Somit liegt der vorliegenden Erfindung
das technische Problem zugrunde, einen JNK/SAPKs-Assay bereitzustellen,
der die vorstehend zusammengefaßten
Nachteile vermeidet, d.h. keine radioaktive Markierung erfordert
und darüber
hinaus trotz einem geringeren Zeitaufwand (Expositionszeit) empfindlich
ist.
Die Lösung dieses technischen Problems wird
durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen
erzielt.
Es stellte sich während den zu dieser Erfindung
führenden
Experimenten heraus, dass die vorstehend geschilderten Probleme überwunden
werden können,
indem die Aktivität
von JNK/SAPKs dadurch bestimmt wird, dass eine Kinase-Reaktion mit aus
einem Zellysat erhaltenen JNK/SAPKs in Gegenwart von ATP und GST-Transkriptionsfaktoren
durchgeführt
wird, und anschließend
eine Bestimmung der Menge an phosphoryliertem GST-Transkriptionsfaktor
(p-GST-Transkriptionsfaktor] über
die spezifische Bindung eines anti-p-GST-Transkriptionsfaktor-Antikörpers erfolgt,
wobei die Menge an gebundenem Antikörper die Menge an phosphoryliertem GST-Transkriptionsfaktor
(p-GST-Transkriptionsfaktor)
reflektiert und somit indirekt die Aktivität der JNK/SAPKs.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung
ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von JNK/SAPKs, wobei das
Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
- (a)
Herstellung eines Zellysats oder Gewebelysats;
- (b) Aufreinigung von endogenen JNK/SAPKs;
- (c) Durchführung
einer Kinase-Reaktion mit den nach Schritt (b) erhaltenen JNK/SAPKs
in Gegenwart von ATP und eine oder beide N-terminale Phosphorylierungsstellen
enthaltendem GST-Transkriptionsfaktor-Protein;
und
- (d) Nachweis der Menge an phosphoryliertem GST-Transkriptionsfaktor-Protein
durch Zugabe eines spezifischen anti-p-GST-Transkriptionsfaktor-Antikörpers zu
dem Gemisch aus Schritt (c) und Bestimmung der Aktivität der JNK/SAPKs
anhand der Menge an gebundenem anti-p-GST-Transkriptionsfaktor-Antikörper.
Unter dem Begriff "Transkriptionsfaktor" sollen die nachfolgenden
speziellen Substrate für JNK/SAPKs
verstanden werden, z.B. (TCF)/Elk-1, c-Jun, Jun B, Jun D und ATF-2,
ganz besonders c-Jun.
Die Herstellung eines Zellysats zur
Gewinnung der JNK/SAPKs kann mittels dem Fachmann bekannten Routineverfahren
erfolgen, z.B. mittels des in dem nachstehenden Beispiel beschriebenen Verfahrens.
Der Fachmann kennt auch alle Maßnahmen,
die ergriffen werden müssen,
damit bei dem Aufschließen
der Zellen die JNK/SAPKs vollständig und
in aktiver Form zur Verfügung
stehen. So kann z.B. der Abbau durch Proteasen mittels bekannten Protease-Hemmern,
wie z.B. PMSF, unterdrückt
werden.
Um die Aktivität der JNK/SAPKs bestimmen zu
können,
ist es vorteilhaft, die endogenen JNK/SAPKs aus dem Zellysat anzureichern
und dadurch die endogenen Transkriptionsfaktor-Proteine abzutrennen. Dies kann durch
dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen, z.B. mittels Immunpräzipitation
oder klassischen Proteinaufreinigungsverfahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die Anreicherung bzw. Isolierung der JNK/SAPKs aus dem Zellysat über Immunpräzipitation.
Dies erfolgt über
anti-JNKs/SAPK-Antikörper,
die z.B. an eine Säule
oder an Kügelchen,
z.B. magnetische Kügelchen,
gebunden sind, gemäß Standardverfahren.
Dabei handelt es sich bei den für
dieses Verfahren geeigneten Antikörpern um monoklonale, polyklonale
oder synthetische Antikörper.
Der hier verwendete Ausdruck "Antikörper" umfaßt auch
Fragmente. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoklonalen
Antikörpers
(z.B. Fab-, Fv- oder "single
chain Fv"-Fragmente),
welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen.
Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise
handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoklonale Antikörper. Die
erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren
hergestellt werden, wobei vorzugsweise JNK/SAPKs-Peptide oder synthetische
Fragmente davon als Immunogen dienen. Diese Peptide bzw. die Fragmente
davon können
durch Gewinnung des entsprechenden Gens, Klonierung und rekombinante
Expression erzeugt werden. Verfahren zur Gewinnung monoklonaler
Antikörper
sind dem Fachmann bekannt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die Immunpräzipitation
der endogenen, im Zellysat enthaltenen JNK/SAPKs dadurch, dass diese
mit spezifischen Antikörpern
inkubiert und danach an Protein-A-Sepharose-Kügelchen gebunden werden. Dabei
sollten die Antikörper
gegen alle JNK/SAPKs gerichtet sein bzw. gegen ein Epitop, das allen JNK/SAPKs
gemeinsam haben, damit der Assay quantitativ ist, d.h. die Gesamtaktivität aller JNK/SAPKs
erfaßt
wird. Die weiteren Verfahrensschritte können dann mit den von den Protein-A-Sepharose-Kügelchen
freigesetzten JNK/SAPKs oder noch-gebundenen JNK/SAPKs erfolgen,
jedenfalls muß gewährleistet
sein, dass durch Bindung an den Antikörper die biologische Aktivität der JNK/SAPKs nicht
gehemmt oder sonstwie nachteilig beeinflußt wird.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
sind die spezifischen Antikörper
anti-JNK1-, anti-JNK2- und/oder anti-JNK3-Antikörper, die gegen gemeinsame
Epitope von JNK1, JNK2 und JNK3 gerichtet sind (Davis et al., Biochem.
Soc. Sympl. 1999, 64, S. 1-12). Die vorstehend beschriebenen Antikörper sind im
Handel erhältlich.
Im nachfolgenden wird die Erfindung
am Beispiel des Transkriptionsfaktors c-Jun beschrieben. Dies ist
aber nicht als Beschränkung
der Erfindung zu verstehen. Bezüglich
der übrigen
vorstehend aufgezählten
Transkriptionsfaktoren ist analog zu verfahren.
Die Durchführung der Kinase-Reaktion mit den
gewonnenen JNK/SAPKs erfolgt in Gegenwart von ATP und eine oder
beide N-terminale
Phosphorylierungsstellen enthaltendem GST-c-Jun. Bedingungen für Kinase-Reaktionen
sind dem Fachmann bekannt und die Reaktion kann z.B. gemäß dem nachstehenden
Beispiel durchgeführt
werden. Der Fachmann kann auch das für diesen Reaktionsschritt erforderliche
GST-c-Jun selbst reinigen oder rekombinant herstellen (van Dam et
al., EMBO J. 1995, 14: 1798-1811) Geeignetes GST-c-Jun-Protein ist
auch im Handel erhältlich
(siehe dazu die Angaben im nachstehenden Beispiel). GST-c-Jun ist
ein rekombinant in Bakterien exprimiertes c-Jun-Protein, das an GST fusioniert ist.
GST ermöglicht
die Aufreinigung des rekombinanten c-Jun-Proteins über Glutathion-Sepharose-Beads.
Der Begriff "GST-c-Jun" umfaßt alle Formen des Proteins,
die noch einer Phosphorylierungsreaktion durch JNK/SAPKs zugänglich sind,
somit auch Formen, die gegenüber
den natürlichen
Formen Veränderungen
aufweisen, z.B. ein anderes Glykosilierungsmuster, Austausch, Deletion
und/oder Addition von Aminosäure(n)
etc. Dazu zählen
auch verkürzte Formen
von GST-c-Jun, wobei die verkürzten
Formen C-terminal oder N-terminal
verkürzt
sein können,
jedenfalls noch mindestens eine Phosphorylierungsstelle aufweisen,
vorzugsweise besitzen sie noch beide Phosphorylierungsstellen.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist das für
die Kinase-Reaktion verwendete GST-c-Jun GST-c-Jun 1-166 oder GST
c-Jun-1-79, die z.B. von der Firma Santa Cruz, Heidelberg erhältlich sind,
wobei die Zahlen auf die Positionen der verbliebenen Aminosäuren hinweisen.
Ein für den Nachweis des phosphorylierten GST-c-Jun
geeigneter Antikörper
kann gemäß üblicher
Verfahren hergestellt werden, wobei bezüglich dieses Antikörpers bzw.
dessen Herstellung die vorstehenden Ausführungen zu anti-JNK-Antikörpern sinngemäß gelten.
Dieser Antikörper
muß zwei Hauptvoraussetzungen
erfüllen:
Er muß spezifisch an
GST-c-Jun binden und zwischen der phosphorylierten und unphosphorylierten
Form unterscheiden können,
d.h. nur an die phosphorylierte Form binden. Solche Antikörper können z.B.
dadurch hergestellt werden, dass phosphoryliertes GST-c-Jun (vorzugsweise
beide Phosphorylierungssstellen enthaltend) oder ein die phosphorylierten
Bindungstelle(n) (z.B. Ser63 und/oder Ser73) enthaltendes Fragment
als Immunogen verwendet wird und dann nach Antikörpern gescreent wird, die nur
noch an die phosphorylierte Form des GST-c-Jun binden, nicht jedoch
an die unphosphorylierte.
Für
das erfindungsgemäße Verfahren
liegt der Konzentrationsbereich von GST-c-Jun zwischen 0,2–5 μg pro 50 μl Kinase-Reaktion,
wobei der Bereich von 1-3 μg/50 μl Kinase-Reaktion bevorzugt
ist. Der Konzentrationsbereich des verwendeten Zellysats liegt zwischen
50 – 1000 μg Protein
pro 50 μl
Kinase-Reaktion, wobei der Bereich von 100 – 300 μg bevorzugt ist. Vorzugsweise
ist der anti-p-GST-c-Jun Antikörper
im Vergleich zu GST-c-Jun im Überschuß vorhanden,
um eine quantitative Messung zu erhalten, wobei die Konzentration
des Antikörpers
von seiner Affinität
abhängt.
Die quantitative Bestimmung der (absoluten) JNK/SAPKs- Aktivität kann durch
Vergleich mit einer Kontrollreaktion erfolgen, die JNK/SAPKs mit
bekannter Aktivität
enthält.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erkennt der anti-p-GST-c-Jun-Antikörper spezifisch
die Phosphorylierung an Ser73 und/oder Ser63.
Die Bestimmung der Aktivität von JNK/SAPKs über die
Bindung des anti-p-GST-c-Jun-Antikörpers kann über verschiedene allgemeine
Verfahren erfolgen, z.B. Western-Blot, Immunfluoreszenz, ELISA,
Radioimmunassay (RIA) etc., wobei Western-Blot für das erfindungsgemäße Verfahren
bevorzugt ist. Vorzugsweise trägt
der anti-p-GST-c-Jun-Antikörper
eine nachweisbare Markierung, wobei als Markierung eine fluoreszente
Verbindung, ein kolloidales Metall, eine chemilumineszente Verbindung,
eine biolumineszente Verbindung, eine phosphoreszente Verbindung
oder ein Enzym besonders bevorzugt ist. In der am meisten bevorzugten
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die JNK/SAPKs-Aktivität über einen primären polyklonalen
Kaninchen anti-p-GST-c-Jun-Antikörper und
einen im Handel erhältlichen
sekundären
anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase-Antikörper und
verstärkte
Chemilumineszenz bestimmt. Der anti-p-GST-c-Jun-Antikörper kann
auch an einen festen Träger über übliche Verfahren
absorbiert sein. Desweiteren besteht die Möglichkeit, daß der primäre Antikörper biotin-konjugiert
ist und ein Streptavidin-Peroxidase
gekoppelter Sekundärantikörper verwendet
wird. Falls eine Bestimmung im Fluoreszenz-Mikroskop oder FACS gewünscht ist,
wird vorzugsweise ein Fluorescein- oder Rhodamin-gekoppelter Sekundär-Antikörper eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung stellt
auch Kits bereit, die für
das erfindungsgemäße Verfahren
von Nutzen sind und vorzugsweise einen anti-p-GST-c-Jun-Antikörper oder
ein Fragment davon enthalten und ein eine oder beide Phosphorylierungsstellen
enthaltendes GST-c-Jun-Protein sowie einen Antikörper mit dem sich JNK1, JNK2
und/oder JNK3 durch Immunpräzipitation anreichern
lassen. Der Kit kann außerdem
JNK/SAPKs oder aktive Teile davon enthalten, z.B. zur Kontrolle
oder zur genauen Quantifizierung sowie Protein A-Sepharose-Beads zur
Immunpräzipitation.
Je nach Ausgestaltung des Kits kann der Antikörper an eine weitere Einheit
konjugiert sein, beispielsweise eine Markierung und/oder er kann
auf einem festen Träger
(Substrat) immobilisiert sein. Der Kit kann auch einen zweiten Antikörper zum
Nachweis von p-GST-c-Jun/Antikörper-Komplexen
enthalten. Der Antikörper
oder das Fragment davon können
frei vorliegen oder an einen festen Träger immobilisiert sein, beispielsweise
eine Plastikschale, ein Teströhrchen,
eine Mikrotiterplatte, ein Teststäbchen etc. Der Kit kann auch
Anleitungen enthalten, die die Verwendung der enthaltenen Verbindungen
in einem Assay zur Bestimmung der JNK/SAPKs-Aktivität erläutern. Der
Kit kann weiterhin geeignete Reagenzien zum Nachweis von Markierungen
oder zur Markierung positiver und negativer Kontrollen, Waschlösungen,
ECL-Reagenzien (Fa. Amersham, Braunschweig), Verdünnungspuffer
etc. enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch für Zwecke
von Nutzen, bei denen eine auf der Aktivierung von JNK/SAPKs beruhende
Krebstherapie durchgeführt
wird. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren
zur Beurteilung der Wirksamkeit einer Krebstherapie, dadurch gekennzeichnet,
dass die therapeutische Aktivierbarkeit der JNK/SAPKs über das
vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren bestimmt wird,
vorzugsweise zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf der Therapie.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist, daß JNK/SAPKs
vollständig
aus einem Zell-Lysat immunpräzipitiert
werden. Deshalb kann man mit dieser Methode nicht nur die Phosphorylierung
von c-Jun, sondern selektiv die Phosphorylierung aller Substrate
der JNK/SAPKs analysieren. Zu diesen Substraten zählen z.B.
die Transkriptionsfaktoren (TCF)/Elk-1, c-Jun, Jun B, Jun D und
ATF-2. Der Nachweis der phosphorylierten Proteine erfolgt über einen
Antikörper,
der spezifisch die phosphorylierte Form der entsprechenden Transkriptionsfaktoren
erkennt.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Schema zum erfindungsgemäßen Assay
JNK/SAPKs werden mit spezifischen
Antikörpern
(FL, C-17, Fa. Santa Cruz) immunpräzipitiert, an Protein-A-Sepharose
gebunden und anschließend
mit nichtradioaktivem ATP und GST-c-Jun-Protein inkubiert. Die Aktivität von JNK/SAPKs
führt zur Phosphorylierung
des GST-c-Jun-Proteins an Ser-63 und Ser-73. Die Menge der Phosphorylierung,
die die Aktivität
von JNK/SAPKs reflektiert, kann über
Western-Blot Analyse mittels eines phospho-c-Jun-spezifischen Antikörpers nachgewiesen
werden.
2 Spezifische Phosphorylierung von GST-c-Jun 1-166
in dem erfindungsgemäßen Assay.
Lysate von JURKAT-Zellen, die 4 Stunden mit
Cisplatin (1 μg/ml)
behandelt worden waren, um die JNK/SAPKs zu aktivieren, wurden zur
Immunpräzipitation
von JNK/SAPKs mit den polyklonalen Kaninchen-IgG-Antikörpern FL
und C17 (Santa Cruz) und Protein-A-Sepharose verwendet. Die Kinase-Reaktion
wurde durch Inkubation des Immunpräzipitats mit Kinase-Puffer
und unmarkiertem ATP (Spur a) oder mit Kinase-Puffer, unmarkiertem
ATP und GST-c-Jun 1-166 als Substrat (Spur d) durchgeführt. Alternativ
wurde der Kinase-Puffer nur mit GST-c-Jun 1-166 und unmarkiertem
ATP ohne Immunpräzipitat inkubiert
(Spur b). Die verschiedeneren Reaktionsgemische oder nur Kinase-Puffer
(Spur c) wurden mittels 12% SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Western-Blot
analysiert. Das MG (in kDa) ist auf der linken Seite der Figur angegeben.
Die Phosphorylierung des GST-c-Jun-Proteins wurde mittels einem polyklonalem
phospho-c-Jun-Ser73-spezifischen IgG-Antikörpers (New
England BioLabs) und verstärkter
Chemilumineszenz nachgewiesen. Erklärung zum Verfahren: Bei der
verstärkten
Chemilumineszenz wird ein Peroxidase-gekoppelter Sekundärantikörper an
den Primärantikörper gebunden. Gibt
man eine Lösung
zu, die das Substrat "Luminol" enthält, wird
Luminol von der Peroxidase zersetzt und es kommt zu einer Lichtreaktion.
Die Menge des entstehenden Lichtes kann quantitativ auf einem Röntgenfilm
oder im Luminometer erfaßt
werden.
Insgesamt 1 × 107 JURKAT-Zellen
(Zellbank des Deutschen Krebsforschungszentrums, Heidelberg; Kultivierung
bei 37°C
in einem Inkubator in RPMI-1640 Medium, welches 10% Hitzeinaktiviertes
fötales
Kälberserum
(Fa. Biochrom, Hamburg), 25 mM HEPES und 2 mM L-Glutamin (Fa. GIBCO/Life
Technologies, Eggenstein, Deutschland) enthält) wurden in eiskaltem PBS
gewaschen und anschließend
in 400 μl
Flag-Puffer (20 mM Tris, pH-Wert 7,5, 137 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1%
Triton X-100TM, 10% Glycerin, 25 mM β-Glycerinphosphat,
2 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Na3VO4; pH-Wert 10, 0, 1 mM PMSF, 10 μg/ml Aprotinin,
10 μg/ml
Leupeptin) lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation (20 min,
2°C, 13.000 UpM)
geklärt
und der Zellkern-freie Überstand,
der nur die Proteine des Zytoplasmas und der Membranen enthielt,
wurde in ein neues Gefäß überführt. Nach
Bestimmung des Proteingehaltes wurden je 200 μg Protein mit je 1,5 μl polyklonalem
IgG-Kaninchen-Antikörper
gegen JNK1 und JNK3 (C-17, sc-474; Fa. Santa Cruz, Heidelberg, Deutschland; gerichtet
gegen die Aminosäuren
369 bis 384 des C-Terminus) oder gerichtet gegen JNK1, JNK2 und JNK3
(FL, Fa. Santa Cruz, Aminosäuren
1 bis 384 von JNK1) zugegeben und das Gemisch wurde 45 min. bei
Raumtemperatur durch Rotation vermischt. Danach wurden 25 μl einer Suspension
von Protein-A-Sepharose-Kügelchen
(Sigma, Deisenhofen, Deutschland) zugegeben und das Gemisch wurde
1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rotation inkubiert. Die Kügelchen
wurden zur Entfernung unspezifisch gebundener Proteine zweimal mit
Flag-Puffer gewaschen und einmal mit Kinase-Puffer. Die Kinase-Reaktion
wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl in Gegenwart von nichtmarkiertem
ATP (100 μM)
und GST-c-Jun-Fusionsprotein (2 μg)
durchgeführt,
das die beiden N-terminalen Phosphorylierungsstellen Ser63 und Ser73
enthält,
die für
die Phosphorylierung durch JNK/SAPKs essentiell sind (1). Dazu wurden die Protein-A-Sepharose-Kügelchen
in 50 μl Kinase-Puffer suspendiert,
der aus 25 mM HEPES, pH-Wert 7,4, 25 mM MgCl2,
25 mM β-Glycerophosphat,
100 μM ATP
(Roche, Mannheim, Deutschland), 0,1 mM Na3VO4 und 2 μg
GST-c-Jun 1-166 bestand, das wie von van Dam et al., EMBO J. 14
(1995), 1798-1811, beschrieben hergestellt worden war, oder alternativ
2 μg GST-c-Jun 1-79 (Santa
Cruz). Nach Inkubation für
25 min. bei 37° wurde
die Reaktion durch Zugabe von 30 μl
3 × SDS-Auftragspuffer (187,5
mM Tris-HCl, pH-Wert 6,8, 6% SDS, 30% Glycerin, 10% β-Mercaptoethanol,
0,3% Bromphenolblau) beendet. Die Produkte wurden mittels 12% SDS-PAGE
unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf ECL-Membranen
(Amersham, Braunschweig, Deutschland) übertragen. Phosphoryliertes
GST-c-Jun-Protein
wurde mit einem polyklonalen Kaninchen-IgG-phospho-spezifischen anti-c-Jun(Ser73)-Antikörper (New
England Biolabs) angefärbt,
der in einer Verdünnung
von 1:5.000 verwendet wurde. Dieser Antikörper erlaubte die spezifische
Bestimmung der JNK/SAPKs-induzierten Phosphorylierung von c-Jun an Ser73, wobei
diese Stelle für
die c-Jun-abhängige
transkriptionelle Aktivität wichtig
ist. Gebundene Antikörper
wurden über
anti-Kaninchen-Meerettichperoxidase-Konjugat (Santa Cruz, Heidelberg)
in einer Verdünnung
von 1:5.000 und anhand verstärkter
Chemilumineszenz nachgewiesen. Die Spezifität des Assays wurde durch die Durchführung der
Kinase-Reaktion
in Abwesenheit oder Gegenwart von GST-c-Jun, Immunpräzipitats oder
ATP bestimmt. Nur die Kinase-Reaktion, die alle Reagenzien zusammen
enthielt, ergab ein starkes Signal (2).
Eine schwache Bande, die in der Reaktion ohne GST-c-Jun sichtbar
ist (Spur a) dürfte durch
die Phosphorylierung von endogenem Jun-Protein entstanden sein, das
zusammen mit JNK/SAPKs präzipitierte.
Die Doppelbande entspricht mono- und bi-phosphoryliertem Jun-Protein. Dieser
Assay erforderte nur Entwicklungszeiten im Sekundenbereich und zeigte
nur eine sehr geringe Hintergrundbindung. Er ist somit hochempfindlich und
es kann davon ausgegangen werden, dass dieser Assay um Größenordnungen
empfindlicher ist im Vergleich zu den bisherigen auf 32P-Markierung
basierenden Assays.