DE69837931T2

DE69837931T2 - Jnk3 modulatoren und verfahren zu ihrer verwendung

Info

Publication number: DE69837931T2
Application number: DE69837931T
Authority: DE
Inventors: Roger J. Princeton DAVIS; Richard A. Guilford FLAVELL; Pasko New Haven RAKIC; Alan J. Worcester WHITMARSH; Chia-Yin Wallingford KUAN; Derek Di Carmel YANG
Original assignee: University of Massachusetts UMass; UMass Boston
Current assignee: University of Massachusetts UMass; UMass Boston
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-05
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2018-10-06
Also published as: HK1031128A1; CA2302874A1; US20120240247A1; US6943000B2; JP2010233570A; US20060035303A1; WO1999018193A1; US20030023990A1; CA2302874C; DE69837931D1; AU1186099A; EP1027429B1; EP1027429A4; AU756401B2; EP1027429A1; DE69841792D1; JP2001519146A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf Screening-Assays zur Detektion von Inhibitoren der Proteinkinase Expression oder Aktivität.
Hintergrund der Erfindung
Apoptose, oder programmierter Zelltod, ist ein bedeutendes Merkmal des Nervensystems, das Umweltstress ausgesetzt ist, während der normalen Entwicklung und im adulten Gehirn (X.). Stress induzierte Apoptose wurde mit einer Vielzahl von neurologischen Krankheiten in Verbindung gebracht (X.) und setzt de novo Protein- und RNA-Synthese voraus (X.). Die erhöhte Expression des c-Jun Proteins wird mit neuronaler Schädigung infolge globaler Ischämie (X.) oder Transsektion von Nervenaxonen in vivo (X.) in Verbindung gebracht. Die erhöhte Expression und Phosphorylierung von c-Jun wurden in vitro vor dem apoptischen Tod von sympathischen Neuronen, denen die Nerven Wachstumsfaktoren (NGF) entzogen worden waren, beobachtet (X). Weiterhin schützt die Expression eines dominant negativen mutanten c-Jun, oder die Behandlung mit einem c-Jun Antikörper sympathische Neuronen, denen NGF entzogen wurde, vor Apoptose (X.). Jedoch wurde das Erfordernis von c-Jun fit die stressinduzierte neuronale Apoptose nicht in vivo getestet, da c-Jun defiziente Mäuse während der Midgestation sterben (X).
Proteinphosphorylierung ist ein wichtiger Mechanismus der in die Aktivierung von c-Jun in Antwort auf Umweltstresssignale involviert ist (X.). C-Jun N-terminale Kinase (JNK, auch als SAPK bekannt) ist eine Serin/Threonin Proteinkinase, die zwei Reste (Ser-63 und Ser-73) an der NH2-terminalen Aktivierungsdomäne von c-Jun phosphoryliert (X.). Map Kinase Kinase (MKK) 4 (auch bekannt als SEK1) ist ein direkter Aktivator von JNK in Antwort auf Umweltstress und mitogenischen Faktoren (X.). JNK phosphoryliert auch ATF2 und andere Jun-Familien Proteine, die als Komponenten des AP-1 Transkriptionsfaktor-Komplexes funktionieren (X.). Die Phosphorylierung dieser Transkriptionsfaktoren durch JNK führt zu einer erhöhten AP-1 transkriptionalen Aktivität (X.). Umgekehrt ist die Induktion von AP-1 transkriptionaler Aktivität in Zellen, denen es an MKK4 mangelt, selektiv blockiert (X.).
JNK ist mit der Apoptose von NGF-differenzierten PC12 Pheochromocytomzellen in Verbindung gebracht worden (X.), ein Modellsystem für neuronalen Zelltod in vivo (X.). Wenn differenzierten PC12 Zellen Nervenwachstumsfaktoren (NGF) entzogen werden, wird vor dem apoptischen Tod die JNK Aktivierung beobachtet (X.). Transfektionsstudien unter Verwendung von konstitutiv aktivierten und dominant negativen Mutantenkomponenten der JNK Signalwegs zeigten, dass JNK in die durch NGF-Entzug induzierte Apoptose von PC12 Zellen involviert ist (X.)
Zehn JNK Isoformen, die von alternativem Splicing von drei unterschiedlichen Genen herrühren, wurden identifiziert (X.). Obwohl die JNK1 und JNK2 Isoformen weit gehend in murinen Geweben, einschließlich des Gehirns, exprimiert werden, werden die JNK3 Isoformen vor allem im Gehirn und zu einem geringeren Ausmaß im Herzen und im Hoden exprimiert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Mäuse, die das JNK3 Gen nicht besitzen (JNK3 (–/–)), sich normal entwickeln und resistent gegenüber excitotoxischer Schädigung sind und, dass JNK3 eine Rolle bei der stress-induzierten Anfallaktivierung, der AP-1 transkriptionalen Aktivierung und der Kainat-induzierten Apoptose hippocampaler Neuronen spielt. Daher ist JNK3 ein Mediator der Kainat/Glutamat-Excitotoxizität und ein Ziel zur Beschränkung oder Verhinderung excitotoxischer Schädigung.
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Excitotoxizität moduliert, das Verfahren umfassend: Inkubieren einer neuronalen Zelle, die ein JNK3 Protein exprimieren kann, mit einer Verbindung unter Bedingungen und für eine Zeit die ausreichen, damit die neuronale Zelle ein JNK3 Protein ohne die Verbindung exprimieren kann; Inkubieren einer Kontrollzelle unter den gleichen Bedingungen und für die gleiche Zeit in der Abwesenheit der Verbindung; Messung der JNK3 Expression in der neuronalen Zelle in der Gegenwart der Verbindung; Messung der JNK3 Expression in der Kontrollzelle; und Vergleichen der Menge der JNK3 Expression in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Verbindung, wobei ein Unterschied in der Höhe der Expression anzeigt, dass die Verbindung Excitotoxizität moduliert.
In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung erniedrigt die Verbindung die Expression von JNK3.
In einer anderen Ausführungsform von diesem ersten Aspekts der Erfindung umfasst das Verfahren weiterhin Auswählen der Verbindung, wenn es einen Unterschied in der Höhe der Expression in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Verbindung gibt; und Verabreichung der ausgewählten Verbindung an ein Tiermodel für eine excitotoxische Störung und Untersuchen des Tieres auf Excitotoxizität hin, wobei eine Erniedrigung in der Excitotoxizität im Tier anzeigt, dass die Verbindung die JNK3 Expression moduliert.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die Excitotoxizität moduliert, das Verfahren umfassend: Inkubieren einer neuronalen Zelle, die JNK3 Aktivität aufweist, mit einer Verbindung unter Bedingungen und für eine Zeit die ausreichend sind, dass die Zelle JNK3 Aktivität in der Abwesenheit der Verbindungen exprimiert; Inkubieren einer Kontrollzelle unter den gleichen Bedingungen und für die gleiche Zeit ohne die Verbindung; Messung der JNK3 Aktivität in der neuronalen Zelle in der Gegenwart der Verbindung; Messung der JNK3 Aktivität in der Kontrollzelle; und Vergleichen der Menge an JNK3 Aktivität in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Verbindung; wobei ein Unterschied in der Höhe der Aktivität anzeigt, dass die Verbindung Excitotoxizität moduliert.
In einer Ausführungsform dieses zweiten Aspekts der Erfindung erniedrigt die Verbindung die JNK3 Aktivität.
In einer anderen Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfasst das Verfahren weiterhin Auswählen der Verbindung, wenn es einen Unterschied in der Höhe der Aktivität in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Verbindung gibt; und Verabreichung der ausgewählten Verbindung an ein Tiermodel für eine excitotoxische Störung und untersuchen des Tieres auf Excitotoxizität hin, wobei eine Erniedrigung in der Excitotoxizität im Tier anzeigt, dass die Verbindung JNK3 Aktivität moduliert.
Ein dritter Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung die Excitotoxizität moduliert; besagte Methode umfassend Vergleichen der Menge eines JNK3 Polypeptids, das an ein Substrat gebunden ist, in der Gegenwart und in der Abwesenheit einer ausgewählten Verbindung, wobei ein Unterschied in der Menge des Bindens eines JNK3 Polypeptid an ein Substrat anzeigt, dass besagte ausgewählte Verbindung die Excitotoxizität moduliert, wobei das JNK3 Polypeptid aus einer neuronalen Zelle aufgereinigt wurde.
In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist die Bindung eines JNK3 Polypeptids an ein Substrat erniedrigt.
In einer anderen Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfasst das Verfahren weiterhin Auswählen der Verbindung wenn ein Unterschied in der Menge an das Substrat gebundenen JNK3 Polypeptids in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Verbindung gibt; und Verabreichung der ausgewählten Verbindung an ein Tiermodell für eine excitotoxische Störung und untersuchen des Tieres auf Excitotoxizität hin, wobei eine Erniedrigung in der Excitotoxizität im Tier anzeigt, dass die ausgewählte Verbindung die Bindung eines JNK3 Polypeptid an das Substrat moduliert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung einer totipotenten Mauszelle, umfassend wenigstens ein inaktiviertes JNK3 Gen, das Verfahren umfassend:

a. Zur Verfügung stellen einer Vielzahl von totipotenten Mauszellen;
b. Einführen eines DNA-Konstrukts in die Zellen, umfassend ein zertrenntes Maus JNK3 Gen, wobei das JNK3 Gen durch Insertion einer Nukleotidsequenz in das Gen zertrennt ist, das die Expression eines funktionalen JNK3 verhindert;
c. Inkubieren der Zellen, so dass homologe Rekombination zwischen der chromosomalen Sequenz, die für JNK3 kodiert, und dem eingeführten DNA-Konstrukt auftritt; und
d. Identifizierung einer totipotenten Mauszelle umfassend wenigstens ein inaktiviertes JNK3 Gen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Maus, die homozygot für ein inaktiviertes JNK3 Gen ist, umfassend:

a. Zur Verfügung stellen einer totipotenten Mauszelle umfassend wenigstens ein inaktiviertes JNK3 Gen;
b. Einbringen der Zelle in einen Mäuseembryo und Implantation des Embryos in eine weibliche Maus;
c. Zulassen, dass der Embryo sich in eine neonatale Maus entwickelt;
d. Zulassen, dass die neonatale Maus die Geschlechtsreife erreicht; und
e. Paaren zweier geschlechtsreifer Mäuse aus Schritt d., um eine Maus zu erhalten, die homozygot für das inaktivierte JNK3 Gen ist (–/–), wobei die Maus resistent gegenüber excitotoxischer Schädigung ist.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, die die JNK3 Expression inhibiert, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antisense-Nukleinsäure, Ribozym und Antikörper oder eines Fragments davon, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Patienten, der eine Störung hat, die Excitotoxizität involviert, oder ein Risiko für eine solche Störung hat.
In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist besagte Störung mit der stress-induzierten Anfallsaktivität, der AP-1 transkriptionalen Aktivierung und der kaininsäure-induzierten Apoptose von hippocampalen Neuronen assoziiert.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Störung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alzheimer, Huntington, Ischämie, amytrophische laterale Sklerose, Trauma, Erkrankungen der Motoneuronen, Parkinson oder Epilepsie.
Ein siebter Aspekt der Erfindung ist ein transgenes, nicht menschliches Säugetier, das eine transgene disruptierte Expression eines JNK Gens hat, wobei das Transgen chromosomal in die Keimzellen des Säugetiers integriert ist.
In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung ist das Säugetier eine Maus.
In einer anderen Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung resultiert die Disruption in einer Nullmutation.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zelllinie, die von einer Zelle des Säugetiers des siebten Aspekts der Erfindung abstammt.
Wenn nicht anderweitig spezifiziert, kann sich „JNK3" sowohl auf Nukleinsäuren, als auch auf Polypeptide beziehen, sowie die Sequenzen, die in 1A-5B gezeigt sind (SEQ ID NOS: 1-12, siehe auch GenBank Hinterlegungsnummer: U34819, die SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 entspricht; U34820, die SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 entspricht; U07620, die SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 entspricht; L27128, die SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 entspricht; und L35236, die SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 entspricht). SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 6 repräsentieren abgeleitete Nukleotidsequenzen, die auf dem angenommenen Überlapp zwischen den von SEQ ID NOS: 1 und 4 repräsentierten Sequenzen mit der von SEQ ID NO: 7 repräsentierten Sequenz beruhen. JNK3 bezieht sich ebenfalls auf Polypeptide, die wenigstens 85% identisch zu den oben aufgelisteten Aminosäuresequenzen und den Nukleinsäuren, die diese Polypeptide encodieren, sind. Beispiel dieser Sequenzen und Verfahren zu deren Isolierung sind in Gupta et al., supra, 1996; Kiriakis et al., supra; Martin et al., Brain Res. Mol. Brain Res., 35:45-57, 1996; und Mohit et al., Neuron, 14:67-68, 1995 zu finden.
Eine „Kontrollzelle" ist eine Zelle, die generell gleich, z.B. genotypisch und phänotypisch, zu der Zelle ist, mit welcher sie verglichen wird (z.B. können die Zellen Schwesterzellen sein), die jedoch nicht einer Testverbindung ausgesetzt wird.
Wenn nicht anderweitig definiert, haben alle hierin verwendeten wissenschaftlichen Terme dieselbe Bedeutung, wie sie gewöhnlich vom durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung verstanden werden. Obwohl Verfahren, die ähnlich oder gleich denen, die hier beschrieben werden, zur Ausführung oder Testung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Verfahren und Materialen unten beschrieben. Im Falle eines Konflikts soll die vorliegende Beschreibung inklusive der Definitionen maßgeblich sein. Weiterhin sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur illustrativ und sollen nicht limitierend sein.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden detaillierten Beschreibung und der Ansprüche ersichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz der GenBank Hinterlegungsnummer U34819 (SEQ ID NO: 1).
1B ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz der GenBank Hinterlegungsnummer U34819 (SEQ ID NO: 2).
1C ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 3.
2A-B ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz der GenBank Hinterlegungsnummer U34820 (SEQ ID NO: 4).
2C ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz der GenBank Hinterlegungsnummer U34820 (SEQ ID NO: 5).
2D ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 6.
3A-B ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz der GenBank Hinterlegungsnummer U07620 (SEQ ID NO: 7).
3C ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz der GenBank Hinterlegungsnummer U07620 (SEQ ID NO: 8).
4A ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz der GenBank Hinterlegungsnummer L27128 (SEQ ID NO: 9).
4B ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz der GenBank Hinterlegungsnummer L27128 (SEQ ID NO: 10).
5A ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz der GenBank Hinterlegungsnummer L35236 (SEQ ID NO: 11).
5B ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz der GenBank Hinterlegungsnummer L35236 (SEQ ID NO: 12).
6 ist ein Diagramm des wildtyp JNK3 Genlocus, des Targeting Vektors und des mutierten oder zerstörten JNK3 Genlocus.
7 ist ein Balkendiagramm, das die zeitlichen Antworten von wildtyp und JNK3 (–/–) Mäusen auf Kaininsäure (KA) Injektion zeigt.
8 ist ein Balkendiagramm, das die zeitlichen Antworten von wildtyp und JNK3 (–/–) Mäusen auf Pentetrazol (PTZ) Injektion zeigt.
9A ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz des murinen c-Jun (GenBank Hinterlegungsnummer X12740; SEQ ID NO: 13).
9B ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz des murinen c-Jun (GenBank Hinterlegungsnummer X12740; SEQ ID NO: 14).
10A-B ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäuresequenz des murinen c-Fos (GenBank Hinterlegungsnummer V00727; SEQ ID NO: 15).
10C ist eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz des murinen c-Fos (GenBank Hinterlegungsnummer V00727; SEQ ID NO: 16).
11 ist ein Balkendiagramm, das das Level von KA-induzierter AP-1 Aktivität zu verschiedenen Zeitpunkten nach KA Induktion, wie angezeigt durch die Luziferase Aktivität in JNK3 (–/–) Mäusen, die mit transgenen AP-1 Luziferase-Mäusen gekreuzt wurden, zeigt.
12 ist ein Balkendiagramm, das das Level von KA-induzierter AP-1 Aktivität zeigt, wie angezeigt durch das relative Level der Luziferase Aktivität im Hippocampus (HP) und im Cerebellum (CB) von JNK3 (–/–) Mäusen und wildtyp (+/+) Mäusen.
13 ist ein Diagramm der vorgeschlagenen Kette molekularer Ereignisse, die durch KA ausgelöst werden und die zur neuronalen Apoptose führen.
14 ist ein Diagramm der trisynaptischen Verbindung innerhalb der hippocampalen Formation.
Detaillierte Beschreibung
Die JNK Proteinkinase phosphoryliert c-Jun und erhöht in Folge dessen die AP-1 transkriptionale Aktivität in Antwort auf eine spezifische Gruppe von Stresssignalen (Whitmarsh et al., supra; Yang et al., supra). Die neural-spezifische Expression von JNK3 kann Neuronen besonders empfänglich für physiologischen Stress machen. In den hierin beschriebenen Experimenten, wurde in JNK3-defizienten Mäusen eine erhebliche Resistenz gegenüber Kaininsäure (KA) induzierten Verletzungen und Apoptose beobachtet. Die Resistenz gegenüber KA Neurotoxizität kann in der Eliminierung eines spezifischen Stress-Antwort-Signalwegs, der durch die JNK3 Isoform der JNK Proteinkinase vermittelt wird, begründet liegen. Erstens verursachte die Verabreichung von KA die Phosphorylierung der NH₂-terminalen Aktivierungsdomäne von c-Jun und erhöhte die AP-1 transkriptionale Aktivität in wildtyp Mäusen, aber nicht in JNK3-defizienten Mäusen, markant. Zweitens zeigte sich eine andauernde Expression an phosphoryliertem c-Jun innerhalb des am meisten verletzlichen Bereichs des Hippocampus, was zusätzlich darauf hindeutet, dass JNK Aktivität zu neuronaler Apoptose führen kann.
Die hierin beschriebenen Ergebnisse stimmen mit der Abhängigkeit der KA Neurotoxizität vom excitatorischen Kreislauf überein (Nadler et al., Brain Res. 195:47-56, 1980). Da JNK3 im Nervensystem weitläufig exprimiert wird und seine Aktivität durch viele verschiedene Stresssignale erhöht wird (Gupta et al., supra), könnte JNK3 in die stress-induzierte Apoptose, die dutch eine Vielzahl von umweltbedingten Schädigungen verursacht wird, involviert sein.
Die Identifikation von JNK3 als einen kritischen Vermittler der KA-induzierten excitatorischen Neurotoxizität hat klinische Auswirkungen. Die Aminosäuresequenz von murinem, Ratten- und humanem JNK3 ist hoch konserviert (Kyriakis et al., supra; Gupta et al., supra; Martin et al., supra; Mohit et al., Neuron. 14:67-78, 1995). Außerdem ist die Expression des humanen JNK3 Gens auch auf das nervöse und das Nerven- und das Neuroendokrinsystem beschränkt und in vielen Gehirnunterregionen weitläufig exprimiert (Gupta et al., supra; Mohit et al., supra). Daher ist es wahrscheinlich, dass humane und Nager-JNK3 Proteinkinasen verwandte oder identische physiologische Funktionen haben. Eine Neurotoxizität der excitatorischen Aminosäuren wurde für viele neurologische Störungen vermutet, die von akuter Ischämie bis zu chronischen neurodegenerativen Krankheiten reichen (Choi, Neuron, 1:623-634, 1988; Lipton et al., N. Engl. J. Med. 330:613-622, 1994; Rothman et al., Annu. Neurol. 19:105-111, 1986). Bisherige therapeutische Strategien waren auf die Verhinderung des Kalziumeinstroms durch die Zelloberflächenkanäle fokussiert, wie den NMDA-Typ Glutamatrezeptor. Bis heute haben diese Ansätze lediglich gemischte Ergebnisse erzielt (Lipton et al., supra). Daher ist JNK3 ein Ziel für therapeutische Interventionen, wenn excitatorische Neurotoxizität JNK3-vermittelte Apoptose involviert.
In den unten beschriebenen Experimenten wurde die homologe Rekombination dazu verwendet, JNK3-defiziente Mäuse zu erzeugen und deren Antworten auf gesundheitsschädliche Reize wurden untersucht. KA, eine starke excitotoxische Chemikalie, ruft limbische Verletzungen und neuronalen Zelltod hervor. Die Neurotoxizität von KA rührt von der direkten Stimulation des Glutamatrezeptor an postsynaptischen Stellen und einer indirekten Erhöhung der Freisetzung an excitatorischen Aminosäuren von präsynaptischen Stellen her. Es ist gut belegt, dass die systemische Verabreichung von KA die Expression verschiedener zellulärer immediate early Gene (cIEGs), einschließlich c-Jun und c-Fos, induziert. Daher löst die Verabreichung von KA in vivo einen Stressantwortsignalweg im Gehirn aus. Die unten ausgeführten Experimente demonstrieren, dass KA die Phosphorylierung von c-Jun und eine Erhöhung in AP-1 transkriptionaler Aktivität im Gehirn von Wildtypmäusen induziert. Diese Effekte von KA sind jedoch in den Gehirnen von JNK3-defizienten Mäusen merklich unterdrückt. Weiterhin zeigen JNK3 defiziente Mäuse eine bemerkenswerte Resistenz gegenüber KA-induzierten Verletzungen und der Apoptose von hippocampalen Neuronen. Diese normalen mit KA behandelten Mäuse stellen ein nützliches Modell für menschliche Störungen des Nervensystems dar, die Excitotoxizität involvieren.
Auf diesen experimentellen Ergebnissen beruhend wurde JNK3 als ein außergewöhnliches Ziel zur Einschränkung von excitotoxischer Schädigung identfiziert. Im Besonderen ist JNK3 ein Ziel in Screeningprotokollen einschließlich Protokolle zur Screening auf Moleküle, die die JNK3 Genexpression, das Binden von JNK3 an seine Substrate und die JNK3 Aktivität regulieren, wie unten beschrieben. Die durch diese Screeningverfahren gefundenen Moleküle, welche wirksam die JNK3 Expression oder Aktivität erniedrigen, die für die Behandlung von Störungen des Nevensystems verwendet werden können, welche Excitotoxizität involvieren, einschließlich Anfallsleiden wie Epilepsie, zerebrovaskulare Störungen einschließlich Ischemie, metabolisches Ungleichgewicht (z. B. Hypoglykemie), Verletzungen, die auf extremer Hitze oder Kälte beruhen, Traumen (z. B. Bestrahlung, Verletzungen der Wirbelsäule, Druck und ionisches Ungleichgewicht). Hirnleistungsschwachen wie Alzheimer, Parkinson und neurodegenerative Störungen (z. B. Huntington) und motoneuronale Erkrankungen (einschließlich amytrophische laterale Sklerose) (Thompson, Science, 267:1456-1462, 1995; Coyle et al., Science, 262:689-695, 1993).
Verfahren zum Screening auf Moleküle, die die JNK3 Aktivität inhibieren
Die folgenden Assays und Screeningverfahren können verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die wirksame Inhibitoren der JNK3 Aktivität sind. Die Assays und Screeningverfahren können mittels physikalischer Auswahl von Molekülen aus Bibliotheken und mittels Computervergleichen von digitalen Modellen von Verbindungen in molekularen Bibliotheken und einem digitalen Modell der JNK3 Aktivierungsstelle durchgeführt werden. Die in den Assays und Screeningverfahren identifizierten Inhibitoren können, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, mittels Binden an JNK3 (z. B. von Maus oder Mensch), binden an intrazelluläre Proteine, die JNK3 binden, Verbindungen, die mit der Interaktion zwischen JNK3 und seinen Substraten interferieren, Verbindungen, die die Aktivität eines JNK3 Gens modulieren, oder Verbindungen, die die Expression eines JNK3 Gens oder eines JNK3 Proteins modulieren, wirken.
Assays können auch dazu verwendet werden, Moleküle zu identifizieren, die an JNK3-regulatorische Sequenzen (z. B. Promotorsequenzen) binden, und damit die Genexpression modulieren. Siehe z. B. Platt, J. Biol. Chem., 269:28558-28562, 1994.
Die Verbindungen, welche mit den hierin beschriebenen Verfahren gescreent werden können, schließen ein, sind jedoch nicht darauf limitiert, Peptide und andere organische Verbindungen (z. B. Peptidomimetics), die an ein JNK3 Protein binden oder dessen Aktivität in jeglicher Weise inhibieren. Solche Verbindungen können einschließen, sind jedoch nicht darauf limitiert, Peptide; z. B. lösliche Peptide einschließlich doch nicht limitiert auf Mitglieder von zufälligen Peptidbibliotheken (siehe z. B. Lam et al., Nature 354:82-84, 1991; Houghten et al., Nature 354:84-86, 1991) und kombinatorische chemieabgeleitete molekulare Bibliotheken, die aus D- und/oder L-Aminosäuren, Phosphopeptiden (einschließlich jedoch nicht limitiert auf Mitglieder von zufälligen oder teilweise degenerierten gerichteten Phosphopeptidbibliotheken bestehen; siehe z. B. Songyang et al., Cell 72:767-778, 1993) und kleine organische oder anorganische Moleküle.
Verbindungen und Moleküle werden gescreent um diejenigen zu identifizieren, die die Expression eines JNK3 Gens oder eines anderen Gens beeinflussen, welches in die Regulation der Expression von JNK3 involviert ist (z. B. dutch Interaktion mit der regulatorischen Region oder den Transkriptionsfaktoren eines Gens). Verbindungen werden auch dazu gescreent um diejenigen zu identifizieren, die die Aktivität von solchen Proteinen (z. B. durch Inhibierung der JNK3 Aktivität) oder der Aktivität eines Moleküls, das in die Regulation von JNK3 involviert ist, zu beeinflussen.
Computergestützte Modelierungs- oder Suchtechnologien werden verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, oder modifizierte Verbindungen zu identifizieren, die die Expression oder Aktivität eines JNK3 Proteins modulieren oder Kandidaten für eine solche Modulierung sind. Z. B. werden Verbindungen identifiziert, die wahrscheinlich mit der aktiven Stelle des JNK3 Proteins interagieren. Die aktive Stelle von JNK3 kann mittels in der Technik bekannter Verfahren identifiziert werden, einschließlich, z. B. Analyse der Aminosäuresequenz eines Moleküls und von einer Studie von Komplexen, die von JNK3 mit einem nativen Liganden (z. B. ATF2 oder c-Jun) gebildet werden. Chemische oder röntgenkristallographische Verfahren können verwendet werden, um die Aktive Stelle von JNK3 zu identifizieren, über die Lokalisierung eines gebundenen Liganden, wie c-Jun oder ATF2.
Die dreidimensionale Struktur der aktiven Stelle kann bestimmt werden. Dieses kann unter Verwendung von bekannten Verfahren durchgeführt werden, einschließlich Röntgenkristallographie, die dazu verwendet werden kann, eine komplette molekulare Struktur zu bestimmen. Fest- oder Flüssigphasen NMR kann verwendet werden, um bestimmte intramolekulare Entfernungen zu bestimmen. Andere Verfahren der strukturellen Analyse können verwendet werden, um teilweise oder komplette geometrische Strukturen zu bestimmen. Geometrische Strukturen können bestimmt werden mit einem JNK3 Protein, gebunden an einen natürlichen (z. B. c-Jun oder ATF2) oder künstlichen Liganden, was eine genauere Bestimmung der Struktur der aktiven Stelle erlauben kann.
Computerbasiertes numerisches Modelling kann verwendet werden, um eine unvollständige oder nicht ausreichend akkurate Struktur zu vervollständigen. Modellierungsverfahren, die verwendet werden können sind z. B. parametrisierte Modelle, die für bestimmte Biopolymere wie Proteine oder Nukleinsäuren spezifisch sind, molekulardynamische Modelle, die auf der Berechnung molekularer Bewegung basieren, statistische mechanische Modelle, die auf thermalen Ensembles beruhen, oder kombinierte Modelle. Für die meisten Arten von Modellen sind standardmolekulare Kraftfelder, die die Kräfte zwischen den einzelnen Atomen und Gruppen repräsentieren nötig und können aus Kraftfeldern ausgewählt werden, die in der physikalischen Chemie bekannt sind. Informationen über unvollständige oder weniger genaue Strukturen, die wie oben beschrieben bestimmt wurden, können als Einschränkungen bei den Strukturen berücksichtigt werden, die mit diesen Modellierungsverfahren berechnet werden.
Nachdem die Struktur der aktiven Stelle eines JNK3 Proteins entweder experimentell, durch Modellierung oder mittels einer Kombination von Verfahren bestimmt worden ist, können Kandidaten für modulierende Verbindungen mittels Durchsuchen von Datenbanken, die Verbindungen zusammen mit Informationen bezüglich derer molekularer Struktur enthalten, identifiziert werden. Die bei einer solchen Suche identifizierten Verbindungen sind diejenigen, die Strukturen haben, die der Struktur der aktiven Stelle entsprechen, in die aktive Stelle passen, oder mit Gruppen interagieren, die die aktive Stelle definieren. Die durch diese Suche identifizierten Verbindungen sind potentielle JNK3 modulierende Verbindungen.
Diese Verfahren können auch dazu verwendet werden, verbesserte modulierende Verbindungen von bereits bekannten modulierenden Verbindungen oder Liganden zu identifizieren. Die Struktur der bekannten Verbindungen wird modifiziert und die Effekte werden unter Verwendung der hier beschriebenen experimentellen und Computermodellierungsverfahren bestimmt. Die veränderte Struktur wird mit der Struktur der aktiven Stelle eines JNK3 Proteins verglichen, um zu bestimmen oder vorherzusagen, wie eine bestimmte Modifikation des Liganden oder der modulierenden Verbindung deren Interaktion mit dem Protein beeinflussen wird. Systematische Veränderung in der Zusammensetzung, so wie durch Veränderung von Seitengruppen, können ausgewertet werden, um modifizierte modulierende Verbindungen oder Liganden von bevorzugter Spezifität oder Aktivität zu erhalten.
Angesichts der hier offenbarten Lehre können weitere experimentelle und Computermodellierungsverfahren, die nützlich sind, modulierende Verbindungen aufgrund der Identifizierung der aktiven Stellen eines JNK3 Proteins und verwandter Transduktions- und Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, vom Fachmann entwickelt werden.
Beispiele für molekulare Modellierungssysteme sind die QUANTA Programme, z. B. CHARMm, MCSS/HOOK, und X-LIGAND (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA). QUANTA stellt eine Modellierungsumgebung für zweidimensionale und dreidimensionale Modellierung, Simulation und Analyse von Makromolekülen und kleinen organischen Molekülen zur Verfügung. Insbesondere analysiert CHARMm energieminimierungs- und molekulardynamische Funktionen. MCSS/HOOK charakterisiert die Fähigkeit einer aktiven Stelle einen Liganden zu binden unter Verwendung von Energetiken, die mittels CHARMm berechnet wurden. X-LIGAND passt Ligandenmoleküle im elektronendichten Muster von Protein-Ligandenkomplexen ein. Das Programm erlaubt weiterhin auch die interaktive Erstellung, Modifizierung, Visualisierung, und Analyse des Verhaltens von Molekülen miteinander.
Artikel, die die Computermodellierung von Verbindungen, die mit spezifischen Proteinen interagieren, besprechen, können eine zusätzlich Anleitung geben. Z. B. siehe Rotivinen et al., Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166, 1988; Ripka, New Scientist 54-57 (June 16, 1988); McKinaly und Rossmann, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29:111-122, 1989; Perry und Davies, OSAR: Quantiative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc., 1989); Lewis und Dean, Proc. R. Soc. Lond. 236:125-140, 141-162, 1989; und bezüglich eines Modellrezeptors für Nukleinsäurekomponenten siehe Askew et al., Am. J. Chem. Soc. 111:1082-1090. Computerprogramme, die zum Screening und zur Darstellung von Chemikalien entworfen wurden, sind von Firmen wie MSI (supra), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada) und Hypercube, Inc. (Gainesville, FL) erhältlich. Diese Anwendungen wurden im Weitesten für Wirkstoffen entwickelt, die für bestimmte Proteine spezifisch sind; sie können jedoch an das Design von Wirkstoffen, die spezifisch für identifizierte Regionen von DNA oder RNA sind, angepasst werden. Kommerzielle Quellen von chemischen Bibliotheken können als Quellen für Kandidatenverbindungen verwendet werden. Solche chemischen Bibliotheken können von z. B. ArQule, Inc. (Medford, MA) erhalten werden.
Zusätzlich zu dem Design und der Herstellung von Verbindungen, die die Bindung verändern, wie oben beschrieben, können Bibliotheken von bekannten Verbindungen, einschließlich natürlicher Produkte, synthetischer Chemikalien und biologisch aktiver Materialien einschließlich Peptide nach Verbindungen gescreent werden, die Inhibitoren oder Aktivatoren sind.
Verbindungen, die mittels oben beschriebener Verfahren identifiziert wurden, können nützlich sein, um z. B. die biologische Funktion von JNK3 Genprodukten und die Behandlungen von Störungen, bei denen JNK3 Aktivität schädlich ist, zu ergründen. Assays zum Testen der Effektivität von Verbindungen, sowie die hierin beschriebenen, werden weiter unten beschrieben.
In Vitro Screening Assays nach Verbindungen, die an JNK3 Proteine und Gene binden
In vitro Systeme können verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die mit JNK3 Proteinen oder Genen, die diese Proteine enkodieren, interagieren (z. B. binden). Solche Verbindungen können z. B. nützlich sein zur Modulierung der Aktivität von JNK3 Polypeptiden oder Nukleinsäuren, zur Aufklärung ihrer Biochemie, oder zur Behandlung von Störungen, die durch JNK3 Expression ausgelöst oder verschlimmert werden. Diese Verbindungen können selber normale Funktionen unterbinden, oder können im Screeningverfahren nach Verbindungen verwendet werden, die die normale Funktion unterbinden.
Assays zur Identifikation von Verbindungen, die an JNK3 Proteine binden, erfordern die Herstellung eines Reaktionsgemisches des Proteins und der Testverbindung unter Bedingungen die ausreichend sind, um diese zwei Komponenten interagieren und binden zu lassen und damit einen Komplex zu bilden, der detektiert und/oder isoliert werden kann.
Screeningassays nach Molekülen, die an ein JNK3 Protein oder eine JNK3 Nukleinsäure binden können, können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden. Z. B. kann ein JNK3 Protein, Peptid oder Fusionsprotein auf einer festen Phase immobilisiert werden, mit der Testverbindung zur Reaktion gebracht werden, und die Komplexe mittels direkter oder indirekter Markierung der Testverbindung detektiert werden. Alternativ kann die Testverbindung immobilisiert werden, mit dem JNK3 Polypeptid zur Reaktion gebracht werden und jegliche Komplexe detektiert werden. Mikrotiterplatten können als feste Phase verwendet werden und die immobilisierten Bestandteile können mittels kovalenter oder nicht-kovalenter Interaktionen verankert werden. Die nicht-kovalente Befestigung kann mittels Beschichtung der festen Phase mit einer Lösung enthaltend das Molekül und Trocknung erreicht werden. Alternativ wird ein für JNK3 spezifischer Antikörper verwendet, um das Molekül an die feste Phase zu verankern. Solche Oberflächen können in Vorbereitung auf die Verwendung hergestellt und gelagert werden. JNK3 Antikörper können unter Verwendung konventioneller Verfahren, wie diese, die in Coligan et al. (Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 1994, siehe Volume 1, Kapitel 2) beschrieben sind, hergestellt werden.
Im Assay wird der nicht-immobilisierte Bestandteil zu der beschichteten Oberfläche, die den immobilisierten Bestandteil enthält, hinzugegeben unter Bedingungen, die die Interaktion und das Binden zwischen den beiden Bestandteilen erlaubt. Bestandteile, die nicht reagiert haben, werden dann entfernt (z. B. mittels Waschen) unter Bedingungen, sodass jegliche gebildeten Komplexe immobilisiert an der festen Phase verbleiben. Die Detektion der Komplexe kann mittels einer Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Z. B. kann der nicht-immobilisierte Bestandteil des Assays zuvor mit einer radioaktiven oder enzymatischen Markierung markiert werden und unter Verwendung angebrachter Mittel detektiert werden. Falls die nicht-immobilisierte Einheit nicht zuvor markiert wurde, wird ein indirektes Verfahren verwendet. Wenn z. B. die nicht-immobilisierte Einheit ein JNK3 Polypeptid ist, wird ein gegen JNK3 gerichteter Antikörper verwendet, um das gebundene Molekül zu detektieren und ein sekundärer, markierter Antikörper wird verwendet, um den gesamten Komplex zu detektieren.
Alternativ kann eine Reaktion in der flüssigen Phase durchgeführt werden, die Reaktionsprodukte von den Bestandteilen, die nicht reagiert haben, getrennt werden und Komplexe detektiert werden (z. B. unter Verwendung eines immobilisierten Antikörpers, der für ein JNK3 Protein spezifisch ist).
Zellbasierte Assays können verwendet werden um Verbindungen zu identifizieren, die mit JNK3 Proteinen interagieren. Zelllinien, die natürlicherweise solche Proteine exprimieren, oder gentechnisch verändert wurden, solche Proteine zu exprimieren (z. B. mittels Transfektion oder Transduktion mit JNK3 DNA) können verwendet werden. Z. B. können Testverbindungen an Zellkulturen verabreicht werden und die Phosphorylierung von ATF2 oder c-Jun gemessen werden wie infra beschrieben. Eine Erniedrigung in der Menge der Phosphorylierung eines JNK3 Substrats in der Gegenwart der Testverbindung verglichen mit Kontrollen, die nicht die Testverbindung enthalten, zeigt an, dass die Testverbindung ein Inhibitor der JNK3 Aktivität ist.
Inhibitoren der JNK3 Expression, die auf den JNK3 Promotor wirken, können unter Verwendung eines chimären Gens, in welches genomische Sequenzen einschließlich des JNK3 Promotors an einen Reporter fusioniert sind, z. B. die Glühwürmchenluziferase, identifiziert werden. Kultivierte Zellen (einschließlich Neuronen), die mit dieser DNA transformiert sind, werden auf die Expression der Luziferase-Aktivität hin gescreent. Verbindungen, die die Luziferase-Aktivität in diesem Hochdurchsatzassay inhibieren, können mittels direkter Messung des endogenen JNK3 Proteins (mittels Western Blotting) und JNK3 mRNA (mittels Northern Blotting) unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind (z. B. siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1994), bestätigt werden.
Kandidaten für inhibitorische Verbindungen können weiterhin in Zellen oder Zellkulturen sowie in Tiermodellen getestet werden. Z. B. werden Zellen, die JNK3 exprimieren, mit einer Testverbindung inkubiert. Lysate werden von behandelten und unbehandelten Zellen hergestellt und gemäß bekannter Verfahren einem Western Blot unterzogen. Die Blots werden dann mit Antikörpern, die spezifisch für JNK3 sind, sondiert. Eine Abnahme in der Menge der JNK3 Expression in Kulturen, die mit der Testverbindung behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen zeigt an, dass die Testverbindung ein Kandidat für einen Wirkstoff ist, um Störungen, die mit JNK3 Expression assoziiert sind, zu behandeln.
Assays auf Verbindungen, die mit JNK3/JNK3 Substrat-Interaktionen interferieren Moleküle, die die Interaktion zwischen JNK3 und seinen Substraten stören, können unter Verwendung von Assays identifiziert werden, die Protein-Protein Interaktionen detektieren. Z. B. detektiert das Hefe Two-Hybrid Verfahren Protein-Interaktionen in vivo. Ein in vitro Assay ist jedoch bevorzugt, die Hefezellwand nicht permeabel für die Kandidatenmoleküle sein kann. Ein Beispiel für einen in vitro Assay für solche Testmoleküle, die die Interaktion zwischen JNKC3 und einem Substrat stören, schließt die Verwendung von immobilisiertem JNK3 oder immobilisiertem Substrat (z. B. c-Jun) und Inkubation des immobilisierten Bestandteils mit Zelllysaten oder aufgereinigten Proteinen in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Testmoleküls ein. Im Allgemeinen wird das Testmolekül im Bereich eines 100fachen molaren Überschusses über den am meisten vorhandenen Bestandteil (z. B. den Bestandteil, der immobilisiert oder in Lösung ist) getestet. Wenn für das Testmolekül vorhergesagt wurde, dass es mit dem immobilisierten Bestandteil des Assays interagiert, so kann es mit diesem Bestandteil vorinkubiert werden, bevor das Zelllysat oder das aufgereinigte Protein hinzugegeben wird. Nach dem Wegwaschen von ungebundenem Material werden die gebundenen Proteine mit Antikörpern (z. B. ELISA oder Western Blot), oder mittels der Verwendung von markierter Proteine (z. B. radioaktiv oder fluoreszent) unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, detektiert. Testmoleküle, die die Menge an JNK3 gebundenem Substrat vermindern, werden somit als Moleküle identifiziert, die mit JNK3/JNK3 Substratwechselwirkungen interferieren.
Assays nach Verbindungen, die die Effekte von JNK3 in vivo verbessern
Verbindungen, die wie oben beschrieben identifiziert wurden, oder andere Kandidatenverbindungen, die JNK3 Aktivität in vitro inhibieren, können nützlich sein, um Störungen zu behandeln, die JNK3 Aktivität involvieren. Diese Verbindungen können in in vivo Assays getestet werden, z. B. in Tiermodellen für Störungen, die JNK3 Aktivität involvieren. Z. B. sind transgene Mausmodelle für ALS beschrieben worden (Bruijn und Cleveland, Neuropathol. Appl. Neurobiol. 22:373-387, 1996; Dal Canto und Gurney, Brain Res. 676: 25-40, 1995; Cleveland et al., Neurology 47:Suppl 2, S54-61), sowie auch transgene Modelle für Alzheimer beschrieben worden sind, wie die PDAPP Maus und andere (z. B. siehe Loring et al., Neurobiol. Aging 17:173-182, 1996). MPTP (1-Mehtyl-4-Phenyll-1,2,3,6-Tetrahydropyridin)- induzierte dopaminergische Neurotoxizität wurde als Modell für Parkinson in Nagetieren und nicht-humanen Primaten verwendet (z. B. Przedborski et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 93:4565-4571, 1996).
Testverbindungen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie die JNK3 Aktivität inhibieren, werden an Tiere verabreicht, z. B. wie oben beschrieben, die als Modelle für die verschiedenen Krankheitsbeispiele dienen. Behandelte Tiere werden dann einem Assay auf die Inhibition von JNK3 Aktivität hin unterzogen. Solche Assays können indirekt oder folgernd sein, z. B. zeigt eine verbesserte Gesundheit oder ein Überleben des Tiers die Wirksamkeit einer Testverbindung an. Assays können auch direkt sein, z. B. kann eine Erniedrigung in der JNK3 oder c-Jun Expression mittels Northern Analyse von neuronalem Gewebe gemessen werden, das von einem Tier entnommen wurde, welches mit einer Testverbindung behandelt wurde. Eine Erniedrigung in der Menge von JNK3 mRNA, die in der Probe von dem behandelten Tier vorhanden ist im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen zeigt an, dass die Testverbindung die JNK3 Expression inhibiert. Eine Erniedrigung in der Menge von c-Jun zeigt an, dass die Testverbindung die JNK3 Expression oder Aktivität inhibiert.
Antisense Konstrukte und Therapien
Behandlungskuren, die auf einem „Antisense" Ansatz basieren, involvieren das Design von Oligonukleotiden (entweder DNA oder RNA), die komplementär zu JNK3 mRNA's sind. Diese Oligonukleotide binden an die komplementären mRNA Transkripte und verhindern die Translation. Eine absolute Komplementarität ist nicht nötig, obwohl diese bevorzugt ist. Eine Sequenz, die „komplementär" zu einem Teil einer RNA ist, wie hierin verwendet, ist eine Sequenz, die ausreichend komplementär ist, um fähig zu sein, mit der RNA zu hybridisieren und eine stabile Duplex zu bilden; im Fall von doppelsträngigen Antisense-Nukleinsäuren kann ein einzelner Strang der Duplex DNA getestet werden, oder die Bildung einer Triplex kann geprüft werden. Die Fähigkeit zur Hybridisierung wird sowohl von der Höhe der Komplementarität als auch der Länge der Antisense-Nukleinsäure abhängen. Im Allgemeinen gilt, dass je länger die hybridisierende Nukleinsäure ist, desto mehr Basenfehlpaarungen mit einer RNA sie enthalten kann und immer noch eine stabile Duplex bilden kann (oder ggfs. Triplex). Der Fachmann kann unter Verwendung von Standardprozeduren ein zulässiges Ausmaß an Fehlpaarungen sicherstellen, um den Schmelzpunkt des hybridisierten Komplexes zu bestimmen.
Oligonukleotide, die komplementär zu dem 5' Ende der Boten-RNA sind, z. B. der 5' untranslatierten Sequenz bis hin zu und einschließlich des AUG Startkodons, sind im Allgemeinen am wirkungsvollsten für die Inhibition der Translation. Jedoch wurde auch für Sequenzen, die komplementär zu den 3' untranslatierten Sequenzen von mRNA's sind gezeigt, dass diese wirkungsvoll für die Inhibition der Translation sind (Wagner, Nature, 372:333, 1984). Daher könnten Oligonukleotide, die komplementär zu den 5' oder 3' nicht-translatierten, nicht-kodierenden Regionen von JNK3 sind, in einem Antisense Ansatz verwendet werden, um die Translation des endogenen humanen Homologes der JNK3 mRNA zu inhibieren. Oligonukleotide, die komplementär zu der 5' untranslatierten Region der mRNA sind, sollten das Kompliment des AUG Startkodons enthalten. Beispiele für Kandidaten-Antisense-Sequenzen für die 5' und 3' Regionen sind: 5'-AAG AAA TGG AGG CTC ATA AAT ACC ACA GCT-3' (SEQ ID NO: 17) bzw. 5'-ATT GGA AGA AGA CCA AAG CAA GAG CAA CTA-3' (SEQ ID NO: 18).
Obwohl Antisense-Nukleotide, die komplementär zu der kodierenden Region eines JNK3 Gens sind, verwendet werden könnten, sind diese, die komplementär zu den transkribierten untranslatierten Regionen sind, am meisten bevorzugt. Beispiele für diesen Typ von Kandidaten-Sequenzen sind: 5'-TAA GTA AGT AGT GCT GTA TGA ATA CAG ACA-3 (SEQ ID NO: 19) und 5'-TAC TGG CAA TAT ATT ACA GAT GGG TTT ATG-3' (SEQ ID NO: 20).
Anisense-Oligonukleotide, die komplementär zu mRNA kodierenden Regionen sind, sind weniger wirkungsvolle Inhibitoren der Translation, können jedoch in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden. Egal ob sie entworfen sind, an die 5', 3' oder kodierende Region einer JNK3 mRNA zu hybridisieren, sollten Antisense-Nukleinsäuren wenigstens sechs Nukleotide Länge haben und sind vorzugsweise Oligonukleotide, die eine Länge im Bereich von 60 bis ungefähr 50 Nukleotiden haben. In spezifischen Aspekten ist das Oligonukleotid wenigstens 10 Nukleotide oder wenigstens 50 Nukleotide lang. Unabhängig von der Wahl der Zielsequenz werden in vitro Studien gewöhnlich als erstes durchgeführt, um die Fähigkeit von einem Antisense-Nukleotid zu bestimmen, die Genexpression zu inhibieren. Im Allgemeinen verwenden diese Studienkontrolle, die zwischen Antisense-Geninhibition und nichtspezifischen biologischen Effekten der Oligonukleotide unterscheiden. In diesen Studien werden die Level der Ziel RNA oder des Zielproteins gewöhnlich mit denen von einer internen Kontroll RNA oder einem internen Kontrollprotein verglichen. Zusätzlich ist es vorgesehen, dass die Resultate, die unter Verwendung des Antisense-Oligonukleotides erhalten wurden, mit denen verglichen werden, die unter Verwendung des Kontoll-Oligonukleotides erhalten wurden. Es ist bevorzugt, dass das Kontroll-Oligonukleotid ungefähr die selbe Länge hat, wie das Test-Oligonukleotid und dass die Nukleotidsequenz des Oligonukleotides nicht mehr als nötig von der Antisense-Sequenz abweicht, um eine spezifische Hybridisierung zu der Zielsequenz zu verhindern.
Die Oligonukleotide können DNA oder RNA oder chimärische Mixturen oder Derivate oder modifizierte Versionen davon sein, einzelsträngig oder doppelsträngig. Das Oligonukleotid kann modifiziert sein an der Baseneinheit, der Zuckereinheit oder dem Phosphatrückrad, z. B. um die Stabilität des Moleküls oder der Hybridisierung zu verbessern. Das Oligonukleotid kann andere angehängte Gruppen beinhalten, wie Peptide (z. B. für das Targeting von Wirtszellrezeptoren in vivo) oder Agentien, die den Transport über die Zellmembran ermöglichen (wie beschrieben z. B. in Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553, 1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648, 1987; PCT Publikations Nr. WO 88/09810 ) oder der Blut-Hirn-Schranke (siehe z. B. PCT Publikations Nr. WO 89/10134 ) oder hybridisierungs-getriggerte Spaltungsagentien (siehe z. B. Krol et al., BioTechniques 6:958, 1988) oder interkalierende Agentien (siehe z. B. Zon, Pharm. Res. 5:539, 1988). Zu diesem Zweck können die Oligonukleotide an ein anderes Molekül konjugiert sein, z. B. ein Peptid, ein hybridisierungs-getriggertes quervernetzendes Agents, ein Transportagents oder ein hybridisierungs-getriggertes Spaltungsagents.
Das Antisense-Oligonukleotid kann wenigstens eine modifizierte Baseneinheit enthalten die ausgewählt ist aus der Gruppe einschließlich aber nicht limitiert auf 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Chlorouracil, 5-Iodouracil, Hypoxanthin, Xantin, 4-Acetylcytonsin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl) Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-Thiouridin, 5-Carboxymethyl-Aminomehtyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-Thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-Isopentenyladenin, Uracil-5-Oxyacetic Acid (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-Theouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methylurecil, Uracil-5-Oxyacetic Acid Methylester, Uracil-5-Oxyacetic Acid (v), 5-Methyl-2-Thiouracil, 2-(3-Amino-3-N-2-Carboxypropyl) Uracil, (acp3)w, und 2,6-Diaminopurin.
Das Antisense-Oligonukleotid kann ebenfalls wenigstens eine modifizierte Zuckereinheit enthalten, ausgewählt aus der Gruppe einschließend aber nicht limitiert auf Arabinnose, 2-Fluoroarabinose, Xylulose und Hexose.
Das Antisense-Oligonukleotid kann auch wenigstens ein modifiziertes Phosphatrückgrat enthalten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Phosphorothioat, einem Phosphorodithioat, einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phosphordiamidat, einem Methylphosphonat, einem Alkyl-Phosphotriester und einem Formacetal oder ein Analog von irgend einem dieser Rückgrate.
Das Antisense-Oligonukleotid kann ein α-anomerisches Oligonukleotid beinhalten. Ein α-anomerisches Oligonukleotid bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in welchen, entgegengesetzt zu den gewöhnlichen β-Einheiten, die Stränge parallel zueinander laufen (Gautier et al., Nucl. Acids. Res. 15:6625, 1987). Das Oligonukleotid ist ein 2-O-Methylribonukleotid (Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15:6131, 1987) oder ein chimärisches RNA-DNA Analog (Inoue et al., FEHS Lett. 215:327, 1987).
Die Antisense-Oligonukleotide der Erfindung können mittels Standardverfahren, die in der Technik bekannt sind, synthetisiert werden, z. B. unter Verwendung eines automatisierten DNA Synthesizers (solche sind kommerziell erhältlich von Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Beispielsweise können Phosphorothioat Oligonukleotide nach dem Verfahren von Stein et al. (Nucl. Acids Res. 16:3209, 1988) synthetisiert werden und Methylphosphonat Oligonukleotide können unter Verwendung von Glaspolymerträgern mit kontrollierten Poren hergestellt werden (Sarin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448, 1988).
Die Antisense-Moleküle sollten an Zellen verabreicht werden, die JNK3 Proteine in vivo exprimieren. Eine Vielzahl von Verfahren ist für die Verabreichung von Antisense DNA oder RNA an Zellen entwickelt worden; z. B. können Antisense-Moleküle direkt in die Gewebsstelle injiziert werden oder modifizierte Antisense-Moleküle, die designed sind auf die gewünschten Zellen abzuzielen (z. B. Antisense gebunden an Peptide oder Antikörper, die spezifisch Rezeptoren oder Antigene binden, die auf der Zielzelloberfläche exprimiert werden) können systemisch verabreicht werden.
Es ist jedoch häufig schwierig, intrazelluläre Konzentration des Antisense-Moleküls zu erreichen, die ausreichend sind, die Translation von endogenen mRNA's zu unterdrücken. Daher kann ein Ansatz verwendet werden, in dem ein rekombinantes DNA Konstrukt ein Antisense-Oligonukleotid umfasst, welches unter die Kontrolle eines starken pol III oder pol II Promotors gestellt ist. Die Verwendung von solchen Konstrukten, um Zielzellen in einem Patienten zu transfizieren, wird in der Transkription von ausreichenden Mengen von einzelsträngigen RNA's resultieren, die komplementäre Basenpaare mit den endogenen JNK3 Transkripten bilden werden und damit die Translation von dieser mRNA verhindern werden. Z. B. kann ein Vektor in vivo eingebracht werden, sodass er von einer Zelle aufgenommen wird und die Transkription einer Antisense RNA leitet. Ein solcher Vektor kann episomal bleiben oder chromosomal integriert werden, so lange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense RNA zu produzieren.
Solche Vektoren können mittels Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie, die dem Fachmann bekannt sind. Die Vektoren können Plasmidvektoren sein, viral sein oder andere dem Fachmann bekannten, die für die Replikation und Expression in Säugetierzellen verwendet werden. Die Expression der Sequenz, die für die Antisense RNA enkodiert, kann mittels jeglichen Promotors, von dem dem Fachmann bekannt ist, dass dieser in Säugetieren, bevorzugt humanen Zellen fungiert, erreicht werden. Solche Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Geeignete Promotoren schließen ein, sind aber nicht limitiert auf: SV40 Early Promoter Region (Bernoist et al., Nature 290:304, 1981); den Promotor, der in dem 3' Long Terminal Repeat des Rous Sarcoma Virus enthalten ist (Yamamoto et al., Cell 22:787-797, 1988); den Herpes Thymidin Kinase Promotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441, 1981); und die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein Gens (Brinster et al., Nature 296:39, 1988). Die Konstrukte können ebenfalls auf einem künstlichen Chromosom enthalten sein (z. B. künstliche Säugetierchromosomen; MAC; Harrington et al., Nature Genet. 15:345-355, 1997).
Die Produktion eines JNK3 Antisense Nukleinsäuremoleküls mittels eines jeglichen gentherapeutischen Ansatzes, der oben beschrieben ist, resultiert in einem zellulären Level von JNK3 Proteinen, welches weniger ist, als die Menge, die in einem unbehandelten Individuum vorhanden ist.
Ribozyme
Ribozymmoleküle, die entworfen sind, um katalytisch JNK3 mRNA's zu spalten, können ebenfalls verwendet werden, um die Translation von diesen mRNA's und die Expression von JNK3 mRNA's zu verhindern (siehe z. B. PCT Publikation WO90/11364; Saraver et al., Science 247:1222, 1990) Während verschiedene Ribozyme, die die mRNA an Stellen spezifischen Erkennungssequenzen spalten, verwendet werden können, um spezifische mRNA's zu zerstören, ist die Verwendung von Hammerkopfribozymen bevorzugt. Hammerkopfribozyme spalten mRNA's an Stellen, die durch flankierende Regionen vorgegeben werden, die komplementäre Basenpaare mit der Ziel mRNA bilden. Die einzige Voraussetzung ist, dass die Ziel mRNA die folgende Sequenz von zwei Basen hat: 5'-UG-3'. Die Konstruktion und Produktion von Hammerkopfribozymen ist dem Fachmann wohl bekannt (Haseloff et al., Nature 334:585, 1988). Vorzugsweise ist das Ribozym so gestaltet, dass die Spaltungserkennungsstelle in der Nähe des 5' Endes der JNK3 mRNA lokalisiert ist, d. h. um die Effizienz zu erhöhen und die intrazelluläre Ansammlung von nicht-funktionalen mRNA Transkripten zu minimieren.
Beispiele für potentielle Ribozymstellen in humanen JNK3 schließen 5'-UG-3' Stellen ein, die mit dem Initiator Methionin Codon an, z. B. in humanem JNK3, ungefähr den Nukleotiden 224-226 dem Codon für eine stromabwärts potentielle Initiationsstelle (Nukleotide 338-340) und zusätzlichen Codons in der kodierenden Region, einschließlich Nukleotide 698-670, 740-742 und 935-937, korrespondieren.
Die Ribozyme der vorliegenden Erfindung schließen ebenfalls RNA Endoribonukleasen ein (nachstehend „Chech-Typ Ribozyme") wie die, die natürlich in Tetrahymena Thermophila (bekannt als die IVS oder L-19 IVS RNA) vorkommt und die umfangreich durch Chech und seine Mitarbeiter beschrieben wurde (Zaug et al., Science 224:574, 1984; Zaug et al., Science, 231:470, 1986; Zug et al., Nature 324:429, 1986; PCT Anmeldung Nr. WO88/04300 und Been et al., Cell 47:207, 1986). Die Chech-Typ Ribozyme haben eine acht Basenpaar Sequenz, die mit einer Ziel RNA Sequenz hybridisiert, wonach die Spaltung der Ziel RNA stattfindet. Die Erfindung schließt jene Chech-Typ Ribozyme ein, welche acht Basenpaar aktive Stellensequenzen anziehen, die in JNK3 Proteinen vorhanden sind.
Wie beim Antisense-Ansatz können die Ribozyme aus modifizierten Oligonukleotiden bestehen (z. B. für die verbesserte Stabilität oder das verbesserte Targeting) und sollten an Zellen verabreicht werden, die in vivo ein JNK3 Gen exprimieren, z. B. das Gehirn und die Wirbelsäule. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verabreichung involviert die Verwendung eines DNA Konstrukts „kodierend" für das Ribozym unter der Kontrolle eines starken konstitutiven pol III oder pol II Promotors, so dass die transfizierten Zellen ausreichende Mengen des Ribozyms produzieren werden, um die endogenen JNK3 mRNA's zu zerstören und die Translation zu verhindern. Da Ribozyme im Gegensatz zu Antisense-Molekülen katalytisch sind, ist eine niedrigere intrazelluläre Konzentration für die Wirksamkeit nötig.
Für jeden der obigen Ansätze wird das therapeutische JNK3 Antisense oder Ribozym Nukleinsäuremolekülkonstrukt, vorzugsweise direkt in der Zielregion angewendet (z. B. der fokalen Stelle der Aktivität bei einem Anfallsleiden, der Hippokampus bei Alzheimer, der Substantia Nigra in Patienten mit Parkinson), es kann jedoch auch an Gewebe in der Nachbarschaft der Zielregion verabreicht werden, oder sogar an ein Blutgefäß, das die Zielregion versorgt.
Für die Gentherapie wird die Antisene oder Ribozym JNK3 Expression mittels jeglichem geeigneten Promotor kontrolliert (z. B. dem humanen Zytomegalovirus, Simian Virus 40 oder Metallothionein Promotoren) und sie wird mittels jeglichem gewünschten säugetierregulatorischem Element reguliert. Z. B. können, wenn dies gewünscht ist, Enhancer, die eine bevorzugte Genexpression in Zellen unter exitotoxischer Induktion kontrollieren, verwendet werden, um die Antisense JNK3 Expression in einem Patienten mit einem Anfallsleiden zu kontrollieren.
Die JNK3 Antisense oder Ribozymtherapie kann auch mittels direkter Verabreichung der Antisense JNK3 oder Ribozym RNA an die Zielregion bewerkstelligt werden. Diese mRNA kann mittels jeglicher Standardtechnik produziert und isoliert werden, sie ist jedoch am bequemsten mittels in vitro Transkription produzierbar, unter Verwendung einer Antisense JNK3 DNA unter der Kontrolle eines hochwirksamen Promotors (z. B. der T7 Promotor). Die Verabreichung von Antisense JNK3 RNA an Zielzellen wird mittels jeglichen Verfahrens für die direkte Verabreichung von therapeutischen Verbindungen, die hierin beschreiben sind, durchgeführt.
Verfahren zur Behandlung von Störungen, die JNK3 Expression oder Aktivität involvieren
Die Erfindung umfasst weiterhin die Behandlung von Störungen, besonders in Säugetieren wie Menschen, in denen JNK3 eine schädigende Rolle spielt. Eine Anzahl von Störungen des Nervensystems, die Exitotoxizität involvieren, wie Anfallsleiden (z. B. Epilepsie), Demenz, wie neurogenerative Störungen (z. B. Alzheimer, Huntington), zerebrovaskulare Störungen wie Ischemie, motorneuronale Krankheit (einschließlich ALS), Verletzungen, die durch extreme Hitze oder Kälte verursacht wurden, Traumen (z. B. Bestrahlung, Verletzungen der Wirbelsäule, Druck und ionisches Ungleichgewicht), metabolisches Ungleichgewicht (z. B. Hypoglychemie) Parkinson können mit den hier beschriebenen Verfahren behandelt werden. Ohne die Erfindung durch eine Bindung an eine bestimmt Theorie zu limitieren, ist eine bedeutende Zahl von neurologischen Störungen wenigstens teilweise der Excitotoxizität zurechenbar, die über den JNK3 Signalweg vermittelt wird. Daher sind Inhibitoren dieses Signalwegs, die wie oben beschrieben identifiziert wurden, nützlich zur Behandlung von Störungen, die Excitotoxizität involvieren.
Die Therapie kann ausgelegt sein, das Level an endogener JNK3 Genexpression zu reduzieren, z. B. unter Verwendung von Antisense oder Ribozymansätzen, um die Translation von einer JNK mRNA zu inhibieren oder zu verhindern. Triele Helix Ansätze um die Transkription des Gens zu verhindern; oder gezielte homologe Rekombination um ein Gen oder seinen endogenen Promotor zu inaktivieren oder „auszuknocken". Die Antisense, Ribozym oder DNA Konstrukte, die hierin beschrieben werden, können direkt an die Stelle verabreicht werden, die die Zielzellen enthält; z. B. bestimmte Regionen des Gehirns oder der Wirbelsäule. Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, die JNK3 oder ein JNK3 Substrat erkennen und die modifiziert wurden exprimiert zu werden oder anderweitig in die Zelle zu gelangen, können ebenfalls therapeutisch verwendet werden.
Wirksame Dosis
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der Verbindungen der Erfindung, z. B. Verbindungen, die die JNK3 Expression oder Aktivität modulieren, können mittels pharmazeutischer Standardprozeduren bestimmt werden unter entweder Verwendung von Zellen in Kultur oder Versuchstieren, um den LD₅₀ (die Dosis, die lethal für 50 % der Population) und den ED₅₀ (die Dosis, die therapeutisch wirksam für 50 % der Population ist) bestimmt. Das Verhältnis der Dosis zwischen toxischem und therapeutischem Effekt ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis von LD₅₀/ED₅₀ ausgedruckt werden. Polypeptide oder andere Verbindungen, die große therapeutische Indexes besitzen, sind bevorzugt. Obwohl Verbindungen verwendet werden können, die toxische Nebeneffekte aufweisen, sollte darauf geachtet werden, dass ein Verabreichungssystem entwickelt wird, das solche Verbindungen zu der Stelle des betroffenen Gewebes leitet, um eine potentielle Schädigung von unbetroffenen Zellen zu minimieren und damit die Nebeneffekte zu reduzieren.
Die Daten, die aus den Zellkultur Assays und den Tierstudien erhalten wurden, können bei der Formulierung eines Dosierungsbereichs für die Verwendung in Menschen verwendet werden. Die Dosierung von solchen Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von zirkulierenden Konzentrationen, die den ED₅₀ mit wenig oder keiner Toxizität einschließt. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereiches variieren, abhängig von der Dosierungsform die verwendet wird und der Verabreichungsroute, die verwendet wird. Für jegliche im Verfahren der Erfindung verwendeten Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis eingangs aus Zellkultur Assays geschätzt werden. Eine Dosierung kann in Tiermodellen ausgestaltet werden, um einen Konzentrationsbereich im zirkulierenden Plasma zu erhalten, der den IC₅₀ einschließt (d. h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Inhibition der Symptome erreicht) wie in der Zellkultur bestimmt. Solche Informationen können verwendet werden, um nützliche Dosen für Menschen genauer zu bestimmen. Die Plasmalevels können z. B. mittels High Performance Liquid Chromatography gemessen werden.
Formulierungen und Verwendung
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können auf gebräuchliche Art und Weise unter Verwendung von einem oder mehrerer physiologisch verträglicher Träger- oder Hilfsstoffe formuliert werden.
Daher können die Verbindungen und ihre physiologisch verträglichen Salze und Solvate für die Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation (entweder durch den Mund oder die Nase) oder orale, buccale, parenterale oder rektale Verabreichung formuliert werden.
Für die orale Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form annehmen von, z. B., Tabletten oder Kapseln, die auf konventionelle Weise hergestellt wurden, mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen wie Bindeagentien (z. B. prägelatinisierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropyl Methylzellulose); Füllstoffen (z. B. Laktose, mikrokristalline Zellulose oder Kalziumhydrogenphosphat); Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talkum oder Kieselerde); sich zersetzende Stoffe (z. B. Kartoffelstärke oder Natirum Stärkeglycolat); oder Befeuchtungsagentien (z. B. Natriumlaurylsulfat). Die Tabletten können mittels in der Kunst wohl bekannten Verfahren beschichtet werden. Flüssige Präparate für die orale Verabreichung können die Form annehmen von z. B. Lösungen, Sirup oder Suspensionen, oder sie können als ein Trockenprodukt vorliegen, für die Zusammensetzung mit Wasser oder mit einem anderen geeigneten Transportstoff vor der Verwendung. Solche flüssigen Präparate können mittels konventioneller Methoden hergestellt werden mit pharmazeutisch verträglichen Zusatzstoffen wie Stellmitteln (z. B. Sorbitolsirup, Zellulosederivative oder hydrierte essbare Fette); emulgierende Agentien (z. B. Lecithin oder Acacia); nicht-wässrige Bindemittel (z. B. Mandelöl, ölige Ester, Ethylalkohol oder fraktionierte Gemüseöle); und Konservierungsstoffe (z. B. Methyl oder Propyl-p-Hydroxybenzoate oder Sorbinsäure). Die Präparationen können auch Puffersalze, Aromastoffe, Farbstoffe und Süßstoffe enthalten, wie angemessen. Präparationen für die orale Verabreichung können geeignet formuliert werden, um eine kontrollierte Abgabe der aktiven Verbindung zu erreichen.
Für die buccale Verabreichung können die Verbindungen die Form von Tabletten oder Pastillen annehmen, die auf konventionelle Art und Weise hergestellt werden.
Die bevorzugten Verfahren für die Verabreichung der Zusammensetzungen der Erfindung sind die direkte Zuführung der Verbindungen an das zentrale Nervensystem, vorzugsweise an das Gehirn, insbesondere nah oder direkt an die Stelle der Störung, z. B. den Hippokampus im Fall von Alzheimer, die Substantia Nigra im Fall von Parkinson und die fokale Stelle für Anfallsleiden. Dem entsprechend kann die Verabreichung in ein Ventrikel, intrathekal oder intrazerebral ventrikulär erfolgen. Z. B. kann ein Omaya Reservoir-Shunt mit In-Line Filter chirurgisch in den Zisternenraum platziert werden. Eine therapeutische Verbindung in einem angemessenen Trägerstoff (z. B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung) wird mittels Injektion auf vorgeschriebener Grundlage in den Shunt eingeflöst.
Für die Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung bequemerweise in Form eines Aerosolsprays aus unter Druck stehenden Verpackungen oder eines Zerstäubers unter Verwendung eines geeigneten Treibgases z. B. Dichlorodifluoromethan, Trichlorofluoromethan, Dichlorotetrafluoroethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas abgegeben. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit durch die Bereitstellung eines Ventils bestimmt werden, um eine gemessene Menge abzugeben. Kapseln und Patronen aus z. B. Gelatine für die Verwendung in einem Inhalator oder Insuflator können formuliert werden, eine Pudermix der Verbindung und einer geeigneten pudrigen Basis, wie Laktose oder Stärke, zu enthalten.
Die Verbindungen können formuliert werden für die parenterale Verabreichung mittels Injektion, z. B. mittels Bolusinjektion oder kontinuierlicher Infusion. Formulierungen für die Injektion können in Form von Einheitsdosierungen zur Verfügung gestellt werden, z. B. in Ampullen oder in Mehrfachdosenbehältern mit einem zugefügten Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können Formen annehmen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Bindemitteln und können formulierende Agentien wie Stellmittel, stabilisierende und/oder dispergierende Agentien. Alternativ können die aktiven Bestandteile in Puderform vorliegen für die Zusammensetzung mit einem geeigneten Trägerstoff vor der Verwendung, z. B. sterilem pyrogen-freiem Wasser.
Die Verbindungen können auch in rektalen Zusammensetzungen formuliert werden, wie Zäpfchen oder Einbehaltungseinläufen, z. B. enthaltend konventionelle suppositorische Grundstoffe wie Kakaobutter oder andere Glycerine.
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotpräparationen formuliert werden. Solche langwirkenden Formulierungen können mittels Implantation verabreicht werden (z. B. subkutan oder intramuskulär) oder mittels intramuskulärer Injektion. Daher können z. B. die Verbindungen formuliert werden mit geeigneten polymerischen oder hydrophoben Materialien (z. B. als eine Emulsion in einem geeigneten Öl) oder Ionenaustauschharzen, oder als schlechtlösliche Derivative, z. B. als ein schlechtlösliches Salz.
Wenn gewünscht, können die Zusammensetzungen in einer Packung oder einem Spender zur Verfügung gestellt werden, die oder der ein oder mehrere Einheitsdosierungen enthält, die den aktiven Bestandteil enthalten. Die Packung kann z. B. Metall oder Plastikfolie umfassen, wie eine Blisterverpackung. Die Packung oder der Spender können zusätzlich Anleitungen für die Verabreichung enthalten.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können auch einen Trägerstoff oder ein Hilfsmittel enthalten, von denen dem Fachmann viele bekannt sind. Hilfsstoffe, die verwendet werden können, schließen ein Puffer (z. B. Zitratpuffer, Phosphatpuffer, Acetatpuffer und Bikarbonatpuffer), Aminosäuren, Harnstoff, Alkohole, Ascorbinsäure, Phospholipide, Proteine (z. B. Serumalbumin) EDTA, Natriumchlorid, Liposomen, Mannitol, Sorbitol und Glycerin. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Polypeptide, Antikörper oder modulatorischen Verbindungen können mittels jeglicher Standardverabreichungsroute verabreicht werden. Z. B. kann die Verabreichung parenteral, intravenös, subkutan, intramuskulär, intrakranial, intraorbital, ophtalmisch, intraventrikulär, intrakapsulär, intraspinal, intrazisternal, intaperitoneal, transmukosal oder oral erfolgen. Die modulatorische Verbindung kann entsprechend der korrespondierenden Route der Verabreichung auf verschiedenen Wegen formuliert werden. Z. B. können flüssige Lösungen für die Aufnahme oder Injektion hergestellt werden; Gels oder Puder können für die Aufnahmeinhalation oder topische Anwendung hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind gut bekannt und können z. B. in „Remington's Pharmaceutical Sciences" gefunden werden. Es wird erwartet, dass besonders nützliche Routen der Verabreichung die nasale oder direkte Infusion in das zentrale Nervensystem sind.
BEISPIELE
Beispiel 1. JNK3 Expression
Eine von der 5' Region der Maus JNK3 cDNA abgeleitete 351-bp Sequenz (Nukleotide 62-412) wurde mit [³²P] mittels zufälligem Priming markiert und als Sonde verwendet, um die Gewebeexpressionsmuster des JNK3 Gens zu bestimmen. Eine Northern Blot Analyse wurde unter Verwendung von Standardverfahren mit 2 mg Proben von Poly(A)⁺mRNA durchgeführt, die aus Hoden, Niere, Skelettmuskulatur, Leber, Lunge, Milz, Hirn und Herz isoliert wurde. Alle Northern Blots wurden mit [³²P]-markiertem β-Aktiv als Kontrolle sondiert, um das Laden von ähnlichen Mengen von RNA in jeder Spur sicherzustellen. Ein starkes Signal, korrespondierend zu einem 2.7 kb Transkript, sowie ein schwaches Signal, korrespondierend zu einem 7.0 kb Transkript, wurden im Gehirn detektiert. Ein schwaches Signal korrespondierend zu einem 2.7 kb Transkript wurde auch im Herzen detektiert. Ein Signal korrespondierend zu einem 2.4 kb Transkript wurde in den Hoden detektiert. JNK3 Expression wurde in keinen anderen untersuchten Geweben detektiert.
In situ Hybridisierungsanalyse hat darauf hingewiesen, dass JNK3 in vielen Regionen des Gehirns exprimiert ist (Martin et al., supra). Totale RNA (10 mg) wurde daher aus unterschiedlichen Regionen des Mäusehirns isoliert (Cerebellum, cerebraler Cortex, Hippocampus, Mesenzeffalon, Thalamus und Stammhirn) unter Verwendung des TRIzol Reagents (Gibco-BRL) und im Northern Blot unter Verwendung der JNK3 Sonde wie oben beschrieben, analysiert. Ein Signal korrespondierend zu einem 2.7 kb Transkript wurde in allen Lektionen des untersuchten Hirns detektiert und war im Hippokampus am meisten vorhanden.
Beispiel 2. Gezielte Disruption des JNK3 Gens
Um JNK3-defiziente Mäuse zu erzeugen, wurde ein Targeting-Vektor erzeugt, um ein internes 4 kb Msc1-Spe1 JNK3 genomisches Fragment mit einer PGKneo Kassette zu ersetzen. Eine Karte des JNK3 Gens, des JNK3 Tarketing Vektors und der vorhergesagten Struktur des mutierten JNK3 Gens sind diagrammatisch in 6 gezeigt. Die Restriktionsenzymstellen sind angegeben (B, BamHI; Hp, HpaI; M, MscI; Nco, NcoI, R, EcoRI; Spe, SpeI). Ein 10-kb NotI-EcoRI JNK3 Fragment (die NotI Stelle war vom Vektor abgeleitet) wurde aus einer λ FixII Phagenbibliothek eines 129/Sv Mäusestamms (Stratagene Inc.) kloniert. Der Targeting Vektor wurde mittels Insertion eines 4.0 kb MscI Fragments vom 5' Ende des JNK3 genomischen Fragments, einer 1.6 kb PGK-Neokassette (Negishi et al., Nature 376:435-438, 1995) und eines 1.8 kb SpeI-NcoI Fragments des 3' Endes des JNK3 Fragments in den pBluescript KS Vektor (Stratagene, Inc.) unter Verwendung von entsprechenden Linkern konstruiert. Der Targeting Vektor enthält eine 2.6-kb PGK tk Kassette (Negishi et al., supra) der das 5' Ende der JNK3 genomischen Sequenz für die negative Selektion von mutanten ES Zellen flankiert (Mansour et al., Nature 336:348-352, 1988). Die durch den Targeting Vektor im JNK3 Gen ersetzte Region umfasst 1 ½ Exons, die die Aminosäuren 211-267 von JNK3 kodieren (wie in 5B gezeigt). Diese Region schließt das Tripeptid Dual Phosphorylierungsmotiv Thr-Pro-Tyr (TPY) ein, dass für die JNK Gruppe charakteristisch ist und für die Proteinkinase Aktivität erforderlich ist (Dèrijard et al., supra). Die zwei im JNK3 Lokus gezeigten schraffierten Boxen korrespondieren zu den Unterdomänen VIII und IX (kodierend die Aminosäurereste 189-267 im JNK3 Protein, das in 5B gezeigt ist) von JNK3.
Der Targeting Vektor wurde mit NotI linearisiert und in W9.5 embryonische Stamm (ES) Zellen elektroporiert. Genomische DNA von Transfektanten, die resistend gegenüber G418 (200 mg/ml) (Gibco, BRL) und Gancyclovir (2 mM) (Syntex, Palo Alto, CA) waren, wurden isoliert und mittels Southern Blot Analyse gescreent. Die Southern Blot Analyse von vier unabhängigen G418- und gancyclovir-resistenten Klonen ergab drei Klone, die das gewünschte homologe Rekombinationsereignis enthielten (Targetingfrequenz 2.9 %). Chimärische Mäuse wurden mittels Injektion dieser ES Zellen in C57BL/6 (B6) Mäuseblastozysten erzeugt.
Southern Blots von EcoRI-verdauter DNA, die von den Schwänzen dieser chimärischen Mäuse erhalten waren, wurden mit der radiomarkierten 351 bp JNK3 Sonde sondiert. Der EcoRI Verdau resultierte in einer 12 kb Bande, die zu dem Wildtyp (endogenes Allel) korrespondierte und einer 4.2 kb Bande, die zu der Mutante (zertrenntes Allel) korrespondierte.
Zwei Klone vermittelten die Keimbahnübertragung des zertrennten JNK3 Allels in die nächste Generation von Mäusen. Heterozygote (+/–) wurden untereinander gekreuzt, um homozygot mutante Mäuse (–/–) zu erzeugen, die mittels Southern Blot Analyse von genomischer DNA identifiziert wurden. Totale RNA, die aus Mäusehirn isoliert worden war, wurde mittels Nothern Blot Analyse untersucht. Der Blot wurde mit einer zufällig geprimten ³²p markierten Maus JNK3 cDNA Sonde sondiert, dann gestrippt und folgend mit Maus JNK1 und β-Aktin cDNA Sonden erneut sondiert. Das Haupt JNK3 Transkript im Hirn ist 2.7 kb und die JNK1 Transkripte im Mäusehirn sind 2.3 und 4.4 kb groß. Blots, die mit einer JNK3 cDNA Sonde hybridisiert wurden, detektierten Transkripte in Wildtyp (+/+) aber nicht in homozygoten Knockout (–/–) Mäusen.
Reverse Transriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) Analyse wurde verwendet um zu bestätigen, dass JNK Transkripte im Homozygoten JNK3 (–/–) Hirn abwesend waren. Eine JNK1 Sonde (447 bp) wurde aus Maushirn RNA mittels RT-PCT (Yang et al., supra) amplifiziert unter Verwendung der Amplimere 5'-GTGTGCAGCTTATGATGCTATTCTTGAA-3' (SEQ ID NO: 21) und 5'CGCGTCACCACATACGGAGTCATC-3' (SEQU ID NO:22). Die RT-PCR Detektion (Yang et al., supra) von JNK3 mRNA in Mausgewebe wurde mittels RT-PCR unter Verwendung der Amplimere: 5'-CTGGAGGAGTTCCAAGATGTCTACT-3' (SEQ ID NO: 23) und 5'-TGGAAAGAGCTTGGGGAAGGTGAG-3' (SEQU ID NO: 24) durchgeführt, um ein spezifisches 537 bp DNA Produkt zu erhalten. Aus Mäusehirn isolierte RNA wurde mit für HPRT spezifischen Primern als eine Kontrolle amplifiziert. Diese Experimente bestätigten die Abwesenheit von JNK3 Transkripten im homozygoten JNK3 (–/–) Hirn.
Proteinkinase Assays wurden durchgeführt um zu zeigen, dass JNK3 (–/–) Mäusehirn defizient für JNK3 Aktivität war. In diesen Experimenten wurde die JNK3 Kinase Aktivität in Hirnlysaten nach Immunodeletion von JNK1 und JNK2 mittels In-Gel Protein Kinase Assays unter Verwendung des Substrats GST-cJun (Dèrijard et al., supra) gemessen. Wenn murine hippokampale Lysate (30 μg) aus Wildtyp (+/+) und homozygoten Knockout (–/–) Hirnen im Assay untersucht wurden, wurden die 55 kD und 46 kD JNK3 Isoformen in Wildtyp aber nicht JNK3 (–/–) Mäusen detektiert, was bestätigt, dass JNK3 (–/–) Mäusehirn defizient für JNK3 Kinaseaktivität war. Zusammen demonstrieren diese Daten, dass die gezielte Disruption des JNK3 Gens in einem Null-allel resultierte.
Die JNK3 (–/–) Mäuse waren fruchtbar und von normaler Größe. Die histologlische Begutachtung einer Auswahl von Geweben zeigte keine offensichtliche Abnormalität bei Verwendung von Hematoxilin und Eosin (H&E) Färbung von Herz, Lunge, Thymus, Milz, Lymphknoten, Leber, Niere und Skelettmuskulatur. JNK3 (–/–) und Wildtyp Mäusehirne wurden mittels immunozytochemischer Analyse eines Pyramidyl neuronalen Markers (MAP-2), interneuronalen Markern Kalbindin und Parvalbumin, einem Astrozytenmarker (Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP; Hsu et al., J. Histochem. Cytochem. 29:577-580, 1981) und Nissl's Färber (Hsu et al., supra) untersucht. Diese Studien zeigten, dass JNK3 (–/–) Mäuse offensichtlich eine normale Entwicklung und strukturelle Organisation des Hirns haben. Eine vergleichbare Anzahl von motorischen Neuronen wurden im Nukleus des Gesichtsnervs in Wildtyp und JNK3 (–/–) Mäusen gefunden (2150-2300 Neuronen pro Nukleus am Tag 10 nach Geburt n = 4). Die Neuronen wurden anhand der Morphologie identifiziert und mittels eines doppelt blinden Assays von seriellen Sektionen durch die Gesichtsnerv Nuklei von Wildtyp und JNK3 (–/–) Mäusen gezählt. Daher besteht keine offensichtliche Abnormalität, einschließlich Zelltod, in der Entwicklung bei JNK3 (–/–) Mäusen.
Beispiel 3. JNK3 defiziente Mäuse sind gegenüber KA-induzierten Anfällen resistent
JNK3 (–/–) Mäusen und ihren Wildtyp Geschwistern aus gleichem Wurf wurde intraperitoneal (i.p.) 30 mg/kg KA injiziert um Anfälle zu induzieren. Ben-Ari, supra). In Wildtyp Mäusen induzierte die Verabreichung von KA zunächst „starre Anfälle" mit abnormaler Körperhaltung und schritt dann zu Kopfnicken („wet-dog shakes"), zittern der Vorderpfoten, rearing, Verlust des Gangbildes, und schließlich anhaltenden Krämpfen fort. Die Anfallsaktivitäten flauten typischerweise 1 Stunde nach Injektion ab. Wildtyp und heterozygote Mäuse entwickelten motorische Symptome von Anfällen, einschließlich rearing, nach 30-40 Minuten Postinjektion. Im Gegensatz dazu entwickelten die JNK3 (–/–) Mäuse viel mildere Symptome, die hauptsächlich „starre" Anfälle und gelegentlich myoklonischem Zittern bestanden. Bei dieser Dosis entwickelten JNK3 (–/–) Mäuse keine Grand Mal Anfälle und erholten sich viel schneller als die Wildtyp und heterozygoten Mäuse taten. JNK3 (–/–) Mäuse entwickelten Anfälle, die in ihrer Schwere denen von Wildtyp Mäusen vergleichbar waren, lediglich bei höheren Dosierungen von KA (45 mg/kg, i. p.). Bei dieser Dosis von KA starben jedoch mehr als 60 % der Wildtyp Mäuse durch anhaltende tonisch-klonische Krampfanfälle, während alle der JNK3 (–/–) Mäuse überlebten. Diese Resultate weisen darauf hin, dass JNK3 (–/–) Mäuse resistent gegenüber dem Effekt von exitotoxischem KA waren. Weiterhin erholten sich JNK3 (–/–) Mäuse viel schneller von der Verabreichung des Wirkstoffs als Wildtyp Mäuse (7). Die Klassifizierung der Anfälle, wie in 7 und 8 gezeigt sind: 1, Hemmung der Bewegung; 2, myoklonische Zuckungen des Kopfes und des Halses mit kurzen zuckenden Bewegungen; 3, unilaterale klonische Aktivität; 4, bilaterale tonische und klonische Aktivität der vorderen Extremitäten; und 5, allgemeine tonisch-klonische Aktivität mit Verlust der Haltungsspannung, oft im Tod resultierend.
Beispiel 4. Resistenz gegenüber Pentetrazol (PTZ)-induzierten Anfällen
Da die Resistenz gegenüber KA-induzierten Anfällen zwischen Tieren aus dem gleichen Wurf unterschiedlich war (+/+ und +/– sind weniger resistent als –/– Mäuse), kann die beobachtete differenzielle Suszeptibilität nicht einem Unterschied zwischen Mausstämmen zugerechnet werden (Schauwecker und Steward, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:4103-4108, 1997). Jedoch könnte die Resistenz von JNK3 defizienten Mäusen gegenüber KA-induzierten Anfällen aufgrund einer erniedrigten Durchdringung des Wirkstoffs über die Bluthirnschranke oder einem erhöhten GABA (Gamma Aminobuttersäure) inhibitorischen postsynaptischen Potential (IPSP) oder der Entfernung eines spezifischen Signaltransduktionswegs, der durch die JNK3 Proteinkinase vermittelt wird, auftreten. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde die Antwort von JNK3 (–/–) und Wildtyp Mäusen auf ein weiteres epileptogenischen Agents, Pentetrazol (PTZ) (Sigma) untersucht. PTZ wurde aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, Anfälle über die Blockierung der GABA-IPSPs zu induzieren (Ben-Ari et al., Neurosci. 6:1361-1391, 1981).
JNK3 (–/–) Mäuse und Wildtyp Tiere aus dem gleichen Wurf entwickelten Anfälle von vergleichbarer Stärke über alle getesteten Dosierungen von PTZ (30, 40, 50, 60 mg/kg, i.p., 8). Weiterhin und im Gegensatz zum langsamen Voranschreiten den motorischen Symptome, die bei KA-induzierten Anfällen gesehen wurden, induzierte PTZ abrupte allgemeine tonisch-klonische Krampfanfälle innerhalb von 5 Minuten nach Injektion, was vermutlich wiederspiegelt, dass ein epileptogener Mechanismus alleine über die extrazelluläre Inhibition der GABA-IPSP arbeitet. Daher kann die differentielle Suszeptibilität gegenüber der KA Toxizität in JNK3 (–/–) Mäusen weder als eine Konsequenz von schlechter Wirkstoffverabreichung an das Nervensystem, noch durch starke GABA-IPSPs im neuralen Kreislauf erklärt werden. Weiterhin untersuchten wir die Expression der Kairat-Typ Glutamatrezeptoruntereinheiten GluR5-7 (Parmingen Kat. Nr. 60006E) mittels Immunozytochemie unter Verwendung von Standardverfahren.
Pyramidale Neuronen im hippokampalen CA1 Unterfeld wurden am meisten hervorstehend durch den Glu5-7 Antikörper markiert. Wildtyp als auch JNK3 (–/–) Mäuse zeigten markant markierte apikale Dendriten, die sich aus leicht markierten Somata im CA1 Unterfeld des Hippokampus ergaben, ein Muster, das ähnlich zum Primatenhippokampus ist (Good et al., Brain Research 624:347-353, 1993). Zusätzlich zu den Kainat-Typ Untereinheiten GluR5-7 waren auch das Expressionsmuster der GluR1 Untereinheit, die essentiell für verschiedene Glutamatrezeptor-Subtypen ist, und von Kalbindin, das den Einfluss von extrazellulärem Kalzium Puffern kann, ununterscheidbar zwischen JNK3 (–/–) und Wildtyp Mäusen. Zusammen weisen diese Resultate auf keine ersichtliche strukturelle Abnormalität hin, die verantwortlich für die Resistenz von JNK3 (–/–) Mäusen gegenüber KA-induzierter Exitoxizität sein könnte.
Beispiel 5. Attenuierung von KA-induzierter Phosphorylierung von c-Jun
Die systemische Verabreichung von KA an Wildtyp Mäuse kann einen Stress-Antwort-Signalweg induzieren, der dutch die JNK3 Proteinkinase vermittelt wird. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde die Expression der immediate-early Gene c-fos und c-jun (Morgan et al., Annu. Rev. Neurosci. 14:421-451, 1991; Smeyne et al., Nature 363:166-169, 1993; Kasof et al., J. Neurosci. 15:4238-4249, 1995) untersucht, um zu bestimmen, ob KA Wildtyp und JNK3 (–/–) Mäusen ein gleichwertiges Maß an schädlicher Stimulation aufbürdet. Totale RNA wurde aus den Hippocampi von Mäusen extrahiert, die vor und nach 0.5, 2, 4 oder 8 Stunden nach KA Injektion (30 mg/kg, i.p.) getötet wurden und Northern Blots wurden mit murinen c-fos und c-jun Sonden sondiert. Die c-Jun Sonde war ein 207 bp Fragment, korrespondierend zu Nukleotiden 888-1094 (9) der murinen C-Jun cDNA. Die c-Fos Sonde war ein 347 bp Fragment des murinen c-Fos Gens (Exon 4; Basenpaare 2593-2939) (10). Sowohl JNK3 (–/–) als Wildtyp Mäuse zeigten ein vergleichbares Level von schneller Induktion von c-fos und c-jun Transkripten, welches allmählich vier Stunden nach Injektion abfiel.
Um dieses Phänomen weiter zu definieren, wurde die Verteilung von KA-induzierter c-Fos und c-Jun Immunoreaktivität entlang des synaptischen Kreislaufs des Hippokampus untersucht. In diesen Experimenten wurden homozygot mutante und Kontroll-Wildyp Mäuse getötet und mittels transkardialer Perfusion von 4 % Paraformaldehyd bei 2 oder 6 Stunden nach der Injektion von KA (30 mg/kg i.p.) fixiert. Die Gehirne von beiden Gruppen wurden entfernt, für eine Stunde post-fixiert und auf einem Vibratom geschnitten (40 mm dick). Die Gewebeschnitte wurden mittels Immunozytochemie aufgearbeitet, um die Expression von c-Jun (Santa Cruz, Kat# sc-45), c-Fos (Santa Cruz, Kat# sc-52) und phospho-spezifische c-Jun (Ser-73) (New England Biolabs, #9164S) zu detektieren. Die Schnitte wurden in einer Lösung des primären Antikörpers (verdünnt 200X in PBS) schwimmen gelassen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubation mit dem sekundären Antikörper, Avidin-Biotin konjugierte Peroxidase (Vectastain Elite ABC kit, Vector Lab.) und DAB (3,3'Diaminobenzidin, Sigma) Reaktion wurden unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt (Hsu et al., supra). In der Abwesenheit von KA gab es keine detektierbare c-Fos Expression und lediglich ein paar c-Jun positive Zellen innerhalb des Gyrus Dentatus. Zwei Stunden nach KA Injektion (30 mg/kg, i.p.) gab es eine große Erhöhung in c-Fos Immunoreaktivität, die die gleiche war in Wildtyp sowie JNK3 (–/–) Mäusen, in der gesamten Hippokampalregion. Gleichzeitig gab es eine Erhöhung in der Anzahl von c-Jun positiven Zellen im Gyrus Dentatus und der CA3 Region des Hippokampus in Wildtyp sowie JNK3 (–/–) Mäusen. Sechs Stunden nach KA Injektion erstreckte sich die Expression von c-Jun auf die CA1 Region in sowohl Wildtyp als auch JNK3 (–/–) Mäusen. Die Induktion von c-Fos und c-Jun wird allgemein als ein Indikator von neuronaler Aktivität akzeptiert, der schädlicher Stimulation folgt (Morgan et al., supra). Das vergleichbare Induktionslevel, der vergleichbare Zeitablauf und die vergleichbare Verteilung von c-Jun und c-Fos-markierten Zellen, deutet an, dass JNK3 (–/–) und Wildtypmäuse einem equivalenten Level an schädlichem Stress durch die systemische Verabreichung von KA ausgesetzt waren.
C-Jun wird dutch Phosphorylierung der NH₂-terminalen Aktivierungsdomäne durch JNK aktiviert. Die Expression von phosphoryliertem C-Jun stellt ein weiteres Maß zur Verfügung, ob JNK-ähnliche Aktivität in JNK3 (–/–) Mäusen vorhanden war. Die Expression von phosphoryliertem C-Jun wurde untersucht unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen C-Jun gerichtet war, das an Ser-73 phosphoryliert war, eine der Stellen, die durch JNK phosphoryliert werden (Whitmarsh et al., supra; Dèrijard et al., supra; Kyriakis et al., supra). Vor der Anregung mit KA wurden keine Zellen durch den Antikörper, entweder in Wildtyp oder in JNK3 (–/–) Mäusen, markiert. Zwei Stunden nach KA Injektion gab es ein hohes Level an phosporyliertem c-Jun im Gyrus tentatus und der CA3/CA4 Region des Hippocampus in Wildtypmäusen. Im Gegensatz dazu wurden lediglich Spuren von phosphoryliertem c-Jun in den JNK (–/–) Mäusen detektiert. Daher gab es entweder ein erniedrigtes Level oder eine weniger lang anhaltende Phosphorylierung von c-Jun in den JNK-3 (–/–) Mäusen.
Zusätzlich gab es eine dynamische Änderung der Verteilung von phosphoryliertem c-Jun im Wildtypmaus Hippocampus. Sechs Stunden nach KA Injektion Hang die Expression an phosphoryliertem c-Jun im Gyurs tentatus und schritt zu einem eingeschränkten Bereich in der hippokampalen CA3 Region fort. Bei größerer Vergrößerung wurden offensichtlich, dass die Expression von phosphoryliertem c-Jun einen Fokus von Zellzerstörung umrundete. Im Gegensatz dazu wurde keine Markierung von phosphoryliertem c-Jun in den JNK3 (–/–) Mäusen zum gleichen Zeitpunkt detektiert. Es ist gut belegt, dass die hippocampale CA3 Region, die am meisten verletzliche Struktur gegenüber KA Excitotoxizität ist, vermutlich aufgrund von sowohl einer hohen KA Bindungsaffinität (Berger et al., supra) sowie einer starken excitatorischen synaptischen Verbindung zwischen CA3 pyramidalen Neuronen (Westbrook et al., Brain Research 273:97-109, 1983). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass JNK3 erforderlich ist für die Phosphorylierung von c-Jun, die durch KA induziert wird.
Beispiel 6. Attenuierung von KA-induzierter AP-1 transkriptionale Aktivität
Da die Phosphorylierung von c-Jun ein wichtiges anfängliches Ereignis während der Induktion von AP-1 transkriptionale Aktivität ist (Whitemarsh et al., supra; Yang et al., supra), wurde untersucht, ob die beobachtete Attenuierung von c-Jun Phosphorylierung zu einer erniedrigten Induktion von AP-1 transkriptionaler Aktivität in JNK3 (–/–) Mäusen führen würden. JNK (–/–) Mäuse wurden mit transgenen AP-1 Luziferase (AP1-Luc) Mäusen gekreuzt (Rincon et al., Embo. J. 13:4370-4381, 1994) und die Nachkommenschaft wurde zurückgekreuzt. Die JNK-3 (–/–)-AP1-Luc (–/+) Mäuse wurden zusammen mit JNK3 (+/+) Mäusen in Experimenten verwendet, um das Level von KA induzierter AP-1 transkriptionaler Aktivität in der Gegenwart oder Abwesenheit von JNK3 zu vergleichen. Die AP1-Luc Mäuse enthalten das Luziferasegen aus dem Glühwürmchen unter der Kontrolle von vier Kopien einer Konsensus AP-1 Bindestelle im Kontext des minimalen Ratten Prolaktinpromoters. Es wurde gezeigt, dass die Expression von Luziferase in diesen Mäusen auf das Vorhandensein des AP-1 regulatorischen Elements zurückzuführen ist.
Im Luziferaseassay wurden Mäuse zu Intervallen nach der Injektion von KA (30 mg/kg, i.p.) getötet und die relative Luziferaseaktivität mit der verglichen, die hippocampalen Lysaten detektiert wurde, die von Mäusen erhalten wurde, denen Trägersubstanz (Kochsalzlösung) injiziert wurde. Die Mäuse wurden enthauptet, die Gehirne wurden zerschnitten und die Gehirngewebe wurden sofort in Puffer lysiert, der 25 mM Hepes pH 7.4 1% Trinton^®X-100, 1mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 10 μg/ml Leupeptin (Promega, Madison, WI) enthielt. Die Luziferaseaktivität wurde wie in Rincon und Flavell (Embo. J. 13:4370-4381, 1994) beschrieben, gemessen. Die Injektion von KA (30 mg/kg, i.p.) verursachte eine große Induktion von AP-1 transkriptionaler Aktivität im Hippocampus von Wildtypmäusen, wie durch die Induktion von Luziferaseaktivität bewiesen wurde. Die Luziferaseaktivität in Wildtypmäusen war nach sechs Stunden detektierbar, stieg allmählich bis zum Höchstwert bei drei Tagen an und verblieb für wenigstens sieben Tage (11). Kontrollexperimente demonstrierten, dass die Injektion von Trägersubstanz (Kochsalzlösung) keine Induktion von Luziferaseaktivität in den AP-1 Luc Mäusen auslöste.
Die relative Luziferaseaktivität im Hippocampus und Cerebellum, die von Wildtyp (+/+) und JNK3 (–/–) Mäusen präpariert wurde, wurde nach KA Injektion gemessen. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Jeder Zeitpunkt repräsentiert den Mittelwert von drei bis fünf (+ SEM) individuellen Tieren. Die Induktion von Luziferaseaktivität war am ausgeprägtesten im Hippocamus, wo eine deutlich größere Induktion der Phosphorylierung von c-Jun beobachtet wurde, verglichen mit dem Cerebellum und dem cellebralen Cortex. Die Induktion von AP-1 Aktivität war signifikant erniedrigt in den JNK3 (–/–) Mäusen mit dem AP-1 Luc Transgen im Vergleich zu den Wildtypmäusen. 15 Stunden nach Injektion von KA war die AP-1 Aktivität im Hippocampus von Wildtypmäusen ungefähr vierfach größer verglichen mit den JNK3 (–/–) Mäusen. Drei Tage nach Injektion war die AP-1 Aktivität mehr als sechsmal höher im Hippocampus von Wildtyp verglichen mit JNK3 (–/–) Mäusen. Zusammen demonstrieren diese Daten, dass die Disruption des JNK3 Gens die KA induzierte Phosphorylierung von c-Jun und AP-1 Transkriptionsaktivität im Hippocampus in vivo unterdrückt.
Beispiel 7. Resistenz gegenüber KA induzierter Apoptose
Eine einzigartige Eigenschaft von KA unter anderen epileptogenen Agentien ist seine Stärke, neuronalen Zelltod zu induzieren (Ben-Ari, supra; Schwob et al., supra). Da diese Eigenschaft der Zellzerstörung von einem anhaltenden Level von AP-1 transkriptionaler Aktivität begleitet wird, wurde vorgeschlagen, dass AP-1 den KA induzierten neuronalen Tod induziert (Kasof et al., supra; Schwarzschild et al., J. of Neurosci. 17:3455-3466, 1997). Daher wurden Wildtyp und JNK3 (–/–) Mäusehirne nach Behandlung mit KA untersucht, um zu bestimmen, ob die Attenuierung von AP-1 transkriptionaler Aktivität in JNK3 (–/–) Mäusen das Ausmaß an neuronaler Schädigung veränderte (Ben-Ari, supra; Ben-Ari et al., supra; Schwob et al., Neurosci. 5:991-1014, 1980).
Diese Experimente wurden wie folgt ausgeführt: Wildtyp und JNK3 (–/–) Mäuse wurden drei Tage nach der Injektion von KA (30 mg/kg i.p.) getötet und mittels transkardialer Perfusion von 4 % Paraformaldehyd und 1.5 % Glutaraldehyd fixiert. Mitteldünne und dünne Schnitte des Hirns wurden unter Verwendung eines Vibratoms hergestellt und in Epon eingebettet. Gewebsblöcke wurden unter Verwendung eines Mikrotoms mit einer Diamantröhre präpariert und bei 1μm dicken halbdünnen Schnitten mittels Toluidinblaufärbung untersucht und bei ultradünnen Schnitten mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Nissl's Färbelösung wurde für die eingängliche Untersuchung von Schädigung am Hippocampus verwendet (Kluver et al., J. Neuropath. Exp. Neuro. 12:400-403, 1953). GFAP Immunozytochemie wurde ebenfalls verwendet, um die Zellzerstörung im Hippocampus zu bewerten (Hsu et al., supra). Die Nissel's Färbung wurde ebenfalls wie oben beschreiben durchgeführt. TUNEL Assays, die zur Bewertung von Apoptose verwendet wurden, wurden unter Verwendung von Cryostatschnitten (50 μm) von cerebralen Hemisphären durchgeführt, die mit Sucrose cryoprotektiert waren. Der TUNEL Assay wurde vom terminalen Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)-vermittelten dUTP nick Endmarkierungsassay modifiziert (Gavrieli et al., J. Cell. Biol. 119:493-501, 1992). In Kürze wurden Gewebsschnitte, die direkt auf einem salinierten Objektträger angebracht waren mit 2 % TRITON^® X-100 (20 Minuten bei Raumtemperatur) permeabilisiert und dann für die nick Endmarkierung für zwei Stunden beim 37 °C unter Verwendung von 0.32 U/μl TdT (Boehringer Mannheim, Kat# 220582) und 2 μM Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim, Kat# 1573152) in einem Gesamtvolumen von 40 μl inkubiert. Die Gewebe wurden mit Anti-Digoxigenin Antikörper (Boehringer Mannheim, Kat# 1333062) 500-fach verdünnt, inkubiert und für die Immunocytochemie unter Verwendung von Standardverfahren weiterverarbeitet (Hsu et al., supra).
Die durch KA verursachte Schädigung des Hippocampus wurde eingangs mittels Nissel's Färbelösung untersucht. Der KA-induzierte Zellverlust verursachte entweder eine Lücke in der Färbung in der pyramidalen Neuronen in der CA3 Region oder eine diffuse und zerstreute Färbung durch das gesamte CA1 Unterfeld. Um die durch die Nissel's Färbelösung aufgedeckte Zellzerstörung zu bestätigen, wurde das TUNEL Verfahren zur Detektion von Apoptose angewandt. Gruppen von Zellen mit pyknotischen Nuklei und positiv TUNEL-markierten Zellen wurden im hippocampalen CA3 Unterfeld, das ohne Nissel's Anfärbung war, gefunden.
Gleichsam war ein hoher Prozentsatz an pyramidalen Neuronen, die pyknotische Nuklei zeigten und zerstörte apikale Dendriten und eine große Zahl an stark TUNEL-markierten Zellen im hippokampalen CA1 Unterfeld lokalisiert, welches eine erniedrigte Nissel's Färbung zeigte. Da das TUNEL Verfahren und die pyknotische Morphologie nur das Ausmaß an Zellschädigung zu einem Zeitpunkt eines dynamischen Prozesses anzeigten, wurde weiterhin die Immunoanfärbung von schaden-induziertem GFAP als eine alternative Abschätzung für das Ausmaß der Zellzerstörung im Hippocampus verwendet. Konsistent mit den Mustern von Nissel's, Toluidin und TUNEL Anfärbung wurde eine erhöhte Anzahl von stark GFAP markierten Astrocyten entweder in der hippocampalen CA3 oder CA1 Region gefunden. Somit wurde eine Kombination von Nissel's Färbung, GFAP Immunocytochemie, TUNEL Verfahren und Toluidinfärbung von halbdünnen Schnitten verwendet, um die KA-induzierte Schädigung im Maus Hippocampus zu klassifizieren.
Eine Gesamtzahl von 17 Wildtyp und 18 JNK3 (–/–) Mäusen wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 (unten) gezeigt. Die Tabelle wurde aus zwei Datensätzen zusammengetragen.
Erstens wurden Wildtyp (n = 11) und JNK (–/–) (n = 10) Mäuse am fünften Tag nach einer einzelnen Injektion von KA (30 mg/kg, i.p.) getötet. Zweitens erhielten Wildtyp (n = 6) und JNK3 (–/–) (n = 8) Mäuse eine Injektion von KA (30 mg/kg, i.p.) für fünf aufeinanderfolgende Tage und wurden zwei Tage nach der letzten Injektion untersucht. Das Ausmaß der hippocampalen Schädigung in Wildtypmäusen war in den Experimenten unter Verwendung beider Protokolle vergleichbar. Das Verhältnis von keinem Zellverlust CA3 Läsion/CA3 + CA1 Läsion war 2/7/2 in den Experimenten mit Einzelinjektion und 2/2/2 in den Experimenten mit mehrfacher Injektion. Tabelle 1 Kainat-induzierte neuronale Schädigung (Anzahl an Tieren)

JNK3 Genotyp +/+ –/–

Kein erkennbarer Zellverlust 4 18

Selektiver CA3 Zellverlust 9 0

Einschließlich CA1 Zellverlust 4 0
Die hippocampale CA3 Region war der KA-induzierten Schädigung am meisten zugänglich in den Wildtypmäusen (9/17, 53 %). Der Zellverlust wurde durch Kristallviolettfärbung in der CA3 Region angezeigt. Unter Verwendung des TUNEL-Verfahrens (Gavrieli et al., supra), das die DNA Fragmentierung in den sterbenden Zellen identifiziert, wurden Gruppen von markierten Zellen in der geschädigten Region gefunden. Eine Anhäufung von pyknotischen Nuklei wurde in der CA3 Region in Toluidin gefärbten halbdünnen Schnitten gefunden. Als ein Resultat der KA induzierten Schädigung gab es selektive gliale Proliferation, die auf die CA3 Region beschränkt war, wie durch die starke Immunoanfärbung von GFAP angezeigt wurde. In einigen Wildtyptieren wurde ein massiver Zellverlust über die gesamte hippocampale CA1 Region hinweg beobachtet (4/17; 24 %). Gleichermaßen wurde die Schädigung der CA1 Region durch erniedrigte Kristallviolettfärbung, positiv TUNEL-markierte Zellen, pyknotische Nuklei, zerstörten apikalen Dendriten von pyramidalen Neuronen und sowohl Hypertophie und Poliferation von GFAP-positiven Astrocyten aufgedeckt.
Im Gegensatz dazu wurde keine ersichtlich hippocampale Schädigung in irgendeiner der JNK3 (–/–) Mäuse untersucht (n = 18). Das Muster von Nissel's Färbelösung, TUNEL Assay, Toluidinblaufärbung von halbdünnen Schnitten und GFAP Immunofärbung der hippocampalen Region in den JNK3 (–/–) Mäusen war ununterscheidbar von dem von unbehandelten Wildtypmäusen. Weiterhin wurde Zellschädigung nichts desto trotz in einem viel kleineren Prozentsatz von Tieren gefunden (2/15, 13 %; p < 0,005 nach der Chi-Quadrat-Analyse, d.f. = 1), obwohl JNK2 (–/–) Mäuse Anfälle von vergleichbarer Schwere bei der sublethalen Dosis von 45 mg/kg KA entwickelten (eine Dosis, die lethal für mehr als 60 % von Wildtypmäusen ist als eine Folge von anhaltenden Konvulsionen).
Verfahren zur Bewertung von Apoptose (z. B. TUNEL Assay) können verwendet werden um zu evaluieren, ob ein JNK3 Modulator die Apoptose beeinflusst.
Beispiel 8. Elektronenmikroskopische Analyse von ultrastrukturellen Änderungen, die mit KA-induzierter neuronaler Schädigung assoziiert sind
In vitro machen kortikale Neuronen abhängig von der extrazellulären Konzentration des Glutamatanalogs N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) entweder Apoptose oder Nekrose durch. (Bonfoco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7162-7166, 1995). Die Unterscheidung zwischen Apoptose versus Nekrose bei der KA-induzierten neuronalen Schädigung ist entscheidend, da Nekrose im Allgemeinen dafür gehalten wird, eine Konsequenz einer akuten mechanischen Verletzung zu repräsentieren, was unvereinbar mit einem aktiven Zelltod-Programm ist, das eine de novo Proteinsynthese involviert. Die TUNEL Ergebnisse (supra) zeigen die Beteiligung von Apoptose an. Um weiter zu untersuchen, ob der neuronale Tod in vivo als Folge der KA-Induktion apoptotisch oder nekrotisch war, wurde Elektronenmikroskopie eingesetzt, um die ultrastrukturellen Änderungen in degenerierten hippokampalen Neuronen zu untersuchen. Die mikroskopische Analyse deutete auf eine Reihe von morphologischen Änderungen hin, die auf eine neuronale Schädigung in den Wildtypmäusen als eine Konsequenz von Apoptose hinwiesen. Das anfängliche Ereignis nach KA-Injektion (30 mg/kg i.p.) schien die Verdichtung und die Segregation von Chromatin in den pyramidalen Neuronen in elektronendichte Massen zu sein, die an der inneren Oberfläche der Zellhülle anlagen. Im Gegensatz dazu enthielten die Nuklei der hippokampalen Neuronen in den JNK3 (–/–) Mäusen nach KA-Injektion ein homogenes elektronendurchsichtiges Euchromatin. In späteren Stadien trat in Wildtypmäusen eine Faltung der Zellkernkontur und eine Kondensation des Zytoplasmas statt. Die doppelschichtige Struktur der Zellkernhülle verblieb den Wildtypmäusen in allen diesen morphologischen Stadien weitgehend in Takt. Schließlich lösten sich die degenerierten Neuronen auf, was zu einer Vielzahl von membrangebundenen apoptotischen Körpern führte. Diese morphologischen Eigenschaften sind alle mit den Kennzeichen für Apoptose konsistent (Kerr et al., Br. J. Cancer 26:239-257, 1972). Daher schien es, dass KA innerhalb der geschädigten Neuronen ein genetisches Programm auslöste, das zur Apoptose führte, was in JNK3-defizienten Neuronen aufgehoben war.
Diese Resultate deuten darauf hin, dass die KA-induzierte Phosphorylierung der NH₂-terminalen Aktivierungsdomäne von c-Jun zu einer erhöhten AP-1 transkriptionalen Aktivität und zu neuronaler Apoptose führt. Ohne Beschränkung auf eine bestimmte Theorie wird in 13 eine vorgeschlagene Kette von molekularen Ereignissen, die durch KA verursacht werden gezeigt, die zu neuronaler Apoptose führen.
Obwohl die systemische Verabreichung von KA vornehmlich Zellschädigung verursacht, die im hippokampalen CA3 Bereich lokalisiert ist, ist die Signifikanz von JNK3 für die stress-induzierte neuronale Apoptose nicht nur auf diese Region beschränkt. Viele Beweise weisen darauf hin, dass die besondere Verletzlichkeit der CA3 hippokampalen Neuronen durch KA in deren einzigartigen zellulären und synaptischen Eigenschaften begründet liegt. Erstens haben die hippokampalen CA3 und CA4 Regionen die höchste Dichte an KA Rezeptoren (Berger et al., Neurosci. Lett. 39:237-242, 1983). Zweitens ist die wiederkehrende synatische Erregung besonders wirksam in der hippokampalen CA3 Region (Miles et al., J. Physiol. (London) 373:397-418, 1986). Die wiederkehrende Erregung der CA3 pyramidalen Neuronen kann die JNK3 Signalisierung aufrechterhalten und daher schnell eine KA Excitotoxizität induzieren. Der beobachtete Fortschreiten der c-Jun Phosphorylierung vom Gyrus dentatus zu der CA3 Region erinnert an den synaptischen Kreislauf des Hippokampus. Ein Diagramm der trisynaptischen Verbindung innerhalb der hippokampalen Formation ist in 14 gezeigt. Die erste synaptische Übergabe (1) erfolgt vom afferenten perforanten Pfad (pp) auf die Granulatzelle des Gyrus dentatus (DG). Die zweite Übergabe (2) folgt der Mossy Fiber (mf) vom Gyrus dentatus zu den CA3 hippokampalen Neuronen. Die dritte Übergabe (3) findet von der hippokampalen CA3 zu der CA1 Region entlang den Schaffer Kollateralen (Sch) statt. Es gibt wiederkehrende synaptische Interaktionen von pyramidalen Neuronen in der CA3 Region.
Beispiel 9. Assays zur Detektion von Inhibitoren der JNK3 Protein Kinase Aktivität
Inhibitoren von JNK3 können in Protein Kinase Assays identifiziert werden. Diese Assays können unter Verwendung von JNK3 das aus Gewebe (z. B. Gehirn) aufgereinigt worden ist, oder mit rekombinantem Enzym durchgeführt werden. Das rekombinante JNK3 kann aus Bakterien-, Hefe- Insekten- oder Säugetierzellen isoliert werden, unter Verwendung von Standardverfahren. Assays mit endogenem (natürlichem) JNK3 sind in der Kunst bekannt und Assays mit rekombinantem JNK3 sind zuvor beschrieben worden (Gupta et al., EMBO J. 15:2760-2770, 1996).
Die Protein Kinase Aktivität von JNK3 kann unter Verwendung von ATP und Proteinsubstraten für JNK3 in einem in vitro Assay gemessen werden. Diese Substrate schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die Transkriptionsfaktoren ATF2 und Elk-1 (Gupta et al., 1996, supra). Der Einbau von Phosphat in die Substrate kann mittels verschiedener Verfahren gemessen werden. Bin Beispiel ist es, den Einbau von radioaktivem Phosphat (z. B. ³²P) in das Substrat zu messen. Der Einbau in das Substrat kann nach Entfernen von nicht eingebauter Radioaktivität durch Präzipitation mit Trichloressigsäure und Wiedergewinnung auf Phosphozellulosepapier oder durch Polyacrylamidgelelektrophorese gemessen werden. Die Radioaktivität kann mittels Szintillationszählung, Phosphorimager Analyse oder mittels Autoradiografie beobachtet werden. Im Allgemeinen würden Verfahren für automatisierte Hochdurchsatzscreenings keine radioaktiven Materialien verwenden. Zu diesem Zweck wird ein Verfahren verwendet, das phophorylierte Substrat ohne eine radioaktive Sonde zu detektieren. In einem Ansatz wird die elektrophoretische Mobilität des Substrats untersucht. Z. B. zeigt ATF2 eine deutliche Reduktion in der elektrophoretischen Mobilität nach Phosphorylierung durch JNK an Thr-69 und Thr-71 (Gupta et al., Science 267:389-393, 1995).
Ein zweiter Ansatz ist die Detektion der Phosphorylierung des Substrats unter Verwendung von immunochemischen Verfahren (z. B. ELISA). Antikörper, die spezifisch an die phosphorylierten Substrate binden, werden hergestellt (monoklonal und polyklonal) und sind kommerziell erhältlich (z. B. New England Biolabs, Promega Corp., und Upstate Biotechnology Inc.). Der Umfang der Substratphosphorylierung wird dann mittels Standard ELISA Assay unter Verwendung von sekundären Antikörpern, die unter Verwendung von Verfahren, die in der Kunst bekannt sind, an Moleküle gekoppelt sind, die für die spektrophotometrische oder fluorometrische Detektion geeignet sind, gemessen.
Moleküle, die JNK3 inhibieren, können in einem Hochdurchsatzscreening identifiziert werden. Ein Molekül, das ein bevorzugter Kandidat für die Behandlung von excitotoxischen Störungen ist, inhibiert JNK3, aber keine anderen Proteinkinasen, einschließlich verwandte MAP Kinasen. Einmal identifizierte Kandidatenmoleküle können unter Verwendung von kombinatorischen chemischen Verfahren oder durch die Synthese von verwandten Molekülen optimiert werden. Diese Moleküle repräsentieren Kandidatenwirkstoffe, die für eine JNK3 Therapie getestet werden können.
Beispiel 10. Assays für die Detektion von Inhibitoren der JNK3 Aktivierung
Die JNK Proteinkinasen werden durch duale Phosphorylierung an Thr und Tyr innerhalb der Proteinkinase Unterdomäne VIII aktiviert (Davis, Trends Biochem. Sci. 19:470-473, 1994). Diese Stellen der Aktivierung der Phosphorylierung sind in JNK3 konserviert (Gupta et al., 1996, supra). Moleküle, die die Aktivierung von JNK3 über eine Beeinträchtigung der Phosphorylierung von JNK3 inhibieren, können mittels Messung der JNK3 Aktivierung in der Gegenwart und Abwesenheit von Kandidatenmolekülen identifiziert werden. Zellen, die JNK3 exprimieren, z. B. neuronale Zellen, neuroendokrine Zellen oder Zellen, die hergestellt wurden, um rekombinantes JNK3 zu exprimieren (Gupta et al., 1996, supra) werden Umweltstress ausgesetzt (z. B. Depolarisation, excitotoxischen Agentien, UV-Strahlung, Hitze und Anoxie) um JNK3 zu aktivieren. Der Zustand der JNK3 Aktivierung kann über verschiedene Verfahren bestimmt werden. Z. B. kann JNK3 isoliert werden, durch Waschen vom Kandidateninhibitor befreit werden und der Aktivierungszustand von JNK3 kann über ein Proteinkinase Assay (supra) bestimmt werden. Alternativ kann die Aktivierung von JNK3 unter Verwendung von immunologischen Verfahren unter Verwendung von Antikörpern, die an die Thr und Tyr phosphorylierte (aktivierte) Form von JNK3 binden, sondiert werden. Antikörper, die spezifisch an das Thr und Tyr phosphorylierte Enzym binden, können hergestellt werden (monoklonal und polyklonal) und sind kommerziell erhältlich (z. B. von New England Biolabs und Promega Corp.). Das Ausmaß an Substratphosphorylierung kann dann über einen Standard ELISA Assay unter Verwendung von sekundären Antikörpern, gekoppelt an spektrophotometische oder fluorometrische Detektion gemessen werden.
Andere Ausführungsformen
Obwohl die Erfindung im Zusammenhang mit der detaillierten Beschreibung erläutert wurde, dient diese nur zur Illustration und schränkt nicht den Schutz des durch die Ansprüche bestimmten Schutzbereichs ein. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die Excitotoxizität moduliert, das Verfahren umfassend: Inkubieren einer neuronalen Zelle, die ein JNK3 Protein exprimieren kann, mit einer Verbindung unter Bedingungen und für eine Zeit die ausreichen, dass die neuronale Zelle ein JNK3 Protein ohne die Verbindung exprimieren kann; Inkubieren einer Kontrollzelle unter den gleichen Bedingungen und für die gleiche Zeit in der Abwesenheit der Verbindung; Messung der JNK3 Expression in der neuronalen Zelle in der Gegenwart der Verbindung; Messung der JNK3 Expression in der Kontrollzelle; und Vergleichen der Menge der JNK3 Expression in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Verbindung, wobei ein Unterschied im Level der Expression anzeigt, dass die Verbindung Excitotoxizität moduliert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung die Expression von JNK3 erniedrigt.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung die Excitotoxizität moduliert, das Verfahren umfassend: Inkubieren einer neuronalen Zelle, die JNK3 Aktivität aufweist, mit einer Verbindung unter Bedingungen und für eine Zeit die ausreichend sind, dass die Zelle JNK3 Aktivität in der Abwesenheit der Verbindung exprimiert; Inkubieren einer Kontrollzelle unter den gleichen Bedingungen und für die gleiche Zeit in der Abwesenheit der Verbindung; Messung der JNK3 Aktivität in der neuronalen Zelle in der Gegenwart der Verbindung; Messung der JNK3 Aktivität in der Kontrollzelle; und Vergleichen der Menge an JNK3 Aktivität in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Verbindung, wobei ein Unterschied im Level der Aktivität anzeigt, dass die Verbindung Excitotoxizität moduliert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Verbindung die Aktivität von JNK3 erniedrigt.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung die Excitotoxizität moduliert, besagte Methode umfassend Vergleichen der Menge eines JNK3 Polypeptids, das an ein Substrat gebunden ist, in der Gegenwart und in der Abwesenheit einer ausgewählten Verbindung, wobei ein Unterschied in der Menge des Bindens eines JNK3 Polypeptid an ein Substrat anzeigt, dass besagte ausgewählte Verbindung die Excitotoxizität moduliert, wobei das JNK3 Polypeptid aus einer neuronalen Zelle aufgereinigt wurde.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Binden eines JNK3 Polypeptids an ein Substrat erniedrigt ist.
Verfahren zur Erzeugung einer totipotenten Mauszelle, umfassend wenigstens ein inaktiviertes JNK3 Gen, das Verfahren umfassend: a. Zur Verfügung stellen einer Vielzahl von totipotenten Mauszellen; b. Einführen eines DNA-Konstrukts in die Zellen, umfassend ein zertrenntes Maus JNK3 Gen, wobei das JNK3 Gen durch Insertion einer Nukleotidsequenz in das Gen zertrennt ist, das die Expression eines funktionalen JNK3 verhindert; c. Inkubieren der Zellen, so dass homologe Rekombination zwischen der chromosomalen Sequenz, die für JNK3 kodiert, und dem eingeführten DNA-Konstrukt auftritt; und d. Identifizieren einer totipotenten Mauszelle umfassend wenigstens ein inaktiviertes JNK3 Gen.
Verfahren zur Herstellung einer Maus, die homozygot für ein inaktiviertes JNK3 Gen ist, umfassend: a. Zur Verfügung stellen einer totipotenten Mauszelle umfassend wenigstens ein inaktiviertes JNK3 Gen; b. Einbringen der Zelle in einen Mäuseembryo und Implantation des Embryos in eine weibliche Maus; c. Zulassen, dass der Embryo sich in eine neonatale Maus entwickelt; d. Zulassen, dass die neonatale Maus die Geschlechtsreife erreicht; und e. Paaren zweier geschlechtsreifer Mäuse aus Schritt d., um eine Maus zu erhalten, die homozygot für das inaktivierte JNK3 Gen ist (–/–), wobei die Maus resistent gegenüber excitotoxischer Schädigung ist.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, die die JNK3 Expression inhibiert, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antisense-Nukleinsäure, Ribozym und Antikörper oder eines Fragments davon, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Patienten, der eine Störung hat, die Excitotoxizität involviert, oder ein Risiko für eine solche Störung hat.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei besagte Störung mit stress-induzierter Anfallsaktivität, AP-1 transktiptionaler Aktivierung und Kaininsäure-induzierter Apoptose von hippocampalen Neuronen assoziiert ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die Störung aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Alzheimer, Huntington, Ischämie, amyotrophe laterale Sklerose, Trauma, Erkrankung der Motoneuronen, Parkinson oder Epilepsie.
Ein transgenes, nichts menschliches Säugetier, das eine transgene disruptierte Expression eines JNK3 Gens aufweist, wobei das Transgen chromosomal in die Keimzellen des Säugetiers integriert ist, wobei die Keimzellen homozygot für das Transgen sind.
Das Säugetier gemäß Anspruch 12, wobei das Säugetier eine Maus ist.
Das Säugetier gemäß Anspruch 12, wobei die Disruption in einer Null-Mutation resultiert.
Eine Zelllinie abstammend von einer Zelle des Säugetiers gemäß Anspruch 12.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, weiterhin umfassend Auswählen der Verbindung, wenn es einen Unterschied im Level der Expression in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Verbindung gibt; und Verabreichung der ausgewählten Verbindung an ein Tiermodel für eine excitotoxische Störung und untersuchen des Tieres auf Excitotoxizität hin, wobei einer Erniedrigung in der Excitotoxizität im Tier anzeigt, dass die Verbindung JNK3 Expression moduliert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 3, weiterhin umfassend Auswählen der Verbindung, wenn es einen Unterschied im Level der Aktivität in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Verbindung gibt; und Verabreichung der ausgewählten Verbindung an ein Tiermodel für eine excitotoxische Störung und untersuchen des Tieres auf Excitotoxizität hin, wobei einer Erniedrigung in der Excitotoxizität im Tier anzeigt, dass die Verbindung JNK3 Aktivität moduliert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, weiterhin umfassend Auswählen der Verbindung, wenn es einen Unterschied in der Menge des JNK3 Polypeptids gibt, das an ein Substrat gebunden ist in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Verbindung; und Verabreichung der ausgewählten Verbindung an ein Tiermodel für eine excitotoxische Störung und untersuchen des Tieres auf Excitotoxizität hin, wobei einer Erniedrigung in der Excitotoxizität im Tier anzeigt, dass die Verbindung das Binden eines JNK3 Polypeptids an das Substrat moduliert.