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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Verfahren
zur Identifizierung von Mitteln, welche durch Transforming Growth
Factor Beta (TGF-β)
und Mitgliedern der TGF-β-Familie,
wie etwa Bone Morphogenic Protein (BMP), vermitteltes Signalisieren
modulieren. Die Erfindung bezieht sich stärker bevorzugt auf Screenings
zur Verwendung in der Bewertung der Eignung von Mitteln, Smad-Proteindegradation
zu modulieren, und auf Verfahren, welche solche Mittel zur Steigerung
oder Inhibierung von BMP-vermitteltem Signalisieren in einer Vielfalt
von Zelltypen verwenden.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Transforming Growth Factor Beta (TGF-β)-Superfamilie ist eine große Familie
von multifunktionalen Proteinen, welche eine Vielfalt von zellulären Funktionen,
einschließlich
zellulärer
Proliferation, Migration, Differenzierung und Apoptose, regulieren.
Für TGF-β, dem Gründungsmitglied
der TGF-β-Familie,
wurde gezeigt, dass es eine Vielfalt von Rollen spielt, welche von
embryonaler Musterbildung bis Zellwachstumsregulierung in adulten
Geweben reichen. TGF-β übt seine
biologische Funktion durch Signaltransduktionskaskaden aus, welche
letztlich die Expression einer Reihe von spezifischen Genen aktivieren
und/oder suprimieren. Andere TGF-β-Familienmitglieder
umfassen Aktivine, Inhibine und Bone Morphogenic Proteins (BMPs). BMP-vermittelte
Signaltransduktion ist für
eine Reihe normaler Prozesse, welche Knochenwachstum und die Funktion
des Nervensystems, Augen und Organe wie etwa Nieren umfassen, wichtig.
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TGF-β-Familienmitglieder
initiieren im Allgemeinen Signaltransduktion, in dem sie zuerst
an einen Rezeptor binden. TGF-β löst zum Beispiel
sein Signal aus, indem es zuerst an seinen Typ II Rezeptor bindet,
dann erfolgt die Rekrutierung und Aktivierung seines Typ I Rezeptors.
Die aktivierten Typ I Rezeptoren phosphorylieren dann ihre intrazellulären Signaltransduktionsmoleküle, die
Smad-Proteine (Heldin et al., Nature 390:465–471, 1997; Derynck et al.,
Cell 95:737–740,
1998). In ähnlicher
Weise bindet BMP an BMP-Serin/Threonin-Transmembranrezeptorproteinkinasen.
Die Signale werden weiter von den Rezeptoren zum Kern transduziert,
wodurch ein verändertes
Genexpressionsmuster hervorgerufen wird. Signaltransduktion vom BMP-Rezeptor
zum Kern ist dafür
bekannt, Proteine der Smad-Familie zu beinhalten, von welchen manche
in Transkriptionskomplexe inkorporiert werden und nachgeordnete
Gene aktivieren.
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Smads
sind rezeptoraktivierte, signaltransduzierende Transkriptionsfaktoren,
welche Signale von Rezeptoren der TGF-β-Familie weiterleiten. Mitglieder
der Smad-Proteinfamilie wurden durch Homologie zu dem Drosophila
Gen Mothers Against dpp (mad) identifiziert, welches ein essentielles
Element in dem Drosophila dpp Signaltransduktionsweg kodiert (siehe
Sekelsky et al., Genetics 139:1347–1358, 1995; Newfeld et al.,
Development 122:2099–2108,
1996). Smad-Proteine sind im Allgemeinen durch hoch konservierte
amino- und carboxy-terminale Domänen
charakterisiert, welche durch einen Prolin-reichen Linker separiert
sind. Die amino-terminale Domäne
(die MH1 Domäne)
vermittelt DNA-Bindung und die carboxy-terminale Domäne (die MH2
Domäne)
assoziiert mit dem Rezeptor.
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Bisher
wurden acht Smad-Proteine identifiziert und deren Beteiligung in
durch TGF-β-Familienmitglieder
induzierten Signalantworten dargestellt (siehe Kretzschmar und Massague,
Current Opinion in Genetics and Development 8:103–111, 1998).
Diese Smads können
in drei Untergruppen eingeteilt werden. Eine Gruppe (Smads1, 2,
3, 5 und 8) umfassen Smads, welche direkte Substrate einer Rezeptorkinase
der TGF-β-Familie
sind. Eine andere Gruppe (Smad 4) umfasst Smads, welche nicht direkt
Rezeptorsubstrate sind, welche aber durch Assoziation mit rezeptoraktivierten
Smads im Signalisieren teilnehmen. Die dritte Gruppe von Smads (Smad6
und Smad7) besteht aus Proteinen, welche Aktivierung von Smads aus
den ersten beiden Gruppen inhibieren.
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Smads
haben spezifische Rollen in den Wegen der unterschiedlichen TGF-β-Familienmitglieder. Unter den
für TGF-β-Familienmitglieder
identifizierten Smad-Proteinen sind Smad2 und Smad3 spezifisch für TGF-β-Signalisieren
(Heldin et al., Nature 390:465–471,
1997). Die aktivierten Smad2 und Smad3 interagieren mit dem verbreiteten
Vermittler Smad4 und translozieren in Kerne, wo sie eine Reihe spezifischer
Gene aktivieren (Heldin et al., Nature 390:465–471, 1997). Der TGF-β Weg verwendet
die signalinhibitorischen Proteine Smad6 und Smad7, um den Netto-Output
des Signalisierens zu balancieren, sowie direkte Aktivierung von Smad2
und/oder Smad3. Im Falle des BMP-vermittelten Signalisierens werden
im Anschluss an die Bindung eines BMP an einen BMP-Rezeptor Smad1 und
Smad5 an den Rezeptor rekrutiert und phosphoryliert. Sobald diese
Proteine phosphoryliert sind, bilden Smad1 und Smad5 mit Smad4 einen
Komplex und der Komplex transloziert in den Kern, wodurch die Aktivierung
von BMP-vermittelter Gentranskription hervorgerufen wird.
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Obwohl
Smad2 und Smad3 intrinsische Transaktivierungsaktivität als Transkriptionsfaktor
besitzen (Zawel et al.; Mol Cell 1:611–617, 1998), wurde durch Studien
demonstriert, dass sie größtenteils
durch spezifische Interaktion mit anderen Kernfaktoren spezifische
Genexpression aktivieren (Derynck et al., Cell 95:737–740, 1998).
Ein spezifischer TGF-β-vermittelter
Effekt auf einen bestimmten Zelltyp kann durch Aktivierung eines
spezifischen Smad-Proteins erreicht werden, wodurch Veränderungen
in der Expression von spezifischen Genen hervorgerufen werden. Das
Zusammenspiel oder Crosstalk von unterschiedlichen Signaltransduktionswegen
ist essentiell, um eine balancierte und integrierte Antwort auf
die Summe aller Signale auf eine bestimmte Zelle unter bestimmten
Bedingungen zu ermöglichen.
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Es
wurde herausgefunden, dass TGF-β-induziertes
Signalisieren auf dem Level von Smad mit dem Ras-vermitteltem MAP-Kinaseweg
und dem Jak/Stat-Weg
Crosstalk betreibt (Ulloa et at., Nature 397:710–3, 1999; Kretzschmar et al.,
Nature 389:618–22,
1997).
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Wie
oben erwähnt,
spielt TGF-β eine
Rolle in der Regulation von Zellwachstum. Abhängig von dem Typ oder/und der
Wachstumsphase der antwortenden Zellen kann TGF-β ein Wachstumsstimulator oder
ein Wachstumsinhibitor sein. Als potenter negativer Wachstumsregulator
von Epithelialzellen spielt TGF-β eine wichtige
Rolle in der epithelialen Karzinogenese (Cui et al., Cell. 86:531–542, 1996).
Es wurde gezeigt, dass TGF-β durch Induktion
von zyklinabhängigen
Kinaseinhibitoren wie etwa p15 und p21 Zellwachstumsarretierung
verursacht (Hannon et al., Genes Dev. 9:1831–45, 1995) und eine TGF-β-Typ II-Rezeptormutation,
welche Zellen gegenüber
TGF-β resistent
macht, zu einer Verstärkung
des karzinogenen Zustands von Zellen führt (Markowitz et al., Science
268:1336–8,
1995). Mutationen in Smad-Genen wurden auch mit Krebs assoziiert.
Es wurde herausgefunden, dass manche Darmkarzinome im Tumorsupressorprotein
Smad2 Mutationen tragen (Eppert et al., Cell 88:543–552, 1996;
Hata et al., Nature 388:82–87,
1997). Es wurde auch gezeigt, dass Smad4 in humanen Pankreaskarzinomen
und vielleicht in anderen Tumoren ein Tumorsuppressorgen ist. Smad3-mutierte
Mäuse entwickeln
metastasierenden colorektalen Krebs (Zhu et al., Cell 94:703–714, 1998), was
nahelegt, dass Smad3 eine Rolle im humanen Darmkrebs spielen könnte. In
anderen Zusammenhängen scheinen
TGF-β und
Mitglieder des TGF-β-Wegs
eine zellwachstumsfördernde
Rolle zu spielen. Es wurde berichtet, dass in frühen Stadien der Karzinogenese
TGF-β als
Tumorförderer
wirkt. In einer späteren
Phase kann TGF-β maligne
Progression stimulieren. Es wurde kürzlich demonstriert, dass TGF-β im Anschluss
an Organtransplantationen direkt in der Förderung von Malignizität beteiligt
ist (Hojo et al., Nature 397:530–534, 1999). Demnach kann TGF-β Tumorzellinvasion
und Metastase fördern
und Verfahren zur Modulation von TGF-β-Signalisieren könnten Möglichkeiten
zur Verfügung
stellen, eine effektive Krebstherapie zu entwickeln.
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Obwohl
gewisse Aspekte von TGF-β-
und BMP-vermitteltem Signalisieren verstanden sind, ist weiteres
Wissen über
diese Signalwege nötig,
um die Entwicklung therapeutischer Mittel, welche solch Signalisieren modulieren,
zu vereinfachen. Demgemäß besteht
in der Fachwelt ein Bedürfnis
an einem verbesserten Verständnis
der molekularen Mechanismen des TGF-β- und BMP-vermittelten Signalisierens
und an der Entwicklung von Mitteln, welche solch Signalisieren modulieren.
Die vorliegende Erfindung erfüllt
dieses Bedürfnis
und stellt weiterhin andere ähnliche
Vorteile bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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In
Kürze dargestellt,
stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung von
Mitteln, welche durch TGF-β und/oder
andere Mitglieder der TGF-β-Familie,
wie etwa BMP, vermittelte Signaltransduktion modulieren, bereit.
Im Rahmen gewisser Aspekte umfassen solche Verfahren die Schritte
(a) Inkontaktbringen (i) eines ersten Polypeptids, umfassend eine
HECT-E3-Ubiquitinligase-WW-Domäne, worin
die HECT-E3-Ubiquitinligase-WW-Domäne die in
SEQ ID NO:11 gezeigte Sequenz umfasst, in der die Fähigkeit
des Polypeptids zur Bindung an ein Smad-Protein in Bezug auf die
HECT-E3-Ubiquitinligase
nicht wesentlich vermindert ist; (ii) eines zweiten Polypeptids,
umfassend ein Smad-PY-Motiv, umfassend die in SEQ ID NO:20 gezeigte
Sequenz, in der die Fähigkeit
des Polypeptids zur Bindung an eine E3-Ubiquitinligase in Bezug auf ein natives Smad-Protein,
umfassend das PY-Motiv, nicht wesentlich vermindert ist; und (iii)
eines Kandidatenmittels; wobei der Schritt des Inkontaktbringens
unter Bedingungen, die einen nachweisbaren Bindungsgrad des ersten Polypeptids
an das zweite Polypeptid in Abwesenheit von Kandidatenmittel zulassen,
durchgeführt
wird; (b) Bestimmen eines Bindungsgrads des ersten Polypeptids an
das zweite Polypeptid; und (c) Vergleichen des Bindungsgrads mit
einem Kontroll-Bindungsgrad des ersten Polypeptids an das zweite
Polypeptid in Abwesenheit von Kandidatenmittel.
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Im
Rahmen anderer Aspekte umfassen solche Verfahren die Schritte: (a) Inkontaktbringen
(i) eines Kandidatenmittels; (ii) einer ubitritinierten HECT-E3-Ubiquitinligase,
worin die HECT-E3-Ubiquitinligase eine WW-Domäne einschließt, umfassend
die in SEQ ID NO:11 gezeigte Sequenz; und (iii) eines Smad-Proteins oder
einer Varianten davon, das/die ein PY-Motiv umfassend; umfassend
die in SEQ ID NO:20 gezeigte Sequenz, worin der Kontakt unter Bedingung
und für
eine Zeitdauer stattfindet, die ausreichend sind, um die Ubiquitinierung
des Smad-Proteins oder einer Varianten davon durch die HECT-E3-Ubiquitinligase
in Abwesenheit von Kandidatenmittel zuzulassen (b) Bestimmen eines
Ubiquitinierungsgrads des Smad-Proteins oder einer Variante davon;
und (c) Vergleichen des Ubiquitinierungsgrads mit einem Kontroll-Ubiquitinierungsgrad
in Abwesenheit von Kandidatenmittel.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Diagramm, welches den allgemeinen Mechanismus der Ubiquitin(Ub)-Ligation
an Zielproteine illustriert. Ubiquitinierung wird durch einen ATP-abhängigen Transfer
eines Ubiquitin-Monomers auf Enzym 1 (E1) in der Ubiquitinkaskade
initiiert. Im Anschluss an die Ubiquitinaktivierung von E1 findet
ein Transfer von Ubiquitin auf ein Ubiquitinträgerprotein (E2) statt. Der
Transfer von Ubiquitin an ein Zielprotein wird durch Ubiquitinligasen
vermittelt (E3's).
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2 ist
ein Western-Blot, welcher die Induktion von Smad1-Degradation durch
BMP illustriert. Wie angezeigt, ist der Level an mit einem Tag versehenem
Smad1 in transfizierten Fällen
im Anschluss an eine Behandlung mit BMP und/oder LLF (Leu-Leu-Phe,
ein Proteasom-Inhibitor) dargestellt.
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3 ist
ein Western-Blot, welcher Smad1-Ubiquitinierung illustriert. Wie
angezeigt, wurden COS-Zellen, welche mit einem HA-Tag versehenes
Smad1 exprimieren, mit einem oder mehreren von BMP, LLF und/oder
Ubiquitin (Ub) behandelt. Zellen wurden lysiert und Smad1 wurde
immunprezipitiert. Wie angezeigt, wurden die Western-Blots mit Anti-HA-
und Anti-Ubiquitin-Antikörpern sondiert.
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4 ist
ein Autoradiogramm, welches die Bindung von WWP1.1 an das PY-Motiv
von Smad1 illustriert. Untransfizierte COS-Zellen (COS) oder COS-Zellen, welche mit
mit einem HA-Tag versehenem Smad1 oder verändertem Smad1 mit einem mutierten
PY-Motiv (Smad1*) transfiziert wurden, wurden lysiert. Smad1 wurde
immunprezipitiert und mit 32P-markierten
GST-Fusionsproteinen
von der WWP1.1-WW-Domäne
inkubiert. Wie angezeigt, wurde gebundenes WWP1.1 dann autoradiographisch
detektiert.
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5A–5D sind
Histogramme, welche die Bindung von PY-Motivpeptiden an WWP1-WW-Domänepeptide
illustrieren. Vier GST-Fusionspeptide
wurden untersucht: GST-WWP1.1 (5A), GST-WWP1.2 (5B),
GST-WWP1.3 (5C) und GST-WWP1.4 (5D).
In jeder Abbildung ist auch die Bindung an GST alleine gezeigt (quer-schraffierte
Säulen,
wie angezeigt). WW-Domänepeptide
wurden in den angegebenen Rezeptorbeschichtungskonzentrationen auf
Polystyrolplatten beschichtet und mit BSA abgesättigt. Wie angezeigt, wurden
dann biotinylierte PY-Motivpeptide (Nedd, mutiertes Nedd und WBP1)
dazugegeben. Bindung wurde unter Verwendung eines zeitauflösenden Fluoressenzassays
ermittelt und ist als Bindungsaktivität (cps) dargestellt.
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6A–6D sind
Graphen, welche die Bindung von Smad PY-Motivpeptiden an WWP1-WW-Domänepeptide
illustrieren. Vier GST-Fusionspeptide
wurden untersucht und sind in jedem Graphen dargestellt: GST-WWP1.1, GST-WWP1.2,
GST-WWP1.3 und GST-WWP1.4. Bindung an GST alleine ist auch gezeigt
(unausgefüllte
Quadrate). WW-Domänepeptide
wurden in der angezeigten Rezeptorbeschichtungskonzentration auf
Polystyrolplatten beschichtet und mit BSA abgesättigt. Biotinylierte PY-Motivpeptide
(Smad7 (6A), Smad6 (6B),
Smad2 (6C) und Smad3 (6D))
wurden dann wie angezeigt hinzugefügt. Bindung wurde unter Verwendung
eines zeitauflösenden
Fluoressenzassays ermittelt und ist als cps dargestellt.
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7A–7B sind
Graphen, welche die Bindung von Smad-PY-Motivpeptiden an WWP1-WW-Domänepeptide
illustrieren. Vier GST-Fusionspeptide
wurden untersucht und sind in jedem Graph dargestellt: GST- WWP1.1, GST-WWP1.2,
GST-WWP1.3 und GST-WWP1.4. WW-Domänepeptide
wurden in der angezeigten Rezeptorbeschichtungskonzentration auf
Polystyrolplatten beschichtet und mit BSA abgesättigt. Wie angezeigt, wurden
dann biotinylierte PY-Motivpeptide (Smad5 (7A) und
Smad1 (7B)) hinzugefügt. Bindung
wurde unter Verwendung eines zeitauflösenden Fluoressenzassays ermittelt
und ist als cps dargestellt.
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8A–8B sind
Graphen, welche die Bindung von ansteigenden Konzentrationen von
einem Smad7-PY-Motivpeptid an WWP1-WW-Domänepeptide
illustrieren. In 8A ist die Bindung von GST-Fusionspeptiden (GST-WWP1.1,
GST-WWP1.2, GST-WWP1.3 und GST-WWP1.4)
dargestellt, sowie die Bindung an RSP5.2-WW-Domäne. WW-Domänepeptide
wurden in der angezeigten Rezeptorbeschichtungskonzentration auf
Polystyrolplatten beschichtet und mit BSA abgesättigt. Biotinylierte PY-Motivpeptide wurden
dann in den angezeigten Konzentrationen hinzugefügt. Bindung wurde unter Verwendung
eines zeitauflösenden
Fluoressenzassays ermittelt und ist als cps dargestellt. Wie angezeigt,
stellt 8B eine Scatchard-Analyse des Smad7-PY-Motivs
an WWP1.2 und WWP1.4 dar.
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9A–9C sind
Autoradiogramme, welche die Aktivierung und Aktivität von E1
in einem gekoppelten Ubiquitinierungsassay illustrieren. 9A zeigt
ubiquitiniertes E1 (Spur 2), wobei die Präsenz von kovalent an markiertes
Ubiquitin gebundenes E1 durch die angezeigte Hochmolekulargewichtsbande
dargestellt ist. In 9B sind Banden, welche ubiquitiniertes
EI und E2 (UBC5c) anzeigen, in Spur 1 dargestellt und diese Ubiquitinierung
ist nicht in Spur 2 (Reaktion in der Abwesenheit von E1 durchgeführt) oder
Spur 3 (Reaktion in der Anwesenheit von DTT durchgeführt) vorhanden. 9C zeigt
ubiquitiniertes EI und E2 (UBC7) in Spur 1 und diese Ubiquitinierung
ist nicht in Spur 2 (Reaktion in der Abwesenheit von E1 durchgeführt) oder
in Spur 3 (Reaktion durchgeführt
in der Anwesenheit von DTT) vorhanden.
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10A–10C sind Autoradiogramme, welche die Ubiquitinierung
von der HECT-E3-Ligase-WWP1-WW-Domäne in einem gekoppelten Ubiquitinierungsassay
illustrieren. Wie angezeigt, ist in jeder Figur der Einbau von markiertem
Ubiquitin in eine WWP1-HECT-Domäne
beinhaltende Reste 611–985
oder 611–990
dargestellt. Wie angezeigt, wurden Reaktionen in Anwesenheit oder
Abwesenheit von DTT durchgeführt.
Ubiquitiniertes WWP1-GST
ist durch einen Pfeil angezeigt. In 10A war
das E2 UBC5c, und in 10B war das E2 UBS7. Kontrollen
(10C) wurden in der Abwesenheit von E2 durchgeführt.
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11A–11C sind Autoradiogramme, welche die Ubiquitinierung
von der HECT-E3-Ligase WWP1 in einem gekoppelten Ubiquitinierungsassay
illustrieren. In jeder Figur ist der Einbau von markiertem Ubiquitin
in eine WWP1-HECT-Domäne
beinhaltende Reste 611–985
dargestellt. Ebenso dargestellt sind ubiquitiniertes EI und E2.
Wie angezeigt, wurden die Reaktionen in der Anwesenheit oder Abwesenheit
von DTT durchgeführt.
In 11A war das E2 UBC5c und in 11B war das E2 UBS7. Kontrollen (11C) wurden in der Abwesenheit von E2 (Spur 1)
oder in der Anwesenheit von E1 und E2 (Spur 2) durchgeführt.
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12A–12C sind Autoradiogramme, welche den Zeitverlauf
der Ubiquitinierung von der HECT-E3-Ligase WWP1 in einem gekoppelten
Ubiquitinierungsassay illustrieren. In jeder Figur ist der Einbau von
markiertem Ubiquitin in eine WWP1-HECT-Domäne enthaltende Reste 611–985 im
Anschluss an verschiedene Inkubationszeiten, wie angezeigt, dargestellt.
In 12A war das E2 UBC5c und in 12B war das E2 UBS7. Eine Kontrolle (12C) wurde in der Abwesenheit von E2 in einer
60-Minuten-Reaktion durchgeführt.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Wie
oben erwähnt,
ist die vorliegende Erfindung im Allgemeinen auf Verfahren zur Identifizierung
von Mitteln, welche durch ein oder mehrere TGF-β-Familienmitglieder (z.B. Transforming
Growth Factor Beta (TGF-β)
oder Bone Morphogenic Protein (BMP)) vermitteltes Signalisieren
modulieren und auf Verfahren zur Verwendung solcher Mittel für therapeutische
Zwecke gerichtet. Die Mittel, welche unter Verwendung der hierdurch
zur Verfügung
gestellten Verfahren identifiziert wurden, modulieren im Allgemeinen
solch Signalisieren durch Targeting spezifischer Smad-Proteine innerhalb
von Zellen. Solche Mittel ermöglichen
einen leistungsstarken Weg, die Antwort von Zellen auf TGF-β-Familienmitglieder
zu verändern.
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Die
vorliegende Erfindung basiert in Teilen auf der Entdeckung, dass
durch TGF-β-Familienmitglieder vermitteltes
Signalisieren durch Ubiquitin-vermittelte
Degradation von gewissen Smad-Proteinen (wie Smad1 und Smad5 für BMP oder
Smad2 und Smad3 für
TGF-β) gedämpft wird.
Die Ubiquitin-vermittelte
Degradation ist im Allgemeinen durch die TGF-β-Familienmitglieder, welche
in der Auslösung
des Signalisierens beteiligt sind, induziert. Weiterhin wurde im
Zusammenhang der vorliegenden Erfindung heraus gefunden, dass HECT-E3-Ubiquitinligasen,
welche eine WW-Domäne
beinhalten, an ein PY-Motiv
in gewissen Smad-Proteinen binden, wodurch Ubiquitinierung und Proteasom-vermittelte
Degradation der Ziel-Smads hervorgerufen wird. Mittel, welche die
Bindung zwischen einer HECT-E3-WW-Domäne und einem Smad-PY-Motiv inhibieren, können im
Allgemeinen zur Inhibierung der Degradation von einem Smad-Protein
verwendet werden (d.h. Stabilisierung des Smad-Proteins), wodurch ein verstärktes TGF-β-Familienmitglied
vermitteltes Signalisieren hervorgerufen wird.
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Ubiquitin
vermittelte Proteindegradation ist durch den Ubiquitin-konjugierenden Weg
reguliert (1). Innerhalb dieses Wegs ist
selektive Ubiquitinierung durch ATP-abhängigen Transfer von einem Ubiquitin
Monomer auf Enzym 1 (E1) in der Ubiquitinkaskade initiiert. An E1
gebundenes Ubiquitin wird dann mit ATP aktiviert, um ein Ubiquitin-AMP-Intermediat
zu bilden. Das AMP wird durch das Cystein des aktiven Zentrums von E1
ersetzt, um eine Thioester-Verknüpfung
mit dem Carboxy-Terminus von Ubiquitin zu bilden. Ein zweites aktiviertes
Ubiquitin wird dann durch E1 gebildet, welches dem E1 ermöglicht,
Ubiquitin von dem Cystein seines aktiven Zentrums auf das Cystein
des aktiven Zentrums von einem Ubiquitin-Trägerprotein (E2) zu transferieren.
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Während dieses
Transfers beginnt die Diversität
in dem Ubiquitinierungsweg zu initiieren und zu amplifizieren. Der
höchste
Grad an Selektivität
in der Ubiquitinierungskaskade erfolgt auf dem Level des Ubiquitin-Transfers,
Ligation und Polymerisation auf ausgewählte Substrate. Dieser terminale
Schritt ist durch Ubiquitinligasen (E3's) vermittelt. E2 transferiert entweder
das Ubiquitin von seinem aktiven Zentrum auf das Cystein von einer-E3-Ubiquitinligase
oder auf das Zielprotein in einer E3-abhängigen Weise. Im Anschluss
an Transfer und Ligation von Ubiquitin auf Substrate durch E3 ist
das ubiquitinierte Protein Ziel für Degeration durch das 26S-Proteasom.
Selektivität
für Proteasom-vermittelte
Proteindegradation ist durch den Ubiquitin-Tag bestimmt.
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Wie
hier verwendet, ist eine HECT-E3-Ubiquitinligase eine E3-Ubiquitinligase,
welche eine HECT(Homologous to E6 Carboxyl Terminus)-Sequenz innerhalb
der katalytischen carboxy-terminalen Domäne beinhaltet.
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Ein
Smad-Protein ist ein Protein, welches zu bekannten Smad-Proteinen
homolog ist (d.h. welches mindestens 50% Identität der primären Sequenz in der MH2 Domäne aufweist)
und welches in der durch ein TGF-β-Familienmitglied
vermittelten Signaltransduktion teilnimmt (d.h. Expression eines
Smad-Proteins verstärkt
oder inhibiert detektierbar solche Signaltransduktion, welche unter
Verwendung jedes für
das bestimmte TGF-β-Familienmitglied
geeigneten Assays gemessen wurde). Smad-Proteine von besonderem
Interesse umfassen Smad1 (Hoodless et al., Cell 89:1165–1173, 1996),
Smad2 (Kakao et al., J. Biol. Chem 272:2896–2900, 1997); Smad3 (Zhang
et al., Nature 383:168–172,
1996), Smad5 (Liu et al., Nature 381:620–623, 1996), Smad6 (Imamura
et al., Nature 389:622–626,
1997) und Smad7 (Hayashi et al., Cell 89:1165–1173, 1997). Es wird indes
offensichtlich sein, dass jedes Smad-Protein, welches ein PY-Motiv
wie hier beschrieben beinhaltet, unter Verwendung der hier zur Verfügung gestellten
Verfahren stabilisiert werden könnte.
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ASSAYS FÜR MITTEL, WELCHE TGF-β-FAMILIENMITGLIEDER
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VERMITTELTES SIGNALISIEREN MODULIEREN
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Screening
assays für
Mittel, welche TGF-β-
und/oder BMP-vermitteltes Signalisieren oder durch ein oder mehrere
andere TGF-β-Familienmitglieder
vermitteltes Signalisieren modulieren, können in einer Vielzahl von
Ausführungen
durchgeführt
werden, welche zellbasierte und in vitro Assays umfassen. Im Allgemeinen sollte
solch ein Assay den Effekt eines Mittels bewerten, welches dieses
hat auf: (1) Bindung von einer HECT-E3-Ubiquitinligase-WW-Domäne an Smad-PY-Motiv;
(2) Ubiquitinierung eines Smad-Proteins durch E3 Ubiquitinligase;
(3) Proteolyse von einem Smad-Protein (z. B. durch Ermittlung des
zellulären
Levels eines Smad-Proteins) oder (4) HECT-E3-Ubiquitinligaseaktivität. Für Smad-Proteine
beinhaltende Assays können Mittel,
welche BMP-vermitteltes Signalisieren modulieren, durch die Verwendung
von Smad1 oder Smad5 (oder einer Variante von Smad1 oder Smad5)
identifiziert werden. Gleichermaßen können Mittel, welche TGF-β-vermitteltes Signalisieren
modulieren, durch die Verwendung von Smad2 oder Smad3 (oder einer
Variante von Smad2 oder Smad3) identifiziert werden.
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Kandidatenmittel,
welche innerhalb der hier zur Verfügung gestellten Assays gescreent
werden können,
umfassen, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Antikörper und
Antigenbindungsfragmente davon, konkurrierende Peptide, welche zu
einer WW-Domäne
oder PY-Motiv korrespondieren und andere natürliche oder synthetische Moleküle, wie
etwa kleine Inhibitormoleküle,
welche an eine HECT-E3-Ubiquitinligase oder ein Smad-Protein binden.
Kandidatenmittel können
in einer Bibliothek enthalten sein (z. B. eine Sammlung von Verbindungen).
Solche Mittel können
zum Beispiel durch DNA-Moleküle
in einer Expressionsbibliothek kodiert sein. Andere solche Mittel
umfassen Verbindungen, welche in der Fachwelt als „kleine
Moleküle" bekannt sind, welche
ein Molekulargewicht von weniger als 105 Daltons,
bevorzugt weniger als 104 Daltons und noch
mehr bevorzugt weniger als 103 Daltons haben.
Solche Kandidatenmittel können
als Mitglieder einer kombinatorischen Bibliothek, welche durch multiple
vorherbestimmte chemische Reaktionen hergestellte synthetische Mittel
(z. B. Peptide) beinhalten, zur Verfügung gestellt werden. Der Durchschnittsfachmann
wird sich darüber
bewusst sein, dass eine Vielzahl solcher Bibliotheken nach etablierten
Verfahren hergestellt werden können
und dass Mitglieder einer Kandidatenmittel-Bibliothek simultan oder
sequentiell wie hier beschrieben einem Screening unterzogen werden
können.
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In
vitro Assays können
für ein
schnelles Screening der Fähigkeit
von Kandidatenmitteln, Bindung von einer HECT-E3-Ubiquitinligase
an ein Smad-Protein
zu inhibieren, verwendet werden. Wie oben erwähnt, wurde im Zusammenhang
der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass diese Bindung zwischen
der WW-Domäne
von HECT-E3-Ubiquitinligase und des PY-Motivs von gewissen Smad-Proteinen
stattfindet. Entsprechend kann jeder in vitro Assay, welcher den
Effekt eines Kandidatenmittels auf diese Interaktion ermittelt, zur
Identifizierung von Mitteln verwendet werden, welche TGF-β-Familienmitglied
vermitteltes Signalisieren (z. B. durch ein oder mehrere Mitglieder
von der TGF-β-Familie,
umfassend TGF-β,
BMP, Aktivin(e) und/oder Inhibin(e), vermitteltes Signalisieren)
modulieren. Solche Assays ermitteln typischerweise den Effekt eines
Mittels auf die Bindung zwischen einem Polypeptid, umfassend eine
HECT-E3-WW-Domäne, oder
einer Variante davon, und einem Smad-PY-Motiv, oder einer Variante
davon.
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Eine
HECT-E3-WW-Domäne
ist, wie hier verwendet, eine Region von einer HECT-E3-Ubiquitinligase, welche
20 bis 22 Aminosäurereste
auseinanderliegende Tryptophanreste beinhaltet (s. M. Sudol, Prog.
Biophys. Molec. Biol. 65:113–132,
1996) und detektierbar an ein Smad-PY-Motiv bindet, wie hier beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform
genügt
eine WW-Domäne in der
nachfolgenden Sequenz: QPLPPGWERRVDDRRRVYYVDHNTRTTTWQRPTMESVR (SEQ
ID NO:11; WWP1-WW-Domäne
2).
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Ein
Smad-PY-Motiv ist eine 10–14
aufeinanderfolgender Aminosäurenanteil
von einem Smad-Protein, welcher eine PPxY(Pro-Pro-Xaa-Tyr; SEQ ID NO:14)-Sequenz
beinhaltet, in welcher x und Xaa beide eine Aminosäure representiert.
Solch ein PY-Motiv bindet weiterhin detektierbar an eine HECT-E3-Ubiquitinligase-WW-Domäne, wie
hier zur Verfügung
gestellt. Repräsentative
Smad-PY-Motive sind zum Beispiel in Smads1, 2, 3, 5, 6, und 7 vorhanden.
Smad-PY-Motive genügen
bevorzugt der Sequenz ELESPPPPYSRYPM (SEQ ID NO:20).
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Bevorzugt
beinhaltet eine WW-Domäne
oder PY-Motiv-Polypeptidvariante
konservative Substitutionen. Eine „konservative Substitution" ist eine, in welcher
eine Aminosäure
für eine
andere Aminosäure,
welche ähnliche
Eigenschaften hat, ausgetauscht ist, dergestalt dass ein Fachmann
auf dem Gebiet der Proteinchemie erwarten würde, dass die Sekundärstruktur
und hydropathische Natur des Polypeptids im Grunde unverändert ist.
Aminosäuresubstitutionen
können
im Allgemeinen basierend auf der Gleichheit in Polarität, Ladung, Löslichkeit,
Hydrophobizität,
Hydrophilität
und/oder der amphipathischen Natur der Reste gemacht werden. Zum
Beispiel umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und
Glutaminsäure;
positiv geladene Aminosäuren
umfassen Lysin und Arginin; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren
Kopfgruppen mit ähnlichen
Hydrophilitätswerten
umfassen Leucin, Isoleucin und Valin; Glycin und Alanin; Asparagin
und Glutamin; und Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin. Andere
Gruppen von Aminosäuren,
welche konservative Austausche darstellen können: (1) Ala, Pro, Gly, Glu,
Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu,
Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; und (5) Phe, Tyr, Trp, His. Eine
Variante oder eine Alternative könnte
auch nicht konservative Austausche enthalten. Varianten (oder Alternativen)
könnten
auch zum Beispiel durch Deletion oder Addition von Aminosäuren, welche
einen minimalen Einfluss auf die Sekundärstruktur und die hydropathische
Natur des Polypeptids haben, modifiziert werden.
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WW-Domäne und PY-Motiv-Polypeptide
können
zusätzliche
Sequenzen umfassen, welche zu einem endogenen Protein unähnlich sind.
Solche Sequenzen umfassen Signale (oder Führungs-)sequenzen am N-terminalen
Ende des Proteins, welche cotranslational oder posttranslational
den Transfer des Proteins vermitteln. Das Polypeptid könnte auch
an einen Linker oder an eine andere Sequenz zur Vereinfachung der
Synthese, Reinigung oder Identifizierung des Polypeptids (z. B.
poly-His) oder zur Verstärkung
der Bindung des Polypeptids an einen festen Träger konjugiert sein. Zum Beispiel
könnte
ein Polypeptid an eine Immunoglobulin Fc Region konjugiert sein.
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Das
WW-Domänepolypeptid
und das PY-Motiv-Polypeptid werden unter Bedingungen in Kontakt
gebracht, welche die Bindung zwischen den beiden Polypeptiden in
der Abwesenheit eines Kandidatenmittels erlauben. Kandidatenmittel
können
zum Reaktionsansatz vor oder nach dem Kontakt des WW-Domänepolypeptids
mit dem PY-Motiv-Polypeptid hinzugefügt werden. Die Reaktion wird
dann inkubiert und die Bindung des WW-Domänepolypeptids an das PY-Motiv-Polypeptid
wird unter Verwendung jedweder Standardtechnik ermittelt. Ein geeigneter
Bindungsassay verwendet einen festen Träger, wie oben beschrieben,
an welchen das Polypeptid angebracht ist. Bindung kann durch Entfernung
ungebundener Substanzen und Detektion der Anwesenheit des anderen
Polypeptids am festen Träger
festgestellt werden. Eine solche Detektion könnte zum Beispiel durch einen
Antikörper
oder ein Antigenbindungsfragment-Detektionsreagenz
oder unter Verwendung eines kompetitiven Assays mit markiertem Polypeptid,
wie oben dargestellt, erreicht werden. Alternativ kann das Polypeptid,
welches nicht auf einen Träger
immobilisiert ist, ein Tag umfassen, welches Detektion von gebundenem
Polypeptid erleichtert. Tags umfassen, ohne aber darauf beschränkt zu sein,
Biotin, Enzyme, radioaktive Gruppen (z. B. 32P),
Farbstoffe, lumineszierende Gruppen, fluoreszierende Gruppen und
andere Sequenzen, welche leicht von einem Detektionsreagenz gebunden
werden (z. B. antigene Sequenzen welche spezifisch durch bestimmte
Antikörper
gebunden werden). Im Allgemeinen sollte ein Mittel die Bindung zwischen dem
WW-Domänepolypeptid
und dem PY-Motiv-Polypeptid detektierbar modulieren.
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Beispielhaft
könnte
ein Polypeptid (zum Beispiel ein WW-Domänepolypeptid
oder ein PY-Motiv-Polypeptid) durch unspezifische Interaktion (z.
B. an eine Polystyrolplatte) oder durch eine Protein-Tag-Interaktion (z. B.
eine Interaktion zwischen einem His6-Fusionsprotein
und einer Nickelplatte) immobilisiert werden. Das Polypeptid kann
zum Beispiel durch Kontaktieren einer Polystyrolassayplatte (Costar)
mit dem Polypeptid über Nacht
bei 4° Celsius
in einem 200 mM Carbonatpuffer (Pierce, Rockford IL) in einem Konzentrationsbereich von
0,3 bis 30 μg/mL
immobilisiert werden. Ungebundenes Polypeptid könnte durch Waschen mit destilliertem, deionisiertem
Wasser entfernt werden und die Platten könnten dann mit 1% BSA/Carbonatpuffer
für zwei
Stunden bei Raumtemperatur abgesättigt
werden. Platten könnten
dann mit Tris/Tween-Puffer (50 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 1% BSA, 1 mM DTT 0,1% Tween20, Protease-Inhibitorcocktail
(Boehringer-Mannheim) gewaschen werden. Die anderen Polypeptide
könnten
markiert (z. B. biotinyliert) werden und eine Bindung an das immobilisierte
Polypeptid (z. B. gelöst
in Tris/Tween-Puffer und inkubiert in den Assayplatten bei 4° Celsius
für unterschiedliche
Zeitintervalle) zugelassen werden. Platten könnten dann mit PBS/0.1 % Triton X100
gewaschen werden. Bindung könnte
zum Beispiel durch Sondierung der Assaykammern mit 1 μg/mL Europium-markiertem Streptavidin
(DELFIA; Wallac Oy, Turku, Finnland) in DELFIA Assay-Puffer/0,1
% Triton X 100 für
eine Stunde bei Raumtemperatur detektiert werden. Ungebundenes Europium-markiertes
Streptavidin könnte
durch Waschen mit PBS/0,1 % Triton X 100 entfernt werden. Europium
könnte
für zeitauflösende Fluoressenz(TRF)-Messungen
mit dem DELFIA-Verstärkungspuffer
freigesetzt werden. TRF-Messungen könnten zum Beispiel mit einem
DELFIA 1234 (Wallac Oy, Turku, Finnland) Fluorometer gemacht werden.
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Im
Rahmen ähnlicher
Assays könnte
eine radioaktive Markierung das Biotin ersetzen. Zum Beispiel könnte ein 32P-markiertes Polypeptid durch Phosphorylierung
einer geeigneten Stelle verknüpft
an das WW-Domänepolypeptid
oder das PY-Motivpolypeptid erzeugt werden. Eine solche Stelle ist
die PKA-Stelle in dem pGEX KG Vektor (Pharmingen), welche unter
Verwendung von α-[32P]-ATP und Proteinkinase A (Sigma) markiert
werden könnte.
Die Menge an Bindung könnte
zum Beispiel durch Cerenkov-Zählung
oder SDS-PAGE unter Verwendung von Standardtechniken quantifiziert
werden. Der verwendete feste Träger
könnte
auch variiert werden. Ein für
solche Assays geeigneter Träger
ist Neutravidin-Agarose-Beads (Pierce, Rockford, IL). Bindung könnte unter
Verwendung solch eines Trägers
durch Inkubation in einem PBS/1 % Tween20-Puffer in einem "End-Over"-Schüttler bei
4° für variierende
Zeitintervalle durchgeführt
werden. Es ist offensichtlich, dass jeder dieser Assays modifiziert
werden könnte,
um Immobilisation zu ermöglichen,
nachdem Bindung stattgefunden hat.
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Um
den Effekt eines Kandidatenmittels auf die Bindung der WW-Domäne an das
PY-Motiv zu bestimmen, wird der Bindungsgrad in Anwesenheit und
Abwesenheit des Kandidatenmittels verglichen. Ein Mittel, welches
detektierbar solche Bindung inhibiert oder verstärkt, könnte zur Veränderung
von TGF-β-Familienmitglied
vermitteltem Signalisieren in einer Zelle verwendet werden. Bevorzugte
Mittel modulieren TGF-β- und/oder
BMP-vermitteltes Signalisieren.
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Andere
in vitro Assays könnten
entwickelt werden, um den Effekt eines Mittels auf die Ubiquitinierung einer
E3-Ubiquitinligase und/oder eines Smads zu ermitteln. In vitro Ubiquitinierungsreaktionen
sind in der Fachwelt gut bekannt. Zum Beispiel könnten gekoppelte Ubiquitinierungsassays
(in welchem Ubiquitintransfer von E1 zu E2 und von E2 zu E3 beobachtet
wird) angewendet werden. Solche Assays erfordern die Rekonstruktion
eines E1/E2/E3-Wegs. Rekombinante E1- und E2-Komponenten sind von
einer Reihe von Quellen (z. B. BostonBiochem, Cambridge, MA) erhältlich,
um Ubiquitin an eine E3-Ligase von Interesse zu koppeln. Radiomarkiertes
Ubiquitin könnte
unter Verwendung von Standardverfahren wie zum Beispiel PKA-vermitteltem Einbau
von [32P]-Phosphat von α-[32P]-ATP
an die PKA-Stelle des GST-Ubiquitin-Fusionsproteins (pGEX KG Expressionsvektor)
erzeugt werden. Ein geeigneter Ubiquitinassaypuffer ist: 50 mM Tris
pH7,6, 1 mM ATP, 0,2 mM EDTA, 5 mM MgCl2,
1 Einheit anorganische Pyrophosphatase, 0,005 % Triton X100 und
1 μM Staurosporin.
In einer 0.030 mL Reaktion sind im Allgemeinen die folgenden Mengen
an Reaktionskomponenten geeignet: 50–200 ng E1, 0,1–1 μg E2, 5 μg GST-Ubiquitin
(BostonBiochem, Cambridge, MA) und 50–200 ng E3. Reaktionen könnten bei
Raumtemperatur durchgeführt
werden und könnten
mit einem SDS-PAGE-Ladepuffer, welcher nicht Mercaptane enthält, beendet
werden. Reaktionen könnten
durch SDS-PAGE analysiert werden. Ein Assay kann in ähnlicher
Art mit endogenem Protein von zum Beispiel HeLa-Zellextraktfraktionen durchgeführt werden
(siehe Hershko et al., J. Biol. Chem. 258:8206–8214, 1983). Zur Messung von
Smad-Protein-Ubiquitinierung wird ein Smad-Polypeptid zur Reaktion
hinzugefügt.
Diese Assays könnten
zur Messung von Smad-Proteindegradation durch Beimischung von 100–1000 ng
von 20S-Proteasom
(BostonBioChem, Cambridge MA) in den Assay weiter modifiziert werden.
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Ein
Smad-Polypeptid zur Verwendung in einem solchen Assay könnte mit
einem Tag versehen werden, um die Detektion von kovalent angefügtem Ubiquitin
zu erleichtern. Solch ein Polypeptid könnte ein Vollänge-Smad-Protein
oder könnte
ein trunkiertes Protein oder eine Variante davon sein, vorausgesetzt,
dass das Polypeptid ein funktionelles PY-Motiv und eine Ubiquitinierungsstelle
aufweist. Eine Ubiquitinierungsstelle könnte basierend auf den in der
Fachwelt bekannten Kriterien identifiziert werden. Zum Beispiel
findet Ubiquitinierung im Allgemeinen an Lysinresten innerhalb hundert
Aminosäuren
der HECT/WW-Bindungsstelle
statt. In ähnlicher
Weise könnte
eine HECT-E3-Ubiquitinligase zur Verwendung innerhalb eines solchen
Assays ein Vollänge-Protein,
ein trunkiertes Protein oder eine Variante davon sein, vorausgesetzt,
dass die Ligase eine funktionelle WW-Domäne und HECT-Domäne aufweist
und ein Smad-Protein
von Interesse ubiquitiniert.
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Zellbasierte
Assays (z. B. Assays in welchen intakte Zellen einem Kandidatenmittel
exponiert werden) könnten
zur Detektion des Effekts eines Mittels auf Smad-Proteindegradation
in der zellulären
Umgebung verwendet werden. Solche Assays könnten unter Verwendung einer
jeden Zelle durchgeführt
werden, welche einen Rezeptor für
einen TGF-β-Familienmitgliedsliganden
exprimiert. In bevorzugten Ausführungsformen
exprimiert eine Zelle einen TGF-β- und/oder
Bone Morphogenic Protein(BMP)-Rezeptor. Bekannte BMP-Rezeptoren umfassen
ALK2, 3 und 6 (siehe Attisano et al., Cell 68:97–108, 1992; ten Dijke et al.,
Oncogene 8:2879–2887,
1993). Bekannte TGF-β-
und Aktivin-Rezeptoren
wurden zum Beispiel von Attisano et al., Cell 75:671–680, 1990;
Attisano et al., Mol. Cell. Biol. 16:1066–1073, 1996; Ebner et al.,
Science 262:900–902, 1993
Lin et al., Cell 68:775–785,
1992; Mathews und Vale, Cell 65:973–982, 1991; und Tsuchida et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11242–11246, 1993 beschrieben. Geeignete
Zellen könnten
leicht durch immunchemische Verfahren (unter Verwendung von gegen
bekannte BMP- oder TGF-β-Rezeptoren
erstellte Antikörper), durch
direkte Messung von BMG- oder TGF-β-Bindung an die Zellen oder
durch die Detektion einer BMP- oder TGF-β-vermittelten Antwort in der Zelle im
Anschluss an Exposition mit BMP oder TGF-β identifiziert werden. Solche
Methoden sind in der Fachwelt gut bekannt. Bevorzugte Verfahren
zur Identifizierung geeigneter Zellen beinhalten die Verwendung
eines Reportergens, in welchem die Expression unter der Kontrolle
eines TGF-β- oder
BMP-Response-Elements ist. Im Allgemeinen sollte eine Zelle einen
Rezeptorspiegel exprimieren, welcher unter Verwendung eines jedweden
solchen Assays detektierbar ist. Zellen, welche einen BMP-Rezeptor exprimieren,
umfassen, ohne aber darauf beschränkt zu sein, Knochenzellen,
Neuronen und Nierenzellen. TGF-β-Rezeptoren
sind im Allgemeinen weithin exprimiert.
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Eine
Zelle, welche einen TGF-β-Familienmitglied-Rezeptor
exprimiert, wird mit einer Menge des TGF-β-Familienmitglieds, welche ausreichend
ist, um einen detektierbaren Spiegel von TGF-β-Familienmitglied-vermitteltem
Signalisieren in der Zelle zu erzeugen, in Kontakt gebracht, unter
Verwendung irgendeines Assays für
durch das TGF-β-Familienmitglied
vermittelter Genexpression, welcher für den jeweiligen Zelltyp geeignet
ist. Solche Assays könnten
auf der Detektion der verstärkten
Expression von TGF-β-Familienmitglied-regulierten
Genen basieren, wie etwa durch einen hybridisierungs- oder amplifikations-basierten
Assay oder einen Assay zur Expression eines an einen TGF-β- oder BMP-regulierten
Promoter funktionell verbundenes Reportergen. Alternativ könnte solch
ein Assay ein funktionaler Assay sein. Zum Beispiel stimuliert eine BMP-Behandlung
für 1–2 Wochen
Differenzierung von Osteoblasten. Inkontaktbringen von solchen Zellen
mit BMP sollte ausreichen, um durch Mineralisation detektierte Differenzierung
hervorzurufen. Im Allgemeinen ist Inkontaktbringen einer Zelle mit
100 ng BMP für
2–24 Stunden
ausreichend, um ein detektierbares Level von BMP-vermitteltem Signalisieren
in der Zelle hervorzurufen.
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Um
den Effekt eines Kandidatenmittels auf TGF-β-Familienmitglied-vermitteltes Signalisieren
zu bestimmen, wird eine Zelle mit einem TGF-β-Familienmitgliedsligand, wie oben beschrieben,
und mit einem Kandidatenmittel in Kontakt gebracht. Eine Zelle könnte mit
beiden Substanzen simultan oder sequentiell in beiden Reihenfolgen
in Kontakt gebracht werden. Die Menge des verwendeten Mittels wird
in Abhängigkeit
von dem Typ des Mittels und des spezifischen verwendeten Assays
variieren, aber im Allgemeinen sind 1 bis 50 μM des Kandidatenmittels ausreichend.
Im Rahmen bevorzugter Ausführungsformen
ist das TGF-β-Familienmitglied TGF-β oder BMP.
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Im
Anschluss an das Inkontaktbringen von TGF-β-Familienmitglied und Kandidatenmittel
wird TGF-β-Familienmitglied-induzierte
Smad-Protein-Degradation
(bevorzugt Degradation von Smad1, 2, 3, 5, 6 oder 7) ermittelt.
Es ist offensichtlich, dass jeder der vielfältigen Assays verwendet werden
könnte,
um Smad-Proteindegradation zu ermitteln, umfassend, ohne aber darauf
beschränkt
zu sein, Assays zur Detektion des Levels von: (1) ein Smad-Protein;
(2) Ubiquitinierung eines Smad-Proteins; oder (3) HECT-E3-Ubiquitinligaseaktivität in der
Zelle. In jedem Assaytyp (im größeren Detail
weiter unten beschrieben) wird der detektierte Level mit dem in
demselben Zelletyp, unter denselben Bedingungen aber in der Abwesenheit
des Kandidatenmittels detektierten Level verglichen. Ein statistisch
signifikanter Unterschied in dem detektierten Signal in der Anwesenheit
des Kandidatenmittels relativ zu dem Signal ermittelt in der Abwesenheit
des Kandidatenmittels zeigt an, dass das Mittel TGF-β-Familienmitglied-vermitteltes
Signalisieren in der Zelle moduliert.
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Um
den Level eines Smad-Proteins zu ermitteln, könnten gut bekannte immunchemische
Verfahren angewendet werden. Solche Verfahren verwenden typischerweise
ein Mittel, wie etwa einen Antikörper
oder ein Antigenbindungsfragment davon, welches spezifisch an das
Smad-Protein bindet. Um solche Assays durchzuführen, werden im Allgemeinen
die Zellen lysiert und das Lysat (mit oder ohne Vorbehandlung) wird mit
Antikörpern
unter Bedingungen, welche Antigen-spezifische Bindung erlauben,
in Kontakt gebracht. Gebundener Antikörper wird dann mittels eines
geeigneten Detektionsreagenz detektiert.
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Es
gibt eine Vielzahl von Assayformen, welche verwendet werden könnten, um
den Level eines Smad-Proteins in einem Zellysat zu detektieren.
Sehe z.B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1988. In einer Ausführungsform beinhaltet ein Assay,
um ein Smad-Protein zu binden und von dem Rest des Lysats zu entfernen,
die Verwendung eines Bindungsmittels immobilisiert auf einen festen
Träger.
Das gebundene Smad-Protein könnte
dann unter Verwendung eines Detektionsreagenz, welches eine Reportergruppe
aufweist und spezifisch an den Bindungsmittel/Smad-Komplex bindet,
detektiert werden. Solche Detektionsreagenzien könnten zum Beispiel einen Antikörper, welcher
spezifisch an das Smad-Protein bindet, umfassen. Alternativ könnte ein
kompetitiver Assay verwendet werden, in welchem ein Smad-Protein
oder ein Teil davon mit einer Reportergruppe markiert wird und die
Bindung an das immobilisierte Bindungsmittel nach Inkubation des
Bindungsmittels mit dem Lysat zugelassen wird. Das Ausmaß mit welchen
Komponenten des Lysats die Bindung des markierten Smad-Polypeptids
an das Bindungsmittel inhibieren, ist für den Level des Smad-Proteins
in dem Lysat indikativ.
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Ein
fester Träger
zur Verwendung in solchen Assays könnte jedes dem Durchschnittsfachmann
bekannte Material sein, an welches das Bindungsmittel angefügt werden
könnte.
Zum Beispiel könnte
der feste Träger
eine Testkammer in einer Mikrotiterplatte oder eine Nitrocellulose
oder andere geeignete Membran sein. Alternativ könnte der Träger ein Bead oder Scheibe sein,
wie zum Beispiel Glas, Fiberglas, Latex oder ein Plastikmaterial.
Das Bindungsmittel könnte
unter Verwendung einer Vielzahl dem Fachmann bekannten Techniken,
welche ausführlich
in der Patent- und wissenschaftlichen Literatur beschrieben sind,
auf den festen Träger
immobilisiert werden. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung
bezieht sich der Begriff „Immobilisation" sowohl auf nicht-kovalente
Assoziation, wie etwa Adsorption, und kovalente Verknüpfung (welche
eine direkte Verbindung zwischen dem Bindemittel und den funktionellen
Gruppen auf dem Träger
oder eine durch ein Vernetzungsmittel hervorgerufene Verbindung
sein könnte).
Immobilisation durch Adsorption an eine Kammer einer Mikrotiterplatte
oder an eine Membran ist bevorzugt. In solchen Fällen könnte die Adsorption durch Inkontakbringen
des Bindungsmittels in einem geeigneten Puffer mit dem festen Träger für ein geeignetes
Zeitintervall (typischerweise zwischen etwa 1 Stunde und etwa 1
Tag) erreicht werden. Im Allgemeinen ist das Inkontaktbringen einer
Kammer einer Plastikmikrotiterplatte (wie etwa Polysterol oder Polyvinylchlorid)
mit einer Menge an Bindungsmittel im Bereich von etwa 10 ng bis
etwa 10μg
und bevorzugt etwa 100 ng bis etwa 1 μg, ist ausreichend, um eine
adäquate
Menge des Bindungsmittels zu immobilisieren.
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In
bestimmten Ausführungsformen
ist der Assay ein zwei-Antikörper-Sandwich-Assay.
Dieser Assay könnte
durchgeführt
werden, indem zuerst ein Antikörper,
welcher auf einem festen Träger,
meist eine Kammer einer Mikrotiterplatte, immobilisiert ist, mit
dem Lysat in Kontakt gebracht wird, so dass es einem Smad-Protein in
der Probe ermöglicht
ist, an den immobilisierten Antikörper (z. B. Inkubation für 30 Minuten
bei Raumtemperatur) zu binden. Ungebundene Probe wird dann von den
immobilisierten Smad-Antikörper-Komplexen entfernt
und ein Detektionsreagenz (bevorzugt ein zweiter Antikörper, welcher
in der Lage ist, an einer anderen Stelle an das Smad Protein zu
binden), welches eine Reporter-Gruppe enthält, hinzugefügt. Die
Menge des Detektionsreagenz, welches an den festen Träger gebunden
bleibt, wird dann unter Verwendung eines für die spezifische Reportergruppe
geeigneten Verfahrens bestimmt. Für radioaktive Gruppen sind
im Allgemeinen Szintilationszählungen
oder autoradiographische Verfahren geeignet. Spektroskopische Verfahren
könnten zur
Detektion von Farbstoffen, lumineszierenden Gruppen und fluoreszierenden
Gruppen verwendet werden. Biotin könnte unter Verwendung von Avidin,
gekoppelt an eine andere Reportergruppe (meist eine radioaktive oder
fluoreszierende Gruppe oder ein Enzym), detektiert werden. Enzym-Reportergruppen
könnten
im Allgemeinen durch die Hinzugabe von Substrat (im Allgemeinen
für ein
gewisses Zeitintervall), gefolgt von spektroskopischen oder anderen
Analysen der Reaktionsprodukte, detektiert werden.
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Der
Ubiquitinierungsgrad des Smad-Proteins könnte basierend auf der Veränderung
in der elektrophoretischen Mobilität des ubiquitinerten Proteins
leicht bestimmt werden. In Kürze,
Zellen könnten
lysiert werden und im Lysat enthaltene Proteine könnten durch
SDS-PAGE getrennt werden. Ein Protein von Interesse könnte durch
Western-Blot-Analyse detektiert werden. Ubiqitinierung führt zu einer
Verschiebung des ersichtlichen Molekulargewichts des Proteins zur
Hochmolekulargewichtsregion des Gels. Quantitative oder semiquantitative
Ergebnisse könnten
unter Verwendung von markiertem Sekundär-Antikörper oder anderer Detektionsreagentien,
die in der Fachwelt bekannt sind, erhalten werden.
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HECT-E3-Ubiquitinligase-Aktivität in der
Zelle könnte
mittels eines der vielzähligen
in der Fachwelt meist verwendeten Ubiquitinierungs-Assays bewertet
werden. Solche Assays verwenden typischerweise ein mit einem Tag
versehenes Zielprotein und/oder markiertes Ubiquitin. Ligase-Aktivität wird dann
durch Verwendung zum Beispiel eines gekoppelten Ubiquitinierungs-Assays,
wie hier beschrieben, ermittelt. Solche Assays verwenden im Allgemeinen
E3-Ubiquitinligase
(im Allgemeinen in einem Lysat, oder partiell oder substantiell von
einem Zell-Lysat gereinigt), um das mit einem Tag versehene Zielprotein
zu ubiquitinieren. Durch Verwendung von radiomarkiertem Ubiquitin
könnte
zum Beispiel der Umfang der Ubiquitinierung des Zielproteins durch
Szintillationszählung
nach Entfernung von ungebundenem Ubiquitin bestimmt werden. Alternativ
könnte die
Degradation des Zielproteins direkt durch SDS-PAGE-Auflösung der Reaktionen und Detektion
des Tags ermittelt werden. Assays zur Detektion von Ubiquitinierung
und Degradation von Proteinen sind in der Fachwelt gut bekannt und
representative Assays sind hier beschrieben.
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Im
Allgemeinen könnte
der Effekt eines Mittels auf TGF-β-Familienmitglied-vermitteltes
Signalisieren basierend auf seiner Aktivität in den obigen Assays bestimmt
werden. Für
Smads, welche BMP-vermitteltes Signalisieren (umfassend Smad 1 und
5) verstärken,
könnten
Mittel, welche Smad-Protein-Degradation inhibieren, verwendet werden,
um BMP-vermitteltes Signalisieren zu steigern. Ähnlich könnten Mittel, welche Degradation
solcher Smad-Proteine verstärken,
zur Inhibierung von BMP-vermitteltem Signalisieren verwendet werden.
Für TGF-β vermitteltes
Signalisieren könnten
Mittel, welche Smad2- und/oder Smad3-Protein-Degradation inhibieren,
verwendet werden, um Signalisieren zu steigern und Mittel, welche
Degradation solcher Smad-Proteine verstärken, könnten verwendet werden, um
Signalisieren zu inhibieren. Mittel, welche durch die hier zur Verfügung gestellten
Screenings identifiziert wurden, könnten im Rahmen einer Vielzahl
von therapeutischen Zusammenhängen,
wie unten in weiteren Details beschrieben, verwendet werden.
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VERFAHREN ZUR VERWENDUNG VON MITTELN,
WELCHE TGF-β-FAMILIENMITGLIED-VERMITTELTES SIGNALISIEREN
MODULIEREN
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Mittel,
welche BMP-vermitteltes Signalisieren modulieren, könnten für die Prävention
oder Behandlung von mit in gewissen Zelltypen insuffizientem oder überschüssigem,
BMP-vermitteltem Signalisieren assoziierten Zuständen verwendet werden. Im Allgemeinen
ist ein Mittel, welches BMP-vermitteltes Signalisieren steigert
(z. B. Bindung einer HECT-E3-Ubiquitinligase-WW-Domäne
an ein Smad1 oder Smad5-PY-Motif inhibiert), für die Stimulation von Knochen-Anabolismus
sowie zur Behandlung von gebrochenen Knochen, Osteoporose und akutem
oder chronischem Nierenversagen anwendbar. Mittel, welche BMP-vermitteltes
Signalisieren inhibieren, könnten
zum Beispiel innerhalb Therapien für Krebs, Entzündung, Alterung
und Infektionskrankheiten verwendet werden.
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Ähnlich könnten Mittel,
welche TGF-β vermitteltes-Signalisieren
modulieren, für
die Prävention
oder Behandlung von mit in gewissen Zelltypen insuffizientem oder überschüssigem,
TGF-β-vermitteltem
Signalisieren assoziierten Zuständen
verwendet werden. Im Allgemeinen ist ein Mittel, welches TGF-β-vermitteltes Signalisieren
inhibiert (z. B. Bindung einer HECT-E3-Ubiquitinligase-WW-Domaine an ein Smad2
oder Smad3-PY-Motif erhöht),
zur Behandlung von Krebs, Entzündung,
Neurodegeneration und Fibrose verwendbar.
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Zur
Verabreicheung an einen Patienten sind ein oder mehrere Mittel im
Allgemeinen als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert,
welche eine sterile, wässrige
oder nicht-wässrige
Lösung,
Suspension oder Emulsion sein können
und welche zusätzlich
einen physiologisch verträglichen
Träger
(z. B. ein nicht-toxisches Material, welches nicht mit der Aktivität des aktiven
Inhaltsstoffes interferiert) umfasst. Jeder geeignete, dem Durchschnittsfachmann
bekannte Träger
könnte
in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Representative
Träger
umfassen physiologische Salzlösungen,
Gelatine, Wasser, Alkohol, natürliche
oder synthetische Öle,
Saccharidlösungen,
Glykole, injizierbare organische Ester, wie etwa Ethyloleat, oder
eine Kombination solcher Materialien. Solche Zusammensetzungen könnten auch
Puffer (z. B. neutral-gepufferte
Salzlösung
oder phosphat-gepufferte Salzlösung),
Kohlenhydrate (z. B. Glukose, Mannose, Sucrose oder Dextrane), Mannitol,
Proteine, Polypeptide oder Aminosäuren, wie etwa Glycin, Antioxidantien,
antimikrobielle Verbindungen, chelatierende Mittel, wie etwa EDTA
oder Glutathion, Adjuvantien (z. B. Aluminium-Hydroxid), inerte
Gase und/oder Konservierungsmittel umfassen. Zusammensetzungen der
vorliegenden Erfindung könnten
auch als Lyophilisate formuliert sein. Pharmazeutische Zusammensetzungen
könnten
auch andere Verbindungen enthalten, welche biologisch aktiv oder
inaktiv sein könnten.
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Die
hier beschriebenen Zusammensetzungen könnten als Teil einer Formulierung
mit verzögerter
Freisetzung (z. B. eine Formulierung, wie etwa eine Kapsel, welche
eine langsame Freisetzung der Verbindung im Anschluß an die
Verabreichung bewirkt) verabreicht werden. Solche Formulierungen
könnten
im Allgemeinen unter Verwendung gut bekannter Technologien hergestellt
und zum Beispiel durch orale, rektale oder subkutane Implantation
oder durch Implantation an der gewünschten Zielstelle verabreicht
werden. Formulierungen mit verzögerter
Freisetzung könnten
ein Polypeptid, Polynukleotid oder modulierendes Mittel enthalten,
welches in einer Trägermatrix
dispergiert und/oder umgeben von einer mengenkontrollierenden Membran
in einem Reservoir enthaltend ist. Träger zur Verwendung in solchen
Formulierungen sind biokompatibel und könnten auch biodegradierbar
sein; bevorzugt ermöglichen
diese Formulierungen ein relativ konstantes Maß an Freisetzung. Die Menge
der in der Formulierung mit verzögerter
Freisetzung enthaltenen Verbindung hängt von der Implantationsstelle,
der Rate und erwarteten Dauer der Freisetzung und der Natur des
zu behandelnden oder des vorzubeugenden Zustands ab.
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Ein
anderes Abgabesystem für
solches Mittel ist ein kolloidales Dispersionssystem. Kolloidale
Dispersionssysteme umfassen makromolekulare Komplexe, Nanokapseln,
Mikrosphären,
Beads und lipid-basierte Systeme, umfassend Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen,
gemischte Mizellen und Liposomen. Ein bevorzugtes kolloidales System
zur Verwendung als Abgabevehikel in vitro und in vivo ist ein Liposom
(z. B. ein artifizieller Membranvesikel). Es wurde gezeigt, dass
große
unilamellare Vesikel (LUV), in einer Größenordnung von 0,2–4,0 μm einen substantiellen
Prozentsatz eines große
Makromoleküle
enhaltenden, wässrigen
Puffers einschließen
können.
Das Targeting von Liposomen kann basierend auf anatomischen und
mechansistischen Faktoren klassifiziert werden. Anatomische Klassifikation
basiert auf dem Level an Selektivität, zum Beispiel organspezifisch,
zellspezifisch und organellspezifisch. Mechanistisches Targeting
kann basierend darauf unterschieden werden, ob sie passiv oder aktiv
ist. Passives Targeting nutzt die natürliche Tendenz von Liposomen,
sich zu Zellen des retikulo-endothelialen Systems (RES) in Organen,
welche sinusoidale Kapillaren enthalten, zu verteilen. Auf der andern
Seite beinhaltet aktives Targeting die Veränderung von Liposomen durch Kopplung
der Liposomen an einen spezifische Liganden wie etwa einen monoklonalen
Antikörper,
Zucker, Glykolipid oder Protein oder durch Veränderung der Zusammensetzung
oder Größe des Liposmen,
um Targeting zu Organen und Zelltypen, welche unterschiedlich zu
natürlich
vorkommenden Lokalisationsstellen sind, zu erreichen.
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Um
Zell- oder Gewebespezifität
zu erreichen, könnten
(in manchen Fällen)
Mittel topisch verabreicht werden. Andere Mittel könnten spezifisch
für gewisse
HECT-E3/Smad-Protein-Interaktionen sein, und könnten daher einen spezifischen
Ziel-Zelltyp oder Gewebe haben. Es könnte jedoch in gewissen Fällen günstig sein, eine
Targeting-Gruppe zu verwenden, um die Beförderung eines Mittels an eine
gewünschte
Stelle zu vereinfachen. Eine Targeting-Gruppe ist jede Verbindung
(z. B. ein monoklonaler oder polyklonaler Anitkörper, ein Protein oder ein
Liposom) oder Zelle, welche die Beförderung des Mittels zu einer
Ziel-Zelle oder Gewebe erleichtert, wodurch die lokale Konzentration
des Mittels erhöht
wird. Targeting-Gruppen umfassen Antikörper oder Fragmente davon,
Rezeptoren, Liganden und andere Moleküle, welche an Zellen des oder
in der Umgebung des Zielgewebes binden. Ein Antikörper-Targeting-Mittel
kann ein intaktes (ganzes) Molekül,
ein Fragment davon oder ein funktionelles Äquivalent davon sein. Beispiele
für Antikörperfragmente
sind F(ab')2, -Fab', Fab und F[v] Fragmente,
welche durch konventionelle Verfahren oder durch genetische oder
Protein-Konstruktion produziert sein könnten. Die Verknüpfung ist
im Allgemeinen kovalent und kann z. B. durch direkte Kondensation
oder andere Reaktionen oder durch Verwendung eines bi- oder multifunktionalen
Linkers erreicht werden. Targeting-Gruppen könnten basierend auf der/den
Zelle(n) oder Gewebe(n), in welchen erwartet wird, dass das Mittel
seinen therapeutischen Nutzen ausübt, ausgewählt sein.
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Wie
oben erwähnt,
sind Patienten, welche von einer Behandlung mit einem Mittel welches
TGF-β- und/oder
BMP-vermitteltes Signalisieren moduliert, solche, die unter einem
Zustand, welcher mit insuffizientem oder überschüssigem TGF-β- und/oder BMP-vermitteltem
Signalisieren in gewissen Zelltypen assoziert ist, leiden (oder
das Risiko haben, einen solchen Zustand zu entwickeln). Solche Zustände könnten unter
Verwendung von Kennzeichen, welche in der Fachwelt für diese
Zustände
anerkannt sind, oder durch in vitro Analyse des Smad-Protein-Levels diagnostiziert
werden.
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Mittel
können
einem Patienten durch jede Prozedur, die für den zu behandelnden Zustand
geeignet ist, verabreicht werden, umfassend zum Beispiel topische,
orale, nasale, intrathekale, rektale, vaginale, sublinguale oder
parenterale Verabreichung, wie etwa subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intrasternale,
intrakavernöse,
intrameatale oder intraurethrale Injektion oder Infusion. Eine geeignete
Dosis und eine geeignete Dauer und Frequenz der Verabreichung wird
durch solche Faktoren wie der Zustand des Patienten, der Typ und
das Ausmaß der
Krankheit des Patienten, die besondere Form des aktiven Inhaltesstoffes
und des Verabreichungsverfahrens bestimmt. Im Allgemeinen stellt
eine geeignete Dosis und Behandlungsschema das/die Mittel in einer
ausreichenden Menge zur Verfügung,
die einen therapeutischen und/oder prophylaktischen Nutzen ermöglicht (z.
B. ein verbessertes klinisches Resultat, wie etwa häufigere
komplette oder partielle Remissionen oder längere Krankheitsfreiheit und/oder
Gesamtüberleben).
Zur prophylaktischen Verwendung sollte eine Dosis ausreichend sein,
um den Beginn zu verhindern, zu verzögern oder das Ausmaß des mit
TGF-β- und/oder
BMP-vermittelem Signalisieren assozierten Zustands abzuschwächen. Optimale
Dosierungen können
im Allgemeinen durch experimentelle Modelle und/oder klinische Studien
ermittelt werden. Die Verwendung der minimalen Dosis, welche ausreicht,
um eine effektive Therapie zur Verfügung zu stellen, ist im Allgemeinen
bevorzugt. Therapeutische oder prophylaktische Effektivität kann im
Allgemeinen bei Patienen durch Assays, welche für den zu behandelnden oder
vorzubeugenden Zustand geeignet sind, welche dem Durchschnittsfachmann
vertraut sein werden, überwacht
werden. Geeignete Dosisgrössen
werden mit der Größe des Patienten
variieren, aber werden typischerweise im Bereich zwischen etwa 10
ml bis etwa 500 ml für
10–60
kg Tier liegen. Die nachfolgenden Beispiele sind zur Illustration
und nicht zur Begrenzung aufgeführt.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Ubiquitinierung von Smad-Proteinen und
initiale Charakterisierung von E3/Smad-Protein-Bindung
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Dieses
Beispiel illustriert die BMP-induzierte Ubiquitinierung von Smad-Proteinen und die
Identifizierung von einer HECT-E3-Ligase-Domaine, welche an Smad-Proteine
bindet.
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Vektor
zur Expression von mit einem HA-Tag versehenem Smad1 wurde in COS-Zellen
transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden dann mit 100 ng BMP
für 4 Stunden
in Abwesenheit oder Anwesenheit von 50–100 μM des Proteasom-Inhibitors Leu-Leu-Phe
(LLF) behandelt. Die Zellen wurden lysiert und gleiche Mengen von
Protein wurden in jede Spur geladen. Western-Analyse wurde unter
Verwendung von Anti-HA-Antikörper
(BAbCo, Berkeley, CA) durchgeführt.
Wie in 2 dargestellt, induziert BMP Smad1-Degradation
und LLF blockiert BMP-induzierte Smad1 Degradation.
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Um
die in vivo Ubiquitinierung von Smad1 zu ermitteln, wurde ein Smad1-Expressionsvektor
in COS-Zellen transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden mit
BMP und dem Proteasom-Inhibitor LLF, wie oben beschrieben, behandelt.
Die Zellen wurden dann lysiert und gleiche Mengen von Protein wurden
zur Immunpräzipitation
unter Verwendung von Anti-HA-Antikörper zur Präzipitation von mit einem Tag
versehenem Smad1-Protein verwendet. Das immunpräzipitierte Smad1 wurde einer
SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von einem Western-Blot unter Verwendung
von Anti-HA-Antikörper
oder Anti-Ubiquitin-Antikörper (BAbCo).
Mit LLF behandelte Zellen und mit LLF plus BMP behandelte Zellen
akkumulierten deutlich mehr hochmolekulargewichtiges, ubiquitiniertes
Smad1-Protein (3).
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Um
die in vitro Bindung von Smads mit verschiedenen WW-Domänen zu analysieren,
wurde mit einem HA-Tag versehenes Smad1 in COS-Zellen exprimiert.
Das exprimierte Smad1 wurde aus dem Zell-Lysat immunpräzipitiert.
Nach ausführlichem
Waschen wurde das immunpräzipiterte
Smad1 mit 32P-markierten GST-Fusionsproteinen von
WWP1-WW-Domänen
gemischt. Die Bindungsprodukte wurden gewaschen und einer SDS-PAGE
unterzogen. COS-Extrakte
und 32P-markiertes GST-Protein wurde als
Kontrollen verwendet. Es wurde herausgefunden, dass WWP1.1 (eine
GST-Fusion mit der ersten WW-Wiederholung: LPSGWEQRKDPHGRTYYVDHNTRTTTWERPQPLPPGWE
(SEQ ID NO:26) an Smad1 (4, Spur 2), aber nicht das am
PY-Motif mutierte Smad1 (4, Spur 3) bindet. Die verwendete
Smad1-PY-Peptidsequenz war: Biotin-Ahx-PADTPPPAYLPPED-CONH2 (SEQ ID NO:22) und die mutierte Smad1-PY-Peptidsequenz
war: Biotin-Ahx-PADTPPPAHLPPED-CONH2 (SEQ
ID NO:27).
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass BMP Ubiquitinierung von Smad-Proteinen induziert,
wobei ein Weg verwendet wird, welcher eine HECT-E3-Ubiquitinligase
umfasst.
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Beispiel 2
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Interaktion zwischen HECT-E3-Ubiquitinligase-WW-Domäne und Smad-Proteinen-PY-Motiv-Peptiden
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Dieses
Beispiel illustriert die Bindung von HECT-E3-WW-Domänen an PY-Motive.
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Die
HECT-Domäne-E3-Ligase
WWP1 hat vier WW-Domänen
(WWP1.1, 1.2, 1.3, 1.4), welche mit den WBP-1-PY-Motif-Peptiden
interagieren (Chen und Sudol, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7819–7823, 1995).
Die Sequenz für
jede Domäne
ist:
WWP1.1: LPSGWGWEQRKDPHGRTYYVDHNTRTTTWERPQPLPPG (SEQ ID
NO:10);
WWP1.2: QPLPPGWERRVDDRRRVYYVDHNTRTTTWQRPTMESVR (SEQ
ID NO:11);
WWP1.3: GPLPPGWEKRVDSTDRVYFVNHNTKTTQWEDPRTQGLQ (SEQ
ID NO:12;)
und
WWP1.4: EPLPEGWEIRYTREGVRYFVDHNTRTTTFKDPRNGKSS
(SEQ ID NO:13)
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Jede
Domäne
wurde individuell als GST-Fusionsprotein exprimiert. Ein TRF-Eindungs-Assay
wurde verwendet, um Interaktionen von PY-Motiv-Peptiden mit diesen Domänen oder
GST alleine zu bewerten. WW-Domänen
wurden über
Nach bei 4°C
in einem 200 mM Carbonatpuffer (Pierce, Rockford, IL) bei unterschiedlichen
Konzentrationen (0, 1, 3, 10 μg/mL)
an 96-Kammer-Polystyrol-Assayplatten
(Costar) gebunden. Ungebundene WW-Domänen wurden mit destilliertem,
deionisiertem Wasser weggewaschen und die Platten wurden mit 1%
BSA/Carbonat-Puffer für
2 Stunden bei Raumtemperatur abgesättigt. Die Platten wurden dann mit
Tris/Tween-Puffer: 50mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1%
BSA, 1 mM DTT, 0,1% Tween20, Protease-Inhibitorcocktail (Boehringer-Mannheim)
gewaschen.
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PY-Motiv-Peptide
wurden mit einem C6-Linker und Biotin-Tag
synthetisiert. Die folgenden PY-Motive wurden verwendet:
WBP1:
Biotin-Ahx-HPGTPPPPYTVGPG-CONH2 (SEQ ID
NO:28);
Nedd: Biotin-Ahx-IPGTPPPNYDSLRL-CONH2 (SEQ
ID NO:29);
Mutiertes Nedd: Biotin-Ahx-IPGTPPPNHDSLRL-CONH2
(SEQ ID NO:30).
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Diese
biotinylierten Peptide wurden in Tris/Tween-Puffer gelöst und zu
den Assay-Platten hinzugegeben (30 μM). Die Platten wurden bei 4°C für unterschiedliche
Erfassungszeitintervalle inkubiert. Die Platten wurden dann mit
PBS/0,1 % Triton X100 gewaschen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur
mit 1 μg/mL
Europium-markiertem Streptavidin (DELFIA; Wallac Oy, Turku, Finnland)
in DELFIA-Assay-Puffer/0,1% Trition X100 sondiert. Das ungebundene
Europium-markierte Streptavidin wurde mit PBS/0,1% Trion X1000 gewaschen.
Europium wurde für
zeitauflösende
Fluoreszenz-Messungen mit DELFIA-Verstärkungspuffer freigesetzt. Messungen
wurden entweder mit einem DELFIA 1234 oder Victor Fluorometern gemacht.
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Das
WBP1-Peptid bindete spezifisch an die WWP1-WW-Domänen aber
nicht an GST (5A–5D). Die
anderen biotinylierten Peptide reagierten nicht spezifisch mit den
WW-Domänen
oder GST (5A–5D).
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Smad-PY-Motiv-Peptide
von Smad 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 7 (Tabelle 1) wurden dann mit den
WW-Domänen
von WWP1 bewertet (
6A–
6D und
7A–
7B).
Die GST–WW-Domänen-Fusionsproteine und
GST alleine wurden über
Nacht mit 30 μg/mL
beschichtet. Nach Absättigung
der Kammern mit BSA wurden die WW-Domäne-Peptide mit den Smad-PY-Motiv-Peptiden
titriert. Smad 7-Peptid zeigte sehr starke Interaktion mit der zweiten
WW-Domäne
von WWP1 (WWP1.2;
6A–
6D); sehr
viel stärker
als das beschriebene WBP1-PY-Peptid
(
5A–
5D).
Die Smad 5- und Smad 6-Peptide zeigten messbare Interaktionen mit
den WWP1-WW-Domänen,
waren aber moderat verglichen mit den Smad7 Interaktionen (
6A–
6D und
7A–
7B).
Da war keine meßbare
Interaktion von PY-Motif-Peptiden von Smad 1, 2 oder 3. Tabelle 1 Smad Protein-PY-Motive
| Smad
Protein | PY-Motiv-Peptide |
| Smad7 | ELESPPPPYSRYPM
(SEQ ID NO:20) |
| Smad6 | GPESPPPPYSRLSP
(SEQ ID NO:21) |
| Smad1 | PADTPPPAYLPPED
(SEQ ID NO:22) |
| Smad5 | PADTPPPAYMPPDD
(SEQ ID NO:23) |
| Smad2 | IPETPPPGYISEDG
(SEQ ID NO:24) |
| Smad3 | AGLTPPPGYLSEDG
(SEQ ID NO:25) |
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Eine
detaillierte Bewertung der Interaktionen von Smad7 mit den WWP1-WW-Domänen und
der zweiten WW-Domäne
von RSP5 wurde durchgeführt.
GST wurde zur Korrektur von unspezifischen Hintergrundinteraktionen
verwendet. Die Peptid-Titration der WW-Domänen wurde durch ein nicht-lineares "least squares fit" der Daten und Scatchard-Analyse
bewertet ( 8A–8B). Beide
Methoden zeigten, dass WWP1.2 sehr spezifische Interaktionen mit
Smad 7-Peptiden hatte (Kd = 2,4 μM). Bindungsinteraktionen
von WWP1.1 und WWP1.3 führte
in der Scatchard-Analyse nicht zu einem linearen Kurvenverlauf.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass HECT-E3-Ubiquitinligase-WW-Domänen an Smad-Protein-PY-Motive binden.
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Beispiel 3
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Gekoppelter Ubiquitin-Assay zur Detektion
von HECT-E3-Ligase-Ubiquitinierung
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Dieses
Beispiel illustriert einen gekoppelten enzymatischen Assay, welcher
das Schicksal von markierten Ubiquitin-Molekülen in dem E1/E2/E3-Weg bewertet.
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Rekombinante
E1(ubc5c)- und E2(ubc7)-Komponenten wurden von BostonBiochem (Cambridge,
MA) erhalten. Radiomarkiertes Ubiquitin wurde durch PKA-vermittelten
Einbau von [32P]-Phosphat von α-[32P]-ATP an die PKA-Stelle des GST-Ub-Fusionsproteins (pGEX
KG Expressionsvektor) generiert. Der Ubiquitin-Assay-Puffer (UbB)
war wie folgt: 50 mM Tris pH 7,6, 1 mM ATP, 0,2 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 1 Einheiten organische Pyrophosphatase,
0,005% Triton X100 und 1 μM
Staurosporin. In einer 0,030 mL Reaktion waren folgende Komponenten
vorhanden: 50–200
ng E1, 0,1–1 μg E2 und
5 μg GST-Ub.
Reaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt und mit einem SDS-PAGE- Lade-Puffer, welcher
nicht Mercaptane enhielt, beendet. Reaktionen wurden durch SDS-PAGE
analysiert. Die Ubiquitinierung der Cystein-Reste der aktiven Zentren von
E1 und E2s (ubc 5c und ubc 7) wurde beobachtet (9A-9C).
Die Zugabe von 20 mM DTT verhinderte die Bildung von Thioester-Intermediaten (9B-9C).
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Um
den Transfer auf eine HECT-E3-Ligase zu bewerten, wurden, wie angezeigt,
Assays, wie oben beschrieben, mit der Zugabe von 50–100 ng
der WWP1-HECT-Domäne
beinhaltenden Reste 611–985
oder 611–990
von WWP1, durchgeführt.
Sequenzen dieser Domänen
sind unten dargestellt:
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WWP1-HECT-Domäne 611–985:
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WWP1-HECT-Domäne 611–990:
-
Es
wurde gezeigt, dass die HECT-Domäne
von WWP1 entweder durch E1/ubc5C oder E1/ubc7 (10A–10C und 11A–11C) beladen wurde. Die kürzere HECT-Domäne, WWP1
(611–985), wurde
nur mit einem Ubiquitin-Molekül beladen,
vermutlich auf sein Cystein des aktiven Zentrums. Die Sensitivität des Ubiquitin-Addukts
mit WWP1(611–985)
für DTT
ist mit der Verbknüpfung
an das Cystein des aktiven Zentrums konsistent (11A und 11B,
vergleiche Spur 4 bis Spur 2). Die längere HECT-Domäne, WWP1(611–990) zeigte
eine fehlende Substratselektivität
(10A und 10B).
Zeitstudien der WWP1(611–990)-Reaktionen,
vermittelt entweder durch ubc5 coder ubc7, zeigten, dass das E2
ubc5c effizienter in der Aktivierung von WWP1(611–990) war
(12A–12C). Der Verlust von GST-Ubiquitin korrelierte
mit dem Erscheinen von hochmolekularen Spezies (> 201 kDa).
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Diese
Ergebnisse bestätigen
die Rolle von HECT-E3-Ubiquitinligasen in der Smad-Protein-Degradation.
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