en électrophorèse.

7) Méthodes basées sur l'utilisation en hybridation de sondes oligonucléotidiques spécifiques d'allèles « Allele Specific Oligonucleotide » (ASO) (Stoneking et al., 1991). Des exemples de sondes utilisables pour la détection de la mutation G.1263mac.A. par ASO figurent sur le Tableau 4.

8) Méthode OLA « dual color Oligonucleotide Ligation Assay » (Samiotaki et al., 1994).

9) Méthode ARMS « Amplification Refractory Mutation System », ou ASA « Allele Specific Amplification », ou PASA « PCR Amplification of Specific Allele » (Wu et al . , 1989) .
Cette liste n'est pas exhaustive, et d'autres méthodes bien connues peuvent être utilisées.
Recherche de remaniements, par exemple de tvt~e délëtions D'autres méthodes bien connues et basées sur les techniques d'hybridation à l'aide de sondes génomiques, de sondes ADNc, de sondes oligonucléotidiques ou de ribosor_des WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 peuvent être utilisées pour la recherche de ce type de remaniements.
Font donc, ainsi, également partie de l'invention, les méthodes de diagnostic d'une 5 prédisposition à des troubles liés à FMO chez un patient selon l'invention, caractérisées en ce que ladite analyse est réalisée par hybridation, ladite hybridation étant réalisée de préférence à l'aide d'au moins une sonde oligonucléotidique spécifique de l' allèle, ou en ce que la

10 présence d'une mutation est détectée par comparaison avec la séquence correspondante naturelle non mutée, ou en ce que ladite analyse est réalisée par séquençage, ou par migration électrophorétique, et plus particulièrement par SSCP ou DGGE, ou en ce que ladite analyse est réalisée par 15 une méthodologie visant à détecter une troncation de la protéine.
Font aussi partie de l'invention) les méthodes de diagnostic d'une prédisposition à des troubles liés à
FMO chez un patient selon l'invention, caractérisées en ce 20 que tout ou partie de la séquence nucléique du gène FMO est amplifiée préalablement à la mise en évidence de la ou des mutations, de préférence l'amplification est réalisée par PCR ou PCR-like, les amorces choisies pour réaliser l'amplification étant de préférence choisies parmi les 25 amorces selon l'invention.
Les réactifs pour détecter et/ou identifier une mutation du gène FMO dans un échantillon biologique, caractérisés en ce qu'il comprennent une sonde dite de capture et/ou une sonde dite de détection, l'une au moins de ces sondes comportant une sêquence selon l'invention, ou un anticorps selon l'invention, font également partie de l'invention.
Méthodes basées sur la détection du produit du cène Les mutations du gène FMO peuvent être responsables de différentes modifications du produit de ce gène, modifications utilisables pour une approche diagnostique. En effet, les modifications d'antigénicité
peuvent permettre la mise au point d'anticorps spécifiques.
Toutes ces modifications peuvent être utilisées en approche diagnostique, grâce à plusieurs méthodes bien connues basées sur l'utilisation d'anticorps mono- ou polyclonaux reconnaissant la protéine normale ou des variants mutês, par exemple méthode RIA ou ELISA.
Enfin, il est également possible de diagnostiquer une prédisposition à des troubles liés à FMO, l0 chez un patient, en mesurant l'activité enzymatique de la (ou des) FMO à partir d'échantillons biologiques dudit patient. La mesure de cette (de ces) activité(s), par comparaison avec un étalon, interne ou externe, sera en effet indicative d'une prédisposition à l'un des troubles précédemment cités.
Compositions thérapeutiques La présente invention concerne également les traitements thérapeutiques, curatifs ou préventifs, de troubles liés à FMO.
On pourra utiliser les composés impliqués directement ou indirectement dans l'activité FMO, issus de l'utilisation des modèles cellulaires décrits précédemment.
On pourra particulièrement utiliser les composés capables d'interagir avec les FMOs, normales ou variantes, à titre d'agoniste ou d'antagoniste notamment.
La présente invention concerne également des compositions thérapeutiques comportant à titre de principe actif un composé capable de moduler l'activité FMO, il peut s'agir de composés à activité pro-FMO, notamment tels que décrits précédemment, ou des composés à activité anti-FMO.
De façon générale, on entendra par composé à
« activité pro-FMO » un composé qui induira l'activité FMO, au contraire un composé anti-FMO aura tendance à réduire l'activité FMO. L'effet réel de ces types d'activités dépendra du type d'enzyme exprimée, normale ou pathologique.

De façon préférée, on pourra utiliser des compositions thérapeutiques dont l'activité sera différente ' envers les enzymes FMOs normales et variantes.
I1 est tout d'abord possible de prévoir un traitement de substitution, c'est-à-dire des compositions thérapeutiques caractérisées en ce qu'elles comportent â
titre de principe actif un composé â activitê pro-FMO ; il pourra s'agir notamment de tout ou partie de polypeptides tels qu'ils ont été décrits précédemment, ou bien d'un vecteur d'expression de ces mêmes polypeptides, ou bien encore de composés chimiques ou biologiques ayant une activité pro-FMO, une activité FMO-like ou induisant la production de FMO.
I1 est possible également d'utiliser des compositions thérapeutiques dans lesquelles le principe actif aura une action anti-FMO, en particulier anti-FMO
variante. Dans ce cas il s'agit d'un traitement suppressif.
I1 pourra s'agir, par exemple, de composés interagissant avec lesdites enzymes, notamment des composés protéiques, 2o et en particulier d'anticorps anti-FMO, notamment lorsque ces anticorps reconnaîtront les protéines variantes. Il pourra s'agir également de produits chimiques ayant une activité anti-FMO, notamment des antagonistes de FMO
variante.
Parmi les nombreux composés pharmaceutiques utilisables, il faut citer plus particulièrement, les séquences anti-sens interagissant avec le gène FMO normal ou muté, ou bien les séquences sens agissant sur la régulation de l'expression de ces gênes, lesdits produits 3o pouvant également interagir en aval des produits d'expression induits par les FMOs.
I1 faut également mentionner les anticorps monoclonaux inhibant les FMOs, en particulier les FMOs mutées, et/ou inhibant les ligands correspondants et/ou les produits induits par l'activité FMO, qui peuvent donc avoir des activités pro ou asti.

I1 est également possible de prévoir l'expression de protéines ou leurs fragments in vivo, notamment par le biais de la thérapie génique et en utilisant les vecteurs qui ont été décrits précédemment.
Dans le cadre de la thérapie génique, il est possible également de prévoir l'utilisation des séquences des gènes ou des ADNc précédemment décrits, « nus », cette technique a notamment été développêe par la société Vical, qui a montré qu'il était, dans ces conditions, possible l0 d'exprimer la protéine dans certains tissus sans avoir recours au support d'un vecteur viral notamment.
Toujours dans le cadre de la thérapie génique, il est également possible de prévoir l'utilisation de cellules transformées ex-vivo, lesquelles pourront être ensuite réimplantées, soit telles quelles, soit au sein de systèmes de type organoïde, tel que cela est également connu dans l'état de la technique (Danos et al., 1993). On peut également envisager l'utilisation d'agents facilitant le ciblage d'un type cellulaire déterminé, la pénétration dans les cellules ou le transport vers le noyau.
Ainsi, l'invention a également pour objet une composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un composé
capable de moduler l'activité FMO, de préférence l'activité
FM02 et/ou FMOx.
L'invention comprend également une composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un composé capable d'interagir avec FMO, de préférence capable d'interagir avec FM02 et/ou FMOx, ou une composition thérapeutique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle présente une activité différente sur FMO normale et FMO pathologique.
L'invention comprend également une composition thérapeutique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif un composé à activité
pro-FMO, de préférence choisi parmi les composés suivants .

WO 98/24914 PCT/FR97l02226 a) une protéine ou un polypeptide selon l'invention, b) un vecteur d'expression selon l'invention, c) une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce que ladite séquence est une séquence - 5 sens induisant l'expression de FMO.
L'invention concerne en outre une composition thérapeutique selon l'invention, caractêrisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif un composé â activité
anti-FMO selon l'invention, de préférence le principe actif l0 est choisi parmi les composés suivants .
a) un anticorps anti-FMO selon l'invention, b) un vecteur d'expression selon l'invention, c) une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce que ladite séquence est une séquence 15 antisens inhibant l'expression de FMO, d) une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce que ladite séquence est une séquence sens inhibant l'expression de FMO.
L'invention concerne aussi une composition 20 thérapeutique selon l'invention, caractérisée en ce que le principe actif est une séquence soluble interagissant avec FMO.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un principe actif, de préférence au moins un produit 25 selon l'invention, capable de moduler ou d'interagir avec FMO, FM02 et/ou FMOx, pour réaliser un médicament destiné
au traitement et/ou ~ la prévention de troubles liés au fonctionnement de FMO.
Sous un autre aspect, l'invention est relative à
30 un procédé de biodégradation ou de biosynthêse de composé
organique ou inorganique, caractérisé en ce qu'il met en ~uvre un polypeptide ou une cellule selon l'invention.
. Les polypeptides à activité FMO selon l'invention pourront en effet avantageusement être utilisés 35 pour biodégrader suivant les réactions d'oxydation, telles que décrites par exemple par Ziegler !Ziegler et al., 1993), les composés substrats de FMO, en particulier les composés tels que cités dans la présente description, ou être utilisés pour la biosynthèse de composé d'intérêt à
partir desdits composés substrats de FMO, notamment pour la 5 biosynthèse de médicament, d'additif alimentaire, de pesticide ou d'herbicide.
Les procêdés d'élaboration de composê d'intérêt, caractérisés en ce qu'ils utilisent un polypeptide ou une cellule selon l'invention, font bien entendu partie de l0 l'invention. Les polypeptides ou cellules selon l'invention) pourront en effet avantageusement être utilisés in vitro pour déterminer la métabolisation potentielle du composé d'intérêt et pour analyser les métabolites éventuellement obtenus, leur toxicité et/ou 15 leur activité. Les résultats obtenus permettront de confirmer le composé ou de le reformuler de manière à ce qu'il devienne ou pas substrat de FMO, ou à ce que les métabolites formés soient différents.
Les produits susceptibles d'être obtenus par 20 ledit procédé de biosynthèse, font également partie de l'invention.
Enfin, l'invention comprend l'utilisation de polypeptide ou de cellule selon l'invention, pour la détoxification de composé xénobiotique, substrat de FMO.
25 Ces composés xénobiotiques peuvent être présents dans l'environnement, tels que pesticide ou herbicide, présents naturellement dans les plantes comme certains alcaloïdes, ou peuvent correspondre à des composës pharmaceutiques.
30 D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après, faite en se référant aux dessins annexés suivants .
- Figure 1 . Séquence polypeptidique correspondant à
la séquence SEQ ID N° 3 prédite de hFM02, homologue humaine de la FM02 de macaque.

WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 - Ficture 2 . Séquence nucléotidique correspondant partiellement à la sêquence SEQ ID N° 1 du gène codant pour hFM02, homologue humaine de la FM02 de macaque.
Au vu des homologies des ARN messagers connus de gènes de la famille des mono-oxygénases à flavine, ces gènes partagent la même structure exon/intron .
exonl . non traduit, variable en taille et en séquence, exon2 . début de la région codante, code pour les acides aminés 1-44, exon3 . acides aminés 45-107, exon4 . acides aminés 108-161, exon5 . acides aminés 162-209, exon6 . acides aminés 210-275, exon7 . acides aminés 276-394) exon8 . acides aminés 395-419, exon9 . acides aminés 420-535, fin du codant et région non traduite 3'.
Les introns sont variables en taille et en complexité.
Nous avons d'abord isolé la séquence de trois fragments du BAC 123H04M qui contiennent la totalité des exons de cet homologue.
Fragment 1 . contenant les exons 1 et 2, Fragment 2 . contenant l'exon 3, Fragment 3 . contenant les exons 4 à 9.
Les séquences de deux introns ont ensuite été
complétêes. -- Figure 3 .
Figure 3A . Description de la structure exon/intron du gène codant pour hFM02, homologue humaine de la FM02 de macaque.
Sont indiquées les positions des débuts et fins d'exons sur les séquences nuclêotidiques SEQ ID N° 1 et N° 2.
Figure 3B . Description de la structure exon/intron du gêne codant pour hFMOx.

WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 Sont indiquées les positions des dêbuts et fins d'exons sur les séquences nucléotidiques SEQ ID N° 4 et N°
S.
- Fiaure 4 . Homologie entre le gène FM02 de macaque et son homologue humain tel que présenté en figure 2.
La région S' non traduite diverge légèrement de la séquence de macaque tel que présenté en figure 2.
- Fiaure 5 . Relevé des positions variantes de la séquence de l'ARNm de hFM02 humain par rapport à la séquence homologue de macaque ; influence des variations sur la séquence protéique.
- Fiaure 6 . Homologies entre les séquences d'ARMm de la FM02 de macaque et de son homologue humaine.
La position de la mutation G.1263mac.A est repérée par une flèche verticale.
- Fiaure 7 . Homologies entre les séquences peptidiques de la FM02 de macaque et de son homologue humaine.
- Fiaure 8 . Analyse de la ségrégation du polymorphisme G.1263mac.A dans la famille étudiée.
L'ADN génomique des individus 3, 4, et 7 à 14 a été
amplifié par PCR, et la séquence des fragments obtenus analysée pour détecter des sites d'hétérozygotie ségrégeant avec la maladie.
Les symboles pleins indiquent les individus atteints du GPAO juvénile. Les symboles barrés indiquent des individus non génotypés. Les individus 11 et 12 sont des jumeaux.
G/G - homozygotes pour la base en position homologue de la position 1263 de l'ARNm de la FM02 de macaque.
G/A = hétérozygotes pour la base en position homologue de la position 1263 de l'ARNm de la FM02 de macaque.
- Fiaure 9: Localisation chromosomique du BAC123H04M
par hybridation in situ fluorescente.
(A) Un signal spécifique est observê sur les deux chromosomes 1. Sur la photo (B) est représenté un seul des deux chromosomes 1. En (C), seules les bandes R de ce chromosomes sont observées, montrant que le signal - de la sonde 123H04M est localisé sur la bande 1q23.
- Figure 10 . Séquence nucléotidique correspondant partiellement à la séquence SEQ ID N° 4 du gène codant pour l'isoforme hFMOx humaine.
Ce gène présente un taux d'homologie de 75 % en ADN et de 70 % en acides aminés avec les ARNs messagers de mono-oxygénases à flavine présents sur le BAC 123H04M.
l0 I1 est présenté, dans cette figure préliminaire, en quatre fragments .
fragment 1 . code pour l'exon 2 (premier exon codant)) fragment 2 . exon 3, fragment 3 . exons 4 à 8, fragment 4 . exon 9.
EXEMPLES
Isolement du BAC 123H04M
Afin d'identifier un gène codant pour une nouvelle FMO, on a isolé un BAC (« Bacterial Artificial Chromosome ») correspondant à la région candidate précédemment localisée sur le chromosome 1. Une banque de BACs couvrant le génome humain complet a été préparée à partir de l'ADN d'une lignée lymphoblastique humaine dérivée de l'individu n° 8445 des familles du CEPH. Cette lignée a été utilisée comme source d'ADN de haut poids moléculaire. L'ADN a été partiellement digéré par l'enzyme de_restriction BamHl, puis cloné au site BamHl du plasmide pBeloBacII. Les clones ainsi obtenus ont été « poolés » et criblés selon une procédure d'analyse tridimensionnelle précédemment décrite pour le criblage des banques de YACs (« Yeast Artificial Chromosome » ) (Chumakov et al., 1992). Les pools tridimensionnels obtenus ont été
criblés par PCR â l'aide des amorces encadrant le marqueur D1S3423(WI-10286). Ce STS (« Sequence Tagged Site ») avait été précédemment localisé dans la région candidate. Un clone du BAC 123H04M a été ainsi isolé.

WO 98/24914 ~ PCT/FR97102226 Après digestion par l'enzyme de restriction Notl, la taille de l'insert porté par ce BAC a été déterminée sur un gel d'agarose 0,8 ~ après migration par électrophorèse en champ alterné (CHEF) (4 heures à 9 Volts/cm, avec un angle de 100°, à 11°C en tampon 0,5xTAE). On a ainsi mis en évidence que le BAC 123H04M porte un insert de 180 kb.
Localisation chromosomique du BAC 123H04M par hybridation in situ fluorescente (FISH) La localisation chromosomique du BAC dans la lo région candidate 1q23-q25 a été confirmée par hybridation in situ fluorescente (FISH) sur chromosomes métaphasiques, selon la méthode décrite par Cherif et al., 1990. Le BAC
123H04M a été localisé plus précisément dans la bande 1q23 du chromosome 1 (Figure 9).
li Séquenç:age de l'insert du BAC 123H04M
Afin de séquences l'insert du BAC 123H04M, on a préparé trois banques distinctes de sous clones à partir de l'ADN soniquê de ce BAC.
Après incubation une nuit, les cellules issues de 20 trois litres de culture ont été traitées par lyse alcaline selon les techniques classiques. Après centrifugation du produit obtenu dans un gradient de chlorure de césium, 52 ~g d'ADN du BAC 123H04M ont été purifiés. 7 ~.g d'ADN ont été
soniqués dans trois conditions différentes, afin d'obtenir 25 des fragments dont les tailles se distribuent uniformément de 1 à 9kb. Les fragments obtenus ont été traités dans un volume de 50 ~1 avec 2 unités de Vent polymérase pendant 20 minutes à 70°C, en présence des 4 déoxytriphosphates (100 ~.M). Les fragments aux extrémités franches rêsultant de 30 cette étape ont été séparés par électrophorèse en gel 1 d'agarose à bas point de fusion (60 Volts pendant 3 heures).
Les fragments groupés selon leurs tailles ont été excisês et les bandes obtenues traitées par l'agarase. Après extraction au chloroforme et dialyse sur colonnes Microcon 100, l'ADN
35 en solution a été ajustë à une concentration de 100 ng/~.1.
Une ligation a été effectuPe, incubation une nuit, en WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 mettant en présence 100 ng de l'ADN fragmenté du BAC 123H04M
et 20 ng d'ADN du vecteur linéarisé par digestion enzymatique, et traité par la phosphatase alcaline. Cette réaction é été réalisée dans un volume final de 10 ul en 5 présence de 40 unités/~1 de T4 ADN ligase (Épicentre). Les produits de ligation ont ensuite servi à transformer par électroporation, soit une souche XL-Blue (pour les plasmides multicopies), soit une souche D10HB (pour les sous clones issus du BAC). Les clones lacZ- et résistants à
l0 l'antibiotique, ont été repiqués individuellement en microplaques pour stockage et séquençage.
On a ainsi obtenu .
- 864 sous clones issus de l'insertion de fragments de 2 à
3 kb au site SmaI du plasmide pucl8 ;
15 - 1728 sous clones correspondant à l'insertion de fragments de 1,5 à 2 kb au site BamHI (rendu franc) du plasmide BluescriptSK ;
- 288 sous clones portant des fragments de 4 à 7 kb insérés au site PmlI d'un vecteur BAC modifié.
20 Les inserts de ces sous clones ont été amplifiés par PCR sur cultures bactériennes incubées une nuit en utilisant les amorces des vecteurs flanquant les insertions.
La séquence des extrémités de ces inserts (en moyenne 500 bases de chaque côté) a été déterminée par séquençage 25 automatique fluorescent sur séquenceur ABI 377, équipé du logiciel ABI Prism DNA Sequencing Analysis (version 2.1.2).
Les fragments de séquence provenant des sous-BACS
ont été assemblés par le logiciel Gap4 de R. Staden (Bonfield et al., 1995). Ce logiciel permet la 30 reconstruction d'une séquence complète â partir de fragments . de séquences. La séquence déduite de l'alignement des différents fragments est la séquence consensus.
On a enfin utilisé des techniques de séquençage dirigé (marche systématique de l'amorce) pour parfaire les 35 séquences et relier les contigs.
Analyse des séguences Les exons potentiels du BAC 123H04M ont été
repérés par recherche d'homologie sur les banques publiques de protéines, d'acides nucléiques et d'EST (Expressed Sequence Tags).
Banques de données .
On a utilisé des refontes locales des principales banques publiques. La banque de protéines utilisée est constituée par la fusion non redondante des banques Genpept (traduction automatique de GenBank, NCBI ; Benson et al., 1996) ; Swissprot, (George et al., 1996) ; et PIR/NBRF
(Bairoch et al., 1996). Les doublons ont été éliminés par le logiciel "nrdb" (domaine public, NCBI ; Benson et al., 1996). Les répétitions internes ont ensuite été masquées par le logiciel « xnu » (domaine public, NCBI ; Benson et al., 1996). La banque résultante, dénommée NRPU (Non-Redundant Protein- Unique) a servi de référence pour les recherches d'homologies protéiques. Les homologies trouvées avec cette banque ont permis de localiser des régions codant potentiellement pour un fragment de protéine au moins apparenté à une protéine connue (exons codants). La banque d'EST utilisée est composée des sous-sections « gbest » (1-9) de Genbank (NCBI ; Benson et al., 1996). Elle contient tous les fragments de transcrits publics.
Les homologies trouvées avec cette banque ont permis de localiser des régions potentiellement transcrites (présentes sur l'ARN messager).
La banque d'acides nucléiques (autres que les EST) utilisée contient toutes autres sous-sections de Genbank et de l'EMBL (Rodriguez-Tome et al., 1996) dont les doublons ont été éliminés comme précédemment.
Locriciels On a utilisé l'ensemble de logiciel BLAST (domaine public, Altschul et al., 1990) de recherche d'homologies entre une séquence et des banques de données protéiques ou nucléiques. Les seuils de signification dépendent de la longueur et de la complexité de la région testöe ainsi que de la taille de la banque de référence. Ils ont été ajustés et adaptés à chaque analyse.
Identification de polymorphismes aénétiaues associés au FMO
en relation avec un polymorphisme phénotypiaue associé à la - 5 survenue du alaucome -iuvénile GPAO-J maladie de transmission autosomale dominante (locus GLC1A) Détection de Polymorphismes/Mutations 1) Extraction de l'ADN
L'ADN est extrait du sang veineux périphérique l0 après lyse cellulaire, digestion protéique, partition organique et finalement précipitation alcoolique.
Le sang (20 ml) est prélevé par ponction veineuse périphérique sur un tube contenant de l'EDTA.
I1 est dilué avec un volume d'eau bidistillée.
15 Après 10 minutes, les cellules sont collectées par centrifugation à 1600 g pendant 10 minutes. Cette manipulation est répétée.
Les cellules blanches sont lysées en présence de 20 ml de tampon CLB (Tris 10 mM pH 7.6, 5 mM MgCl2, sucrose 20 0.32 M, Triton X-100 1 % (v/v). Les noyaux sont collectés par centrifugation â 1600 g pendant 10 minutes. Cette manipulation est répétée.
Les noyaux sont lavés une fois dans le tampon RSB
(Tris 10 mM pH 8, NaCl 10 mM, EDTA 10 mM). Le culot est 25 resuspendu dans 2 ml de tampon RSB auquel est ajouté du lauryl sulfate de sodium (1 ~) et la protéinase K
(200 mg/ml). Le mélange est incubê à 55°C pendant au moins 3 heures et rêgulièrement agité.
La solution d'ADN ainsi obtenue est ensuite 30 extraite avec un volume de phénol êquilibré avec un tampon 50 mM Tris pH 8. Cette opération est répétée et complétée par une extraction avec un volume de chloroforme /alcool isoamylique (24 . 1 v/v).
L'ADN est précipité avec un volume d'isopropanol, 35 rincé à l'ethanol (70 %), séché et enfin resuspendu dans 1 ml de tampon TE (Tris 10 mM pH 8, EDTA 0.5 mM). La concentration d'ADN est évaluée par mesure de l'absorbance à
260 nm en utilisant l'équivalence de 50 ~g/ml d'ADN pour une unité d'absorbance. La concentration d'ADN est alors ajustée à 200 ~g/ml.
2) Amplification de l'ADN génomique Les amorces oligonucléotidiques utilisées pour l'amplification génomique des séquences exoniques dêrivées du BAC 123H04M, telles que prédites par analyse informatique, ont été définies à l'aide du logiciel OSP
(Hillier et al., 1991).
Toutes ces amorces contiennent, en amont des bases spécifiquement ciblées par l'amplification, une queue oligonucléotidique commune, destinée à permettre le séquençage des fragments amplifiés (PU pour les amorces en amont, et RP pour les amorces en aval ; séquences exposées sur le Tableau 5).
Les amorces oligonucléotidiques ont été
synthétisées selon la méthode des phosphoramidites, sur un synthétiseur GENSET UFPS 24.1.
L'amplification de chaque séquence exonique prédite a été réalisée par réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), dans les conditions suivantes .
Volume final 50 ~1 ADN génomique 100 ng MgCl2 2 mM
dNTP (pour chacun) 200 ~.M
Amorce (pour chacune) _ 7.5 pmoles AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin) 1 unité
*Tampon de PCR 1 X
* :(10X=0.1 M Tris HCl pH B.3, 0.5 M KC1) L'amplification est réalisée dans un thermocycleur Perkin Elmer 9600 ou MJ Research PTC200 avec couvercle chauffant. Après un chauffage à 94°C pendant 10 minutes, 35 cycles sont effectués. Chaque cycle comprend . 30 secondes à
94°C, 1 minute à 55°C et 30 secondes à 72°C. Un segment final d'élongation de 7 minutes à 72°C termine l'amplification.
La quantité de produits d'amplification obtenue est déterminée sur micro-plaque de 96 puits, par fluorométrie, utilisant l'agent intercalant Picogreen (Molecular Probes).
3) Détection des polymorphismes/mutations - Séquence Les produits de l'amplification génomique par PCR ont été séquencés sur séquenceur automatique ABI 377, en utilisant des amorces fluorescentes marquées par les fluorochromes ABI (Joe, Fam, Rox et Tamra) et l'ADN
polymérase Thermosequanase (Amersham).
Les réactions ont été réalisëes en microplaques de 96 puits, sur thermocycleur Perkin Elmer 9600, dans des conditions classiques de cycles de température .
- 8 cycles . dénaturation . 5 sec. à 94°C; hybridation . 10 sec. ; êlongation . 30 sec. à 72°C, puis - 13 cycles . dénaturation . 5 sec. à 94°C; élongation . 30 sec. à 72°C.
6 unités de Thermosequanase, et 5-25 ng de produit d'amplification ont été utilisées par réaction de séquence.
A l'issue des cycles d'amplification, les produits des réactions de séquence sont précipités dans l'éthanol, resuspendus dans du tampon de charge contenant de la formamide, dénaturés, et déposés sur gels d'acrylamide 4 % ; les électrophorêses (2 heures 30 à 3000 Volts) sont conduites sur séquenceurs ABI 377 équipés des logiciels ABI
de collection et d'analyse (ABI Prism DNA Sequencing Analysis Software, version 2.1.2.).
- Analyse des séquences Le GPAO-J étant une maladie autosomale dominante, les données de séquence obtenues ont été analysées afin de détecter la présence de sites d'hétérozygotie parmi les patients atteints de glaucome juvénile. Les sites d'hétérozygotie ont été confirmés après comparaison des séquences des deux brins d'ADN génomique de chaque individu concerné. Un site d'hétérozygotie est retenu comme mutation candidate responsable de la survenue de troubles liés à FMO
s' il est présent dans une population de membres d' une même 5 famille, alors qu'il est absent en général chez les contrôles non apparentés à la famille.
- Résultats Parmi tous les fragments d'amplification dérivés du BAC 123H04M étudiés, l'un d'entre eux présente un site 10 d'hétêrozygotie ségrégeant avec la survenue du glaucome juvénile dans un pédigree représenté sur la Figure 8.
Ce site d'hétérozygotie (G/A) est présent chez 7 patients atteints de GPAO-J tandis qu'il est absent de 3 patients sains homozygotes (G/G), tous issus de la même 15 famille. De plus, 99 contrôles non apparentés sont de même homozygotes (G/G) pour ce site, indiquant que la fréquence de l'allèle A dans la population générale est inférieure à
0.005.
Le site est contenu dans l'exon 8 du gène codant 20 pour la protéine hFM02 selon l'invention ; la mutation décrite transforme l'acide glutamique en position 402 de la sêquence SEQ ID N° 1 de la hFM02 en lysine (Figure 1).
Il est surprenant de remarquer que le calcul des lod scores intégrant les données précédentes pour 25 différentes hypothèses de fréquences de chaque allèle dans la population générale, indique une probabilité supérieure à 100 contre 1 que l' hétérozygotie (G/A) décrite soit liée au GPAO-J (Tableau 6). Cette probabilité est significative du fait que l'analyse a porté sur une seule famille.
30 Les amorces ayant permis l'amplification du fragment d'ADN contenant ce site d'hétérozygotie sont décrites dans le Tableau 1.
Tableau 1 . Séctuences des amorces utilisées pour amplifier 35 la région exoniaue dérivée du BAC 123H04M et contenant un site d'hétérozyaotie lié au GPAO juvénile Locus du fragment . FM02/Exon 8 Taille du fragment amplifié . 420 Amorces: Amont PU (SEQ ID N°7) . 5'TCACATAGAGTGCTATGGGGG
Aval RP (SEQ ID N°8) . 5'CTTAGGAAGAAGATAAAAATGCAAC
Tableau 2 . Exemples d'amorces pour détecter la mutation G.1263mac.A par « Sinctle Nucleotide Primer Extension »
a) SEQ ID N°9 . 5' AATGTCCATCATCATAGTTCTCT 3' (antisens) et/ou b) SEQ ID N°10 . 5' TAGGCTTGTGTAGCCTGCCCTCA 3' (sens) Tableau 3 . Identification de la mutation G.1263mac A par RFLP
5' C CTCA GAGAA 3' « normal »

site DdeI (C TNAG) 5' CCCTCAaAGAGAA 3' « mutant pas de coupure Tableau 4 . Exemple de sondes pour la détection de la mutation G.1263mac.A. par la technique ASO
Spécifique de l'allèle G
SEQ ID N° 11 . 5' CCTCA~AGAGAACTAT 3' et sa complémentaire .
SEQ ID N° 12 . 3' GGAGTQTCTCTTGATA 5' Spécifique de l'allèle A
SEQ ID N° 13 . 5' CCTCA~AGAGAACTAT 3' et sa complémentaire SEQ ID N° 14 . 3' GGAGTTTCTCTTGATA 5' Tableau 5 . Séauence des amorces utilisées pour le séauencaQe des fragments d'amplification à partir d'ADN
Qénomigue PU 5' TGTAAAACGACGGCCAGT
RP 5' CAGGAAACAGCTATGACC
Tableau 6 . Lod score entre le polymorphisme G.1263mac A et le GPAO -iuvénile dans la famille étudiée en fonction de la fréauence des deux allèles dans la t~opulation Générale Frquence de l'allle O (taux de Lod score rare (A) recombinaison) 0.01 0 2.07 0.001 0 2.10 0.0001 0 2.10 0.00001 0 2.10 SEQUENCE LISTING

' SEQ ID N 2 1~ SEQ ID N 14 RÉFÉRENCES
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LISTE DE SÉQUENCES
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
. (i) DÉPOSANT:
(A) NOM: GENSET
(B) RUE: 29 RUE ROYALE
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75008 (ii) TITRE DE L' INVENTION: SÉQUENCE NUCLEOTIDIQUE CODANT POUR UNE
FLAVINE MONOOXYGENASE,PROTEINE CORRESPONDANTE ET LEURS
APPLICATIONS DANS LE DOMAINE DU DIAGNOSTIC ET
THÉRAPEUTIQUE
(iii) NOMBRE DE SÉQUENCES: 19 (iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (vi) DONNÉES DE LA DEMANDE ANTÉRIEURE:
(A) NUMÉRO DE LA DEMANDE: FR 9615032 (B) DATE DE DEPOT: 06-AUG-1996 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26016 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENÇE: SEQ ID NO: 1:

WO 98!24914 ~ PCT/FR97/02226 AGACTGGGTG ATTTATAAAGGAAAGAGGTTTAATTGACTCCCAGTTCCACAATGCTGGGG 3i80 AGGACTCAGG AAATTTACAATCATGGCAGT~GGAAAGAGAGGTGCTGAGCAAAGGGGGAA 3290 WO 98/24914 PCT/FIt97/02Z26 CCCTGACTTACAACCATGCCCTAACTTGCATTCTTGCTCAAAAAGATTAAACAAAAGTTT.3900 CACCAAAAAAP,F~~AAAAAAAAAAAP.AAAAAATACTGATTTGTGGGCACTCCATCCCAAAT 9380 TTiTTTTTTT TTTGAGATGGAGTCTCGCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGGGCAGTAGCGCAA 6420 ATCTGTTTCT

A.~1AAATACAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCGCATACCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGG 7790 CATTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAGAGCAAAATTCTGTCTCA.~1AAAAAAAAAAGGGATT 7860 GACCTGCCTG GGCAACATGGTAAGACCTCATCTCTACAAAF,F1~~AAAAAAAAAAAAAATAC8580 ATTTCTTGGCCAGGTATGGTGATTCATGTTTGTAATCCCAGCAC1'TTGGGAGGCTGAGGC11220 GGAATGCTGA CCATGTGTCAGGCACTCTGCAAAGTGTTTTGCGTGAAATATCTTCTC'fAA12660 TACAAAGTCC ACAAAGAGGCGGC'fACATAAAACGTTCCTGACATATGCCAATTGCATGAT12720 TATGATGGTC TTTGTGTAAGGTGGTGGTTTTTGTAGTTTTTGTTATCA~GCACACATCAT13080 ACAGGGTTTC ACTATGCTGCTCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGGGCTCAATCA.ACCTGCCT15840 ACAGATTGAA ATAGTTCACCCACAGTAGTG'r,GATTGGGATTCAAACCCAAGCAGTCTGTA19990 TCTAATACCCAGAGTTATCTAACATTGGAGF~AAACTGTTTCAAGAGATTACGACCTGCCT21060 TAACATGACA AATGCTTTGATTGAATAATATATGGAGTGTTCAGGGAAGGAGAGAAAGGG 229$0 .

WO 98/24914 ~ PCTIFR97/02226 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 2:
(i) CARACTRISTIQUES
DE LA
SQUENCE:

(A) LONGUEUR:

paires de bases (B) TYPE:
nuclotide (C) NOMBRE
DE BRINS:
simple (D) CONFIGURATION:
linaire (ii) TYPE
DE MOLCULE:
ADNc (xi) DESCRIPTION NO: 2:
DE LA
SQUENCE:
SEQ ID

TGTCATCATT

GTCAACCCTC

(2) INFORMATIONS
POUR LA SEQ
ID N0: 3:

(i) CARACTRISTIQUES
DE LA SQUENCE:

(A) LONGUEUR: 535 acides amins (B) TYPE: acide amin (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE
MOLCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 3:
Met Ala Lys Lys Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ile Ser Leu Lys Cys Cys Val Asp Glu Gly Leu Glu Pro Thr Cys Phe Glu Arg Thr Glu Asp Ile Gly Gly Val Trp Arg Phe Lys Glu Asn Val Glu Asp Gly Arg Ala Ser Ile Tyr C~ln Ser Val Val Thr Asn Thr Ser Lys Glu Met Ser Cys Phe Ser Asp Phe Pro Met Pro Glu Asp Phe Pro Asn Phe Leu His Asn Ser Lys Leu Leu Glu Tyr Phe Arg Ile Phe Ala Lys Lys Phe Asp Leu Leu Lys Tyr Iie Gln Phe Gln Thr Thr Val Leu Ser Val Arg Lys Cys Pro Asp Phe Ser Ser Ser Gly Gln Trp Lys Val Val Thr Gln Ser Asn Gly Lys Glu Gln Ser Ala Val Phe Asp Ala Val Met Val Cys Ser Gly His His Ile Leu Pro His Ile Pro Leu Lys Ser Phe Pro Gly Met Glu Arg Phe Lys Gly Gln Tyr Phe His Ser Arg Gln Tyr Lys Plis Pro Asp Gly Ser Glu Gly Lys Arg Ile Leu Val Ile Gly Met Gly Asn Ser Gly Ser Asp Ile Ala Val Glu Leu Ser Lys Asn Ala Ala Gln Val Phe Ile Ser Thr Arg His Gly Thr Trp Val Met Ser Arg Ile Ser Glu Asp Gly Tyr Pro Trp Asp Ser Val Phe His Thr Arg Phe Arg Ser Met Leu Arg Asn Val Leu Pro Arg Thr Ala Val Lys Trp Met Ile Glu Gln Gln Met Asn Arg Trp Phe Asn His Glu Asn Tyr Gly Leu Glu Pro Gln Asn Lys Tyr Ile Met Lys Glu Pro Val Leu Asn Asp Asp Val Pro Ser Arg Leu Leu Cys Gly Ala Ile Lys Val Lys Sir Thr Val Lys Glu Leu Thr Glu Thr Ser Ala Ile Phe Glu Asp Gly Thr Val Glu Glu Asn Ile Asp Val Ile Ile Phe Ala Thr Gly Tyr Ser Phe Ser Phe Pro Phe Leu Glu Asp Ser Leu Val )fis Val Glu Asn Asn Met Val Ser Leu Tyr Lys Tyr Ile Phe Pro Ala His Leu Asp Lys Ser Thr Leu Ala Cys Ile Gly Leu Ile Gln Pro Leu Gly Ser Ile Phe Pro Thr Ala Glu Leu Gln Ala Arg Trp Val Thr Arg Val Phe Lys Gly Leu Cys Ser Leu Pro WO 98/24914 PCT/FIt97/02226 Ser Glu Arg Thr Met Met Met Asp Ile Ile Lys Arg Asn Glu Lys Arg Ile Asp Leu Phe Gly Glu Ser Gln Ser Thr Leu Gln Thr Asn Gln Tyr Val Asp Tyr Leu Asp Glu Leu Ala Leu Ile Gly Ala Lys Pro Glu Asp Phe Cys Ser Leu Leu Phe Lys Asp Pro Leu Ala Val Arg Leu Lys Tyr Phe Gly Pro Cys Asn Ser Tyr Xaa Tyr Leu Val Gly Pro Gly Arg Gln Trp Glu Gly Phe Arg Asn Ala Ile Phe Gln Lys Gln Arg Ile Thr Leu Lys Pro Leu Lys Thr Arg Ala Leu Lys Ser Ser Asn Phe Ser Asp Val Ser Phe Leu Leu Lys Ile Leu Gly Leu Ala Val Val Val Ala Leu Phe Phe Cys Gln Leu Gln Trp Ser (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 9:

(i) CARACTRISTIQUES DE LA SQUENCE:

(A) LONGUEUR: 25969 pa ires de s base (B) TYPE: nuclotide (C) NOMBRE DE BRINS: d ouble (D) CONFIGURATION: lin aire (ii) TYPE DE MOLCULE: ADN ( gnomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SQUE NCE: SEQ NO: 9:
ID

TCACATCTGC CTTCTAGCAAF,F~AAAAAAAAAAAGTAAAGAATGAAGGGCAAAGGGATGTT 8580 WO 98124914 PCT/FR9'7102226 WO 98/24914 PCT/FIt97/02226 CAGGCCTTGG TGTGTGTTGTTCCCCTTCCTC~'GTCCATGTGTTCTCATGATTCAACTCCT13080 WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 GTTTTTGGAAGA.~1TATCTTGTCCGTGCTTATGGGTGTATGAAGACATCAATAATAATACT13920 WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 A,~~~AAAAAAA AATGCAATTTTTTGGAGATTTGCAGCAATTTAAAAACTCAAGGCCAGGCG18890 ATATCTCCAG TAAATTCTGCCTCACAGTAAI~AAGTGATCTCTCAAGGTTCTCACATATTT19560 AGTGAAGTTA

GATTTCTGCCTGAACAGATTTTTAACACAGACAAAAGTGCCCTATTCTGGI~,F~~AAAAAAA20160 TGCTCACTGC CCAGAAAAGCTGATGCCCTGA_GAACAGCAGGTTTTTCCAATAGAGAGAGT22800 ss (2) INFORM ATIONS LA SEQ
POUR ID NO:
5:

(i) CARACTRISTIQUES
DE LA SQUENCE:

(A) LONGUEUR:

paires de bases (B) TYPE:
nuclotide (C) NOMBRE
DE BRINS:
simple (D) CONFIGURATION:
linaire (ii) T YPE DE
MOLCULE:
ADNc (xi) DE LA NO: 5:
DESCRIPTION SQUENCE:
SEQ ID

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 6:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 532 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
{C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: peptide (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 6:
Met Ser Lys Arg Val Gly Ile Ile Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ile Trp Cys Cys Leu Glu Glu Gly Leu Glu Pro Thr Cys Phe Glu Arg Ser Asp Asp Val Gly Gly Leu Trp Lys Phe Ser Asp His Thr Glu Glu Gly Arg Ala Ser Ile Tyr Gln Ser Val Phe Thr Asn Ser Ser Lys Glu Met Met Cys Phe Pro Asp Phe Pro Tyr Pro Asp Asp Tyr Pro Asn Tyr Ile His His Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ile Lys Thr Tyr Ala Gln Lys Lys Glu Leu Leu Arg Tyr Ile Gln Phe Glu Thr Leu Val Ser Gly Ile Lys Lys Cys Pro Ser Phe Leu Val Thr Gly Gln Trp Val Val Val Thr Glu Lys Asp Gly Lys Gln Glu Ser Thr Ile Phe Asp Ala Val Met Ile Cys Ser Gly His His Val Tyr Pro Asn Leu Pro Thr Asp Ser Phe Pro Gly Leu Asp Gln Phe Arg Gly Asn Tyr Leu His Ser Arg Asp Tyr Lys Asn Pro Glu Ala Phe Lys Gly Lys Arg Val Leu Val Ile Gly Leu Gly Asn Ser Gly Ser Asp Ile Ala Val Glu Leu Ser Arg Leu Ala Thr Gln Val Ile Ile Ser Thr Arg Ser Ala Ser Trp Val Met Ser Arg Val Trp Asp Asp Gly Tyr Pro Trp Asp Met Met Tyr Val Thr Arg Phe Ala Ser Phe Leu Arg Asn Val Leu Pro Ser Phe Ile Ser Asp 1'rp Leu Tyr Val Gln Lys Met Asn Thr Trp Phe Lys His Glu Asn Tyr Gly Leu Met WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 Pro Leu Asn Gly Ser Leu Arg Lys Glu Pro Val Phe Asn Asp Glu Leu Pro Ser Arg Ile Leu Cys Gly Thr Leu Ser Ile Lys Pro Ser Val Lys Glu Phe Thr Glu Thr Ser Ala Val Phe Glu Asp Gly Thr Met Phe Glu Ala Ile Asp Ser Val Ile Phe Ala Thr Gly Tyr Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Leu Asp Glu Thr Ile Met Lys Ser Arg Asn Asn Glu Val Thr Leu Phe Lys Gly Ile Phe Pro Pro Leu Met Glu Lys Pro Thr Lev Ala Val Ile Gly Leu Val Gln Ser Leu Gly Ala Ala Ile Pro Thr Ala Asp Leu Gln Ala Trp Trp Ala Ala Lys Val Phe Ala Asn Ser Cys Thr Leu Pro Thr Thr Asn Glu Met Met Asp Asp Thr Asp Glu Lys Met Gly Lys Lys Leu Lys Trp Phe Gly Gln Ser Gln Thr Leu Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Tyr Val Asp Glu Leu Gly Ser Phe Ile Gly Ala Lys Pro Asn Ile Pro Trp Leu Phe Leu Thr Asp Pro Arg Leu Ala Leu Glu Val T'yr Phe G1y Pro Cys Ser Pro Tyr Gln Phe Arg Leu Met Gly Pro Gly Lys Trp Asp Gly Ala Arg Asn Ala Ile Leu Thr Gln Trp Asn Arg Thr Val Lys Pro Thr Arg Thr Arg Val Val Ser Glu Val Gln Arg Pro His Pro Phe Tyr Asn Leu Leu Lys Met Leu Ser Phe Pro Leu Leu Leu Leu Ala Val Thr Leu Thr Phe Tyr (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 9:

WO 98/24914 ~ PCTIFR97l02226 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 10:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 11:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases (B) TYPE: nucléotide _ (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide"
(xi} DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 12:

WO 98/24914 ~ PCT/FR97/02226 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 13:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 14:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLÉCULE: Autre acide nucléique (A) DESCRIPTION: /desc = "oligonucleotide"
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 19:

';. ~~; r,f , (..y-.~",~,~.~...',"~;,.~i.~:

Claims

REVENDICATIONS

1. Séquence nucléotidique isolée, caractérisée en ce qu'elle code pour la protéine FMO2 ou FMOx humaine et leurs variants protéiques qui présentent au moins une mutation et au maximum 10 % de mutation.

2. Séquence nucléotidique isolée selon la revendication 1, caractérisée en ce qu elle code pour la protéine FMO2 humaine et qu'elle comprend une séquence choisie parmi :
a) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 2001 au nucléotide en position 2056 de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 1, b) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 2405 au nucléotide en position 2542 de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 1, c) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 10026 au nucléotide en position 10214 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, d) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 13341 au nucléotide en position 13503 de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 1, e) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 16036 au nucléotide en position 16178 de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 1, f) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 20558 au nucléotide en position 20757 de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 1, g) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 21972 au nucléotide en position 22327 de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 1, h) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 24411 au nucléotide en position 24483 de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 1, i) la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 25487 au nucléotide en position 25899 de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 1.

3. Séquence nucléotidique isolée, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences codant pour un polypeptide comprenant le polypeptide de séquence SEQ ID
N° 3 ou SEQ ID N° 6.

4. Séquence nucléotidique isolée, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi :
a) la séquence nucléique SEQ ID N° 1, b) la séquence nucléique SEQ ID N° 2, c) les séquences nucléiques représentées sur les figures 1 et 2, d) une séquence qui comporte, par rapport aux séquences a), b) et c), au moins une mutation ponctuelle, e) une séquence complémentaire des séquences a), b), c) et d).

5. Séquence nucléotidique isolée, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 10 bases, avantageusement au moins 20 bases et de préférence au moins 30 bases de l'une quelconque des séquences nucléotidiques selon la revendication 4, à l'exception des séquences nucléotidiques suivantes :
a) 5'-CTCCTATTAGTATCGCCTGGTTGG-3' ; et b) 5'-TACTGGATCCTGACAAGATAATAAAGCCCAAAG-3'.

6. Séquence nucléotidique isolée selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins la mutation G.1263mac.A.

7. Séquence nucléotidique isolée, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi :
a) la séquence nucléique SEQ ID N° 4, 9~
b) la séquence nucléique SEQ ID N° 5, c) les séquences nucléiques représentées sur la figure 10, d) une séquence qui comporte, par rapport aux séquences a), b) et c) , au moins une mutation ponctuelle, e) une séquence complémentaire des séquences a) , b), c) et d).

8. Séquence nucléotidique isolée, caractérisée en ce qu'elle hybride avec une séquence selon la revendication 7.

9. Séquence nucléotidique isolée, caractérisée en ce qu'elle présente au moins 80 % d~homologie avec une séquence selon la revendication 7.

10. Séquence nucléotidique isolée, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 10 bases, avantageusement au moins 20 bases at de préférence au moins 30 bases de l'une quelconque des séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 7 à 9.

11. Séquence nucléotidique utilisable notamment comme amorce spécifique d'un allèle, caractérisée an ce que sa séquence est choisie parmi les séquences selon l'une des revendications 5 et 10.

12. Séquence nucléotidique utilisable notamment comme amorce nucléique, caractérisée en ce que sa séquence est choisie parmi les séquences selon l'une des revendications et 10 et les séquences SEQ ID N° 7 , SEQ ID N° 8 , SEQ ID
N° 9 et SEQ ID N° 10.

13. Séquence nucléotidique utilisable notamment comme sonde nucléique, caractérisée en ce que sa séquence est choisie parmi les séquences selon l'une des revendications 5 et 10 et les séquences SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID
N° 13 et SEQ ID N° 14.

14. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications à 10) caractérisée en ce que la séquence code pour l'un des domaines de FMO2 et de FMOx.

15. Polypeptide codé par une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 10 et 14.

16. Polypeptide selon la revendication 15 de séquence d'acides aminés SEQ ID No 3 ou SEQ ID No 6.

17. Vecteur de clonage et/ou d'expression dans une cellule hôte appropriée d'une séquence nucléotidique, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence selon l'une des revendications 1 â 10 et 14.

18. Vecteur selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans ladite cellule hôte.

19. Vecteur selon l'une des revendications 17 et 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur à réplication autonome.

20. Vecteur selon l'une des revendications 17 et 18, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'intégration chromosomique.

21. Vecteur selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.

22. Vecteur selon la revendication 21, caractérisé en ce que le vecteur d'un réalisé sur la base d'un adénovirus, d'un AAV, d'un rétrovirus, d'un poxvirus ou d'un virus herpétique.

23. Cellule transformée par un vecteur selon l'une des revendications 17 à 22.

24. Cellule selon la revendication 23, caractérisée en ce qu.il s'agit d'une cellule procaryote.

25. Cellule selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote.

26. Animal, caractérisé en ce qu'il contient une cellule selon l'une des revendications 23 à 25.

27. Procédé de production de polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'on cultive une cellule selon l'une des revendications 23 à 25 et en ce que l'on récupère la protéine produire.

28. Polypeptide susceptible d'être obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 27.

29. Polypeptide spécifique de la forme mutée d'un polypeptide selon la revendication 29, caractérisé en ce que sa séquence est choisie parmi les séquences polypeptidiques comprenant au moins une mutation.

30. Anticorps dirigés contre un polypeptide selon l'une des revendications 15, 16, 29 et 29.

31. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux selon la revendication 30, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par réaction immunologique d'un organisme humain ou animal avec un agent immunogène constitué par un polypeptide selon l'une des revendications 15, 16, 28 et 29.

32. Anticorps polyclonaux ou monoclonaux selon la revendication 31, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par réaction immunologique d'un organisme humain ou animal à un agent immunogène constitué par un polypeptide selon la revendication 29.

33. Anticorps selon l'une des revendications 30 à 32, caractérisés en ce qu'il s'agit d'un anticorps marqué, notamment peur l'imagerie

34. Utilisation de cellules selon l'une des revendications 23 à 25 ou d'un animal selon la revendication 26, pour la sélection de produis impliqués directement ou indirectement dans l'activité FMO.

35. Utilisation de cellules selon l'une des revendications 23 à 25 ou d'un animal selon la revendication 26, pour la sélection de produits interagissant avec la FMO naturelle ou mutée, notamment à
titre d'agoniste ou d'antagoniste de cette enzyme.

36. Produit obtenu par la mise en oeuvre de l'une des revendications 34 ou 35.

37. Méthode de diagnostic d'une prédisposition à des troubles liés à FMO chez un patient, caractérisée en ce qu'on détermine à partir d'un prélèvement biologique dudit patient la présence d'une mutation dans le gène FMO par l'analyse de tout ou partie d'une séquence nucléique correspondant audit gène, la présence d'au moins une telle mutation étant indicative d'une prédisposition dudit patient à des troubles liés à FMO.

38. Méthode de diagnostic selon la revendication 37, caractérisée en ce que 1a mutation que l'on cherche à
déterminer est la mutation G.1263mac.A.

39. Méthode selon l'une des revendications 37 ou 38, dans laquelle la séquence d'acide nucléique analysée est un ADN
génomique, un ADNc ou un ARNm.

40. Méthode selon l'une des revendications 37 à 39, caractérisée en ce que ladite analyse est réalisée par hybridation.

41. Méthode selon l'une des revendications 37 à 40, caractérisée en ce que la présence d'une mutation est détectée par comparaison avec la séquence correspondante naturelle non mutée.

42. Méthode selon l'une des revendications 40 et 41, caractérisée en ce que ladite hybridation est réalisée à
l'aide d'au moins une sonde oligonucléotidique spécifique de l'allèle.

43. Méthode selon l'une des revendications 40 à 42, caractérisée en ce que ladite analyse est réalisée par séquençage.

44. Méthode selon l'une des revendications 40 à 42, caractérisée en ce que ladite analyse est réalisée par migration électrophorétique, et plus particulièrement par SSCP au DGGE.

45. Méthode selon l'une des revendications 40 à 42, caractérisée en ce que ladite analyse est réalisée par une méthodologie visant à détecter une troncation de la protéine.

46. Méthode selon l'une des revendications 40 à 45, caractérisée en ce que tout ou partie de la séquence nucléique du gène FMO est amplifiée préalablement à la mise en évidence de la ou des mutations.

47. Méthode selon 1a revendication 46, caractérisée en ce que l'amplification est réalisée par PCR ou PCR-like.

48. Méthode selon l'une des revendications 46 ou 47, caractérisée en ce que les amorces choisies pour réaliser l'amplification sont choisies parmi les amorces définies selon l'une des revendications 11 ou 12.

49. Réactif pour détecter et/ou identifier une mutation du gène FMO dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une sonde dite de capture et/ou une sonde dite de détection, l'une au moins de ces sondes comportant une séquence selon: l' une des revendications 1 à 14, ou en ce qu'il comporte un anticorps selon l'une des revendications 30 à 33.

50. Méthode de diagnostic d'une prédisposition à des troubles liés à FMO chez un patient, caractérisée en ce qu'on détermine à partir d'un prélèvement biologique dudit patient la présence d'une FMO mutée.

51. Méthode selon la revendication 50, caractérisée en ce qu'elle utilise un anticorps mono ou polyclonal selon l'une des revendications 30 à 33.

52. Méthode selon l'une des revendications 50 ou 51, caractérisée en ce que la détection est effectuée par un procédé ELISA ou RIA.

53. Méthode de diagnostic d'une prédisposition à des troubles liés à F'MO chez un patient, caractérisée en ce qu'on détermine à partir d'un prélèvement biologique dudit patient l'activité enzymatique d'au moins une FMO.

54. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un composé
capable de moduler l'activité FMO humaine.

55. Composition thérapeutique caractérisée en ce que le principe actif est capable de moduler l'activité FMO2 et/ou FMOx.

56. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif au moins un composé
capable d'interagir avec FMO humaine.

57. Composition thérapeutique caractérisée en ce que le principe actif est capable d'interagir avec FMO2 et/ou FMOx.

58. Composition thérapeutique selon l'une des revendications 54 à 57, caractérisée en ce qu'elle présente une activité différente sur FMO normale et FMO
pathologique.

59. Composition thérapeutique selon l'une des revendications 54 à 58, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif un composé à activité pro-FMO.

60. Composition selon la revendication 59, caractérisée en ce que le composé à activité pro-FMO est choisi parmi les composés suivants :
a) une protéine ou un polypeptide selon la revendication 36, b) un vecteur d'expression selon l'une des revendications 17 à 22, c) une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 10 et 14, caractérisée en ce que ladite séquence est une séquence sens induisant l'expression de FMO.

61. Composition thérapeutique selon l'une des revendications 54 à 58, caractérisée en ce qu'elle comporte à titre de principe actif un composé à activité anti-FMO.

62. Composition selon la revendication 61, caractérisée en ce que le principe actif est choisi parmi les composés suivants:
a) un anticorps anti-FMO, selon lune des revendications 30 à 33, b) un vecteur d'expression selon l'une des revendications 17 à 22, c) une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 10 et 14, caractérisée en ce que ladite séquence est une séquence antisans inhibant l'expression de FMO, d) une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 à 10 et 14, caractérisée en ce que ladite séquence est une séquence sens inhibant l'expression de FMO.

63. Composition selon la revendication 56, caractérisée en ce que le principe actif est une séquence soluble interagissant avec FMO.

64. Utilisation d'un principe actif capable de moduler l'activité FPO humaine, l'activité FMO2 et/ou FMOx, pour réaliser un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de troubles liés à FMO.

65. Utilisation d'un principe actif capable d'interagir avec FMO, avec FMO2 et/ou FMOx, pour réaliser un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de troubles liés à FMO.

66. Utilisation d'au moins un produit selon la revendication 36, pour réaliser un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de troubles liés à FMO, à
FMO2 et/ou à FMCx.

67. Procédé de biodégradation ou de biosynthèse de composé organique ou inorganique, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un polypeptide selon l'une des revendications 15, 165, 28 et 29 ou une cellule selon l'une des revendications 23 à 25.

68. Procédé d'élaboration de composé d'intérêt, caractérisé en ce qu'il utilise un polypeptide selon l'une des revendications 15, 16, 28 et 29 ou une cellule selon l'une des revendications 23 à 25.

69. Produit susceptible d'être obtenu par un procédé
selon l'une des revendications 67 et 68.

70. Utilisation ce polypeptide selon l'une des revendications 15, 16, 28 et 29, au d'une cellule selon l'une des revendications 23 à 25 pour la détoxification de composé xénobiotique.