JP2022532216A - タンパク質の選択的分解 - Google Patents

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Abstract

本発明は、標的タンパク質とＥ３ユビキチンリガーゼとの間の相互作用を機能的に促し、前記標的タンパク質の分解を媒介することができるペプチドおよび小分子部位を同定するための方法を提供する。いくつかの部位は、特定の標的バリアントを分解することができるが、他の標的バリアントを分解することができない。前記部位は、目的のＥ３リガーゼのためのネオ基質を形成する。記載されている方法は、細胞内の特定の標的を選択的に分解することができる化合物の生成を可能にし、病理学的状態のための医薬の開発のために意味がある。本開示は、また、翻訳後修飾酵素、例えばＮ－メチルトランスフェラーゼ、プロリルオリゴペプチダーゼ、ラクタマーゼ、ヒドロキシラーゼ、およびデヒドラターゼを使用した修飾ペプチドの生成、ならびにそれを使用する方法も記述する。

Description

相互参照
本出願は、２０１９年５月１５日に出願された米国仮出願第６２／８４８，５０９号、および２０１９年５月２９日に出願された米国仮出願第６２／８５４，２７３号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に基づく利益を主張している。
背景
正確な様式でのタンパク質の分解は、細胞機能を制御するための鍵になり得る。多くの病理学的状態は、早熟なタンパク質発現または機能不全なバリアントの発現のいずれかによる、細胞経路の異常な機能によって特徴付けられる。よって、このようなタンパク質の蓄積物または機能不全な欠陥バリアントを特異的かつ正確に分解する化合物は、種々の病気を処置するために有用であり得る。タンパク質分解を媒介する新たな分子を発見または開発するための新しい技術が開発されつつある。
しかしながら、効率的な様式で機能的分解を実現する分子をスクリーニングするための方法の選択肢は限られている。したがって、正確かつ選択的なやり方で、選択的な標的タンパク質の分解を実現する方法および組成物を開発する必要性が存在する。本発明の方法は、特定のＥ３リガーゼに対するネオ基質の生成を、前記Ｅ３リガーゼと標的タンパク質との間の相互作用を促してその分解を導くことができる化合物ライブラリーを使用することによって可能にする、スクリーニングプラットフォームを記述する。この技術は、種々の医薬部位、ならびにペプチドのＤＮＡにコードされたライブラリーおよび大員環を調べることができ、それらの多くは、その二価性の性質ゆえに、有力な医薬候補となる見込みがあるであろう。このプラットフォームは、機能的な標的分解を実現する分子のみが存在する、選択的なアプローチを記述する。
大環式ペプチド天然産物が、細菌、真菌、植物、藻類、軟体動物、および哺乳動物を含む幅広い種から同定および単離されている。これらは、多様な生物学的に活性な分子の原料として認められている。ジコノチド（イモガイ種のＣｏｎｕｓ ｍａｇｕｓの毒素から単離された環状ペプチドである）などの海洋性原料に由来するいくつかの環状ペプチドは、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。ジコノチドは、重度の慢性的な疼痛のために使用される、多くのシナプスにおいて神経伝達を制御するＮ型カルシウムチャンネルの選択的な遮断によって機能する鎮痛薬である。大環式ペプチド化合物は、また、幅広い範囲のその他の治療領域においても非常に有望であり、癌、免疫調節（例えば、シクロスポリンＡ）、および真菌感染（例えば、エキノキャンディン）のための、臨床的に承認されたいくつかの治療薬をもたらしている。
これらの化合物の適用における有用性および分野は、それらの天然原料からの抽出の低収率、有機合成上の課題、および活性を最適化するための多数のバリアントを入手できないことによって、制限されることが多い。この理由により、バイオテクノロジー的アプローチ、および天然原料を出発材料とする半合成的アプローチが、医薬製造のために利用されることが多い。大環式ペプチドの特に興味深いグループは、多重バックボーンのＮ－メチル化環状ペプチド（ペプチドバックボーン上の多数の部位がＮ－メチル化された環状ペプチド）である。これらの化合物は、興味深い薬理学的特性（例えば、小腸上皮膜に対する透過性が高いことに起因する、高いバイオアベイラビリティ、およびプロテアーゼに対して安定性が高いことに起因する、ｉｎ ｖｉｖｏにおける長い半減期）を有する。このファミリーのペプチドのプロトタイプの代表は、免疫調節剤のシクロスポリンＡである。シクロスポリンＡは、最初は子嚢菌のＴｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ（非常に複雑な非リボソーム性ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）（具体的にはシクロスポリンシンターゼと呼ばれる）によってシクロスポリンＡを合成する）から単離された、１１－ｍｅｒの環状ペプチドである。シクロスポリンシンターゼ内に備わるメチルトランスフェラーゼドメインによって、ペプチド伸長の間に、シクロスポリンのバックボーンメチル化が起こる。過去数十年にわたり、多くのチームが、天然産物の改変型または多様化した誘導体を製造するために、このＮＲＰＳ機構を再構築または進化させるようと試みてきた（例えば、異なるアミノ酸、異なる大きさの環、異なるＮ－メチル化パターンなど）が、それらの取り組みは、残念なことに、無益であり、困難であることが判明した。
これらの種類の多重Ｎ－メチル化環状ペプチドを製造するための、現在確立している方法は、これらの化合物を天然に産生する、対応する微生物の大規模な培養物を発酵させ、その後、手のこんだ分画および精製方法を行うことを含む。少量の化合物のための、完全な化学合成、または酵素学と半合成を組み合わせたハイブリッドストラテジーのいずれかに依拠する、代替的な方法がいくつか開発されている。
リボソームによって合成され、翻訳後に修飾を受けたペプチド（ＲｉＰＰ、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ）は、細菌、真核生物、および古細菌を含む、多様な生物によって産生される２２を超えるサブクラスからなる、多様なクラスのリボソーム起源の天然産物である。ＲｉＰＰは、典型的には、通常のＲＮＡポリメラーゼＩＩ機構（真核生物において）によって転写され、次いで、リボソームによって翻訳される遺伝子上にコードされた、全Ｌプロタンパク質として産生される。この活性な大員環は、Ｎ末端シグナル認識モチーフおよびＣ末端シグナル認識モチーフと隣接しているカセット内にコードされている。翻訳後、この全Ｌプロタンパク質は、いくつかの修飾（例えば、側鎖アシル化、いくつかまたは全ての位置のＬ－アミノ酸からＤ－アミノ酸への異性化、側鎖ヒドロキシル化、バックボーンＮ－メチル化、末端間環化、ジスルフィド架橋形成、トリプタチオニン架橋形成、その他多数）を導入し、このプロタンパク質からカセットペプチドを遊離させ、次いで最終的な天然産物に変換する、修飾酵素のセットによる処理を受ける。Ｎ末端シグナル認識モチーフおよびＣ末端シグナル認識モチーフは、プロセシング酵素のためのドッキング部位として機能し、触媒作用の順序およびキネティクスを統制する。
ＲｉＰＰプロセシング酵素について高頻度に見られる特徴の１つは、それらの多くが、カセット内にコードされた活性ペプチドの配列に事実上完全に依存せず、それによって、カセット内の置換に対する高い耐容性がもたらされることである。毒キノコＲｉＰＰのアマトキシン／ファラトキシン／ＭＳＤｉｎファミリーについての研究によって、対応するプロリルオリゴペプチダーゼ／マクロシクラーゼ（ＰｏｐＢ）の、種々の天然に存在するアクティブペプチドカセット配列バリアントに対する、ならびに多くの合成的に誘導されたバリアントに対する無差別性の概念が裏付けられた。このような知見によって、プロタンパク質コード遺伝子内のカセットコード配列のＤＮＡを変化させるだけでＲｉＰＰベースの天然産物の幅広く多様化された誘導体を生成させるための、直裁的な戦略に向けての可能性が示される。
要旨
本明細書において、宿主細胞中で、第１の試験タンパク質の分解を誘発する１つまたはそれを超える分子を同定するための方法が開示されている。この方法は、前記宿主細胞中で、（ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはその機能的フラグメント；（ｉｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質、を発現させることを含み得る。前記宿主細胞は、デスエージェントの発現を制御するためのプロモーター配列を含み得、ここで、前記第１のＤＮＡ結合部分は、前記プロモーター配列に特異的に結合する。前記分子は、前記宿主細胞に送達され得る。前記分子の非存在下で、前記デスエージェントの発現が活性化され得る。前記分子の存在下で、前記第１の試験タンパク質は、前記Ｅ３ユビキチンリガーゼによって分解され得る。
いくつかの実施形態において、前記方法は、第２のＤＮＡ結合部分、第２の試験タンパク質、および第２の遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質を宿主細胞中で発現させることをさらに含み、ここで、前記宿主細胞は、前記第２のＤＮＡ結合部分に特異的な配列を有する１つまたはそれを超えるプロモーターによって駆動される１つまたはそれを超えるポジティブ選択レポーターを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、本方法は、宿主細胞内に配置された複数のポジティブ選択レポーターをさらに含み、ここで、前記複数のポジティブ選択レポーターの各ポジティブ選択レポーターは、前記第２のＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーター配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、前記ポジティブ選択レポーター（単数または複数）は、前記宿主細胞内に配置されたプラスミド中にコードされている。
いくつかの実施形態において、前記分子は、分子ライブラリーの部分であり得る。いくつかの実施形態において、前記ライブラリーからの分子は、外来的に送達されてもよい。いくつかの実施形態において、前記分子は、細胞内で生成されてもよい。いくつかの実施形態において、前記分子は、細胞内で、ＤＮＡにコードされたライブラリーから生成されてもよい。
いくつかの実施形態において、第２の試験タンパク質を保存しながら、宿主細胞中の特定の試験タンパク質の分解を選択的に媒介する分子を同定するための方法が記述される。前記方法は、宿主細胞中で、活性化ドメインとＤＮＡ結合部分とを有する試験タンパク質を含む第１の融合タンパク質を発現させること；活性化ドメインとＤＮＡ結合部分とを有する第２の試験タンパク質；宿主細胞中で、必要とされるユビキチン化機構コンポーネントと共に、Ｅ３リガーゼを含む第３のタンパク質を発現させること；および分子を、ライブラリーから前記宿主細胞に送達することを含んでいてもよく、ここで、ネガティブセレクションデスエージェントを発現させるための遺伝子の配列が、宿主細胞内に配置され、かつ前記第１の融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列に作動可能に連結されており、ここで、ポジティブ選択レポーターが、前記宿主内に配置され、かつ前記第２の融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列に作動可能に連結されており、さらにここで、前記分子が存在しない場合、前記第１の試験タンパク質の発現が、前記遺伝子活性化部分による前記デスエージェントの発現の活性化を引き起こし、一方で、前記第２の試験タンパク質の発現が、前記遺伝子活性化部分による前記ポジティブ選択レポーターの発現の活性化を引き起こす。
いくつかの実施形態において、前記ライブラリーからの分子は、外来的に送達される。いくつかの実施形態において、前記分子は、細胞内で生成される。いくつかの実施形態において、前記分子は、細胞内で、ＤＮＡにコードされたライブラリーから生成される。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列によって活性化されるポジティブコントロールレポーターを発現させるための１つを超える配列を含む。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列によって活性化されるデスエージェントを発現させるための１つを超える配列を含む。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、前記第１の融合タンパク質をコードするインテグレーテッドＤＮＡ、前記第２の融合タンパク質をコードするインテグレーテッドＤＮＡ、前記第３の融合タンパク質をコードするインテグレーテッドＤＮＡ；前記デスエージェントをコードするプラスミドＤＮＡ；およびポジティブ選択レポーターをコードするプラスミドＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＫＲＡＳのバリエーションである。いくつかの実施形態において、前記第２の試験タンパク質は、ＫＲＡＳである。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、アンドロゲン受容体スプライスバリアントＡＲＶ（ＡＲＶ３、ＡＲＶ７、またはＡＲＶ９）である。いくつかの実施形態において、前記第２の試験タンパク質は、野生型アンドロゲン受容体である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＩＤＨのバリエーションである。いくつかの実施形態において、前記第２の試験タンパク質は、野生型ＩＤＨである。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、Ｍｙｃである。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＣＣＮＥである。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、エストロゲン受容体（ＥＲ）である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ２である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＰＤ－１またはＰＤＬ－１である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＣＴＬＡ－４である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、Ｔａｕである。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、Ａｃｔ１／ＣＩＫＳ（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ ｔｏ ＩκＢ Ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ Ｓｔｒｅｓｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、Ｅｔｓ転写因子バリアント（ＥＴＶ１、ＥＴＶ２、ＥＴＶ３、ＥＴＶ４、またはＥＴＶ５）である。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡ結合部分は、ＬｅｘＡ、ｃＩ、Ｇｌｉ－１、ＹＹ１、グルココルチコイド受容体、ＴｅｔＲ、またはＵｍｅ６に由来する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子活性化部分は、ＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ－κＢ、Ｂ４２、ＢＰ６４、ＶＰ６４、またはｐ６５に由来する。
いくつかの実施形態において、前記デスエージェントは、ＤＮＡまたはＲＮＡから選択される遺伝因子の過剰発現産物である。いくつかの実施形態において、前記遺伝因子は、ＧＩＮ１１などの増殖抑制（ＧＩＮ）配列である。いくつかの実施形態において、前記デスエージェントは、リボソームによってコードされた生体異物剤、リボソームによってコードされた毒、マイルドな過剰発現によって重篤な増殖障害を引き起こすリボソームによってコードされた内在性または外来性遺伝子、生存に必須の遺伝子を切断するリボソームによってコードされたリコンビナーセ、毒性２次代謝産物の合成に関与する制限因子、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記デスエージェントは、コレラ毒素、ＳｐｖＢ毒素、ＣＡＲＤＳ毒素、ＳｐｙＡ毒素、ＨｏｐＵｌ、Ｃｈｅｌｔ毒素、Ｃｅｒｔｈｒａｘ毒素、ＥＦＶ毒素、ＥｘｏＴ、ＣｄｔＢ、ジフテリア毒素、ＥｘｏＵ／ＶｉｐＢ、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＧ、ＶｏｐＦ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＳｄｂＡ、ＳｉｄＧ、ＶｐｄＡ、Ｌｐｇ０９６９、Ｌｐｇｌ９７８、ＹｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｏｐＥ２、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｉｐＡ、ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、アマトキシン、ファラシジン、キラートキシンＫＰ１、キラートキシンＫＰ６、キラートキシンＫｌ、キラートキシンＫ２８（ＫＨＲ）、キラートキシンＫ２８（ＫＨＳ）、炭疽菌致死因子エンドペプチダーゼ、志賀毒素、サポリン毒素、リシン毒素、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、真菌または細菌である。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓである。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉである。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓである。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
いくつかの実施形態において、前記分子は、小分子である。いくつかの実施形態において、前記小分子は、ペプチド模倣物である。いくつかの実施形態において、前記分子は、ペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するタンパク質産物由来である。ある特定の実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、合成されたタンパク質産物である。いくつかの実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、組換え遺伝子の産物である。いくつかの実施形態において、前記分子は、前記宿主細胞内に導入された試験ＤＮＡ分子から発現されたペプチドまたはタンパク質であり、ここで、前記試験ＤＮＡ分子は、前記ライブラリーを形成しているポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ライブラリーは、長さが６０アミノ酸またはそれより少ないポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲをコードする。いくつかの実施形態において、前記３’ＵＴＲは、ｓＯＲＦ１の３’ＵＴＲである。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、メチオニン－バリン－アスパラギンという共通のＮ末端配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ライブラリー中の前記ポリペプチドは、前記宿主細胞中で、環状ペプチドまたは二環性ペプチドに加工される。
本明細書において、ある特定の実施形態において、プラスミドベクターが開示されている。いくつかの実施形態において、前記プラスミドベクターは、ＧＡＬ４－ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）およびＶＰ１６活性化ドメイン（ＡＤ）とインフレームで挿入された第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、Ｕｍｅ６－ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」）とＶＰ１６活性化ドメイン（ＡＤ）にインフレームで挿入された第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および第３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、前記プラスミドベクターを含む。
本明細書において、ある特定の実施形態において、プラスミドベクターのライブラリーが開示されており、各プラスミドベクターは、第１のスイッチ可能なプロモーターに作動可能に連結された異なるペプチド配列をコードするＤＮＡ配列；第２のスイッチ可能なプロモーターの制御下にあるデスエージェントをコードするＤＮＡ配列；および第３のスイッチ可能なプロモーターの制御下にあるポジティブ選択レポーターをコードするＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態において、前記異なるペプチド配列は、共通のＮ末端安定化配列をコードしている。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡ配列は、３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡ配列をコードしている。いくつかの実施形態において、前記異なるペプチド配列は、長さが６０アミノ酸またはそれより少ない。いくつかの実施形態において、前記異なるペプチド配列は、ランダムである。いくつかの実施形態において、前記異なるペプチド配列は、標的への結合のために、事前に富化されている。いくつかの実施形態において、宿主細胞のライブラリーであり、それぞれ前記プラスミドベクターのライブラリーを含む。
本明細書において、ある特定の実施形態において、プラスミドベクターのライブラリーが開示されており、各プラスミドベクターは、第１のスイッチ可能なプロモーターに作動可能に連結されたペプチドＮ－メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列；第２のスイッチ可能なプロモーターに作動可能に連結されたプロリルオリゴペプチダーゼを含み；いくつかの実施形態において、前記異なるペプチド配列は、長さが１８アミノ酸またはそれより少ない。いくつかの実施形態において、前記異なるペプチド配列は、ランダムである。いくつかの実施形態において、前記異なるペプチド配列は、標的への結合のために、事前に富化されている。いくつかの実施形態において、宿主細胞のライブラリーであり、それぞれ前記プラスミドベクターのライブラリーを含む。
本明細書において、特定のタンパク質の分解を加速するように構成された宿主細胞が記述されている。前記宿主細胞は、Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはその機能的フラグメント；第１の試験タンパク質、第１のＤＮＡ結合部分、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；デスエージェント（ここで、前記デスエージェントの発現は、前記第１のＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列の制御下にある）；および６０またはそれより少ないアミノ酸のポリペプチドを発現し得、ここで、前記ポリペプチドは、前記第１の融合タンパク質の分解が加速される様式で、前記第１の融合タンパク質と前記Ｅ３ユビキチンリガーゼとの間の相互作用を調節する。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、第２のＤＮＡ結合部分、第２の試験タンパク質、および第２の遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質；およびポジティブ選択レポーターをさらに含み、ここで、前記ポジティブレポーターの発現は、前記第２のＤＮＡ結合部分に特異的な第２のプロモーターＤＮＡ配列の制御下にある。
いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、ペプチド安定化のためのＮ末端配列をコードする。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、大員環である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、Ｎ－メチル化大員環である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、ｍＲＮＡにコードされた産物であり、ここで、前記ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、前記ｍＲＮＡは、ＤＮＡ分子にコードされた産物であり、ここで、前記ＤＮＡ分子は、前記宿主細胞内に、外来的に送達される。いくつかの実施形態において、合成化合物ライブラリーを試験してもよい。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、真核生物または原核生物である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、動物、植物、真菌、または細菌である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ハプロイド酵母細胞である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ディプロイド酵母細胞である。いくつかの実施形態において、前記ディプロイド酵母細胞は、前記第１のキメラ遺伝子、前記第２のキメラ遺伝子、および前記第３のキメラ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む第１の宿主細胞を、前記デスエージェント、ポジティブ選択レポーター、およびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む第２の宿主細胞と接合させることによって生成される。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓである。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉである。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓである。
本明細書において、標的タンパク質の分解を選択的に加速するためのキットが開示されている。キットは、第１のＤＮＡ結合部分と活性化ドメインとの間にインフレームで挿入され得る第１の試験タンパク質を含む第１の融合タンパク質；第２のＤＮＡ結合部分と第２の活性化ドメインとの間にインフレームで挿入され得る第２の融合タンパク質；および上述したプラスミドベクターの前記ライブラリーをコードする、第１のプラスミドベクターを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、前記キットは、宿主細胞内でＥ３リガーゼを発現させるために構成された第２のプラスミドベクターをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記第１のベクターは、Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードしていてもよい。
本明細書において、第１の試験タンパク質の分解を誘発する１つまたはそれを超える分子を同定するための方法が開示されている。前記方法は、複数の宿主細胞中で、（ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはその機能的フラグメント；および（ｉｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質を発現させることを含んでいてもよい。前記複数の宿主細胞は、それぞれデスエージェントの発現を制御するためのプロモーター配列を含んでいてもよく、前記第１のＤＮＡ結合部分は、前記第１の融合タンパク質のユビキチン化および成熟前分解を引き起こす様式で、前記Ｅ３ユビキチンリガーゼを前記第１の融合タンパク質に動員する分子の非存在下で、前記デスエージェントの発現が活性化されるように、前記プロモーター配列に特異的に結合してもよい。前記方法は、異なる分子を、前記複数の宿主細胞のそれぞれに送達すること、および前記分子が内部に送達される細胞の生存に基づいて前記第１の試験タンパク質の分解を促進する分子を特定することを含んでいてもよい。
本明細書において、ある特定の実施形態において、第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を選択的に促進し、その分解をもたらす分子を同定するための方法が開示されており、前記方法は、前記宿主細胞中で、前記第１の試験タンパク質、ＤＮＡ結合部分、および遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質を発現させること；前記宿主細胞中で、前記第２の試験タンパク質、ＤＮＡ結合部分、および遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質を発現させること；前記宿主細胞中で、Ｅ３ユビキチンリガーゼを含む第３のタンパク質を発現させること；および分子を、ライブラリーから前記宿主細胞に、前記分子が前記第１の試験タンパク質と前記Ｅ３ユビキチンリガーゼとの間に架橋相互作用を生じさせ、その選択的分解をもたらすように送達することを含み；ここで、デスエージェントを発現させるための遺伝子の配列が、宿主細胞内に配置され、かつ前記第１の融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列に作動可能に連結されており；ここで、ポジティブ選択レポーターが、宿主細胞内に配置され、かつ前記第２の融合タンパク質の前記ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。前記第１の試験タンパク質は、前記デスエージェントの発現を活性化する機能的転写因子を形成し得；および前記第２の試験タンパク質は、ポジティブ選択レポーターの発現を活性化する機能的転写因子を形成し得る。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ＤＮＡ結合部分に特異的な前記プロモーターＤＮＡ配列によって活性化されるデスエージェントを発現させるための１つを超える配列を含む。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列によって活性化されるポジティブコントロールレポーターを発現させるための１つを超える配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、前記第１の融合タンパク質をコードするインテグレーテッドＤＮＡ、前記第２の融合タンパク質をコードするインテグレーテッドＤＮＡ、前記第３の融合タンパク質をコードするインテグレーテッドＤＮＡ；前記デスエージェントをコードするプラスミドＤＮＡ；およびポジティブ選択レポーターをコードするプラスミドＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡ結合部分は、ＬｅｘＡ、ｃＩ、Ｇｌｉ－１、ＹＹ１、グルココルチコイド受容体、ＴｅｔＲ、またはＵｍｅ６に由来する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子活性化部分は、ＶＰ１６、Ｇａｌ４、ＮＦ－κＢ、Ｂ４２、ＢＰ６４、ＶＰ６４、またはｐ６５に由来する。いくつかの実施形態において、前記デスエージェントは、遺伝因子であり、ここで、遺伝材料の過剰発現は、前記宿主細胞の増殖阻害をもたらす。いくつかの実施形態において、前記デスエージェントは、ＤＮＡの過剰発現産物である。いくつかの実施形態において、前記デスエージェントは、ＲＮＡの過剰発現産物である。いくつかの実施形態において、前記デスエージェントを発現させるための前記遺伝子の配列は、ＧＩＮ１１などの増殖抑制（ＧＩＮ）配列である。いくつかの実施形態において、前記デスエージェントは、リボソームによってコードされた生体異物剤、リボソームによってコードされた毒、マイルドな過剰発現によって重篤な増殖障害を引き起こすリボソームによってコードされた内在性または外来性遺伝子、生存に必須の遺伝子を切断するリボソームによってコードされたリコンビナーセ、毒性２次代謝産物の合成に関与する制限因子、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記デスエージェントは、コレラ毒素、ＳｐｖＢ毒素、ＣＡＲＤＳ毒素、ＳｐｙＡ毒素、ＨｏｐＵｌ、Ｃｈｅｌｔ毒素、Ｃｅｒｔｈｒａｘ毒素、ＥＦＶ毒素、ＥｘｏＴ、ＣｄｔＢ、ジフテリア毒素、ＥｘｏＵ／ＶｉｐＢ、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＧ、ＶｏｐＦ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＳｄｂＡ、ＳｉｄＧ、ＶｐｄＡ、Ｌｐｇ０９６９、Ｌｐｇｌ９７８、ＹｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｏｐＥ２、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｉｐＡ、ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、アマトキシン、ファラシジン、キラートキシンＫＰ１、キラートキシンＫＰ６、キラートキシンＫｌ、キラートキシンＫ２８（ＫＨＲ）、キラートキシンＫ２８（ＫＨＳ）、炭疽菌致死因子エンドペプチダーゼ、志賀毒素、サポリン毒素、リシン毒素、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＫＲＡＳのバリエーションである。いくつかの実施形態において、前記第２の試験タンパク質は、ＫＲＡＳである。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、アンドロゲン受容体スプライスバリアントＡＲＶ（ＡＲＶ３、ＡＲＶ７、またはＡＲＶ９）である。いくつかの実施形態において、前記第２の試験タンパク質は、野生型アンドロゲン受容体である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＩＤＨのバリエーションである。いくつかの実施形態において、前記第２の試験タンパク質は、野生型ＩＤＨである。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、Ｍｙｃである。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＣＣＮＥである。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、エストロゲン受容体（ＥＲ）である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＩＫＺＦ１またはＩＫＺＦ２である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＰＤ－１またはＰＤＬ－１である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＣＴＬＡ－４である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、Ｔａｕである。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、Ａｃｔ１／ＣＩＫＳ（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ ｔｏ ＩκＢ Ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ Ｓｔｒｅｓｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）である。いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、Ｅｔｓ転写因子バリアント（ＥＴＶ１、ＥＴＶ２、ＥＴＶ３、ＥＴＶ４、またはＥＴＶ５）である。
いくつかの実施形態において、前記分子は、小分子である。いくつかの実施形態において、前記小分子は、ペプチド模倣物である。いくつかの実施形態において、前記分子は、ペプチドまたはタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するタンパク質産物由来である。いくつかの実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、合成されたタンパク質産物である。いくつかの実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、組換え遺伝子の産物である。いくつかの実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、前記宿主細胞内に導入された試験ＤＮＡ分子の発現産物であり、ここで、前記試験ＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、前記ライブラリーを形成する。いくつかの実施形態において、前記ライブラリーは、６０またはそれより少ないアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、翻訳後修飾の産物である。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、切断を含む。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、環化を含む。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、二環化を含む。いくつかの実施形態において、前記環化は、プロリルエンドペプチダーゼとの反応を含む。いくつかのケースにおいて、前記プロリルエンドペプチダーゼは、配列番号４２～５８またはその機能的フラグメントから選択されるものであり得る。いくつかのケースにおいて、前記プロリルエンドペプチダーゼは、配列番号４２～５８の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものであり得る。
いくつかの実施形態において、前記環化は、ベータラクタマーゼとの反応を含む。いくつかのケースにおいて、前記ラクタマーゼは、配列番号１１９～１２０またはその機能的フラグメントから選択されるものであり得る。いくつかのケースにおいて、前記ラクタマーゼは、配列番号１１９～１２０の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものであり得る。
いくつかの実施形態において、前記二環化は、ヒドロキシラーゼおよびデヒドラターゼとの反応を含む。いくつかのケースにおいて、前記ヒドロキシラーゼは、配列番号１２３またはその機能的フラグメントを含んでいてもよい。いくつかのケースにおいて、前記ヒドロキシラーゼは、配列番号１２３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものであり得る。いくつかのケースにおいて、前記デヒドラターゼは、配列番号１２４～１２７またはその機能的フラグメントから選択されるものであり得る。いくつかのケースにおいて、前記デヒドラターゼは、配列番号１２４～１２７の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものであり得る。
いくつかの実施形態において、前記二環化は、トリプタチオニン架橋によって形成される。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、メチル化を含む。いくつかの実施形態において、前記メチル化は、Ｎ－メチルトランスフェラーゼとの反応を含む。いくつかのケースにおいて、前記Ｎ－メチルトランスフェラーゼは、配列番号６１～１１６またはその機能的フラグメントから選択されるものである。いくつかのケースにおいて、前記Ｎ－メチルトランスフェラーゼは、配列番号６１～１１６の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものであり得る。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、ハロゲン化を含む。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、グリコシル化を含む。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、アシル化を含む。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、リン酸化を含む。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、アセチル化を含む。
いくつかの実施形態において、前記試験ＤＮＡ分子は、修飾酵素を発現する遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、前記試験ＤＮＡ分子は、メチオニン－バリン－アスパラギンというＮ末端配列を発現する遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、前記試験ＤＮＡ分子は、３’ＵＴＲをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態において、前記３’ＵＴＲは、ｓＯＲＦ１の３’ＵＴＲである。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、真核生物または原核生物である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、動物、植物、真菌、または細菌である。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓである。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉである。いくつかの実施形態において、前記真菌は、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓである。
本明細書において、細胞における、環状の、バックボーンがメチル化された大環式ペプチドおよび大環式ペプチドの産生に関連する遺伝子およびペプチドを含む組成物および方法が開示されている。特に、本発明は、このような種類の環状ペプチドのプロセシングに関与するタンパク質に加えて、ギムノペプチドに具体的に関連するペプチドをコードするＧｙｍｎｏｐｕｓ種由来の遺伝子およびタンパク質の使用に関する。好ましい実施形態において、本発明は、また、真核生物、原核生物、または無細胞系における異種発現による、小さなペプチド、およびギムノペプチドのようなペプチドを含む小さな環状ペプチドを作成するための方法にも関する。
前記方法は、機能性分子のスクリーニングを可能にするための大員環のライブラリーを、起こり得るＮ末端メチル化イベントと共に、宿主細胞内部で、異種性に生じさせるための酵素の使用をさらに記述する。いくつかの例において、前記機能性分子は、２つのタンパク質の相互作用をモジュレートして、タンパク質－タンパク質相互作用を破壊するか、または促すことができる。また、Ｅ３ユビキチンリガーゼとタンパク質との間の相互作用を促し、前記タンパク質の機能的分解をもたらすことができる修飾大員環の選択も記述されている。
本明細書において、いくつかの実施形態において、環状ペプチドを製造する方法が記述されている。この環状ペプチドを製造するための方法は、プロリルオリゴペプチダーゼを遺伝子組換えにより発現させること；および前記プロリルオリゴペプチダーゼを、直鎖ペプチドと、直鎖ペプチドが環状ペプチドに変換されるように接触させることを含んでいてもよく；ここで、前記プロリルオリゴペプチダーゼの活性部位は、配列番号５５のアミノ酸位置６０３に対応する位置にトリプトファン残基を有さず、および／または配列番号５５のアミノ酸５６３に対応する位置にアスパラギン残基を有さない。
いくつかの実施形態において、前記プロリルオリゴペプチダーゼは、配列番号５５のアミノ酸位置６０３に対応するアミノ酸位置６０３にロイシンを有し、および／または配列番号５５のアミノ酸位置５６３に対応するアミノ酸位置５６３にセリン残基を有する。いくつかの実施形態において、前記プロリルオリゴペプチダーゼ（ｐｒｏｌｙｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）は、配列番号４２～５８のいずれか１つに対応する配列を含む。いくつかの実施形態において、前記プロリルオリゴペプチダーゼ（ｐｒｏｌｙｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）は、配列番号４２～５８の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものである。
いくつかの実施形態において、前記プロリルオリゴペプチダーゼを前記直鎖ペプチドと接触させることは、細胞内で起こる。いくつかの実施形態において、前記プロリルオリゴペプチダーゼを前記直鎖ペプチドと接触させることは、細胞内で起こらない。いくつかの実施形態において、前記直鎖ペプチドは、遺伝子組換えにより発現される。いくつかの実施形態において、前記環状ペプチドは、１８またはそれを超えるアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書において、第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を破壊する環状ペプチドを同定する方法が記述されている。前記方法は、（ａ）宿主細胞中で、（ｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；および（ｉｉ）第２の試験タンパク質を発現させること；および（ｂ）前記ペプチドを前記宿主細胞に送達すること（ここで、前記環状ペプチドの非存在下で、デスエージェントの発現が活性化される）を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書において、第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を促す環状ペプチドを同定する方法が記述されている。前記方法は、（ａ）宿主細胞中で、（ｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；および（ｉｉ）第２の試験タンパク質を発現させること；および（ｂ）前記ペプチドを前記宿主細胞に送達すること（ここで、前記環状ペプチドの非存在下で、デスエージェントの発現が活性化される）を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書において、ペプチドをメチル化する方法が記述されている。前記方法は、Ｎ－メチルトランスフェラーゼを遺伝子組換えにより発現させること；および前記Ｎ－メチルトランスフェラーゼを、ペプチドと、前記ペプチドのバックボーン中の複数の窒素がメチル化されるように接触させることを含んでいてもよく；ここで、Ｎ－メチルトランスフェラーゼは、配列番号６１～１１６の１つの配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記接触させるペプチドは、環状ペプチドである。いくつかの実施形態において、前記ペプチドまたは環状ペプチドは、１８またはそれを超えるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｎ－メチルトランスフェラーゼを前記ペプチドと接触させることは、細胞内で起こる。いくつかの実施形態において、前記Ｎ－メチルトランスフェラーゼを前記ペプチドと接触させることは、細胞内で起こらない。いくつかの実施形態において、前記ペプチドは、遺伝子組換えにより発現される。
いくつかの実施形態において、本明細書において、第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を破壊する環状ペプチドを同定するための方法が記述されている。前記方法は、（ａ）宿主細胞中で、（ｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；および（ｉｉ）第２の試験タンパク質を発現させること；および（ｂ）前記ペプチドを前記宿主細胞に送達すること（ここで、前記環状ペプチドの非存在下で、デスエージェントの発現が活性化される）を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書において、第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を促す環状ペプチドを同定するための方法が記述されている。前記方法は、（ａ）宿主細胞中で、（ｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；および（ｉｉ）第２の試験タンパク質を発現させること；および（ｂ）前記ペプチドを前記宿主細胞に送達すること（ここで、前記環状ペプチドの非存在下で、デスエージェントの発現が活性化される）を含んでいてもよい。
参照による援用
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、および特許出願が、それぞれ具体的かつ個別に参照により援用されるべきものと示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明（そこでは、本開示の原理が利用される）、および添付の図面を参照することによって、本開示の特徴および利点のより一層の理解が得られるであろう。
図１は、Ｅ３ユビキチンリガーゼとのタンパク質（Ｂａｉｔ）の相互作用を特異的に媒介してその分解を導き、それによって細胞増殖に必要とされるポジティブマーカーの発現消失を引き起こす化合物を同定するためのプラットフォームを示す。
図２は、Ｅ３ユビキチンリガーゼとタンパク質の相互作用を媒介してその分解を導く化合物を同定するためのプラットフォームを示す。
図３は、Ｅ３ユビキチンリガーゼとタンパク質（Ｂａｉｔ ２）の相互作用を特異的に媒介して、別のタンパク質（Ｂａｉｔ １）の活発な発現を維持しつつ、その分解を導く化合物を同定するためのプラットフォームを示す。
図４は、Ｅ３ユビキチンリガーゼとタンパク質（ＢａｉｔＭＵＴ）の相互作用を特異的に媒介して、別のタンパク質（ＢａｉｔＷＴ）の活発な発現を維持しつつ、その分解を導く化合物を同定するためのプラットフォームを示す。
図５Ａは、より大きなペプチドを大環状化できない相対プロリルオリゴペプチダーゼ（ｐｒｏｌｙｌｏｌｉｏｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）の活性部位に存在するトリプトファン残基の保存を示す。この配列リードは、より大きなペプチドを大環状化できるＧｙｍｎｏｐｕｓ ｆｕｓｉｐｅｓから単離されたプロリルオリゴペプチダーゼの活性部位に、トリプトファン残基が存在しないことを示す。
図５Ｂは、植物プロリルオリゴペプチダーゼホモログの構造と、この酵素の活性部位中の位置６０３のトリプトファン残基を指し示す矢印を示す。
図５Ｃは、より大きなペプチドを大環状化できない相対プロリルオリゴペプチダーゼ（ｐｒｏｌｙｌｏｌｉｏｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）の活性部位に存在するアスパラギン残基の保存を示す。この配列リードは、より大きなペプチドを大環状化できるＧｙｍｎｏｐｕｓ ｆｕｓｉｐｅｓから単離されたプロリルオリゴペプチダーゼの活性部位に、アスパラギン残基が存在しないことを示す。
図５Ｄは、植物プロリルオリゴペプチダーゼホモログの構造と、この酵素の活性部位中の位置５６３のアスパラギン残基を指し示す矢印を示す。
図６は、メチルトランスフェラーゼと、プロリルオリゴペプチダーゼまたはラクタマーゼとを使用して大環状架橋剤のライブラリーを作成するためのベクタープラットフォームを示す。
図７は、メチルトランスフェラーゼとプロセシング酵素とを使用して大環状架橋剤のライブラリーを作成するためのベクタープラットフォームを示す。
図８は、図１に記載されているメカニズムを使用した、標的タンパク質の分解についてのネガティブリードアウトアッセイを示す。
図９は、図２に記載されているメカニズムを使用した、標的タンパク質の分解についてのポジティブリードアウトアッセイを示す。
図１０Ａ～Ｃは、ＮＡＡ、ＰＡＡ、および２，４－ＤＣＰＡなどの架橋剤のハイスループットスクリーニングを使用した、標的タンパク質の分解についてのポジティブリードアウトアッセイを示す。
図１１Ａ～Ｃは、コロナチンなどの架橋剤のハイスループットスクリーニングを使用した、標的タンパク質の分解についてのポジティブリードアウトアッセイを示す。
詳細な説明
本開示は、統合された真核生物または原核生物のワンハイブリッドシステムを使用できるシステムを提供し、ここで、両方の生物に関して、Ｂａｉｔ発現プラスミドが使用される。さらに、このようなシステムを使用した相互作用検出の効率を比較するために、アフィニティーが既知の、広範囲にわたる一連のロイシンジッパー融合タンパク質を生成させることができる。前記酵母システムは、あるダイナミックレンジにわたって、定量的リードアウトを生成することができる。加えて、本明細書に開示されている修飾を受けた発現ベクターは、真核生物および原核生物の両方において、目的のタンパク質の発現のために使用することができる。
本開示は、また、細胞膜を横切って分子を送達するためのシステムも提供する。細胞膜は、（特にペプチド、タンパク質、および核酸などの生物製剤のための）医薬送達における重大な課題をもたらす。この膜バリアーを破壊し、生物製剤を細胞内に送達するための１つの可能性のある戦略は、そのような製剤を「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）に結合させることである。３０年間にわたる研究にもかかわらず、ＣＰＰ活性の根本的な原理は不明確なままである。エンドシトーシスによって細胞内に入るＣＰＰは、一般に、サイトゾルに到達するために、細胞内小胞から抜け出す。残念なことに、エンドソームの膜は、これらのＣＰＰの細胞質送達に対して、細胞内部に逃れ出るペプチドが、多くの場合ごく僅かであるような、強固なバリアーであることが判明している。よって、ペプチドに、種々の細胞種に対する非常に巧妙な内因性の細胞透過活性を付与する、新たなスキャフォールドおよび構造が必要とされている。いくつかの天然に存在するポリケタイドおよびペプチドは、注目すべき細胞透過性を示す（例えば、シクロスポリンおよびアマニチン）。これらのペプチドは、その細胞膜透過性において決定的な役割を果たし得る特定の修飾（例えば、バックボーンのＮ－メチル化、および環化または二環化）によって特徴付けられる。本明細書に記載されている組成物および方法は、高い治療的価値を有し得、かつタンパク質の高選択的な分解が可能であり得る組成物を生成させるために、類似の修飾の一般的な利用を可能にする方法およびアプローチを記述する。
定義
本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子」は、その発現をアッセイできる遺伝子を指す。このような遺伝子としては、例えば、ＬａｃＺ遺伝子、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、アミノ酸生合成遺伝子、酵母ＬＥＵ２遺伝子、酵母ＨＩＳ３遺伝子、酵母ＬＹＳ２遺伝子、または酵母ＵＲＡ３遺伝子、核酸生合成遺伝子、哺乳類のクロロアムフェニコールアセチル基転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、または特定の抗体が利用可能な任意の表面抗原遺伝子があげられる。レポーター遺伝子は、ポジティブ選択およびネガティブ選択のどちらももたらし得る。
「アレル」は、天然に存在する遺伝子または遺伝子の病原性バリアントを含む、遺伝子のＤＮＡ配列を指す。異なるアレルの発現は、異なるタンパク質バリアントをもたらし得る。
「プロモーター」は、作動可能に連結された転写された配列の５’末端の転写開始点近傍に位置するＤＮＡ配列である。プロモーターは、前記作動可能に連結された遺伝子の転写調節において相互作用する、１つまたはそれを超える調節エレメントまたは調節モジュールを含み得る。プロモーターは、スイッチ可能、または構成的であり得る。スイッチ可能なプロモーターは、薬剤を投与した際に、作動可能に連結された標的遺伝子の可逆的な誘導または抑制を可能にする。スイッチ可能なプロモーターとしては、例えば、それらに限定されないが、ＬｅｘＡオペレーターおよびアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーターがあげられる。構成的プロモーターとしては、例えば、ヒトベータアクチン遺伝子プロモーターがあげられる。
「作動可能に連結された」は、第１のエレメントの活性の調節が、第２のエレメントに対する効果を引き起こすように配置された、２つの巨大分子エレメントを記述する。このように、プロモーターエレメントの活性の調節は、作動可能に連結されたコード配列の発現を変化または制御するために使用し得る。例えば、プロモーターエレメントに作動可能に連結されたコード配列の転写は、前記プロモーターの活性を活性化する因子によって誘導することができ；プロモーターエレメントに作動可能に連結されたコード配列の転写は、前記プロモーターの活性を抑制する因子によって阻害することができる。よって、そのようなコード配列の活性は、前記プロモーターの活性による影響を受ける場合、プロモーター領域がタンパク質のコード配列に作動可能に連結されている。
「インフレーム」は、本明細書全体を通じて使用される場合、プロモーター配列に作動可能に連結されたＤＮＡフラグメントまたはコード配列内における所望の配列のヌクレオチドの適切な配置を指し、それによって、転写および／または翻訳が可能になる。
「融合コンストラクト」は、融合タンパク質をコードする組換え遺伝子を指す。
「融合タンパク質」は、ハイブリッドタンパク質、すなわち、少なくとも２つの異なるタンパク質に由来するドメインを含有するように構成されたタンパク質である。本明細書に記載されている融合タンパク質は、（１）転写制御タンパク質由来の転写制御ドメイン、またはＤＮＡ結合タンパク質由来のＤＮＡ結合ドメインと、（２）相互作用状態についてアッセイされる異種タンパク質の両方を有するハイブリッドタンパク質であり得る。転写制御ドメインの起源であるタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインの起源であるタンパク質と異なっていてもよい。言い換えれば、前記２つのドメインは、互いに異種性であってもよい。
Ｂａｉｔ融合タンパク質の転写制御ドメインは、そのドメインの生物学的活性に応じて、標的遺伝子の転写を活性化することができるか、または抑制することができる。本開示のＢａｉｔタンパク質は、また、目的のタンパク質がＤＮＡ結合部分および転写活性化ドメインに作動可能に連結された融合タンパク質の一部であってもよい。
「架橋相互作用」は、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質の一方または両方が、ある分子（例えば、ライブラリーからのペプチドまたは小分子）と相互作用した場合にのみ起こる、相互作用を指す。いくつかのケースにおいて、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の架橋相互作用は直接的であるが、他のケースにおいて、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用は間接的である。いくつかのケースにおいて、前記相互作用は、作用を受けている１つのタンパク質の、第２のタンパク質に対する活性（例えば、ユビキチン化と、それに続く分解）をもたらす。
「発現」は、遺伝子内にコードされた情報が明らかにされるプロセスである。遺伝子がタンパク質をコードしている場合、発現には、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写、ｍＲＮＡの（必要であれば）成熟ｍＲＮＡ産物へのプロセッシング、および成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳のいずれも含まれる。
本明細書で使用される場合、「クローニングビヒクル」は、クローニングの目的で、核酸配列を宿主細胞内に送達することができる任意の実体である。クローニングビヒクルとしては、例えば、プラスミドまたはファージゲノムがあげられる。宿主細胞内で自立的に複製することができるプラスミドが特に望ましい。あるいは、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に挿入（組み込み）され得る核酸分子、特に、宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に安定的な様式（すなわち、分子が、娘細胞に遺伝することを可能にする様式）で挿入される分子が有用である。
クローニングビヒクルは、多くの場合、１つまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられ、そのＤＮＡ配列は、その部位で、ビヒクルの本質的な生物学的機能を失うことなく決定可能な様式で切断され得、かつ複製およびクローニングを行うために、その部位にＤＮＡがスプライスされ得る。
クローニングビヒクルは、前記クローニングビヒクルによって形質転換された細胞の同定における使用に適するマーカーをさらに含んでいてもよい。例えば、マーカー遺伝子は、宿主細胞に、特定の抗生物質に対する耐性を与える遺伝子であってもよい。
用語「ベクター」は、「クローニングビヒクル」と互換的に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「発現ビヒクル」は、宿主内に形質変換された後、クローニングされた遺伝子の発現を可能にする環境を提供するように特に設計された、クローニングビヒクルと類似する、ビヒクルまたはベクターである。そのような環境を提供する様式の１つは、そのような発現ビヒクルに転写制御配列および翻訳制御配列を含めることであり、そのような転写制御配列および翻訳制御配列は、クローニングされた遺伝子に作動可能に連結することが可能である。そのような環境を提供する別の様式は、そのようなビヒクルにクローニング部位（単数または複数）を設けることであり、ここで、所望のクローン化遺伝子および所望の発現調節エレメントがクローニングされ得る。
発現ビヒクルにおいて、クローニングする遺伝子は、通常、ある特定の制御配列（例えばプロモーター配列）に作動可能に連結される。発現制御配列は、そのベクターが、作動可能に連結された遺伝子を原核宿主および真核宿主中で発現するように設計されたか否かに応じて異なるであろうし、また、ある特定の転写エレメント（例えば、エンハンサーエレメント、終止配列、組織特異性エレメント、または翻訳開始部位および翻訳終止部位）をさらに含んでいてもよい。
「宿主」は、クローニングビヒクルまたは発現ビヒクルのレシピエントである任意の生物を指す。宿主は、細菌細胞、酵母細胞、または培養された動物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）であってもよい。酵母宿主は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであってもよい。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、細菌、真菌、もしくは哺乳動物細胞、または昆虫または植物由来であり得る。細菌宿主細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓである。真菌細胞の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ．ｐｏｍｂｅである。哺乳動物細胞の非限定的な例は、不死化哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＨｅＬａ、もしくはＣＨＯ細胞、または（例えば、ｈＴＥＲＴによるトランスフェクションによって）遺伝的に不死化された、単離された患者初代組織細胞である。植物の非限定的な例は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍまたはＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓである。昆虫細胞の非限定的な例は、ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞である。
「ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）」、または「ＤＮＡ結合部分」は、特異的なポリペプチドの結合を、特異的なＤＮＡ配列（すなわち、「タンパク質結合部位」）に向けることができる部位である。これらのタンパク質は、配列特異的な様式でＤＮＡに結合するホモダイマーまたはモノマーであってもよい。本開示の例示的なＤＮＡ結合ドメインとしては、ＬｅｘＡ、ｃＩ、グルココルチコイド受容体結合ドメイン、およびＵｍｅ６ドメインがあげられる。
「遺伝子活性化部分」または「活性化ドメイン」（「ＡＤ」）は、遺伝子（その制御領域に前記部位が結合する）の発現を誘発（多くの例において、弱く誘発ではあるが）することができる部位である（１つの例は、転写因子由来の活性化ドメインである）。本明細書で使用される場合、「弱く」は、ＧＡＬ４活性化領域ＩＩによって引き起こされる活性化のレベルを下回ることが意図されており、好ましくは、Ｂ４２活性化ドメインによって引き起こされる活性化のレベルであるか、またはそれを下回る。活性化のレベルは、任意の下流レポーター遺伝子システムを使用して、パラレルアッセイにおいて、ＧＡＬ４領域ＩＩ－ポリペプチドによって刺激された発現のレベルを、試験するポリペプチドによって刺激された発現のレベルと比較することによって測定することができる。
用語「配列同一性」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸配列の文脈において、最大のパーセント配列同一性が得られるように、必要に応じて、配列をアラインおよびギャップを挿入した後の、選択された配列におけるアミノ酸残基と同一な、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とはみなさない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のアライメントは、当該技術分野の範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、比較している配列の全長にわたって最大のアライメントを実現するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
標的タンパク質の機能的分解剤のスクリーニング
選択的なタンパク質分解は、医薬の発見に対するユニークなアプローチである。異常なタンパク質またはそのアイソフォームを選択的に分解する能力は、癌などのある特定の病変を選択的に標的とするための、制御されたアプローチをもたらす。Ｅ３ユビキチンリガーゼへの架橋によって選択的な分解を実現する化合物は、触媒性であり、化学量論的レベルである必要はなく、したがって収益性の高い医薬化合物となる。目的のタンパク質をＥ３ユビキチンリガーゼに対して選択的に架橋する化合物のスクリーニングは、問題となっている標的タンパク質の機能的分解を必ずしも保証するものではない。化合物と、標的と、Ｅ３リガーゼが一過性の三次複合体を形成することによって標的タンパク質を機能的に分解することができる化合物のスクリーニングは、行うことが難しい。現在行われているスクリーニングは、標的に対して特異的な化合物を同定し、その化合物を特定のＥ３リガーゼに結合する別の部分に化学的に結合させ、既知の小分子バインダーの標的に限られる大分子を形成することに依拠するものである。
本開示の方法およびシステムは、ペプチドベースの選択的分解剤の細胞内選択を含んでいてもよい。別に述べたように、本明細書に記載されている種々のシステムは、標的タンパク質とＥ３ユビキチンリガーゼとの間の機能的相互作用を生じさせることによって、またはプロテアソームよって直接的に、標的タンパク質の分解を引き起こす分子をスクリーニングするために使用することができる。モデル生物（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、目的の標的と、特定のＥ３ユビキチンリガーゼおよびランダム化ペプチドライブラリーをコードするＤＮＡ配列を含む試験ＤＮＡ分子との共発現のために使用することができる。これによって、選択メカニズム（例えば、ストリンジェントな生存性リードアウト選択メカニズム）を使用した、目的の標的の機能的分解を引き起こすペプチドのバイアスのない選択が可能になり得る。この方法は、ペプチド媒介相互作用を介した、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合した試験タンパク質と転写活性化ドメイン（ＡＤ）との間の相互作用を必要とする、プロテアソームまたは特定のＥ３ユビキチンリガーゼによる転写因子の分解に依拠し得る、酵母ワンハイブリッドシステムの順列を含んでいてもよい（図１および２を参照のこと）。
本開示の方法およびシステムにおいて、ＡＤに融合した試験タンパク質（例えば、ＶＰ１６、ＮＦ－κＢ ＡＤ、ＶＰ６４ＡＤ、ＢＰ６４ ＡＤ、Ｂ４２酸性活性化ドメイン（Ｂ４２ＡＤ）、またはｐ６５トランス活性化ドメイン（ｐ６５ＡＤ））と、ＤＢＤ（例えば、ＬｅｘＡ、ｃＩ、Ｇｌｉ－１、ＹＹ１、グルココルチコイド受容体結合ドメイン、またはＵｍｅ６ドメイン）とによって媒介された転写因子の再構成が使用され得る。同様に、試験タンパク質は、ＡＤを含み、かつ別の結合パートナーを介してＤＮＡに結合していてもよい。
本開示の方法およびシステムにおいて、また、異なるＤＢＤおよびＡＤに融合した、２つの異なるタンパク質、または１つのタンパク質の２つのバリアントも使用され得る。このシステムは、他の試験タンパク質の活性バージョンを保存しながら、前記タンパク質のうちの１つをＥ３リガーゼに結合させてその分解をもたらす化合物を同定することができる。例えば、複合体中の１つのコンポーネントを、残りの複合体の完全性に影響を及ぼすことなく分解する（図３を参照のこと）。このシステムは、また、特定のアイソフォームを、別のバリアントに影響を及ぼすことなく分解する、選択的阻害剤を同定するために使用することもできる（図４を参照のこと）。
目的のタンパク質の発現によって、ＲＮＡポリメラーゼが特異的なゲノム部位に向けられ、遺伝因子の発現が可能になり得る。この遺伝因子は、例えば、選択培地における生物の増殖を可能にするタンパク質をコードする遺伝子であり得る。選択培地は、例えば、ＡＤＥ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＫＡＮＲ、またはＮＡＴＲに対して特異的であってもよく、かつ須成分（Ａｄｅ、Ｕｒａ、Ｔｒｐ）を欠くか、または医薬（Ｇ４１８，ＮＡＴ）を含むであろう。タンパク質がもはや存在しない場合（例えば、タンパク質が外部の組成物によって分解された場合）に検出することができるマーカーは、対抗選択マーカー（ＵＲＡ３遺伝子など）と呼ばれることがあり、プアまたはリーキー（選択されないミュータントの選択によって容易にマスキングされる）であり得る。選択マーカーのこのリーキー性は、高い擬陽性率をもたらし得る。
本開示の方法およびシステムにおいて、標的タンパク質とＥ３ユビキチンリガーゼとの間の架橋相互作用のメディエーターをスクリーニングするために、強力なネガティブ選択マーカーと、短いペプチドまたは大員環の産生の細胞内安定化とが組み合わされ得る。誘導可能なワンハイブリッドアプローチを使用することができ、これによって、いくつかの細胞毒性レポーター（デスエージェント）のいずれか１つまたは組み合わせ、ならびにポジティブ選択マーカーの発現が促進され得る。ワンハイブリッドシステムにおける細胞毒性レポーターの組み合わせの誘導発現を含む本開示の方法は、誘導された細胞の生存を可能にするためには全ての細胞毒性レポーターが同時に「リーキー」でなければならないため、このワンハイブリッドアッセイの偽陽性率を低下させる乗法的な効果を可能にし得る。
本明細書において、ある特定の実施形態において、第１の試験タンパク質とＥ３ユビキチンリガーゼとの間の相互作用を選択的に促し、宿主細胞中の前記試験タンパク質の機能的分解を媒介し得る分子を同定するための方法が開示されている。第２の試験タンパク質を、陽性対照として使用してもよく、例えば、前記分子は第１の試験タンパク質の分解を媒介するが、第２の試験タンパク質の発現に影響を及ぼさない。この方法は、宿主細胞中で、第１の試験タンパク質、ＤＮＡ結合部分、および遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質を発現させること；Ｅ３ユビキチンリガーゼもしくはそのフラグメント、またはいくつかのケースにおいて、Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび関連する機構を発現させること；およびライブラリーからの分子を宿主細胞に送達することを含んでいてもよい。宿主細胞は、デスエージェントの発現を制御するためのプロモーター配列を含んでいてもよい。前記プロモーターは、前記分子の非存在下で、前記デスエージェントの発現が活性化されるように、第１の融合タンパク質中のＤＮＡ結合部分に対して特異的であり得る。前記分子が存在する場合、前記第１の試験タンパク質は、Ｅ３ユビキチンリガーゼによって分解され得る。
図１は、標的Ｂａｉｔタンパク質とＥ３ユビキチンリガーゼとの間のタンパク質－タンパク質相互作用を促す化合物を同定するための方法の例を示し、ここで、前記２つのタンパク質の間の架橋は、前記標的Ｂａｉｔタンパク質の機能的ユビキチン化、およびそれに続く分解を引き起こす。ＤＢＤは、特異的なＤＮＡ結合ドメインを指す。ＡＤは、活性化ドメインを指す。Ｅ３は、目的のＥ３ユビキチンリガーゼを指す。破線の矢印は、Ｂａｉｔタンパク質の分解と、それによるデスエージェント活性化の阻害をもたらす、Ｂａｉｔタンパク質の機能的ユビキチン化を示す。丸は、ペプチド、大員環、または小分子を指す。これらは、ライブラリー由来であってもよい。この例において、細胞の生存は、架橋剤の存在下または非存在下でアッセイすることができる。上のパネルは、Ｂａｉｔが、細胞増殖に必要とされるポジティブマーカーの発現を促進している基本的なケースを図示している。下のパネルは、架橋剤が、Ｂａｉｔタンパク質を、目的の特定のＥ３リガーゼと機能的に架橋することができるケースを示す。このケースにおいて、Ｂａｉｔは分解され、また増殖に必要とされるポジティブマーカーを発現することができないため、細胞は増殖することができない。
図２は、標的Ｂａｉｔが、標的の存在下で増殖を阻害するネガティブ選択マーカーと機能できるように結合している例を示す。３つのシナリオが示されており、上のパネルは、Ｂａｉｔが、デスエージェントの発現を促進し、細胞死をもたらす基本的なケースを図示している。次のパネルは、化合物が、Ｂａｉｔタンパク質とＥ３リガーゼとの間の相互作用を促すことができるが、機能的ユビキチン化、およびそれに続く分解を引き起こさず、デスエージェントの発現および細胞死をもたらすケースを図示している。下のパネルは、化合物が、Ｂａｉｔタンパク質とＥ３リガーゼとの間を架橋し、その分解およびデスエージェントの転写消失を生じさせ、細胞生存をもたらすことができるケースを示す。いくつかの実施形態において、ペプチドライブラリーは、ペプチドではなく、小分子のような化合物を含む外来性のライブラリーで置き換えてもよい。いくつかの実施形態において、小分子は、ペプチド模倣物である。
図３および４は、Ｂａｉｔ標的タンパク質を、バリアント特異的な様式で分解する化合物を同定するためのプラットフォームを示す。図３は、Ｂａｉｔ １とＢａｉｔ ２が関連する（しかしながら、異なる）タンパク質（例えば、タンパク質バリアント）である、類似のアッセイを記述している。図４は、ＢａｉｔＷＴが、タンパク質のＷＴアレルを指し、ＢａｉｔＭＵＴが、分解の標的である病理学的アレルを指す、類似のアッセイを記述している。図２と同様に、ＤＢＤは、プロモーター特異的ＤＮＡ結合ドメインを指す。ＡＤは、活性化ドメインを指す。Ｅ３は、目的のＥ３ユビキチンリガーゼを指す。破線の矢印は、Ｂａｉｔタンパク質の分解と、それによるデスエージェント活性化の阻害をもたらす、Ｂａｉｔタンパク質の機能的ユビキチン化を示す。丸は、ペプチド、大員環、または小分子を指す。３つのシナリオが示されており、上のパネルは、各Ｂａｉｔが、ポジティブマーカーまたはデスエージェントのいずれかの発現を促進し、細胞死をもたらす基本的なケースを図示している。次のパネルは、化合物が、Ｂａｉｔタンパク質とＥ３リガーゼとの間の相互作用を促すことができるが、機能的ユビキチン化、およびそれに続く分解を引き起こさず、細胞死をもたらすケースを図示している。下のパネルは、化合物が、Ｂａｉｔタンパク質とＥ３リガーゼとの間を架橋し、その分解およびデスエージェントの転写消失を生じさせ、細胞生存をもたらすことができるケースを示す。全てのケースにおいて、非特異的なタンパク質の分解に対する選択は、ポジティブ選択マーカーを駆動するために機能的な存在が要求されることによって回避される。選択的なペプチド媒介分解は、（１）デスエージェントの発現がないこと、および（２）ポジティブ選択レポーターの発現（これによって選択性のエビデンスがもたらされる）、に起因する生存によってアッセイされる。
いくつかの実施形態において、標的タンパク質の分解を媒介することができるペプチドまたは小分子を同定するためのスクリーニングは、宿主細胞の集団に対してペプチドまたは小分子を試験することを含んでいてよく、ここで、集団内の異なる細胞は、異なるＥ３リガーゼを発現する。宿主細胞は、次いで、ライブラリーからの候補ペプチド／小分子で形質転換するか、またはその他の方法でライブラリーからの候補ペプチド／小分子に曝露してもよい。このようなケースにおいて、宿主細胞のそれぞれは、同じ標的タンパク質および／またはデスエージェントを含んでいてもよい。生存細胞は、前記ペプチド／小分子と正常に相互作用するＥ３リガーゼを同定するためにシークエンシングしてもよい。別の例において、アッセイの各ウェルは、複数の異なる宿主細胞を含んでいてもよく、ここで、異なる宿主細胞は、異なるＥ３リガーゼを発現する。ライブラリーからのペプチド／小分子は、次いで、標的タンパク質と正常に相互作用し、細胞生存をもたらすペプチド／小分子を同定するために、形質変換するか、またはその他の方法で各ウェル内に導入してもよい。
分解の標的の例は、Ｋ－Ｒａｓ発癌アレル、サイクリンＤファミリー、サイクリンＥファミリー、ｃ－ＭＹＣ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦ、およびβカテニンなどの発癌タンパク質、またはＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ、Ｒ１３２Ｓ、Ｒ１３２Ｃ、Ｒ１３２Ｇ、およびＲ１３２Ｌ）もしくはＩＤＨ２（Ｒ１４０Ｑ、Ｒ１７２Ｋ）などの発癌性バリアントである。
本システムで使用することができるＥ３ユビキチンリガーゼの例は、以下のものを含む（しかしながら、それらに限定されない）リストから選択することができ、そのリストは、Ｃｕｌｉｎファミリー（ＣＲＬ１、ＣＲＬ２、ＣＲＬ３、ＣＲＬ４、ＣＲＬ５、ＣＲＬ７）のマルチサブユニットＥ３リガーゼ、ならびに以下のものを含む（しかしながら、それらに限定されない）ＲＩＮＧ、ＲＩＮＧ－Ｂｅｔｗｅｅｎ－ＲＩＮＧ（ＲＢＲ）、およびＨＥＣＴファミリーの単一サブユニットＥ３リガーゼを含む：セレブロン、Ｓｋｐ２、ＭＤＭ２、ＦＢＸＷ７、ＤＣＡＦ１、ＤＣＡＦ１５、ＶＨＬ、ＡＦＦ４、ＡＭＦＲ、ＡＮＡＰＣ１１、ＡＮＫＩＢ１、ＡＲＥＬ１、ＡＲＩＨ１、ＡＲＩＨ２、ＢＡＲＤ１、ＢＦＡＲ、ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ７、ＢＩＲＣ８、ＢＭＩ１、ＢＲＡＰ、ＢＲＣＡ１、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＢＬＬ１、ＣＣＤＣ３６、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＧＲＲＦ１、ＣＨＦＲ、ＣＮＯＴ４、ＣＵＬ９、ＣＹＨＲ１、ＤＣＳＴ１、ＤＴＸ１、ＤＴＸ２、ＤＴＸ３、ＤＴＸ３Ｌ、ＤＴＸ４、ＤＺＩＰ３、Ｅ４Ｆ１、ＦＡＮＣＬ、Ｇ２Ｅ３、ＨＡＣＥ１、ＨＥＣＴＤ１、ＨＥＣＴＤ２、ＨＥＣＴＤ３、ＨＥＣＴＤ４、ＨＥＣＷ１、ＨＥＣＷ２、ＨＥＲＣ１、ＨＥＲＣ２、ＨＥＲＣ３、ＨＥＲＣ４、ＨＥＲＣ５、ＨＥＲＣ６、ＨＬＴＦ、ＨＵＷＥ１、ＩＲＦ２ＢＰ１、ＩＲＦ２ＢＰ２、ＩＲＦ２ＢＰＬ、Ｉｔｃｈ、ＫＣＭＦ１、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＬＮＸ１、ＬＮＸ２、ＬＯＮＲＦ１、ＬＯＮＲＦ２、ＬＯＮＲＦ３、ＬＲＳＡＭ１、ＬＴＮ１、ＭＡＥＡ、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＲＣＨ１、ＭＡＲＣＨ１０、ＭＡＲＣＨ１１、ＭＡＲＣＨ２、ＭＡＲＣＨ３、ＭＡＲＣＨ４、ＭＡＲＣＨ５、ＭＡＲＣＨ６、ＭＡＲＣＨ７、ＭＡＲＣＨ８、ＭＡＲＣＨ９、Ｍｄｍ２、ＭＤＭ４、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＸ３Ａ、ＭＥＸ３Ｂ、ＭＥＸ３Ｃ、ＭＥＸ３Ｄ、ＭＧＲＮ１、ＭＩＢ１、ＭＩＢ２、ＭＩＤ１、ＭＩＤ２、ＭＫＲＮ１、ＭＫＲＮ２、ＭＫＲＮ３、ＭＫＲＮ４Ｐ、ＭＮＡＴ１、ＭＳＬ２、ＭＵＬ１、ＭＹＣＢＰ２、ＭＹＬＩＰ、ＮＥＤＤ４、ＮＥＤＤ４Ｌ、ＮＥＵＲＬ１、ＮＥＵＲＬ１Ｂ、ＮＥＵＲＬ３、ＮＦＸ１、ＮＦＸＬ１、ＮＨＬＲＣ１、ＮＯＳＩＰ、ＮＳＭＣＥ１、ＰＡＲＫ２、ＰＣＧＦ１、ＰＣＧＦ２、ＰＣＧＦ３、ＰＣＧＦ５、ＰＣＧＦ６、ＰＤＺＲＮ３、ＰＤＺＲＮ４、ＰＥＬＩ１、ＰＥＬＩ２、ＰＥＬＩ３、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ２、ＰＨＦ７、ＰＨＲＦ１、ＰＪＡ１、ＰＪＡ２、ＰＬＡＧ１、ＰＬＡＧＬ１、ＰＭＬ、ＰＰＩＬ２、ＰＲＰＦ１９、ＲＡＤ１８、ＲＡＧ１、ＲＡＰＳＮ、ＲＢＢＰ６、ＲＢＣＫ１、ＲＢＸ１、ＲＣ３Ｈ１、ＲＣ３Ｈ２、ＲＣＨＹ１、ＲＦＦＬ、ＲＦＰＬ１、ＲＦＰＬ２、ＲＦＰＬ３、ＲＦＰＬ４Ａ、ＲＦＰＬ４ＡＬ１、ＲＦＰＬ４Ｂ、ＲＦＷＤ２、ＲＦＷＤ３、ＲＩＮＧ１、ＲＬＦ、ＲＬＩＭ、ＲＭＮＤ５Ａ、ＲＭＮＤ５Ｂ、ＲＮＦ１０、ＲＮＦ１０３、ＲＮＦ１１、ＲＮＦ１１１、ＲＮＦ１１２、ＲＮＦ１１３Ａ、ＲＮＦ１１３Ｂ、ＲＮＦ１１４、ＲＮＦ１１５、ＲＮＦ１２１、ＲＮＦ１２２、ＲＮＦ１２３、ＲＮＦ１２５、ＲＮＦ１２６、ＲＮＦ１２８、ＲＮＦ１３、ＲＮＦ１３０、ＲＮＦ１３３、ＲＮＦ１３５、ＲＮＦ１３８、ＲＮＦ１３９、ＲＮＦ１４、ＲＮＦ１４１、ＲＮＦ１４４Ａ、ＲＮＦ１４４Ｂ、ＲＮＦ１４５、ＲＮＦ１４６、ＲＮＦ１４８、ＲＮＦ１４９、ＲＮＦ１５０、ＲＮＦ１５１、ＲＮＦ１５２、ＲＮＦ１５７、ＲＮＦ１６５、ＲＮＦ１６６、ＲＮＦ１６７、ＲＮＦ１６８、ＲＮＦ１６９、ＲＮＦ１７、ＲＮＦ１７０、ＲＮＦ１７５、ＲＮＦ１８０、ＲＮＦ１８１、ＲＮＦ１８２、ＲＮＦ１８３、ＲＮＦ１８５、ＲＮＦ１８６、ＲＮＦ１８７、ＲＮＦ１９Ａ、ＲＮＦ１９Ｂ、ＲＮＦ２、ＲＮＦ２０、ＲＮＦ２０７、ＲＮＦ２０８、ＲＮＦ２１２、ＲＮＦ２１２Ｂ、ＲＮＦ２１３、ＲＮＦ２１４、ＲＮＦ２１５、ＲＮＦ２１６、ＲＮＦ２１７、ＲＮＦ２１９、ＲＮＦ２２０、ＲＮＦ２２２、ＲＮＦ２２３、ＲＮＦ２２４、ＲＮＦ２２５、ＲＮＦ２４、ＲＮＦ２５、ＲＮＦ２６、ＲＮＦ３１、ＲＮＦ３２、ＲＮＦ３４、ＲＮＦ３８、ＲＮＦ３９、ＲＮＦ４、ＲＮＦ４０、ＲＮＦ４１、ＲＮＦ４３、ＲＮＦ４４、ＲＮＦ５、ＲＮＦ６、ＲＮＦ７、ＲＮＦ８、ＲＮＦＴ１、ＲＮＦＴ２、ＲＳＰＲＹ１、ＳＣＡＦ１１、ＳＨ３ＲＦ１、ＳＨ３ＲＦ２、ＳＨ３ＲＦ３、ＳＨＰＲＨ、ＳＩＡＨ１、ＳＩＡＨ２、ＳＩＡＨ３、ＳＭＵＲＦ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＴＵＢ１、ＳＹＶＮ１、ＴＭＥＭ１２９、Ｔｏｐｏｒｓ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ７、ＴＲＡＩＰ、ＴＲＩＭ１０、ＴＲＩＭ１１、ＴＲＩＭ１３、ＴＲＩＭ１５、ＴＲＩＭ１７、ＴＲＩＭ２、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２２、ＴＲＩＭ２３、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２６、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ２８、ＴＲＩＭ３、ＴＲＩＭ３１、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３４、ＴＲＩＭ３５、ＴＲＩＭ３６、ＴＲＩＭ３７、ＴＲＩＭ３８、ＴＲＩＭ３９、ＴＲＩＭ４、ＴＲＩＭ４０、ＴＲＩＭ４１、ＴＲＩＭ４２、ＴＲＩＭ４３、ＴＲＩＭ４３Ｂ、ＴＲＩＭ４５、ＴＲＩＭ４６、ＴＲＩＭ４７、ＴＲＩＭ４８、ＴＲＩＭ４９、ＴＲＩＭ４９Ｂ、ＴＲＩＭ４９Ｃ、ＴＲＩＭ４９Ｄ１、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ５０、ＴＲＩＭ５１、ＴＲＩＭ５２、ＴＲＩＭ５４、ＴＲＩＭ５５、ＴＲＩＭ５６、ＴＲＩＭ５８、ＴＲＩＭ５９、ＴＲＩＭ６、ＴＲＩＭ６０、ＴＲＩＭ６１、ＴＲＩＭ６２、ＴＲＩＭ６３、ＴＲＩＭ６４、ＴＲＩＭ６４Ｂ、ＴＲＩＭ６４Ｃ、ＴＲＩＭ６５、ＴＲＩＭ６７、ＴＲＩＭ６８、ＴＲＩＭ６９、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ７１、ＴＲＩＭ７２、ＴＲＩＭ７３、ＴＲＩＭ７４、ＴＲＩＭ７５Ｐ、ＴＲＩＭ７７、ＴＲＩＭ８、ＴＲＩＭ９、ＴＲＩＭＬ１、ＴＲＩＭＬ２、ＴＲＩＰ１２、ＴＴＣ３、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＥ３Ｂ、ＵＢＥ３Ｃ、ＵＢＥ３Ｄ、ＵＢＥ４Ａ、ＵＢＥ４Ｂ、ＵＢＯＸ５、ＵＢＲ１、ＵＢＲ２、ＵＢＲ３、ＵＢＲ４、ＵＢＲ５、ＵＢＲ７、ＵＨＲＦ１、ＵＨＲＦ２、ＵＮＫ、ＵＮＫＬ、ＶＰＳ１１、ＶＰＳ１８、ＶＰＳ４１、ＶＰＳ８、ＷＤＲ５９、ＷＤＳＵＢ１、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＸＩＡＰ、ＺＢＴＢ１２、ＺＦＰ９１、ＺＦＰＬ１、ＺＮＦ２８０Ａ、ＺＮＦ３４１、ＺＮＦ５１１、ＺＮＦ５２１、ＺＮＦ５９８、ＺＮＦ６４５、ＺＮＲＦ１、ＺＮＲＦ２、ＺＮＲＦ３、ＺＮＲＦ４、Ｚｓｗｉｍ２およびＺＸＤＣ。
宿主細胞中のタンパク質の発現
１つまたはそれを超えるプラスミドコンストラクトが、宿主細胞中で異なるタンパク質を発現させるために使用され得る。使用されるプラスミドの数は、条件の中でも、宿主細胞、宿主細胞中のインテグレーテッドコンストラクトの存在に依存する。
いくつかのケースにおいて、第１の試験タンパク質の分解を誘発する分子を同定する方法において、Ｅ３ユビキチンリガーゼ、分子ライブラリー由来の分子、ならびに第１の試験タンパク質、第１のＤＮＡ結合部分、および遺伝子活性化ドメインを含む第１の融合タンパク質などのタンパク質が使用され得る。この方法において、また、デスエージェントの発現を促進するプロモーター（ここで、前記プロモーター配列は第１のＤＮＡ結合部分に特異的である）も使用され得る。このスキームに加えて、いくつかのケースにおいて、この方法において、また、第２のＤＮＡ結合ドメインと遺伝子活性化部分を、ポジティブまたはネガティブマーカーの発現を促進するプロモーター（前記プロモーター配列は、第２のＤＮＡ結合部分に特異的であるような）と共に含む、第２の融合タンパク質も利用され得る。
上述したタンパク質および核酸配列は、プラスミドの形態で宿主細胞に提供されてもよい。いくつかのケースにおいて、前記タンパク質の核酸配列、ならびにプロモーター、デスエージェント／ポジティブマーカー、およびネガティブマーカーを含む核酸は、宿主細胞内にインテグレートされてもよい。いくつかのケースにおいて、分子ライブラリー由来の前記分子は、小分子／化合物であり、プラスミドにコードされている必要はない。
例えば、１つの例において、前記第１の融合タンパク質は、プラスミド（プラスミド１）中に提供されてもよく、前記Ｅ３ユビキチンリガーゼは、別個のプラスミド（プラスミド２）中に提供されてもよく、およびライブラリーからのＤＮＡにコードされた分子は、別個のプラスミド（プラスミド３）中に提供されてもよい。３つのプラスミドは、全て、複数の宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。第２の融合タンパク質もまた使用されるケースにおいて、前記第２の融合タンパク質は、プラスミド１中、または別個のプラスミド（プラスミド４）中に提供されてもよい。前記プラスミドの発現コンストラクトは、また、トランスフェクトするプラスミドの数を減らすために、１つまたは２つのプラスミド中に複合化されていてもよい。さらに、デスエージェントまたはポジティブ／ネガティブ選択マーカーを駆動するプロモーターを含むコンストラクトは、また、前記プラスミドまたはその他の方法で提供されてもよく、宿主細胞内にインテグレートされ得る。
別の例において、前記第１の融合タンパク質は、宿主細胞内に遺伝的にインテグレートされ得るが、Ｅ３ユビキチンリガーゼおよび前記分子ライブラリー由来の分子を含むプラスミド２および３は、宿主細胞内にトランスフェクトされる。この例において、前記第２の融合タンパク質もまた、宿主細胞中にインテグレートされ得るか、またはいくつかのケースにおいて、プラスミドとして提供され得る。
さらに別の例において、前記第１の融合タンパク質および前記Ｅ３ユビキチンリガーゼは、どちらも宿主細胞内にインテグレートされ、前記分子ライブラリー由来の分子は、宿主細胞内に、プラスミドの形態でトランスフェクトされる。前記第２の融合タンパク質は、上述したように、宿主細胞内にインテグレートされ得るか、またはプラスミド形態で提供され得る。前記デスエージェントまたは前記ポジティブ／ネガティブ選択マーカーを駆動する前記プロモーターを含むコンストラクトは、また、プラスミドで提供されてもよく、そうでなければ、宿主細胞内にインテグレートされ得る。
別の例において、前記第１の融合タンパク質は、宿主細胞に、プラスミドでトランスフェクト／インテグレートされてもよく、しかしながら内在性Ｅ３ユビキチンリガーゼが使用され、このケースでは、前記Ｅ３リガーゼを含むプラスミドのインテグレーションまたはトランスフェクションは必要ではない。
いくつかのケースにおいて、前記融合タンパク質／タンパク質、前記Ｅ３ユビキチンリガーゼ、前記デスエージェントを駆動するプロモーター（および、使用する場合、ポジティブ／ネガティブ選択マーカーを駆動するプロモーター）のための核酸配列は、全て、宿主細胞内にインテグレートされてもよい。このケースにおいて、分子ライブラリー由来の分子を含む、１つのプラスミドだけが、宿主細胞内にトランスフェクトされてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている前記宿主細胞（単数または複数）は、プラスミドベクターを含む。前記プラスミドは、例えば、前記Ｂａｉｔと目的のＥ３リガーゼを構成する２つのタンパク質のインテグレーションを可能にする、２つの制限部位を含んでいてもよい。目的の前記Ｂａｉｔタンパク質は、癌遺伝子（例えば、サイクリンＥファミリー、サイクリンＤファミリー、ｃ－ＭＹＣ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、Ｋ－Ｒａｓ、ＰＤＧＦＲ、Ｒａｆキナーゼ、およびＶＥＧＦ）を含み得る。目的の前記Ｂａｉｔタンパク質は、炎症反応のエフェクター（例えば、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－１７ＲＢ、ＩＬ－１７ＲＣ、ＩＬ－１７ＲＤ、ＩＬ－１７ＲＥ、Ａｃｔ１（ＣＩＫＳ）、およびＩＬ－２３Ｒ）を含み得る。
プラスミドは、前記Ｂａｉｔおよび目的のＥ３リガーゼを構成する２つのタンパク質、ならびに追加の因子（例えば、前記Ｂａｉｔタンパク質のうちの１つのバリアント）を発現するように構成されてもよい。ターゲティングのためのバリアントは、ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｋ、またはＱ６１Ｌなど）であり得、その対照バリアントは、ＷＴ ＫＲＡＳである。前記追加の因子は、また、前記Ｂａｉｔタンパク質に結合した別のタンパク質、または前記Ｅ３リガーゼの別の標的であってもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されている前記宿主細胞は、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、ＧＡＬ４－ＤＢＤとインフレームで、かつＶＰ６４－ＡＤとインフレームで挿入されているプラスミド、およびＥ３ユビキチンリガーゼを含む第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１の試験タンパク質は、ＫＲＡＳのバリアントであり、前記Ｅ３ユビキチンリガーゼは、ＶＨＬである。
プラスミドは、活性化ドメインまたは別の遺伝子活性化部分と、強いプロモーターとターミネーターによって駆動されるか（ＡＤＨ１など）、または誘導可能なプロモーターによって駆動される（ＧＡＬ１など）、各タンパク質に対するＤＢＤとの融合物をコードしていてもよい。他の例示的な活性化ドメインとしては、ＶＰ１６およびＢ４２ＡＤの活性化ドメインがあげられる。いくつかの実施形態において、前記ＤＮＡ結合部分は、ＬｅｘＡ、ＴｅｔＲ、ＬａｃＩ、Ｇｌｉ－１、ＹＹ１、グルココルチコイド受容体、またはＵｍｅ６ドメインに由来し、前記遺伝子活性化部分は、ＧＡＬ４、Ｂ４２、ＶＰ６４、ＧＡＬ４、ＮＦ－κＢ ＡＤ、Ｄｏｆ１、ＢＰ６４、Ｂ４２、またはｐ６５に由来する。各タンパク質融合物は、その後の生化学的実験のために、例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＭＹＣ、またはＨｉｓタグでタグ付けされていてもよい。前記プラスミドは、また、細菌選択マーカーおよび細菌増殖マーカー（すなわち、ｏｒｉおよびＡｍｐＲ）、および酵母複製マーカーおよび酵母選択マーカー（すなわち、ＴＲＰ１およびＣＥＮまたは２ｕｍ）も含んでいてもよい。前記プラスミドは、また、異なるＤＢＤおよびＡＤに融合した多数のＢａｉｔタンパク質を含んでいてもよい。前記プラスミドは、また、ゲノム中の特定された遺伝子座にインテグレートされてもよい。
本明細書において、ある特定の実施形態において、プラスミドベクターのライブラリーが開示されており、各プラスミドベクターは、第１のスイッチ可能なプロモーターに作動可能に連結された異なるペプチド配列をコードするＤＮＡ配列；第２のスイッチ可能なプロモーターの制御下にあるデスエージェントをコードするＤＮＡ配列；および第３のスイッチ可能なプロモーターの制御下にあるポジティブ選択レポーターをコードするＤＮＡ配列を含む。
選択マーカーの発現
ポジティブ選択マーカー
試験タンパク質の効率的な発現によって、ＲＮＡポリメラーゼが特異的なゲノム部位に向けられ、選択培地における生物の増殖を可能にするタンパク質の発現が可能になり得る。選択培地は、例えば、ＡＤＥ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＫＡＮＲ、またはＮＡＴＲに対して特異的であってもよく、かつ必須成分（Ａｄｅ、Ｕｒａ、Ｔｒｐ）を欠いていてもよく、または医薬（Ｇ４１８、ＮＡＴ）を含んでいてもよい。プラスミドは、選択培地における生物の増殖を可能にする１つまたはそれを超えるポジティブ選択マーカーをコードしていてもよい。
ネガティブ選択マーカー
誘導可能なワンハイブリッドアプローチを使用することができ、これによって、いくつかの細胞毒性レポーター（デスエージェント）のいずれか１つまたは組み合わせ、ならびにポジティブ選択マーカーの発現が促進され得る。ワンハイブリッドシステムにおける細胞毒性レポーターの組み合わせの誘導発現を含む本開示の方法は、誘導された細胞の生存を可能にするためには全ての細胞毒性レポーターが同時に「リーキー」でなければならないため、このワンハイブリッドアッセイの偽陽性率を低下させる乗法的な効果を可能にし得る。前記細胞毒性レポーターは、（例えば、表１に示されるように）種々のポリペプチドのドメインからなり得るか、または含み得る。
Figure 2022532216000002
Figure 2022532216000003
Figure 2022532216000004
Figure 2022532216000005
Figure 2022532216000006
Figure 2022532216000007
Figure 2022532216000008
いくつかの実施形態において、前記デスエージェントは、ＤＮＡまたはＲＮＡから選択される遺伝因子の過剰発現産物である。いくつかの実施形態において、前記遺伝因子は、ＧＩＮ１１などの増殖抑制（ＧＩＮ）配列である。
いくつかの実施形態において、前記デスエージェントは、リボソームによってコードされた生体異物剤、リボソームによってコードされた毒、マイルドな過剰発現によって重篤な増殖障害を引き起こすリボソームによってコードされた内在性または外来性遺伝子、生存に必須の遺伝子を切断するリボソームによってコードされたリコンビナーセ、毒性２次代謝産物の合成に関与する制限因子、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記リボソームによってコードされたデスエージェントは、コレラ毒素、ＳｐｖＢ毒素、ＣＡＲＤＳ毒素、ＳｐｙＡ毒素、ＨｏｐＵｌ、Ｃｈｅｌｔ毒素、Ｃｅｒｔｈｒａｘ毒素、ＥＦＶ毒素、ＥｘｏＴ、ＣｄｔＢ、ジフテリア毒素、ＥｘｏＵ／ＶｉｐＢ、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＧ、ＶｏｐＦ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＳｄｂＡ、ＳｉｄＧ、ＶｐｄＡ、Ｌｐｇ０９６９、Ｌｐｇｌ９７８、ＹｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｏｐＥ２、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｉｐＡ、ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、アマトキシン、ファラシジン、キラートキシンＫＰ１、キラートキシンＫＰ６、キラートキシンＫｌ、キラートキシンＫ２８（ＫＨＲ）、キラートキシンＫ２８（ＫＨＳ）、炭疽菌致死因子エンドペプチダーゼ、志賀毒素、サポリン毒素、リシン毒素、またはそれらの組み合わせである。前記細胞毒性レポーターまたはデスエージェントは、配列番号１～４１から選択される配列を有するタンパク質であってもよい。前記細胞毒性レポーターは、天然に見られる細胞毒性レポーターのバリアントであってもよい。このようなバリアントは、配列番号１～４１に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。
１つまたはそれを超えるポジティブ選択マーカーと共に、プラスミドは、また、バイナリー選択を可能にするために、異なるＤＮＡ結合配列の制御下にある１つまたはそれを超えるネガティブ選択マーカーも含んでいてもよい。前記プラスミドは、Ｂａｉｔタンパク質組み込みプラスミドに存在するＤＢＤに依存するプロモーター、すなわちＤＮＡ結合配列（ＤＢＳ）（例えば、ＬｅｘＡ（ＤＢＤ）によって結合され得るＬｅｘＡｏｐ配列（ＤＢＳ））、によって駆動される表１中の１つまたはそれを超えるネガティブ選択マーカーをコードしていてもよい。いくつかの実施形態において、「デスエージェント」の抑制を確実にするために、前記プラスミドは、前記ＤＢＤに結合し、ドキシサイクリンの存在下において転写をサイレンシングする、強いプロモーター（ＡＤＨ１など）によって駆動されるＴｅｔＲ’－Ｔｕｐ１１融合物などのサイレンシングコンストラクトを含んでいてもよい。前記プラスミドは、細菌選択マーカーおよび細菌増殖マーカー（すなわち、ｏｒｉおよびＡｍｐＲ）、ならびに酵母複製マーカーおよび酵母選択マーカー（すなわち、ＬＥＵ２、およびＣＥＮまたは２－ｍｉｃｒｏｎ）も含んでいてもよい。
本明細書において、ある特定の実施形態において、プラスミドベクターのライブラリーが開示されており、各プラスミドベクターは、第１のスイッチ可能なプロモーターに作動可能に連結された異なるペプチド配列をコードするＤＮＡ配列；第２のスイッチ可能なプロモーターの制御下にあるデスエージェントをコードするＤＮＡ配列；および第３のスイッチ可能なプロモーターの制御下にあるポジティブ選択レポーターをコードするＤＮＡ配列を含む。異なるＥ３ユビキチンリガーゼを駆動するプロモーターを含むプラスミドもまた、ベクターのライブラリー中に含まれていてもよい。
モジュレーターの付加または発現
目的のＢａｉｔタンパク質と特定のＥ３ユビキチンリガーゼとを選択的に架橋し、Ｂａｉｔタンパク質分解をもたらすことができるライブラリーからの分子は、宿主細胞中で、ポジティブおよび／またはネガティブ選択マーカーを使用してスクリーニングすることができる。
いくつかの実施形態において、前記分子は、小分子である。いくつかの実施形態において、前記小分子は、ペプチド模倣物である。前記宿主細胞は、例えば、ＰＤＲ５などの薬剤排出ポンプをコードする遺伝子を欠失させることによって、小分子に対して透過性にすることができる。排出ポンプの発現を誘導する転写因子（ＰＤＲ１およびＰＤＲ３など）をコードする遺伝子としては、それらに限定されない、１２ｇｅｎｅΔ０ＨＳＲ（Ｃｈｉｎｅｎ、２０１１）に記載されている１２遺伝子があげられる。宿主細胞は、エルゴステロールの合成および形質膜における蓄積を阻害することによって、例えば、ＥＲＧ２、ＥＲＧ３、および／またはＥＲＧ６を欠失させることによって、または制御可能なプロモーター下でそれらの発現を駆動することによって、小分子に対して、さらに透過性にすることができる。
他の実施形態において、前記分子は、ペプチド、大員環、またはタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するタンパク質産物由来である。別の実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、合成されたタンパク質産物である。他の実施形態において、前記ペプチドまたはタンパク質は、組換え遺伝子の産物である。
いくつかの実施形態において、前記分子は、宿主細胞に、外来的に導入される。他の実施形態において、前記分子は、宿主細胞内に挿入された試験ＤＮＡの発現産物であり、ここで、前記試験ＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。ＤＮＡにコードされたライブラリーは、複数の試験ＤＮＡ分子を宿主細胞内に送達することによって形成することができる。いくつかの実施形態において、前記ライブラリー中のポリペプチドのペプチド配列は、ランダムである。いくつかの実施形態において、前記異なるペプチド配列は、標的への結合のために、事前に富化されている。
目的のタンパク質の分解を選択的に促進するペプチドをスクリーニングするために、ランダム化ペプチドライブラリーからのペプチドを、宿主細胞に適用してもよく、または宿主細胞から内部的に発現させてもよい。プラスミドを、ランダム化ペプチドライブラリー（例えば、ランダム化ＮＮＫ ６０－ｍｅｒ配列）を発現させるために、さらに使用することができる。前記プラスミドは、強いプロモーター（例えば、ＡＤＨ１プロモーター）または誘導可能なプロモーター（例えば、ＧＡＬ１プロモーター）によって駆動されるランダム化ペプチドライブラリーをインテグレーションするための制限部位を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、前記ランダム化ペプチドライブラリーは、約６０－ｍｅｒである。いくつかの実施形態において、前記ランダム化ペプチドライブラリーは、約５－ｍｅｒ～２０－ｍｅｒである。いくつかの実施形態において、前記ランダム化ペプチドライブラリーは、１５－ｍｅｒ未満である。
前記ライブラリーは、また、ペプチドの半減期を最大化するために、例えば、Ｎ末端安定化のためのメチオニン－バリン－アスパラギン（ＭＶＮ）という固定配列および／または半減期が長いＮ末端残基の別の組み合わせ（例えば、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１２１４２－１２１４９（１９９６）を参照のこと）で開始し、短いタンパク質（例えばｓＯＲＦ１）の３’ＵＴＲで終結していてもよい。前記ペプチドは、また、Ｍｙｃなどのタンパク質タグでタグ付けされていてもよい。いくつかの実施形態において、前記ペプチドのＮ末端残基は、タンパク質分解を最小化するために、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、もしくはＰｒｏ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
前記複数の異なる短いペプチド配列は、任意の方法（例えば、ＮＮＫまたはＮＮＮヌクレオチドランダム化）によって、ランダムに生成させることができる。前記複数の異なる短いペプチド配列は、また、標的に対する結合のために選択する事前の実験によって、または合理的に設計されたペプチドライブラリーを報告している科学文献中に存在するデータセットから、のいずれかによって、あらかじめ選択されていてもよい。
いくつかの実施形態において、前記ライブラリーは、長さが約６０アミノ酸またはそれより少ないポリペプチドを含む。別の実施形態において、前記ライブラリーは、長さが約３０アミノ酸またはそれより少ないポリペプチドを含む。別の実施形態において、前記ライブラリーは、長さが約２０アミノ酸またはそれより少ないポリペプチドを含む。
促進ペプチドの修飾
前記標的の選択的分解をもたらす前記ペプチドは、また、翻訳後修飾の産物であってもよい。前記翻訳後修飾は、切断、環化、二環化、メチル化、ハロゲン化、グリコシル化、アシル化、リン酸化、およびアセチル化のいずれか１つ、または組み合わせを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記メチル化は、Ｎ－メチルトランスフェラーゼとの反応を含む。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、天然に存在する酵素によって行われる。いくつかの実施形態において、前記翻訳後修飾は、合成酵素によって行われる。いくつかの実施形態において、前記合成酵素は、キメラである。
前記ペプチドは、リボソームにより合成され、翻訳後に修飾を受けたペプチド（ＲｉＰＰ）であってもよく、それによって、前記コアペプチドは、除去酵素または環化酵素などの成熟酵素、切断酵素、および／または修飾酵素の動員のために信号を発するリーダーペプチドおよび認識配列を含むプレプロペプチド配列と隣接し、前記除去酵素または環化酵素としては、例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のランチペプチド成熟酵素（ＬａｎＢ、ＬａｎＣ、ＬａｎＭ、ＬａｎＰ）、シアノバクテリア由来のパテラミド生合成因子（ＰａｔＤ、ＰａｔＧ）、Ｃｌｉｔｏｒｉａ ｔｅｒｎａｔｅａ由来のブテラーゼ１、およびＧａｌｅｒｉｎａ ｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ、Ｏｍｐｈａｌｏｔａｃａｅ ｏｌｅａｒｉｓ、Ｄｅｎｄｒｏｔｈｅｌｅ ｂｉｓｐｏｒａ、もしくはＡｍａｎｉｔａ ｂｉｓｐｏｒｉｇｅｒａ、または他の種由来のＰＯＰＢがあげられる。いくつかの実施形態において、前記環化または二環化酵素は、合成キメラである。
１つの例において、可変ペプチドライブラリー領域は、修飾酵素（例えば、Ｄｅｎｄｒｏｔｈｅｌｅ ｂｉｓｐｏｒａ、Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｆｉａｒｄｉｉ、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ、Ｆｏｍｉｔｉｐｏｒｉａ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ、Ｏｍｐｈａｌｏｔｕｓ ｏｌｅａｒｉｕｓ、またはその他由来のオムファロチンＮ－メチルトランスフェラーゼ酵素のホモログ）の一次配列内に埋め込まれており、かつランダム残基を含み、そのうちのいくつかは、ヒドロキシル化、ハロゲン化、グリコシル化、アシル化、リン酸化、メチル化、アセチル化のような追加の修飾によって翻訳後に装飾されていてもよい。この多様化した可変領域は、ＰｏｐＢファミリーに属するプロリルエンドペプチダーゼおよびオムファロチンメチルトランスフェラーゼファミリーに属するＮ－メチルトランスフェラーゼの作用によって、切断および修飾を受け、Ｎ－ｔｏ－Ｃ環化し、必要に応じてバックボーンＮ－メチル化した大員環を形成する。プロリルエンドペプチダーゼの例示的なリストを、表２に示す。前記プロリルエンドペプチダーゼは、配列番号４２～５８から選択される配列を有するタンパク質であってもよい。前記プロリルエンドペプチダーゼは、配列番号５９または６０から選択されるヌクレオチド配列によってコードされていてもよい。前記プロリルエンドペプチダーゼは、天然に見られるプロリルエンドペプチダーゼのバリアントであってもよい。このようなバリアントは、配列番号４２～５８に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。Ｎ－メチルトランスフェラーゼの例示的なリストを表３に示す。前記メチルトランスフェラーゼは、配列番号６１～１１６から選択される配列を有するタンパク質であってもよい。前記メチルトランスフェラーゼは、配列番号１１７または１１８から選択されるヌクレオチド配列によってコードされていてもよい。前記プロリルエンドペプチダーゼは、天然に見られるメチルトランスフェラーゼのバリアントであってもよい。このようなバリアントは、配列番号６１～１１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。
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ギムノペプチドＡ（ＧｙｍＡ）およびギムノペプチドＢ（ＧｙｍＢ）は、ｓｐｉｎｄｌｅｓｈａｎｋマッシュルームであるＧｙｍｎｏｐｕｓ ｆｕｓｉｐｅｓ（Ｇ．ｆｕｓｉｐｅｓ）（Ｃｏｌｌｙｂｉａ ｆｕｓｉｐｅｓとしても知られる）から単離された２種の関連する多重Ｎ－メチル化環状オクタデカペプチドである。ＧｙｍＡとＧｙｍＢは、１つの位置で相異する（ＧｙｍＡではセリンであるのに対し、ＧｙｍＢではスレオニン）。いくつかの侵襲性の接着性癌細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ４３１、Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）は、ＧｙｍＡとＧｙｍＢに対して非常に高い感受性を示し、ＩＣ５０値が低ナノモル濃度範囲である。
驚くべきことに、これらのペプチド大員環を合成するためにＮＲＰＳを利用するのではなく、Ｇ．ｆｕｓｉｐｅｓのゲノムは、ＧｙｍＢの１８アミノ酸をコードする核酸配列を含む１つの遺伝子をコードすることが見出された。この１８－アミノ酸配列は、推定Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性メチルトランスフェラーゼをコードするオープンリーディングフレームのＣ末端にある。以下、ＧｙｍＢペプチド配列カセットが後に続くメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、ギムノペプチド前駆体遺伝子（ＧｙｍＭＡＢ）と呼ばれる。
前記ＧｙｍＭＡＢ遺伝子は、プロリルオリゴペプチダーゼ（ＧｙｍＰ）（メチル化ギムノペプチドカセットを切断および環化する）をコードする別のオープンリーディングフレームも含むクラスター中に存在する。これらの酵素は、Ｇ．ｍａｒｇｉｎａｔａおよびＡｍａｎｉｔａ種のプロリルオリゴペプチダーゼＰｏｐＢタンパク質ならびにＯ．ｏｌｅａｒｉｓのオムファロチン産生酵素に対して弱い類似性を有しており、かつ異なるファミリーのＲｉＰＰｓ／ＲｉＰＰプロセシング酵素を形成し、これらは、比較的大型の１８－ｍｅｒ大員環を収容することを可能にするユニークな構造的および機能的特徴を有する。
さらに、Ｇ．ｆｕｓｉｐｅｓ、例えば、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ｅａｒｌｅ、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ｄｒｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ｏｃｉｏｒ、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ａｃｅｒｖａｔｕｓ、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ｌｕｘｕｒｉａｎｓ、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ａｎｄｒｏｓａｃｅｕｓ（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ａｎｄｒｏｓａｃｅｕｓまたはＳｅｔｕｌｉｐｅｓ ａｎｄｒｏｓａｃｅｕｓとしても知られる）Ｍｉｃｒｏｍｐｈａｌｅ ｆｏｅｔｉｄｕｍ、Ｍｉｃｒｏｍｐｈａｌｅ ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｆｉａｒｄｉｉ。Ｒｈｏｄｏｃｏｌｌｙｂｉａ ｍａｃｕｌａｔａ、およびＲｈｏｄｏｃｏｌｌｙｂｉａ ｂｕｔｙｒａｃｅａと緊密な関係を有するいくつかのＧｙｍｎｏｐｕｓ種を綿密に検討したが、オルソログをコードする何らかの遺伝子またはＧ．ｆｕｓｉｐｅｓにおいて同定された前述した酵素の他の関連遺伝子を検出することはできなかった。一方で、前記オムファロチンの産生に関係する酵素の生合成遺伝子クラスターは、Ｏｍｐｈａｌｏｔｏｕｓ ｏｌｉｖａｓｃｅｎｓならびにＬｅｎｔｉｎｕｌａ ｓｐｅｃｉｅｓ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ａｃｉｃｕｌｏｓｐｏｒａ、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｒａｐｈａｎｉｃａ、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｎｏｖａｅ－ｚｅｌａｎｄｉａｅ、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｂｏｒｙａｎａ、およびＬｅｎｔｉｎｕｌａ ｌａｔｅｒｉｔｉａを含む）などの緊密に関連する種の幅広いグループ中に存在する。よって、同定された遺伝子クラスターは、水平伝播していることが明らかとなった。
Ｇ．ｆｕｓｉｐｅｓなどの種から単離されたメチルトランスフェラーゼおよびプロリルオリゴペプチダーゼなどの酵素は、メチル化された大員環を生成させるために使用することができる。メチル化された大員環は、本明細書に記載されている方法を使用してスクリーニングしてもよい。前記酵素は、宿主細胞内にインテグレートし、ＲｉＰＰのＤＮＡコード化ライブラリーを生成させるために使用され得る。前記酵素は、また、異種原核生物または真核生物発現システムのスケールで、目的の特定の大員環を製造するために使用することもできる。異種発現システムにおける前記酵素の使用は、それらに限定されないが、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６１２９２（ＷＯ２０１９／０９９６７８として公開されている）および米国出願番号第１５／６８３，５８６号（ＵＳ２０１７０３６８１３２Ａ１として公開されている）（これらは、参照によりその全体（特に、それらに開示されているリバースハイブリッドおよび関連する酵母システムに関して）が本明細書に援用される）に記載されているリバースＹ２Ｈシステムを含み得る。
本明細書に記載されている方法を使用して生成される大員環は、医薬として使用し得る。そのような医薬は、種々の疾患または状態の処置のために使用され得る。本明細書に記載されている方法を使用して生成される大員環は、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間のタンパク質－タンパク質相互作用を調節するために使用され得る。本明細書に記載されている方法を使用して生成される大員環は、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間のタンパク質－タンパク質相互作用を破壊するために使用され得る。
本明細書において、ある特定の実施形態において、宿主細胞中で、第１の標的または試験タンパク質を第２の標的タンパク質に結合する分子によって媒介される標的タンパク質の検出または分解方法が開示されており、前記方法は、宿主細胞中で第１の試験タンパク質、第２のタンパク質を含む第１の融合タンパク質を発現させること；第１の分子を前記宿主細胞に送達すること；前記第１の分子を、前記宿主細胞中にある間に、修飾酵素（プロリルオリゴペプチダーゼおよび／またはメチルトランスフェラーゼなど）によって修飾すること；および前記第１の分子によって、前記第１の試験タンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を促すことを含み、ここで、前記第１の分子は、コードするＤＮＡ配列の産物であり、ここで、前記第１の分子は、ランダム化したポリペプチドライブラリーおよび１つまたはそれを超える修飾酵素を含み、ここで、前記１つまたはそれを超える修飾酵素は、前記ランダム化したポリペプチドライブラリーを修飾する。
本明細書に記載されているプロリルオリゴペプチダーゼは、比較的大きなペプチドを大環状化することができるものであってもよい。本明細書に記載されている前記プロリルオリゴペプチダーゼは、少なくとも５アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも１８アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、または少なくとも２５アミノ酸を含むペプチドを大環状化できるものであってもよい。本明細書に記載されている前記プロリルオリゴペプチダーゼは、最大で７アミノ酸、最大で１０アミノ酸、最大で１５アミノ酸、最大で１８アミノ酸、最大で２０アミノ酸、または最大で２５アミノ酸を含むペプチドを大環状化できるものであってもよい。
位置６０３のトリプトファンは、比較的大きなペプチドを大環状化することができない近縁プロリルオリゴペプチダーゼにおいて、高度に保存されているように思われる。同様に、位置５６２の活性部位セリンに隣接する位置５６３のアスパラギンもまた、これらの同じプロリルオリゴペプチダーゼににおいて保存されている。「位置６０３」および「位置５６３」は、本明細書で使用される場合、それぞれ、他のプロリルオリゴペプチダーゼにおける対応するアミノ酸と共に、配列番号５５のプロリルオリゴペプチダーゼにおける活性部位トリプトファンの位置と、活性部位セリンに隣接するアスパラギンの位置を指す。言い換えれば、配列番号５５と異なるプロリルオリゴペプチダーゼの位置６０３または位置５６３は、必ずしもそのタンパク質における６０３番目または５６３番目のアミノ酸でなくてもよく、正しくは、そのプロリルオリゴペプチダーゼが配列番号５５のプロリルオリゴペプチダーゼとアラインされた場合に、配列番号５５の位置６０３または５６３とアラインされる位置であり、そのアミノ酸の、そのタンパク質のＮ末端からの距離とは無関係である。理論に拘束されるものではないが、これらの高度に保存されたトリプトファン残基およびアスパラギン残基の他のアミノ酸、例えば、それぞれロイシンおよびセリンなどへの変異は、より大きな１８－ｍｅｒギムノペプチドなどのペプチドを収容するための構造的柔軟性をもたらすための鍵となり得る。さらに、位置６０３のトリプトファンの、ロイシンなどの別の残基による置換は、プロリンまたはサルコシン（Ｎ－メチル－グリシン）などの小さな第２級アミン残基に向けられているこのオリゴペプチダーゼの切断部位認識特異性を、Ｎ－メチル－バリン、Ｎ－メチル－イソロイシン、またはＮ－メチル－ロイシンなどの、よりかさ高い側鎖を有する第２級アミン部位における切断を可能にするように拡大するために重要な役割を果たし得る。この仮定と一致して、ギムノペプチドＡ／Ｂ前駆体タンパク質のＮ末端切断部位はプロリン残基であるが、Ｃ末端切断部位はメチル－バリン残基である。プロリルオリゴペプチダーゼは、セリンプロテアーゼのファミリーに属する。セリンペプチダーゼの作用メカニズムには、アシル酵素中間体が含まれる。アシル酵素の形成および分解は、両方とも、オキシアニオンに２つの水素結合を提供するオキシアニオン結合部位によって安定化される、負に荷電した四面体の中間体の形成を通して進行する。プロリルオリゴペプチダーゼにおいて、水素結合の１つは、オキシアニオンと、アスパラギン５６３（これは、触媒セリンであるセリン５６２と直接隣接している）の主鎖アミド基との間に形成される。２つめの水素結合は、この種類のセリンペプチダーゼのものであり、チロシン４８１（配列番号５５の位置４８１）のヒドロキシル基によってもたらされる。セリンプロテアーゼファミリーの酵素のキモトリプシンタイプのメンバーにおいて、水素結合は、触媒セリン残基の主鎖アミド基、および触媒セリンから－２位にあるグリシン残基の主鎖アミド基によってもたらされる。位置５６３の高度に保存されたアスパラギンをセリンで置換することによって、セリン５６３残基とグリシン５６１残基（配列番号５５の位置５６１）が、キモトリプシン型プロテアーゼの活性部位セリンとグリシン水素結合ドナーと同様の位置になる。この置換は、この酵素が、２つの切断イベントのそれぞれのための２つの異なる活性部位セリンの間を切り替えることを可能にするために重要な役割を果たし得、例えば、セリン５６２は、位置５６３のセリン残基の主鎖アミドと位置４８１のチロシンのヒドロキシル基によってもたらされるオキシアニオンに対する２つの水素結合によるＮ末端プロリンに向けられた切断に関与する活性部位残基であり得るのに対し、セリン５６３は、位置５６３のセリンと位置５６１のグリシンの主鎖アミドによってもたらされるオキシアニオンに対する２つの水素結合によるＮ－メチル－バリンに向けられた２つ目の切断に関与する活性部位残基であり、または逆も同じである。トリプトファン６０３のロイシンによる置換による、この新しいより大きな触媒ポケット、およびアスパラギン５６３のセリンによる置換による、トグルスイッチ可能な活性部位セリンの組み合わせによって、この新しいオリゴペプチダーゼは、切断部位にかさ高い側鎖を有する多種多様な第２級アミン残基の認識に特に適切になり、かつ過去に特徴付けされたこのファミリーのいかなるメンバーよりもサイズが大きい大員環が組み込まれる。図５Ａに、種々の関連する酵素種の、この残基周辺のアライメントを示す。また、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ｆｕｓｉｐｅｓ酵素からの配列リードも示す。図５Ｂは、植物Ｐｏｐホモログのタンパク質構造を示し、活性部位内のＷ６０３の位置をハイライトしている（ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６２０４９９１１４から改変）。図の下部の矢印は、トリプトファン残基を指し示している。図５Ｃに、種々の関連する酵素種の、セリン残基周辺アライメントを示す。また、Ｇｙｍｎｏｐｕｓ ｆｕｓｉｐｅｓ酵素からの配列リードも示す。図５Ｄは、植物Ｐｏｐホモログのタンパク質構造を示し、活性部位内のＮ５６３の位置をハイライトしている（ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１６２０４９９１１４から改変）。図の下部の矢印は、アスパラギン残基を指し示している。
いくつかのケースにおいて、プロリルオリゴペプチダーゼの活性部位中のトリプトファン残基（配列番号５５の位置６０３の保存されたトリプトファンに対応する）は、異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい。例えば、いくつかのケースにおいて、プロリルオリゴペプチダーゼの活性部位中のトリプトファン残基は、ロイシン残基で置換されていてもよい。いくつかのケースにおいて、本明細書において使用されるプロリルオリゴペプチダーゼは、この酵素の活性部位の位置６０３のトリプトファン残基を含まず、ここで、位置６０３は、配列番号５５の活性部位に対応する。
いくつかのケースにおいて、プロリルオリゴペプチダーゼの活性部位中のアスパラギン残基（配列番号５５の位置５６３の保存されたアスパラギンに対応する）は、異なるアミノ酸残基に置換されていてもよい。例えば、いくつかのケースにおいて、プロリルオリゴペプチダーゼの活性部位中のアスパラギン残基は、セリン残基で置換されていてもよい。いくつかのケースにおいて、本明細書において使用されるプロリルオリゴペプチダーゼは、この酵素の活性部位の位置５６３のアスパラギン残基を含まず、ここで、位置５６３は、配列番号５５の活性部位に対応する。
他の実施形態において、環化は、ベータラクタマーゼとの反応を含む。可変領域は、Ｎ－メチルトランスフェラーゼおよびベータラクタマーゼファミリーのメンバーによって切断され、かつ末端間環化される。表４は、ラクタマーゼの例示的なリスト、および加工された環状ペプチドのアミノ酸配列を示す。前記ラクタマーゼは、配列番号１１９～１２０から選択される配列を有するタンパク質であってもよい。前記ラクタマーゼは、天然に存在するラクタマーゼのバリアント（例えば、非天然バリアント）であってもよい。このようなバリアントは、配列番号１１９～１２０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。いくつかの実施形態において、ランダム化された残基の側鎖のいくつかは、その後にＬ－コンフィギュレーションからＤ－コンフィギュレーションに異性化されるか、またはヒドロキシル化、ハロゲン化、グリコシル化、アシル化、リン酸化、メチル化、およびアセチル化のような追加の修飾によって装飾される。
Figure 2022532216000025
いくつかの実施形態において、環化は、プロリルエンドペプチダーゼ、Ｎ－メチルトランスフェラーゼ、およびヒドロキシラーゼとの反応を含む。いくつかの実施形態において、二環化は、環化されたペプチド上の指定されたアンカード残基のさらなる修飾を含み、環内にトリプタチオニン架橋が形成される。第１のステップは、オキシゲナーゼのチトクロームＰ４５０ファミリーに属するヒドロキシラーゼによる、トリプトファン残基のインドール環の２位のヒドロキシル化を含んでいてもよい。このようなヒドロキシラーゼの例を表５に示す。ヒドロキシラーゼは、配列番号１２３から選択される配列を有するタンパク質であってもよい。ヒドロキシラーゼは、天然に見られるヒドロキシラーゼのバリアント（例えば、非天然バリアント）であってもよい。このようなバリアントは、配列番号１２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。
Figure 2022532216000026
ステップ２は、トリプトファン上の２’－ヒドロキシルの位置とシステイン残基由来のチオール基との間のトリプタチオニン架橋の形成を含んでいてもよい。この縮合反応は、デヒドラターゼの新規なファミリーによって触媒される。デヒドラターゼの例を表６に示す。デヒドラターゼは、配列番号１２４～１２７から選択される配列を有するタンパク質であってもよい。デヒドラターゼは、天然に見られるデヒドラターゼのバリアント（例えば、非天然バリアント）であってもよい。このようなバリアントは、配列番号１２４～１２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。
Figure 2022532216000027
Figure 2022532216000028
Figure 2022532216000029
ステップ３は、トリプタチオニンチオールをスルフィニル形態に変換する、フラビンモノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）酵素によるトリプタチオニンチオールのＳ－酸素化を記述する。このようなモノオキシグナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の例を表７に示す。ステップ４は、Ｐ４５０ファミリーモノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）による、トリプタチオニン形成性トリプトファン残基のインドール環の位置６のヒドロキシル化などの、ペプチド上の側鎖のヒドロキシル化などの潜在的な将来の修飾ステップを記述する。モノオキシグナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）は、配列番号１２８から選択される配列を有するタンパク質であってもよい。モノオキシグナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）は、天然に見られるモノオキシグナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）のバリアント（例えば、非天然バリアント）であってもよい。このようなバリアントは、配列番号１２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有していてもよい。
Figure 2022532216000030
コードされたランダムペプチドライブラリーと隣接する配列は、Ａｍａｎｉｔａ ｂｉｓｐｏｒｉｇｅｒａおよびＡｍａｎｉｔａ ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓのゲノム中で同定されたＭＳＤＩＮファミリー遺伝子（毒素プレプロタンパク質配列）由来のＮ末端フランクおよびＣ末端フランクを使用して修飾することができる。
前記酵素は、ペプチドを生産する目的で、ペプチド合成効率を向上させ、かつ収率を向上させるために、特定の細胞コンパートメントにさらに標的化され得る。
本明細書において、ある特定の実施形態において、宿主細胞中で標的または試験タンパク質をＥ３ユビキチンリガーゼに連結する分子によって媒介される、標的タンパク質の分解を検出する方法が開示されており、前記方法は、宿主細胞中で第１の試験タンパク質、Ｅ３ユビキチンリガーゼを含む第１の融合タンパク質を発現させること；第１の分子を前記宿主細胞に送達すること；前記第１の分子を、前記宿主細胞中にある間に、修飾酵素によって修飾すること；および前記第１の分子によって、前記第１の試験タンパク質と前記Ｅ３ユビキチンリガーゼとの間の相互作用を促すことを含み、ここで、前記第１の分子は、コードするＤＮＡ配列の産物であり、ここで、前記第１の分子は、ランダム化したポリペプチドライブラリーおよび１つまたはそれを超える修飾酵素を含み、ここで、前記１つまたはそれを超える修飾酵素は、前記ランダム化したポリペプチドライブラリーを修飾する。
宿主細胞
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、真核生物または原核生物である。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、動物、植物、真菌、または細菌由来である。いくつかの実施形態において、前記真菌は、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ハプロイド酵母細胞である。他の実施形態において、前記宿主細胞は、ディプロイド酵母細胞である。いくつかの実施形態において、前記ディプロイド酵母細胞は、前記第１のキメラ遺伝子、前記第２のキメラ遺伝子、および前記第３のキメラ遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含む第１の宿主細胞を、前記デスエージェント、ポジティブ選択レポーター、およびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む前記ｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む第２の宿主細胞と接合させることによって生成される。いくつかの実施形態において、前記植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍまたはＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓである。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞である。
本明細書において、ある特定の実施形態において、第１の試験タンパク質、第１のＤＮＡ結合部分、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；Ｅ３ユビキチンリガーゼ；デスエージェント（ここで、前記デスエージェントの発現は、前記ＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列の制御下にある）、および６０またはそれより少ないアミノ酸のポリペプチド（ここで、前記ポリペプチドは、前記第１の試験タンパク質と前記Ｅ３ユビキチンリガーゼとの間の相互作用を調節し、前記第１の試験タンパク質の分解を加速する）を発現するように構成された宿主細胞が開示されている。
いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、また、第２のＤＮＡ結合部分、第２の試験タンパク質、および第２の遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質；およびポジティブ選択レポーターも含んでいてもよく、ここで、前記ポジティブレポーターの発現は、前記第２のＤＮＡ結合部分に特異的な第２のプロモーターＤＮＡ配列の制御下にある。
前記宿主細胞は、小分子の取り込みを可能にする変異体バックグラウンドを有していてもよい。いくつかのケースにおいて、前記宿主細胞は、前記形質転換効率の向上を可能にする変異体バックグラウンドを有する。
本明細書において、ある特定の実施形態において、プラスミドベクターを含む宿主細胞が開示されており、ここで、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ＧＡＬ４－ＤＢＤおよびＶＰ６４－ＡＤとインフレームで挿入されており、また第２のポリペプチドは、ＬｅｘＡ－ＤＢＤおよびＶＰ６４－ＡＤとインフレームで挿入されており、ここで、ＤＮＡ配列は、Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードしている。
本明細書において、ある特定の実施形態において、前述のプラスミド；および前記プラスミドに適合するトランスフェクト可能な宿主細胞、またはその任意の組み合わせからなるキットが開示されている。いくつかの実施形態において、提供される宿主細胞は、プラスミドのコンポーネントで既にトランスフェクトされている。いくつかの実施形態において、前記キットは、前記プラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞と共に使用するための選択可能な薬剤を含む。いくつかの実施形態において、どちらかのプラスミドのバリアントのライブラリーが提供され、ここで、Ｂａｉｔタンパク質またはＥ３ユビキチンリガーゼの１ペア超が提供される。このようなライブラリーは、例えば、選択的なタンパク質ターゲティングを有する薬剤をスクリーニングするために使用することができる。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドプラスミドのバリアントのライブラリーが提供され、ここで、スクリーニングのための、複数の異なる短い試験ポリペプチド配列が提供される。前記複数の異なる短いペプチド配列は、任意の方法（例えば、ＮＮＫまたはＮＮＮヌクレオチドランダム化）によって、ランダムに生成させることができる。前記複数の異なる短いペプチド配列は、また、標的に対する結合のために選択する事前の実験によって、または合理的に設計されたペプチドライブラリーを報告している科学文献中に存在するデータセットから、のいずれかによって、あらかじめ選択されていてもよい。
前記宿主細胞は、追加的に、例えば、ＰＤＲ５などの薬剤排出ポンプをコードする遺伝子を欠失させることによって、小分子に対して透過性にすることができる。排出ポンプの発現を誘導する転写因子（ＰＤＲ１およびＰＤＲ３など）をコードする遺伝子としては、それらに限定されない、１２ｇｅｎｅΔ０ＨＳＲ（Ｃｈｉｎｅｎ、２０１１）に記載されている１２遺伝子があげられる。宿主細胞は、エルゴステロールの合成および形質膜における蓄積を阻害することによって、例えば、ＥＲＧ２、ＥＲＧ３、および／またはＥＲＧ６を欠失させることによって、または制御可能なプロモーター下でそれらの発現を駆動することによって、小分子に対して、さらに透過性にすることができる。
前記宿主細胞は、ベクターによるより効率的な形質転換および／またはより効率的な小分子の取り込みを可能にするための変異をさらに含んでいてもよい。
上述したプラスミドは、種々の順列で使用することができる。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞のゲノム内への前記プラスミドのインテグレーションに続いて、例えば、ＮＮＫまたはＮＮＮコドンを使用して、ランダムにコードされたペプチドによるライブラリーの形質転換が行われる。
いくつかの実施形態において、標的タンパク質の分解を媒介し得るペプチドを同定するためのスクリーニングを行うために、前記宿主細胞は、必要なプラスミドの存在と、非標的タンパク質の発現を保証するために、選択培地中で増殖させる（例えば、酵母については、ポジティブ選択マーカーを欠く培地上、またはヒトまたは細菌細胞については、抗生物質を含む培地上）。この宿主細胞は、次いで、ペプチドライブラリープラスミドで形質転換し、全てのコンポーネントが存在すること、およびデスエージェントの発現を活性化させる前記標的タンパク質などの何らかの誘導可能なコンポーネントの発現が（例えば、Ｇａｌ、ドキシサイクリンなどによって）誘導されていることを保証するために、速やかに選択培地に移してもよい（すなわち、酵母については、プラスミド選択マーカーを両方とも欠く、または細菌または哺乳動物細胞については、抗生物質を欠く培地上）。
他の実施形態において、前記プラスミドは、酵母接合型システムを利用した「プラグアンドプレイプラットフォーム」として使用され、ここでは、前記１つまたはそれを超える（または、２つまたはそれを超える）プラスミド（または、その中の遺伝因子）が、トランスフェクションに代えて、細胞融合、または細胞融合とそれに続く減数分裂によって、同じ細胞内に導入される。この細胞融合には、異なる遺伝因子を保持する２つの異なる酵母宿主細胞が関与する。この実施形態において、酵母宿主細胞１は、ＭＡＴａまたはＭＡＴａｌｐｈａのうちの１つであり、標的タンパク質およびＥ３ユビキチンリガーゼプラスミドのインテグレーションを含む。この実施形態において、酵母宿主細胞１系統は、前記タンパク質が存在することを保証するために、ポジティブ選択培地上で増殖させてもよい。この実施形態において、前記酵母宿主細胞２は、逆の接合型である。この系統は、ランダム化ペプチドライブラリーおよび「デスエージェント」（例えば、細胞毒性レポーター）プラスミドを保持する（またはインテグレートされている）。酵母宿主細胞２は、細胞培養内の非常に多様化したライブラリーのバリエーションを確実にする、大バッチの高効率形質転換プロトコルによって生成させてもよい。このライブラリーバッチのアリコートを、次いで、コンシステンシーを維持するために凍結してもよい。この実施形態において、前記系統は、バッチ中で接合させ、全てのマーカー、前記標的タンパク質、Ｅ３リガーゼ、ポジティブ選択、「デスエージェント」、およびペプチドを保持するディプロイド系統を生じさせてもよい。このバッチ培養を、次いで、全てのシステムコンポーネントの選択を可能にする固形培地（すなわち、ポジティブ選択マーカーを両方とも含まない）上で増殖させ、任意の誘導可能なコンポーネントの発現を誘導（すなわち、Ｇａｌによって）してもよい。
前記標的タンパク質およびＥ３リガーゼならびにライブラリー／細胞毒性コンストラクトを両方とも保持する宿主細胞（トラスフェクションまたは接合のいずれかによって細胞に導入された）に対して行った限界希釈実験で生き残ったコロニーは、特定の標的タンパク質がペプチドによって分解されており、もはやコードされている「デスエージェント」（例えば、細胞毒性レポーター）によってトリガーされるデスカスケードをトリガーすることができないが、ポジティブ選択マーカーを駆動するＢａｉｔバリアントタンパク質の発現を維持しているコロニーを形成し得る。ペプチド配列は、各生存コロニーにおけるプラスミドのペプチドコード領域のＤＮＡシークエンシングによって得ることができる。
前記の生存が、確率論的な偶然または欠陥のある遺伝子の発現によるものではなく、前記標的の分解によることを保証するために、誘導可能なプロモーターを使用して前記Ｅ３リガーゼまたは前記ペプチドのいずれかの産生を不活性化させ、特異性を確証してもよい。いくつかの実施形態において、細胞の生存は、ガラクトースを含む培地上でのみ観察され、ここで、全てのコンポーネントが発現され；ガラクトースを含まない培地上では、前記ペプチドの発現を欠く場合、生存は確認されない。
前記プラスミドは、また、特異性を確証するために、単離して、フレッシュな宿主細胞内に再トランスフォームしてもよい。標的、Ｅ３リガーゼ、ペプチド、ポジティブ選択、および「デスエージェント」を含有する生存可能な宿主細胞の生化学的分画と、それに続くプルダウン実験によって、融合コンストラクトの一部であるコードされたタグ（例えば、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ）を使用して、前記ペプチド配列と、標的タンパク質またはＥ３リガーゼのいずれかとの間の相互作用が確証され得る。これは、また、結合面を決定するためのＳＡＲを実施するためにも役立つ。
スクリーニングアッセイにおいて使用される前記ペプチドは、翻訳後修飾酵素を含むコンプレックスライブラリー由来であり得る。前記修飾ペプチドは、一次配列を同定するためのシークエンシングに加えて、質量分析法などの方法によって分析され得る。前記ペプチドは、また、前記宿主細胞に対して外来的に（ライセートから）再適用し、レポーターの不活性化または活性化を観察することによって、固有の膜透過性について試験することもできる。
十分に生き延びた宿主細胞コロニーをシークエンシングすれば、高度に保存された配列パターンが出現し得、また多重配列アライメントを使用して容易に同定され得る。このようなパターンのいずれかを、ライブラリーペプチド挿入配列内の残基を「アンカー」し、これらの可変残基の順序を入れ替えて、多様性を生み出し、より緊密な結合を実現するために使用し得る。いくつかの実施形態において、これは、また、パターン認識およびライブラリー設計のために開発されたアルゴリズムを使用して行うこともできる。コンバージェンスに達したら、（シークエンシングによって同定された）前記破壊ペプチドパターンは、ペプチド破壊性配列を確定するために使用することができる。コンバージェンスは、最後から２番目と比較して、最後の反復において、いかなる新たな配列も回収されないことによって決定される。
いくつかの実施形態において、ペプチドライブラリーは、本明細書に記載のように、スクリーニングのために生成および／または使用され得る。生成されたライブラリー中の前記ペプチドは、医薬様の特性を有するペプチドであり得る。前記スクリーニングアッセイにおいて使用されるペプチドは、翻訳後にペプチドを修飾する酵素を含むプロセス由来であり得る。例えば、Ｎ－メチル化されたバックボーンを有するか、または構造が大環式であるペプチドのライブラリーを作成するために、メチルトランスフェラーゼ（表３中に記載されているものなど）を、図６に示すプロリルオリゴペプチダーゼ（表２中に記載されているものなど）と共に、前記ライブラリーを作成するために使用してもよい。いくつかの例において、前記の多様化したコアペプチド配列は、最初は、対応するプロリルオリゴペプチダーゼまたはラクタマーゼのための同族の認識部位（ＲＳ、Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ）と隣接しており、その後、直鎖状産物から放出されて環状ペプチドを形成する。酵素（表５～７に記載されているものなど）を使用して、前記コアペプチド配列のさらなる翻訳後修飾が可能である。
代替的なアプローチにおいて、（例えば、タンパク質－タンパク質相互作用を阻害する「架橋」ペプチド（単数または複数）を同定するためにデザインされたシステムにおいて使用するための）医薬様のＮ－メチル化および／または大環状ペプチドのライブラリーを作成するために、メチルトランスフェラーゼ（表３に記載されているものなど）を使用してもよく、ここで、プロテアーゼ切断部位（ＴＥＶプロテアーゼなど）は、図７に示されているように、前記の多様化したコアペプチド配列の上流に挿入されている。前記コア配列のメチル化後、プロテアーゼ誘導が、環化を可能にするブテラーゼ、またはソルターゼなどのさらなるプロセシング酵素のための認識部位（Ｎ末端またはＣ末端部位）が隣接しているコアペプチドの放出し得る。あるいは、インテインドナー部位が、環化を誘発するために含められ得る。いくつかのケースにおいて、前記環化プロセスによって、最終的な大員環内に最小限の「ｓｃａｒ」配列を導入され得る。さらに、表５～７に記載されている酵素を使用して、前記コアペプチド配列の翻訳後修飾が可能である。
実施例１：選択的なタンパク質分解をもたらす分子を同定するための方法。
これは、特定のバリアント分解のための促進物質を同定するための異なるＤＢＤに融合させた、１つのタンパク質の２つのバリアントを使用したシステムの例である。目的のタンパク質およびＥ３リガーゼを構成するタンパク質をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内に組み込むために、インテグレーションプラスミドが使用される。前記プラスミドは、ＡＤ（ＶＰ６４）およびＤＢＤ（ＧＡＬ４）とＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）の融合物、およびＡＤ（ＶＰ６４）およびＤＢＤ（ＬｅｘＡ）とＫＲａｓの別の融合コンストラクト、ならびにＥ３ユビキチンリガーゼ セレブロン（ＣＲＬ４－ＣＲＢＮ）をコードしている。前記タンパク質融合配列は、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ、またはＨＡのいずれかによってタグ付けされている。前記プラスミドは、酵母複製マーカーおよび酵母選択マーカー（ＴＲＰ１およびＣＥＮ）をさらに含む。前記プラスミドは、また、ゲノム中の特定された遺伝子座にインテグレーションするための部位も有する。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ランダム化ペプチドライブラリーであるＮＮＫ ２０－ｍｅｒ配列の発現のために、選択およびライブラリープラスミドと共に同時トランスフォームされる。前記選択プラスミドは、強いプロモーターであるＡＤＨ１によって駆動される。前記選択およびライブラリープラスミドは、また、Ｈｉｓタグをコードする配列も含む。
前記選択およびライブラリープラスミドは、ＧＡＬ４－ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）－ＶＰ６４融合タンパク質によって形成される機能的転写因子が結合した場合に、「デスエージェント」（細胞毒性レポーター発現）を誘導するＬｅｘＡｏｐ配列を追加的に含む。前記選択およびライブラリープラスミドは、また、ＬｅｘＡ－ＫＲＡＳ－ＶＰ６４融合タンパク質の制御下にあるポジティブ選択マーカーであるＡＤＥ２も含み、この融合タンパク質が発現された場合に前記ポジティブ選択マーカーの発現が誘導される。前記プラスミドは、酵母複製マーカーおよび酵母選択マーカー（ＴＲＰ１およびＣＥＮ）をさらに含む。
スクリーニングは、バッチ中で、前記系統を接合させてディプロイド系統を生じさせることによって行い、このディプロイド系統は、全ての前記マーカー、前記標的タンパク質、前記Ｅ３リガーゼ、前記ポジティブ選択、前記デスエージェント、および前記ペプチドを保持している。このバッチ培養を、次いで、固形培地上で増殖させ、これによって、全てのシステムコンポーネントの選択が可能になり（培地は、２つの栄養成分を欠いている）、Ｇａｌによって誘導可能な任意のコンポーネントの発現が誘導される。
生き残ったコロニーは、分解されたＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）（これは、もはやコードされたデスエージェントによって誘導されるデスカスケードをトリガーすることができない）を含む細胞を構成し、その分解は、セレブロンに対するペプチド架橋によって促進されている。同じ細胞は、また、標的化されておらず、生存を可能にするポジティブ選択を駆動するＷＴ ＫＲＡＳも発現する。
ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）を選択的に分解することができる前記ペプチド配列は、各生存コロニー中の選択およびライブラリープラスミドのペプチドコーディング領域をＤＮＡシークエンシングすることによって得る。
特異性を確証するために、前記誘導可能なマーカーを使用し、前記Ｅ３リガーゼの産生を不活性化し、選択性を確証する。前記プラスミドは、次いで、特異性を確証するために、単離し、フレッシュな親系統中に再トランスフォームする。
標的、Ｅ３リガーゼ、ペプチド、選択マーカー、およびデスエージェントを含有する生存可能な系統の生化学的分画と、それに続くプルダウン実験によって、コードされたタグを使用して、前記ペプチド配列といずれかのタンパク質との間の相互作用が確証された。
ＬｅｘＡをＧＡＬ４で置き換えることによって、代替的な例を作成することができる。別の代替的な例において、いずれかのコンストラクト中の融合タンパク質は、ＡＤＨ１プロモーターに代えて、誘導可能なプロモーターであるＧＡＬ１によって駆動される。別の例において、酵母選択マーカーである２ｕｍを、ＣＥＮに代えて、前記標的およびＥ３リガーゼインテグレーションプラスミド、ならびに選択およびライブラリープラスミドに含有させる。同様に、酵母選択マーカーであるＬＥＵ２は、別の例において、代替的に使用することができる。さらに別の例において、前記選択およびライブラリープラスミドから翻訳されたペプチドのＮ末端は、その代わりに、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、またはプロリンであり得る。他の例において、前記確証プラスミド中の遺伝的レポーターは、ＡＤＥ２の代わりに、ＨＩＳ３またはＵＲＡ３である。ハプロイド状態のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのいずれかの接合型は、代替的な例において、バックグラウンド系統として使用することができる。他の例において、ペプチドの前記ライブラリーは、翻訳後修飾を可能にするスキャフォールドから発現され得る。他の例において、バックグラウンド系統は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（ＬａｎＢ、ＬａｎＣ、ＬａｎＭ、ＬａｎＰ）由来のランチペプチド成熟酵素のようなペプチドの環化およびメチル化のための酵素、シアノバクテリア（ＰａｔＤ， ＰａｔＧ）由来のパテラミド生合成因子、Ｃｌｉｔｏｒｉａ ｔｅｒｎａｔｅａ由来のブテラーゼ１、およびＧａｌｅｒｉｎａ ｍａｒｇｉｎａｔａまたは他の種由来のＧｍＰＯＰＢも発現する。
実施例２：標的タンパク質の分解のためのネガティブリードアウト
この例において、前記標的Ｂａｉｔは、必須栄養素の非存在下で増殖を可能にするポジティブ選択マーカーに機能できるように結合している（図１に模式的に示す）。このケースにおいて、細胞を、分解リードアウト培地上に蒔き、生存を架橋剤あり、またはなしでアッセイした。架橋剤が、前記Ｂａｉｔタンパク質を、目的の特定のＥ３リガーゼに機能的に架橋することができるケースにおいて、前記Ｂａｉｔは、分解され、かつ、増殖に必要とされるポジティブマーカーを細胞が発現できないため、細胞は、分解リードアウト培地上で増殖することができない。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、以前に記載されているように（Ｃｈｉｎｅｎ、２０１１）、薬剤排出ポンプおよびその発現をコードする転写因子の欠失によって薬物排出を最小化するために改変した。この例において使用されたＥ３リガーゼは、ＴＩＲ１であった。前記標的は、ＴｅｔＲ ＤＢＤおよびＡＤに融合されたインドール酢酸に応答して、ユビキチン化され、分解される植物タンパク質（オーキシン応答性タンパク質－ＡＸＲ）であった。ＤＢＤは、ポジティブ選択マーカーの上流に結合し、このケースにおいては、ＡＤＥ２であった。細胞は、ＯＤ約１．０で、５倍の希釈系列で、架橋剤ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を２５μＭ、またはなしで、アデニンを含まない選択プレート上に２μｌでスポットして播種した。プレートは、３０℃でインキュベートし、２日後にイメージングした。結果を図８に示す。
実施例３：標的タンパク質の分解についてのポジティブリードアウト
この実施例において、前記標的Ｂａｉｔは、同様に図２に記載されているように発現された場合に、細胞増殖を阻害する「デスエージェント」ネガティブ選択マーカーに機能できるように結合していた。異なるＥ３リガーゼを発現している細胞の生存を、外来的に提供された架橋剤の存在下で評価した。架橋剤が、前記Ｂａｉｔタンパク質を、目的の特定のＥ３リガーゼに、前記Ｂａｉｔ／ＤＢＤ融合タンパク質のユビキチン化をもたらすような様式で機能的に架橋することができるケースにおいて、前記Ｂａｉｔは分解され、細胞は、「デスエージェント」マーカーを発現しないため、増殖する。
前記細胞は、以前に記載されているように（Ｃｈｉｎｅｎ、２０１１）、薬剤排出ポンプおよびその発現をコードする転写因子の欠失によって薬物排出を最小化するために改変される。この実施例において使用された前記Ｅ３リガーゼは、ＴＩＲ１であり、使用された対照Ｅ３リガーゼは、ＣＲＢＮであった。前記標的は、ＴｅｔＲ ＤＢＤおよびＡＤに融合されたインドール酢酸に応答して、ユビキチン化され、分解される植物タンパク質であった。細胞は、また、ＤＢＤ含有融合タンパク質によって制御されるデスエージェントを含んでいた。細胞は、ＯＤ約１．０で、５倍の希釈系列で、２５μＭの架橋剤ＮＡＡを含有する選択プレート上に２μｌでスポットして播種した。プレートは、３０℃でインキュベートし、２日後にイメージングした。結果を図９に示す。
別の例において、異種Ｅ３リガーゼ（このケースにおいてはＴＩＲ１）を発現している細胞を、ＴＩＲ１をＢａｉｔに架橋して分解をもたらし、それによって細胞増殖を可能にする架橋剤を発見するために、生存についてアッセイした（図１０Ａに模式的に示すように）。前記標的は、ＴｅｔＲ ＤＢＤおよびＡＤに融合されたインドール酢酸に応答して、ユビキチン化され、分解される植物タンパク質（ＡＸＲ）であった。前記Ｅ３リガーゼと前記デスエージェントを含有する細胞を、前記標的を含有する細胞と接合させた。接合させた細胞は、次いで、初期ＯＤ６００＝０．０５で、９６ウェルプレート中に分注した。この例において、種々の化合物を、４つ組のウェルにおいて、濃度１０μＭで使用し、細胞を、初期ＯＤ６００＝０．０５で蒔いた（境界となる各サイドのウェルは、ネガティブコントロールとして確保した）。プレートは、３０℃で、振盪しながらインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ １装置中で、ＯＤ６００を使用して、連続的に増殖をモニターした。ポジティブな増殖を示した条件から、架橋剤を同定することができた。機能的な架橋剤は、ＮＡＡ（ウェルＣ、Ｄ／６、７）、２，４－ＤＣＰＡ（ウェルＥ、Ｆ／８，９）、およびＰＡＡ（ウェルＧ、Ｈ／８，９）（構造を図１０Ｂに示す）。図１０Ｃに示す最終的な時点は、４８時間である。
さらに別の例において、異種Ｅ３リガーゼ（このケースにおいてはＣＯＩ１ｂ）を発現している細胞を、ＣＯＩ１ｂをＢａｉｔに架橋して分解をもたらし、それによって細胞増殖を可能にする架橋剤を発見するために、生存についてアッセイした（図１１Ａに示すように）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、以前に記載されているように（Ｃｈｉｎｅｎ、２０１１）、薬剤排出ポンプおよびその発現をコードする転写因子の欠失によって薬物排出を最小化するために改変した。使用された標的は、ＴｅｔＲ ＤＢＤおよびＡＤに融合されたジャスモネート－イソロイシンに応答して、ユビキチン化され、分解される植物タンパク質（ＡＸＲ）であった。前記Ｅ３リガーゼと前記デスエージェントを含有する細胞を、前記標的を含有する細胞と接合させた。接合させた細胞は、次いで、初期ＯＤ６００＝０．０５で、９６ウェルプレート中に分注した。種々の化合物を、２つ組のウェルにおいて、１００μＭから低下する濃度勾配で試験した。細胞増殖を示したウェルは、１００μＭ（ウェルＥ８／９）から、７５μＭ（Ｆ８／９）、５０μＭ（Ｇ８／９）までの、種々の濃度のコロナチン（図１１Ｂに示す構造）を含んでいた。プレートは、３０℃で、振盪しながらインキュベートし、Ｃｙｔａｔｉｏｎ １装置中で、ＯＤ６００を使用して、連続的に増殖をモニターした。図１１Ｃに示す最終的な時点は、８４時間である。

Claims (136)

  1. 宿主細胞中で、第１の試験タンパク質の分解を誘発する分子を同定するための方法であって、
    （ａ）前記宿主細胞中で、
    （ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはその機能的フラグメント；および
    （ｉｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質
    を発現させること
    （ここで、（ｉ）前記宿主細胞は、デスエージェントの発現を制御するためのプロモーター配列を含み、（ｉｉ）前記第１のＤＮＡ結合部分は、前記プロモーター配列に特異的に結合する）；および
    （ｂ）前記分子を、前記宿主細胞に送達すること
    （ここで、前記分子の非存在下で、前記デスエージェントの発現が活性化される）
    を含む方法。
  2. 前記分子の存在下で、前記第１の試験タンパク質が、前記Ｅ３ユビキチンリガーゼによって分解される、請求項１の方法。
  3. 第２のＤＮＡ結合部分、第２の試験タンパク質、および第２の遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質を前記宿主細胞中で発現させることをさらに含み、ここで、前記宿主細胞が、前記第２のＤＮＡ結合部分に特異的な配列を有する１つまたはそれを超えるプロモーターによって駆動される１つまたはそれを超えるポジティブ選択レポーターをさらに含む、請求項１または２の方法。
  4. 複数のポジティブ選択レポーターが前記宿主細胞内に配置され、ここで、前記複数のポジティブ選択レポーターの各ポジティブ選択レポーターが、前記第２のＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーター配列に作動可能に連結されている、請求項１～３のいずれか一項の方法。
  5. 前記ポジティブ選択レポーターが、前記宿主細胞内に配置されたプラスミド中にコードされている、請求項３または４の方法。
  6. 前記分子が、分子ライブラリー由来である、請求項１～５のいずれか一項の方法。
  7. 前記分子が、外来的に送達される、請求項１～６のいずれか一項の方法。
  8. 前記宿主細胞が、前記第１のＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列によって活性化されるデスエージェントを発現させるための遺伝子の１つを超える配列を含む、請求項１～７のいずれか一項の方法。
  9. 前記宿主細胞が、前記融合タンパク質をコードするインテグレーテッドＤＮＡ、前記Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードするインテグレーテッドＤＮＡ、および前記デスエージェントをコードするプラスミドＤＮＡを含む、請求項１～８のいずれか一項の方法。
  10. 前記第１の試験タンパク質が、ＫＲＡＳバリアントである、請求項１～９のいずれか一項の方法。
  11. 前記第２の試験タンパク質が、ＫＲＡＳである、請求項１～１０のいずれか一項の方法。
  12. 前記Ｅ３ユビキチンリガーゼが、セレブロンを含む、請求項１～１１のいずれか一項の方法。
  13. 前記第１のＤＮＡ結合部分が、ＬｅｘＡ、ｃＩ、Ｇｌｉ－１、ＹＹ１、グルココルチコイド受容体、ＴｅｔＲ、またはＵｍｅ６由来である、請求項１～１２のいずれか一項の方法。
  14. 前記第１の遺伝子活性化部分が、ＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ－κＢ、Ｂ４２、ＢＰ６４、ＶＰ６４、またはｐ６５由来である、請求項１～１３のいずれか一項の方法。
  15. 前記デスエージェントが、ＤＮＡまたはＲＮＡから選択される遺伝因子の過剰発現産物である、請求項１～１４のいずれか一項の方法。
  16. 前記遺伝因子が、ＧＩＮ１１などの増殖抑制（ＧＩＮ）配列である、請求項１５のいずれか一項の方法。
  17. 前記デスエージェントが、リボソームによってコードされた生体異物剤、リボソームによってコードされた毒、マイルドな過剰発現によって重篤な増殖障害を引き起こすリボソームによってコードされた内在性または外来性遺伝子、生存に必須の遺伝子を切断するリボソームによってコードされたリコンビナーセ、毒性２次代謝産物の合成に関与する制限因子、またはそれらの組み合わせである、請求項１～１６のいずれか一項の方法。
  18. 前記デスエージェントが、コレラ毒素、ＳｐｖＢ毒素、ＣＡＲＤＳ毒素、ＳｐｙＡ毒素、ＨｏｐＵｌ、Ｃｈｅｌｔ毒素、Ｃｅｒｔｈｒａｘ毒素、ＥＦＶ毒素、ＥｘｏＴ、ＣｄｔＢ、ジフテリア毒素、ＥｘｏＵ／ＶｉｐＢ、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＧ、ＶｏｐＦ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＳｄｂＡ、ＳｉｄＧ、ＶｐｄＡ、Ｌｐｇ０９６９、Ｌｐｇｌ９７８、ＹｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｏｐＥ２、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｉｐＡ、ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、アマトキシン、ファラシジン、キラートキシンＫＰ１、キラートキシンＫＰ６、キラートキシンＫｌ、キラートキシンＫ２８（ＫＨＲ）、キラートキシンＫ２８（ＫＨＳ）、炭疽菌致死因子エンドペプチダーゼ、志賀毒素、サポリン毒素、リシン毒素、またはそれらの組み合わせである、請求項１７の方法。
  19. 前記宿主細胞が、真核生物または原核生物である、請求項１～１８のいずれか一項の方法。
  20. 前記宿主細胞が、動物、植物、真菌、または細菌由来である、請求項１～１９のいずれか一項の方法。
  21. 前記宿主細胞が、真菌由来である、請求項２０の方法。
  22. 前記真菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓである、請求項２１の方法。
  23. 前記宿主細胞が、微生物である、請求項２０の方法。
  24. 前記微生物が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項２３の方法。
  25. 前記微生物が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２３の方法。
  26. 前記宿主細胞が、細菌である、請求項２０の方法。
  27. 前記分子が、小分子である、請求項１～２６のいずれか一項の方法。
  28. 前記小分子が、ペプチド模倣物である、請求項２７の方法。
  29. 前記分子が、ペプチドまたはタンパク質である、請求項１～２６の方法。
  30. 前記ペプチドまたはタンパク質が、天然に存在するタンパク質産物由来である、請求項２９の方法。
  31. 前記ペプチドまたはタンパク質が、合成されたタンパク質産物である、請求項２９～３０のいずれか一項の方法。
  32. 前記ペプチドまたはタンパク質が、組換え遺伝子の産物である、請求項３１の方法。
  33. 前記分子が、前記宿主細胞内に挿入された試験ＤＮＡ分子から発現されたポリペプチドであり、ここで、前記試験ＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコードしている、請求項１～２６のいずれか一項の方法。
  34. 前記試験ＤＮＡ分子が、異なるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のライブラリー由来である、請求項３３の方法。
  35. ＤＮＡ配列の前記ライブラリーの各ＤＮＡ配列が、別個のベクター内に配置されている、請求項３４の方法。
  36. 前記ライブラリーが、長さが６０アミノ酸またはそれより少ないポリペプチドをコードしている、請求項３４～３５のいずれか一項の方法。
  37. 前記ＤＮＡ配列が、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲをコードしている、請求項３３～３５のいずれか一項の方法。
  38. 前記３’ＵＴＲが、ｓＯＲＦ１の３’ＵＴＲである、請求項３７の方法。
  39. 前記ポリペプチドが、メチオニン－バリン－アスパラギンというＮ末端配列を含む、請求項３４の方法。
  40. 前記ポリペプチドが、宿主細胞中で、環状ペプチドまたは二環性ペプチドに加工される、請求項３３～３９のいずれか一項の方法。
  41. 前記ポリペプチドが、翻訳後修飾の産物である、請求項３３～４０のいずれか一項の方法。
  42. 前記翻訳後修飾が、切断を含む、請求項４１の方法。
  43. 前記翻訳後修飾が、環化を含む、請求項４１の方法。
  44. 前記翻訳後修飾が、二環化を含む、請求項４１の方法。
  45. 前記環化が、プロリルエンドペプチダーゼとの反応を含む、請求項４３の方法。
  46. 前記プロリルエンドペプチダーゼが、配列番号４２～５８またはその機能的フラグメントから選択されるものである、請求項４５の方法。
  47. 前記プロリルエンドペプチダーゼが、配列番号４２～５８の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものである、請求項４６の方法。
  48. 前記環化が、ベータラクタマーゼとの反応を含む、請求項４５の方法。
  49. 前記ラクタマーゼが、配列番号１１９～１２０またはその機能的フラグメントから選択されるものである、請求項４８の方法。
  50. 前記ラクタマーゼが、配列番号１１９～１２０の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものである、請求項４６の方法。
  51. 前記二環化が、ヒドロキシラーゼおよびデヒドラターゼとの反応を含む、請求項４５の方法。
  52. 前記ヒドロキシラーゼが、配列番号１２３またはその機能的フラグメントを含む、請求項５１の方法。
  53. 前記ヒドロキシラーゼが、配列番号１２３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものである、請求項５２の方法。
  54. 前記デヒドラターゼが、配列番号１２４～１２７またはその機能的フラグメントから選択されるものである、請求項４７または４８のいずれか一項の方法。
  55. 前記デヒドラターゼが、配列番号１２４～１２７の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものである、請求項５４の方法。
  56. 前記二環化が、トリプタチオニン架橋によって形成される、請求項４５の方法。
  57. 前記翻訳後修飾が、メチル化を含む、請求項４５の方法。
  58. 前記メチル化が、Ｎ－メチルトランスフェラーゼとの反応を含む、請求項５７の方法。
  59. 前記Ｎ－メチルトランスフェラーゼが、配列番号６１～１１６またはその機能的フラグメントから選択されるものである、請求項５８の方法。
  60. 前記Ｎ－メチルトランスフェラーゼが、配列番号６１～１１６の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものである、請求項５９の方法。
  61. 前記翻訳後修飾が、ハロゲン化を含む、請求項４１の方法。
  62. 前記翻訳後修飾が、グリコシル化を含む、請求項４１の方法。
  63. 前記翻訳後修飾が、アシル化を含む、請求項４１の方法。
  64. 前記翻訳後修飾が、リン酸化を含む、請求項４１の方法。
  65. 前記翻訳後修飾が、アセチル化を含む、請求項４１の方法。
  66. 前記試験ＤＮＡ分子が、修飾酵素を発現する遺伝子配列を含む、請求項３３～３８のいずれか一項の方法。
  67. プラスミドベクターのライブラリーであって、各プラスミドベクターが、
    第１のプロモーターに作動可能に連結された異なるペプチド配列をコードするＤＮＡ配列；
    第２のプロモーターの制御下にあるデスエージェントをコードするＤＮＡ配列；および
    第３のプロモーターの制御下にあるポジティブ選択レポーターをコードするＤＮＡ配列を含む
    プラスミドベクターのライブラリー。
  68. 前記異なるペプチド配列が、Ｎ末端安定化配列をコードしている、請求項６７のプラスミドベクターのライブラリー。
  69. 前記ＤＮＡ配列が、３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡ配列をコードしている、請求項６７～６８のいずれか一項のプラスミドベクターのライブラリー。
  70. 前記ペプチド配列が、長さが６０アミノ酸またはそれより少ない、請求項６７～６８のいずれか一項のプラスミドベクターのライブラリー。
  71. 前記ペプチド配列が、ランダムである、請求項６７～６８のいずれか一項のプラスミドベクターのライブラリー。
  72. 前記ペプチド配列が、標的への結合のために、事前に富化されている、請求項６７～７１のいずれか一項のプラスミドベクターのライブラリー。
  73. 宿主細胞のライブラリーであって、各宿主細胞が、請求項６７～７２のいずれか一項のライブラリーに由来するプラスミドベクターを含む、ライブラリー。
  74. Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはその機能的フラグメント；
    第１の試験タンパク質、第１のＤＮＡ結合部分、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；
    デスエージェント（ここで、前記デスエージェントの発現は、前記第１のＤＮＡ結合部分に特異的なプロモーターＤＮＡ配列の制御下にある）；および
    ６０またはそれより少ないアミノ酸のポリペプチド（ここで、前記ポリペプチドは、前記第１の融合タンパク質の分解が加速される様式で、前記第１の融合タンパク質と前記Ｅ３ユビキチンリガーゼとの間の相互作用を調節する）
    を発現するように構成された宿主細胞。
  75. 前記宿主細胞が
    第２のＤＮＡ結合部分、第２の試験タンパク質、および第２の遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質；および
    ポジティブ選択レポーター（ここで、前記ポジティブレポーターの発現は、前記第２のＤＮＡ結合部分に特異的な第２のプロモーターＤＮＡ配列の制御下にある）
    をさらに含む、請求項７４の宿主細胞。
  76. 前記ポリペプチドが、ペプチド安定化のためのＮ末端配列をコードする、請求項７４または７５の宿主細胞。
  77. 前記ポリペプチドは、ｍＲＮＡにコードされた産物であり、ここで、前記ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む、請求項７４～７６のいずれか一項の宿主細胞。
  78. 前記ｍＲＮＡがＤＮＡ分子にコードされた産物であり、前記ＤＮＡ分子が、前記宿主細胞内に外来的に送達される、請求項７７の宿主細胞。
  79. 前記宿主細胞が、真核生物または原核生物である、請求項７４～７８のいずれか一項の宿主細胞。
  80. 前記宿主細胞が、植物、動物、真菌、または細菌由来である、請求項７４～７９のいずれか一項の宿主細胞。
  81. 前記宿主細胞が、真菌由来である、請求項８０の宿主細胞。
  82. 前記宿主細胞が、ハプロイド酵母細胞である、請求項８１の宿主細胞。
  83. 前記宿主細胞が、ディプロイド酵母細胞である、請求項８１の宿主細胞。
  84. 前記ディプロイド酵母細胞は、前記第１の融合タンパク質と前記Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードするＤＮＡ配列を含む第１の宿主細胞を、前記デスエージェントをコードするＤＮＡ配列と６０またはそれより少ないアミノ酸のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを含む第２の宿主細胞と接合させることによって生成される、請求項８３の宿主細胞。
  85. 前記宿主細胞が、小分子の増加した取り込みを可能にする変異体バックグラウンドを有する、請求項７４～８４のいずれか一項の宿主細胞。
  86. 前記宿主細胞が、前記形質転換効率の向上を可能にする変異体バックグラウンドを有する、請求項７４～８５のいずれか一項の宿主細胞。
  87. 前記真菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓである、請求項８１の宿主細胞。
  88. 前記真菌が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項８１の宿主細胞。
  89. 第１のＤＮＡ結合部分と活性化ドメインとの間にインフレームで挿入された第１の試験タンパク質を含む第１の融合タンパク質；
    第２のＤＮＡ結合部分と第２の活性化ドメインとの間にインフレームで挿入された第２の融合タンパク質；および
    請求項６７～７２のいずれか一項に記載のプラスミドベクターの前記ライブラリー
    をコードする第１のプラスミドベクター
    を含むキット。
  90. 宿主細胞内でＥ３リガーゼを発現させるために構成された第２のプラスミドベクターをさらに含む、請求項８９のキット。
  91. 前記第１のベクターが、Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードする、請求項８９のキット。
  92. 第１の試験タンパク質の分解を誘発する分子を同定するための方法であって、
    （ａ）複数の宿主細胞中で、
    （ｉ）Ｅ３ユビキチンリガーゼまたはその機能的フラグメント；および
    （ｉｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質
    を発現させること
    （ここで、（ｉ）前記複数の宿主細胞は、それぞれデスエージェントの発現を制御するためのプロモーター配列を含み、（ｉｉ）前記第１のＤＮＡ結合部分は、前記第１の融合タンパク質のユビキチン化および成熟前分解を引き起こす様式で、前記Ｅ３ユビキチンリガーゼを前記第１の融合タンパク質に動員する分子の非存在下で、前記デスエージェントの発現が活性化されるように、前記プロモーター配列に特異的に結合する）；
    （ｂ）異なる分子を、前記複数の宿主細胞のそれぞれに送達すること；
    （ｃ）前記分子が内部に送達される細胞の生存に基づいて前記第１の試験タンパク質の分解を促進する分子を特定すること
    を含む方法。
  93. 前記複数の宿主細胞中で、第２のＤＮＡ結合部分、第２の試験タンパク質、および第２の遺伝子活性化部分を含む第２の融合タンパク質を前記宿主細胞中で発現させることをさらに含み、ここで、前記宿主細胞は、前記第２のＤＮＡ結合部分に特異的な配列を有する１つまたはそれを超えるプロモーターによって駆動される１つまたはそれを超えるポジティブ選択レポーターをさらに含む、請求項９２の方法。
  94. 前記異なる分子が、分子ライブラリー由来である、請求項９２または９３の方法。
  95. 前記異なる分子が、外来的に送達される、請求項９２～９４のいずれか一項の方法。
  96. 前記第１の試験タンパク質が、ＫＲＡＳバリアントである、請求項９２～９５のいずれか一項の方法。
  97. 前記第２の試験タンパク質が、ＫＲＡＳである、請求項９６の方法。
  98. 前記Ｅ３ユビキチンリガーゼが、セレブロンを含む、請求項９２～９７のいずれか一項の方法。
  99. 前記第１のＤＮＡ結合部分が、ＬｅｘＡ、ｃＩ、Ｇｌｉ－１、ＹＹ１、グルココルチコイド受容体、ＴｅｔＲ、またはＵｍｅ６由来である、請求項９２～９８のいずれか一項の方法。
  100. 前記第１の遺伝子活性化部分が、ＶＰ１６、ＧＡＬ４、ＮＦ－κＢ、Ｂ４２、ＢＰ６４、ＶＰ６４、またはｐ６５由来である、請求項９２～９９のいずれか一項の方法。
  101. 前記デスエージェントが、ＤＮＡまたはＲＮＡから選択される遺伝因子の過剰発現産物である、請求項９２～１００のいずれか一項の方法。
  102. 前記遺伝因子が、ＧＩＮ１１などの増殖抑制（ＧＩＮ）配列である、請求項１０１の方法。
  103. 前記デスエージェントが、リボソームによってコードされた生体異物剤、リボソームによってコードされた毒、マイルドな過剰発現によって重篤な増殖障害を引き起こすリボソームによってコードされた内在性または外来性遺伝子、生存に必須の遺伝子を切断するリボソームによってコードされたリコンビナーセ、毒性２次代謝産物の合成に関与する制限因子、またはそれらの組み合わせである、請求項９２～１０２のいずれか一項の方法。
  104. 前記デスエージェントが、コレラ毒素、ＳｐｖＢ毒素、ＣＡＲＤＳ毒素、ＳｐｙＡ毒素、ＨｏｐＵｌ、Ｃｈｅｌｔ毒素、Ｃｅｒｔｈｒａｘ毒素、ＥＦＶ毒素、ＥｘｏＴ、ＣｄｔＢ、ジフテリア毒素、ＥｘｏＵ／ＶｉｐＢ、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＧ、ＶｏｐＦ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＳｄｂＡ、ＳｉｄＧ、ＶｐｄＡ、Ｌｐｇ０９６９、Ｌｐｇｌ９７８、ＹｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｏｐＥ２、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｉｐＡ、ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、アマトキシン、ファラシジン、キラートキシンＫＰ１、キラートキシンＫＰ６、キラートキシンＫｌ、キラートキシンＫ２８（ＫＨＲ）、キラートキシンＫ２８（ＫＨＳ）、炭疽菌致死因子エンドペプチダーゼ、志賀毒素、サポリン毒素、リシン毒素、またはそれらの組み合わせである、請求項１０３の方法。
  105. 前記複数の宿主細胞が、真核生物または原核生物である、請求項９２～１０４のいずれか一項の方法。
  106. 前記宿主細胞が、動物、植物、真菌、または細菌由来である、請求項９２～１０５のいずれか一項の方法。
  107. 前記真菌が、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項１０６の方法。
  108. 前記分子が、小分子である、請求項９２～１０７のいずれか一項の方法。
  109. 前記小分子が、ペプチド模倣物である、請求項１０８の方法。
  110. 前記分子が、ペプチドまたはタンパク質である、請求項９２～１０７のいずれか一項の方法。
  111. 前記ペプチドまたはタンパク質が、天然に存在するタンパク質産物、合成されたタンパク質または組換え遺伝子のタンパク質由来である、請求項１１０の方法。
  112. 前記分子が、前記宿主細胞内に挿入された試験ＤＮＡ分子から発現されたポリペプチドであり、ここで、前記試験ＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコードしている、請求項９２～１０７のいずれか一項の方法。
  113. 前記試験ＤＮＡ分子が、異なるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のライブラリー由来である、請求項１１２の方法。
  114. 前記ライブラリーが、長さが６０アミノ酸またはそれより少ないポリペプチドをコードしている、請求項１１３の方法。
  115. 前記ポリペプチドが、翻訳後修飾の産物である、請求項１１４の方法。
  116. 環状ペプチドを製造するための方法であって、
    プロリルオリゴペプチダーゼを遺伝子組換えにより発現させること；および
    前記プロリルオリゴペプチダーゼを、直鎖ペプチドと、前記直鎖ペプチドが環状ペプチドに変換されるように接触させることを含む
    （ここで、前記プロリルオリゴペプチダーゼの活性部位は、配列番号５５のアミノ酸位置６０３に対応する位置にトリプトファン残基を有さず、またはアミノ酸位置５６３に対応する位置にアスパラギン残基を有さない）
    方法。
  117. 前記プロリルオリゴペプチダーゼが、配列番号５５のアミノ酸位置６０３に対応するアミノ酸位置６０３にロイシンを有する、請求項１１６の方法。
  118. 前記プロリルオリゴペプチダーゼが、配列番号５５のアミノ酸位置５６３に対応するアミノ酸位置５６３にセリンを有する、請求項１１６の方法。
  119. 前記プロリルオリゴペプチダーゼが、配列番号４２～５８のいずれか１つに対応する配列を含む、請求項１１６または１１７の方法。
  120. 前記プロリルオリゴペプチダーゼが、配列番号４２～５８の１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するものである、請求項１１９の方法。
  121. 前記プロリルオリゴペプチダーゼを前記直鎖ペプチドと接触させることが、細胞内で起こる、請求項１１６～１２０のいずれか一項の方法。
  122. 前記プロリルオリゴペプチダーゼを前記直鎖ペプチドと接触させることが、細胞内で起こらない、請求項１１６～１２１のいずれか一項の方法。
  123. 前記直鎖ペプチドが、遺伝子組換えにより発現される、請求項１１６～１２２のいずれか一項の方法。
  124. 前記環状ペプチドが、１８またはそれを超えるアミノ酸を含む、請求項１１６～１２３のいずれか一項の方法。
  125. 請求項１１６～１２４の方法を使用して生成される１つまたはそれを超えるペプチドを含む、ペプチドライブラリー。
  126. 請求項１１６～１２４の方法を使用して生成される、第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を破壊する環状ペプチドを同定するための方法であって、
    （ａ）前記宿主細胞中で、
    （ｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；および
    （ｉｉ）第２の試験タンパク質
    を発現させること；および
    （ｂ）前記ペプチドを前記宿主細胞に送達すること（ここで、前記環状ペプチドの非存在下で、デスエージェントの発現が活性化される）
    を含む方法。
  127. 請求項１１６～１２４の方法を使用して生成される、第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を促す環状ペプチドを同定するための方法であって、
    （ａ）前記宿主細胞中で、
    （ｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；および
    （ｉｉ）第２の試験タンパク質
    を発現させること；および
    （ｂ）前記ペプチドを前記宿主細胞に送達すること（ここで、前記環状ペプチドの非存在下で、デスエージェントの発現が活性化される）
    を含む方法。
  128. ペプチドをメチル化するための方法であって、
    Ｎ－メチルトランスフェラーゼを遺伝子組換えにより発現させること；および
    前記Ｎ－メチルトランスフェラーゼを、ペプチドと、前記ペプチドのバックボーン中の複数の窒素がメチル化されるように接触させること（ここで、Ｎ－メチルトランスフェラーゼは、配列番号６１～１１６の１つの配列を含む）
    を含む方法。
  129. 前記接触させるペプチドが、環状ペプチドである、請求項１２８の方法。
  130. 前記ペプチドまたは環状ペプチドが、１８またはそれを超えるアミノ酸を含む、請求項１２８または１２９の方法。
  131. 前記Ｎ－メチルトランスフェラーゼを前記ペプチドと接触させることが、細胞内で起こる、請求項１２８～１３０のいずれか一項の方法。
  132. 前記Ｎ－メチルトランスフェラーゼを前記ペプチドと接触させることが、細胞内で起こらない、請求項１２８～１３０のいずれか一項の方法。
  133. 前記ペプチドが、遺伝子組換えにより発現される、請求項１２８～１３２のいずれか一項の方法。
  134. 請求項１２８～１３３の方法を使用して生成される１つまたはそれを超えるペプチドを含む、ペプチドライブラリー。
  135. 請求項１２８～１３３の方法を使用して生成される、第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を破壊する環状ペプチドを同定するための方法であって、
    （ａ）前記宿主細胞中で、
    （ｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；および
    （ｉｉ）第２の試験タンパク質
    を発現させること；および
    （ｂ）前記ペプチドを前記宿主細胞に送達すること（ここで、前記環状ペプチドの非存在下で、デスエージェントの発現が活性化される）
    を含む方法。
  136. 請求項１２８～１３３の方法を使用して生成される、第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との間の相互作用を促す環状ペプチドを同定するための方法であって、
    （ａ）前記宿主細胞中で、
    （ｉ）第１のＤＮＡ結合部分、前記第１の試験タンパク質、および第１の遺伝子活性化部分を含む第１の融合タンパク質；および
    （ｉｉ）第２の試験タンパク質
    を発現させること；および
    （ｂ）前記ペプチドを前記宿主細胞に送達すること（ここで、前記環状ペプチドの非存在下で、デスエージェントの発現が活性化される）
    を含む方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5525490A (en) * 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5695941A (en) * 1994-06-22 1997-12-09 The General Hospital Corporation Interaction trap systems for analysis of protein networks
DE69532127T2 (de) 1994-07-20 2004-08-26 Genetics Institute, Inc., Cambridge Interaktions-fullensysteme zum nachweis von protein-interaktionen
JPH11502717A (ja) 1995-04-11 1999-03-09 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション 逆ツーハイブリッドシステム
US7358056B1 (en) * 1999-08-30 2008-04-15 Signal Pharmaceuticals Methods for modulating signal transduction mediated by TGF-β and related proteins
US7378248B2 (en) * 2000-03-06 2008-05-27 Rigel Pharmaceuticals, Inc. In vivo production of cyclic peptides for inhibiting protein-protein interaction
US6787321B1 (en) * 2000-10-13 2004-09-07 The Regents Of The University Of California Mammalian two-hybrid system for screening for modulators of the accumulation of metabolic products
EP4269427A3 (en) 2016-05-27 2023-11-22 Synthex, Inc. Protein interfaces
WO2019099678A1 (en) * 2017-11-16 2019-05-23 Synthex, Inc. Selective modulation of protein-protein interactions
WO2019104244A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Synthex, Inc. Peptides for inhibiting rad51
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