MXPA04012042A - Un ensayo con celulas humanas para determinar el efecto de los compuestos de muestra en la expresion del potenciador col2. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere a la actividad (crecimiento/diferenciacion/produccion de matriz extracelular) de condorcitos humanos y al efecto del factor de transcripcion Sox9 y el potenciador Col2 como medida para tal actividad; tambien se refiere a la celulas quimerica y al ensayo que utiliza dicha celula, util para predecir el efecto de los compuestos de muestra sobre la actividad de condorcitos, medida por la expresion/actividad de Sox9 y Col2.

Description

UN ENSAYO CON CELULAS HUMANAS PARA DETERMINAR EL EFECTO DE LOS COMPUESTOS DE MUESTRA EN LA EXPRESION DEL POTENCIADOR COL2 CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a actividad (crecimiento/diferenciación/producción de matriz extracelular) de condrocitos humanos y al efecto del factor de transcripción Sox9 y el potenciador Col2 como una medida para tal actividad. También se refiere a una célula quimérica y al ensayo que utiliza tal célula útil a la hora de predecir el efecto de los compuestos de muestra en la actividad de los condrocitos como se mide mediante y expresión/actividad de Sox9 Col2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La destrucción progresiva del cartílago articular es común a artrosis y artritis reumatoide. Este tejido proporciona la lubricación y compresibilidad necesarias para la función de las articulaciones. Por lo tanto, la pérdida del cartílago articular da como resultado incremento del dolor y morbilidad. El cartílago articular se compone de una matriz extracelular rica en colágeno y proteoglicano y los condrocitos que la producen. Así, el condrocito es primordial para entender la función normal del cartílago así como la enfermedad artrítica y degenerativa que le afecta. Los condrocitos aislados tienen una capacidad proliferativa pequeña y tienden a desdiferenciarse en células similares a fibroblastos cuando se sitúan en cultivos celulares. Las fuentes de células humanas para su estudio, particularmente a partir de tejido no enfermizo, son extremadamente escasas por razones obvias éticas y prácticas. Así, gran parte del conocimiento de los inventores de la biología de los condrocitos se deriva de estudios en animales o de sus tejidos y células cultivados. Los estudios genéticos de sujetos humanos que sufren de anormalidades esqueléticas graves han contribuido al conocimiento de los inventores de la biología del condrocito. Las mutaciones que conducen a la pérdida de función/expresión de un solo alelo del gen humano Sox9 se han identificado como la causa de un síndrome raro y grave de malformación esquelética conocido como displasia camptoméiica (Wagner T, Wirth J, Meyer J, Zabel B, Held M, ZimmerJ, Pasantes J, Brícarel/i FD, Keutel J, Hustert E, .: Autosomal sex reversal and camptomelic dysplasia are caused by mutations in and around the SRY-related gene S0X9. Cell 79:1111-1120, 1994; Wright E, Hargrave MR, Christiansen J, Cooper L, Kun J, Evans T, Gangadharan U, Greenfíeld A, Koopman P: The Sry-related gene Sox9 is expressed during chondrogenesis in mouse embryos. Nat Genet 9:15-20, 1995). Los pacientes masculinos presentan inversión de sexo con XY (Wagner T, Wirth J, Meyer J, Zabel B, Held M, Zimmer J, Pasantes J, Brícarelli FD, Keutel J, Hustert E.: Autosomal sex reversal and camptomelic dysplasia are causeó by mutations in and a round the SRY-related gene S0X9. Cell 79:1111-1120, 1994) confirmando el otro papel principal del Sox9 en el desarrollo, la determinación sexual masculina. Los ratones manipulados para expresar sólo un alelo del gen Sox9 (Sox9 +/-), representan una fenocopia cercana del síndrome esquelético humano (Bi W, Huang W, Whitworth DJ, Deng JM, Zhang Z, Behringer RR, de Crombrugghe B: Haploinsufficiency of Sox9 results in detective cartilage primordia and premature skeletal mineralization. Proc Nati Acad Sci USA 98:6698-6703, 2001), manifestando hipoplasia de todos los cartílagos primordiales y huesos derivados de ahí. Además, los ratones derivados de quimerismo de tipo salvaje y las células Sox9 -/- ES (que expresan B-galactosidasa) mostraron que la expresión de Sox9 es obligatoria para que las células se incorporen en condensaciones mesenquimales que dan origen a estructuras de cartílago (Bi W, Deng JM, Zhang Z, Behringer RR, de Crombrugghe B: Sox9 is required for cartilage formation. Nat Genet 22:85-89, 1999). Los ratones genéticamente modificados que tienen expresión dañada o potenciada de Sox9 presentaron inversión de sexo XY o XX, respectivamente (Bishop CE, Whitworth DJ, Qin Y, Agoulnik Al, Agoulnik IU, Harríson WR, Behringer RR, Overbeek PA: A transgenic insertion upstream of sox9 is associated with dominant XX sex reversal in the mouse. Nat Genet 26:490-494, 2000; Vidal VP, Chaboissier MC, de Rooij DG, Schedl A: Sox9 induces testis development in XX transgenic mice. Nat Genet 28:216-217, 2001); confirmando el papel de Sox9 en la determinación sexual en ratones así como en humanos. Sox9 es un miembro de una familia de proteínas HMG-box. Esta familia de proteínas es inusual en que se unen al surco menor de DNA y usualmente cooperan con un compañero o compañeros proteicos para regular la expresión genética (revisada en Kamachi Y, Uchikawa M, Kondoh H: Pairing SOX off: with partners in the reguíatíon of embryonic development. Trends Genet 16:182-187, 2000). hLSox5 y Sox6 parecen jugar un papel en parte solapante en colaborar con Sox9 para regular la expresión de los genes diana de condrocitos incluyendo el Col2a1 y agrecano (Smits P, Li P, Mandel J, Zhang Z, Deng JM, Behringer RR, de Croumbrugghe B, Lefebvre V: The transcríption factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Dev Cell 1:277-290, 2001; Lefebvre V, Behringer RR, de Crombrugghe B: L-Sox5, Sox6 and Sox9 control essential steps of the chondrocyte differentiation pathway. Osteoarthritis Cartilage 9 Suppl A:S69-S75, 2001). Sox9 también regula el "colágeno de cartílago menor", Col1 1a2, mediante interacciones con sitios similares a HMG tanto en el promotor (Bridgewater LC, Lefebvre V, de Crombrugghe B: Chondrocyte-specific enhancer elements in the Col11a2 gene resemble the Col2a1 tissue-specifíc enhancer. J Biol Chem 273:14998-15006, 1998) como dentro de un potenciador intrónico (Liu Y, Li H, Tanaka K, Tsumaki N, Yamada Y: Identification of an enhancer sequence within the fírst intron required for cartilage-specific transcription of the alpha2(XI) collagen gene. J Biol Chem 275:12712-12718, 2000). Sox9 parece integrar las muchas vías de señalización que regulan la expresión de las proteínas de la matriz del cartílago. Esto incluye señales que regulan positivamente el fenotipo del cartílago, tales como un FGFs, y BMP-2, así como la hormona paratiroidea en condrocitos prehipertróficos (Murakami S, Kan M, McKeehan WL, de Crombrugghe B: Up-regulation of the chondrogenic Sox9 gene by fíbroblast growth factors is mediated by the mitogen-activated protein kinase pathway. Proc Nati Acad Sci U S A 97:1113-1118, 2000; Uusita/o H, HHtunen A, Ahonen M, Gao TJ, Lefebvre V, Harley V, Kahari VM, Vuorio E: Accelerated up-regulation of L-Sox5, Sox6, and Sox9 by BMP-2 gene transfer during murine fracture healing. J Bone Miner Res 16:1837-1845, 2001). La inhibición de la expresión de la matriz mediante citoquinas y ácido retinoico también implica la inhibición de Sox9 (Murakami S, Lefebvre V, de Crombrugghe B: Potent inhibition of the master chondrogenic factor Sox9 gene by interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha, J Biol Chem 275:3687-3692, 2000); Sekiya I, Koopman P, Tsuji K, Mertin S, Harley V, Yamada Y, Shinomiya K, Niguji A, Noda M: Transcriptional suppression of Sox9 ex ression in chondrocytes by retinoic acid. J Cell Biochem 81:71-78, 2001). Los estudios han mostrado que la actividad Sox9 se regula tanto mediante el nivel de expresión como mediante la modificación postraduccional (Huang W, Zhou X, Lefebvre V, de Crombrugghe B: Phosphorylation of SOX9 by Cyclic AMP-Dependent Protein Kinase A Enhances S0X9's Ability To Transactivate a Col2a1 Chondrocyte-Specifíc Enhancer. Mol Cell Biol 20:4149-4158, 2000). El Sox9 se ha llamado el "Factor Maestro de Transcripción Condrogénica" (Murakami S, Lefebvre V, de Crombrugghe B: Potent inhibition of the master chondrogenic factor Sox9 gene by interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha, (J Biol Chem 275:3687-3692, 2000)). Por lo tanto, comprender la función Sox9 en el desarrollo del cartílago, el mantenimiento del tejido, y los procesos morbosos es importante al considerar estrategias para detener la destrucción del cartílago e inducir reparación. El factor de transcripción Sox 9 ha surgido como un determinante importante del desarrollo de los condrocitos y la regulación de colágeno de tipo II y la expresión del gen de agrecano Se sabe que el factor de transcripción Sox9 juega un papel en la expresión/actividad de Col2 por los condrocitos. Sería útil construir un modelo que pudiera correlacionar el nivel de presencia de Sox9 a la expresión/actividad de Col2. También sería útil desarrollar un modelo que permitiría el ensayo de diversos compuestos para determinar si tienen un efecto sobre la expresión/actividad de Sox9. Gran parte del conocimiento de los inventores se basa en estudios de ratones genéticamente modificados y sobre el análisis funcional de los condrocitos de ratón in vitro. Las líneas de células murinas que se han desarrollado en las cuales algunas de las propiedades del desarrollo de condrocitos se han imitado son útiles pero las ventajas de una línea celular humana la cual se puede usar para determinar el efecto de diferentes compuestos en la expresión de Col2 serían altamente útiles. Así, para caracterizar mejor el papel potencial de Sox9 en la función de los condrocitos humanos y en procesos morbosos, sería deseable identificar una línea celular humana que conserve las vías regulatorias de Sox9 identificadas en ratón. Es deseable incrementar la actividad del potenciador Col2 en condrocitos para facilitar la regeneración de colágeno. Sería útil investigar los diferentes compuestos para determinar su efecto en la expresión de Co!2. Desafortunadamente no es posible usar condrocitos para probar los compuestos debido a que los condrocitos tienen poca capacidad proliferativa in vitro y tienden a diferenciarse en células similares a fibroblastos, Así, es un objetivo de esta invención proporcionar una línea celular y un procedimiento de ensayo que sea capaz de investigar los compuestos para determinar su capacidad para modificar la actividad del potenciador Col2 en condrocitos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un procedimiento de predicción el efecto de un compuesto prueba sobre la actividad de los condrocitos humanos. El procedimiento comprende las etapas de transfectar las células del condrosarcoma humano SW1353 con un plásmido indicador que comprende los sitios de unión al DNA de Sox9; poner en contacto las células transfectadas con un compuesto prueba durante un periodo de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas; y determinar la actividad del indicador. La presente invención también proporciona una línea celular quimérica que es capaz de imitar el efecto de diversos compuestos sobre la expresión/actividad de Col2. La línea celular comprende una célula SW1353 transfectada con un plásmido que contiene sitios de unión de indicador al DNA de Sox9, Se ha determinado que la línea celular SW1353 es capaz de servir de modelo del comportamiento de los condrocitos en respuesta a la regulación de la expresión de Col2 mediante diversos compuestos, Cuando las células SW1353 se transfectan con un plásmido indicador que contiene sitios de unión a DNA de Sox9, las células se pueden usar como un ensayo para determinar la efectividad del compuesto introducido en cambiar el nivel de Sox9 e indirectamente el nivel de expresión/actividad de Col2a, y por lo tanto actúan como una herramienta a un grado de predicción menor o mayor del efecto del compuesto introducido en la diferenciación de condrocitos. Los estudios de transfección transitoria demuestran que la expresión basal de una construcción indicadora potenciadora Col2 dependiente de Sox9 podría incrementarse mediante coexpresión de un vector de expresión de Sox9. Un panel de reguladores conocidos de la expresión/actividad del Sox9 murino se probaron en el ensayo del potenciador y los resultados se correlacionaron con la expresión del gen endógeno Sox9 usando PCR en tiempo real. La línea celular SW1353 recapitula muchos de los efectos de las citoquinas y factores de crecimiento en la actividad del potenciador de Col2 observados con condrocitos primarios de ratón incluyendo la estimulación mediante FGF-1 y FGF-2 y la represión mediante IL-1 D y TNFD. Estos efectos se han correlacionado con cambios en los niveles de ARNm de Sox9. Los inventores han descubierto que FGF-9 estimula la expresión de Sox9 y la actividad del potenciador de Col2. Además, un examen cuidadoso del efecto de la dosis de IL-1 ? en la actividad potenciadora de Col2 muestra que niveles muy bajos de citoquinas realmente estimulan la actividad del potenciador mientras que dosis más altas, suficientes para estimular la expresión de IL-8, son inhibitorias. Este descubrimiento tiene relevancia para la progresión natural de la enfermedad esteoartrítica. Dado que los condrocitos responden a la enfermedad osteoartrítica temprana con intento de reparación incrementando la expresión de Col2 y esto correlaciona con la expresión autocrina de IL-1 , estos resultados sugieren una relación causal entre los dos. Los investigadores muestran que las células SW1353 pueden responder a un intervalo dinámico de niveles de IL-1 , desde la estimulación Col2 a niveles bajos hasta la represión de la inducción de respuestas catabolicas a niveles más altos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1A muestra la estimulación de la expresión basal del indicador potenciador de 48 pares de bases (pb) Col2a1Luc mediante co-expresión de Sox9 en células SW1353 transfectadas transitoriamente. La figura 1 B muestra bandas western de células SW 353 transfectadas con el plásmido de expresión de Sox9. La figura 2 muestra la respuesta de células SW1353 a factores de crecimiento y citoquinas con activación o represión del indicador potenciador de 48 pb Col2a1. La figura 3 muestra los efectos opuestos de FGF y citoquinas sobre la expresión de Sox9 en células SW1353, La figura 4 muestra el intervalo dinámico de la respuesta biológica de SW1353 como una función de la concentración de IL-lD.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un procedimiento de predicción del efecto de un compuesto prueba sobre la diferenciación de condrocitos humanos. El procedimiento comprende las etapas de transfectar células SW1353 de condrosarcoma humano con un plásmido indicador que comprende sitios de unión al DNA de Sox9; poner en contacto las células transfectadas con un compuesto prueba durante un periodo de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas; y determinar la actividad del indicador. La presente invención también proporciona una línea celular quimérica que es capaz de imitar el efecto de diversos compuestos sobre la expresión/actividad de Col2. La línea celular comprende una célula SW1353 transfectada con un plásmido que contiene sitios de unión del indicador al DNA de Sox9. La presente invención demuestra que las células SW1353 sirven de modelo a muchas de las rutas de señalización identificadas en condrocitos murinos primarios y son por lo tanto útiles en traducir resultados experimentales obtenidos en sistemas murinos a sistemas humanos. Se ha encontrado que FGF-1 y FGF-2 incrementan los niveles de RNAm de Sox9 y la actividad correspondiente de la construcción potenciadora de 48 pb dependiente de Sox9 Col2a1. Esto tiene relevancia para reparar articulaciones bien por la respuesta normal de condrocitos en intentar la reparación normal del cartílago dañado o bien cuando se consideran estrategias para intervención terapéutica. Por ejemplo, la expresión Sox9 se eleva en las articulaciones de ratones que intentan reparar el daño inducido mediante la expresión de un muíante de gen de colágeno tipo NA (Sal minen H, Vuorio B, Saa manen AM: Expresión of Sox9 and type II A procollagen during attempted repair of articular cartilage damage in a transgenic mouse model of osteoarthritis. Arthritis Rheum 44:947-955, 2001). E! análisis in situ mostró que la expresión de Sox9 se corresponde con los condrocitos más proliferativos y metabólicamente activos presentes en el tejido reparado de este modelo. La expresión de FGF-2 endógena se correlaciona también con la reparación del daño de las articulaciones, de forma que un anticuerpo neutralizante para FGF-2 bloquea !a reparación de los defectos de los cartílagos de espesor total en un modelo de conejo, mientras que la infusión de FGF-2 conduce a una reparación mejorada (Salminen H, Vuorio E, Saamanen AM: Expresión of Sox9 and type HA procollagen during attempted repair of articular cartilage damage in a transgenic mouse model of osteoarthritis. Arthritis Rheum 44:947-955, 2001). Así Sox9 proporciona una unión directa entre la entrada de factores de crecimiento procondrogénico y la expresión de genes de condrocitos necesarios para reparar. La presente invención describe que FGF-9 estimula la expresión y actividad de Sox9 en una línea célula humana similar a condrocitos. De acuerdo con estos hallazgos, se encontró que FGF-9 y FGF-2 son los más potentes de todos los miembros de la familia FGF en cuanto a estimular el crecimiento y la producción de matriz de los cultivos de condrocitos de pollo (Praul CA, Ford BC, Leach RM: Effect of fibroblast growth factors 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10 on avian chondrocyte proliferation, J Cell Biochem 84:359-366, 2002). Como se menciona previamente, la expresión de FGF-9 se asocia con el crecimiento de nodulos cartilaginosos benignos en las articulaciones de los pacientes de condromatosis. Estos resultados demuestran que la estimulación de la ruta de señalización de FGF-9/FGFR/Sox-9 tiene valor en estimular la reparación del daño de cartílago.

FGF-9 envía señales a través tanto de FGFR2c como de FGFR3b (Santos-Ocampo S, Colvin JS, Cheflaiah A, Ornitz DM: Expression and biológica! activity of mouse fibrobfast growth factor-9. J Biol Chem 271:1726-1731, 1996), y los ratones que carecen de FGFR3 tienen acondroplasia severa (Colvin JS, Bohne BA, Harding GW, McEwen DG, Ornitz DM: Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3. Nat Genet 12:390-397, 1996)). Sin embargo, los ratones que carecen de FGF9 tienen estructuras que se derivan de cartílago normales, pero en cambio muestran inversión de sexo XY e hipoplasia pulmonar {Colvin JS, Green RP, Schmahl J, Capel B, Ornitz DM: Male-to-female sex reversal in mice lacking fibroblast growth factor 9. Cell 104:875-889, 200; Colvin JS, White AC, Pratt SJ, Ornitz DM: Lung hypoplasia and neonatal death in Fgf9-null mice identify this gene as an essential regulator of lung mesenchyme. Development 128:2095-2106, 2001). Esto sugiere que otros FGF pueden compensar la pérdida de FGF-9 y restaurar el desarrollo normal de cartílago, pero lo recíproco no es cierto; otros receptores FGF no son capaces de reemplazar funcionalmente la pérdida de FGFR3 en el cartílago que se desarrolla. Las similitudes entre las células SW1353 y los condrocitos murinos primarios incluyen respuestas catabólicas inducidas mediante citoquinas inflamatorias que conducen a la destrucción de cartílago en la articulación reumatoide. Aunque esto no es en sí mismo una observación novedosa en esta línea celular, lo es la conexión a la represión del nivei/actividad de Sox9. Los inventores han descubierto que niveles muy bajos de IL-1b estimulan la expresión del potenciador Col2a1 de 48pb y pueden ofrecer una explicación para los resultados paradójicos encontrados en las articulaciones osteoartríticas, donde la expresión de IL-1 en el condrocito correlaciona con síntesis incrementada de colágeno tipo II. Así, el bajo nivel de expresión autocrina de IL-1 puede realmente impulsar una respuesta beneficiosa mediante los condrocitos para intentar reparación en la articulación que degenera. Aunque la represión de la expresión de Col2 mediante IL-1 ? se ha comunicado en una línea celular humana inmortalizada de condrocitos, el descubrimiento de la capacidad de SW1353 para responder específicamente a un intervalo dinámico de niveles de IL-1 es novedoso y particularmente útil para un modelo celular de condrocitos humanos. La respuesta funcional de las células SW1353 sugiere que pueden ser más representativas de los condrocitos que componen los cartílagos hialinos que de aquellos condrocitos que comprenden el hueso en desarrollo o reparación. Las funciones postnatales de Sox9 incluyen el mantenimiento de los condrocitos prehipertróficos en el hueso en crecimiento. Tales estudios han mostrado que la actividad Sox9 se controla tanto al nivel de expresión como mediante modificaciones postraducionales. En el condrocito prehipertrófico, la actividad Sox9 se estimula mediante proteínquinasa A (PKA) en respuesta a tratamiento con PTHrP (Huang W, Chung Ul, Kronenberg HM, de Crombrugghe B: The chondrogenic transcription factor Sox9 is a target of signaling by the parathyroid hormone-related peptide in the growth píate of endochondral bones. Proc Natl Acad Sci USA 98:160-165, 2001; Huang W, Zhou X, Lefebvre V, de Crombrugghe B: Phosphorylation of S0X9 by Cyclic AMP-Dependent Protein Kinase A Enhances S0X9's Ability To Transactivate a Col2a1 Chondrocyte-Specific Enhancer. Mol Cell Biol 20:4149-4158, 200014). Aunque los inventores no han visto un efecto de PTHrP sobre la actividad de Sox9 en células SW1353 transfectadas con el potenciador Col2a1 de 48pb, responden a análogos de A Pc con aproximadamente un incremento de 2 veces en la expresión del potenciador (LB y JS, observaciones no publicadas). Las células SW 353 también actúan de forma insensible a TGFD, BMPs-2, -4, y -6 (datos no mostrados), y esto es consistente con su fenotipo que es más similar a cartílago y menos similar a hueso. Por lo tanto, se considera que las células SW1353 son un modelo útil para estudiar las vías de señalización de Sox9, especialmente aquellas más relevantes para el cartílago. La señalización de FGF/ receptor de FGF tiene un efecto profundo en el crecimiento y la diferenciación de condrocitos in vitro. Sin embargo, determinar las interacciones fisiológicamente relevantes se hace enormemente complejo dado que hay cuatro receptores FGF y 22 ligandos en esta familia. En los condrocitos murinos y en las líneas celulares inmortalizadas modelo de condrocitos (ATDC5 and C3H10T1/2), el indicador Luc de 48pb se induce mediante factores pro-condrogénicos incluyendo FGF- 1 y FGF-2, pero no mediante FGF-7 el cual envía señales exclusivamente a través del receptor FGFRIIIb restringido a células epiteliales (Murakami S, Kan M, McKeehan WL, de Crombrugghe B: Up-regulation of the chondrogenic Sox9 gene by fíbroblast growth factors is mediated by the mitogen-activated protein kinase pathway. Proc Nati Acad Sci U S A 97:1113-1118, 2000). Este plásmido indicador incluye cinco repeticiones en tándem del potenciador Col2a1 de 48 pb y abarca la secuencia mínima, incluyendo los sitios de unión a Sox 9, suficiente para dirigir la expresión específica de condrocitos in vivo (Zhou G, Lefebvre V, Zhang Z, Eberspaecher H, de Crombrugghe B: Three high mobility group-like sequences within a 48-base pair enhancer of the Cot2a1 gene are required for cartilage-specifíc expresión in vivo. J Biol Chem 273:14989-14997, 1998). Aunque proteínas adicionales se unen a este fragmento potenciador, incluyendo LSox5 y Sox6 y ayudan a dirigir la expresión específica de condrocitos (Lefebvre V, Behrínger RR, de Crombrugghe B: L-Sox5, Sox6 and Sox9 control essential steps of the chondrocyte differentiation pathway. Osteoarthrítís Cartilage 9 Suppl A:S69-S75, 2001), la unión a Sox9 es necesaria para la actividad total (Zhou G, et al. J Biol Chem 273:14989-14997, 1998). El FGF-9 es un potente factor condrogénico y envía señales a través de FGFR3b y FGFR2c. Las mutaciones que dan como resultado un FGFR3 constitutivamente activo causan malformaciones esqueléticas incluyendo acondroplasia, hipocondroplasia y displasia tanatofórica y perturban el equilibrio entre crecimiento y diferenciación de condrocitos (Weksler NB, Lunstrum GP, Reíd ES, Horton WA: Differential effects of fibroblast growth factor (FGF) 9 and FGF2 on proliferation, differentiation and terminal differentiation of chondrocyte cells in vitro. Biochem J 342 Pt 3:677- 682, 1999). Adicionalmente, la sobreexpresión de FGF-9 está implicada en una enfermedad rara, condromatosis, caracterizada por la formación de nodulos cartilaginosos del sinovio. Estos estudios sugieren un papel central para FGF-9 en controlar la diferenciación de las células troncales en condrocitos. Los estudios previos mostraron que la actividad potenciadora de Col2 se correlaciona con la expresión de Sox9. Por ejemplo, FGF-2 estimula y las citoquinas reprimen la expresión de ARNm de Sox9 y la proteína en condrocitos primarios de ratones da resultados que apuntan a que Sox9 es un intermedio clave para la regulación de la expresión de Col2 y la expresión de agrecano.

Parte experimental 1. Construcción de expresión de Sox9 Fara generar la construcción de expresión en mamíferos de Sox-9 humana, se purificó el ARNm a partir de los cultivos de células inmortalizadas humanas similares a condrocitos T/C-28a4, mediante el kit RNeasy (Qiagen).

La región codificante completa de 1.5 Kb (base de datos GenBank, N° de acceso Z46629) se obtuvo por transcripción inversa (Advantage RT Kit de Clontech) seguida de la reacción de PCR (Expand High Fidelity PCR Kit de Roche) usando los cebadores sentido: 5'-CGGGATCCGCCACCATGAATCTCCTGGACCCCTTCATG-3' y antisentido 5'-CGGAATTCCTCAAGGTCGAGTGAGCTGT-3'. El producto de PCR se subclonó en pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) y se verificó la secuencia. 2. Cultivo celular Los reactivos se obtuvieron de Invitrogen, a menos que se indique otra cosa. Las células de condrosarcoma humano SW1353 (ATCC n° HTB-94) se acrecentaron en DMEM con SBF al 10%, 10 Dg/ml de gentamicina y se realizaron pases (2 veces por semana) usando tripsina-EDTA al 0.25%. 3. Experimentos de transfección Las células se sembraron a aproximadamente 106 células por matraz en un T-75 en 10 mi de medio de crecimiento o un equivalente basado en el área superficial del recipiente de cultivo, 24 horas antes de la transfección. Para cada transfección, se diluyeron 24 ni de Transit (PanVera) en 250 Di de OptiMEM y se añadieron 12 Dg de la construcción potenciadora del plásmido indicador Col2a1 (48 pb Col2a1). Después de 15-30 minutos de incubación, se retiró el medio de crecimiento de las células, y se diluyeron los complejos de reactivo de transfeccion - ADN hasta un volumen final de 10 mi con OptiMEM y se añadieron a las células. El medio de transfeccion se sustituyó con medio recién preparado después de 7 horas. 24 horas después de la transfeccion se trataron las células con medio sólo o con los factores indicados. Las células se recogieron 48 horas después de la transfeccion y se midió la actividad de la luciferasa usando LucLite y el lector de placas TopCount LSC (Packard). 4. Inmunotransferencia Los lisados celulares se prepararon a partir de los cultivos en monocapa en placas de 24 pocilios mediante la adición de tampón de muestra Tris Glicina (Invitrogen). Se cargaron volúmenes equivalentes de lisado sobre un gel en gradiente de poliacrilamida al 4-20% (Invitrogen) y se realizó la electroforesis. Los geles se transfirieron a nitrocelulosa (Invitrogen) usando un aparato semiseco (BioRad). Se usó el reactivo de bloqueo de inmunotransferencia (Roche) para bloquear la membrana. El anticuerpo para Sox9 se usó a 1 : 1000 en 50% de reactivo de bloqueo de inmunotransferencia, 50% de TBS-T. El anticuerpo secundario fue IgG anti-ratón de conejo conjugado con HRP (Pierce). Se usaron los reactivos de ECL de Pierce para revelar las bandas. Se obtuvo la imagen de quimioluminiscencia con un Lumi-Imager (Roche). 5. Análisis del ARN con Taqman Se preparó el ARN en placas de 75 cm usando los equipos de reactivos RNeasy con tratamiento con desoxirribonucleasa (Qiagen) según el protocolo del fabricante, excepto que se usó una segunda aplicación de desoxirribonucleasas. El ADNc se preparó a partir de 10-20 Di de ARN (1-4 ?g) usando cebadores hexámeros aleatorios y los reactivos de transcripción inversa de PE Biosystems. Las reacciones de Taqman usaron 8 DI de ADNc y ia PE Universal PCR Master Mix 2X (PE Biosystems), cebadores de PCR a 900 nM y la sonda FAM-TAMRA a 200nM. Se sometió a las reacciones (50 Di) a ciclos y se cuantificaron usando PE 5700 con condiciones estándar para 45 ciclos. Los datos se analizaron usando el conjunto de programas GeneAmp5700 (PE Biosystems), ajustando el nivel a un umbral al intervalo lineal para todas las muestras. El DCt se calcula restando el normalizador (GAPDH) de los correspondientes valores específicos para los genes. El D dCt se calcula restando el dCt tratado del DCt de control. La inducción proporcional se determina calculando 2aact. Los datos se presentan como % de aumento respecto a la muestra de control. 6. Sondas y cebadores Taqman Z46629 CACACAGCTCACTCGACCTTG cebador sentido Sox 9 (+1868) TTCGGTTA I I I I I AGGATCATCTCG cebador antisentido Sox 9 (-1943) sonda FRET: FAM-CCCACGAAGGGCGACGATGG-TAMRA Resultados 1. La actividad del potenciador Col2 es sensible a niveles crecientes de Sox9 Se analizó la actividad de la construcción potenciadora de 48 pb Col2a1 (48 pb Col2a1) en células SW1353 transfectadas. Las células SW1353 se transfectaron con una cantidad constante de indicador (0.25 Dg), con o sin cantidades crecientes de la construcción de expresión de Sox9 o vector vacío. La actividad basal de la luciferasa se detectó sólo con el indicador de 48 pb Col2a1 (Fig. 1A), en forma de construcción de control sin potenciador, que contenía el mismo promotor mínimo derivado de Col2 (p89). Fue esencialmente inactivo (<5% de actividad), lo que demostraba que las células SW1353 expresaban probablemente de forma normal los factores de transcripción que estimulan la actividad del potenciador. Para determinar el efecto del plásmido de expresión de Sox9, se realizó la cotransfección con cantidades crecientes del plásmido de expresión de Sox9 (20:1 , 10:1 , 2:1 y 1 :1 ). Los resultados demuestran que la actividad del potenciador se aumentó de modo dependiente a la dosis y que los niveles de Sox9 fueron limitantes. La inclusión de grandes cantidades del plásmido de expresión de Sox9 (1 :1 ) dio lugar a una ligera reducción de la actividad del indicador. La expresión de Sox9 se confirmó preparando inmunotransferencias de los extractos celulares preparados a partir de transfecciones duplicadas (Fig 1 B). A la concentración de ADN más elevada (0.25 Dg), apareció una banda inmunorreactiva, que migraba con el marcador de 66 kDa, en buena concordancia con el tamaño de 68 kDa predicho para Sox9 (carril 5). Se observó una proteína del mismo tamaño en las transfecciones con 2 y 0 veces menos de plásmido de expresión (carriles 4 y 3). Con exposiciones mayores, se detectaron débilmente proteínas inmunorreactivas anti-Sox9 con la transfección 20:1 y para aquellas células que no recibieron el plásmido de expresión de Sox9. 2. Las células SW1353 son sensibles a los factores de crecimiento de fibroblastos procondrogénicos. Se analizó la sensibilidad de las células SW1353 a estos factores de crecimiento de fibroblastos usando el ensayo de transfección del potenciador de 48 pb Col2a1. La adición de FGF-1 (200 ng/ml), FGF-2 (5.9 ng/ml) a los cultivos aumentó la expresión del potenciador de 48 pb entre 3 y 4 veces, mientras que no influyó la expresión de FGF-7 (200ng/ml) (Fig 2). Estos resultados demuestran la conservación de las vías de señalización de FGF-1 y FGF-2 en células SW1353 Para examinar el efecto de FGF-9 sobre la actividad del potenciador, se añadió FGF-9 a los cultivos de células SW1353 que se habían transfectado con el indicador Col2. El FGF-9 (200 ng/ml) estimuló la expresión del potenciador hasta el cuádruple (Fig 2). Este resultado sugiere que las células SW1353 expresan receptores funcionales de FGFR3b y/o FGFR2c y confirman además su utilidad en el estudio de la biología de los condrocitos. 3, Las citoguinas proinflamatorias reprimen la actividad del potenciador Col2 en SW1353 La capacidad de IL-1 0 y TNFD para reprimir la actividad del potenciador Col2 en condrocitos primarios murinos es dependiente de NFDB y coincide con una expresión reducida de Sox9. Las células SW1353 se transfectaron con el indicador de 48 pb Col2a1 y se trataron después con vehículo, TNFD (10 ng/ml) ó IL-1 ? (10 ng/ml) (Fig. 2A). Los resultados demuestran que las células SW1353 expresan receptores funcionales para TNF e IL-1 al mostrar que estos agentes pueden estimular la expresión de IL-8 (mostrado) y las metaloproteasas de matriz (no mostrado). La expresión de luciferasa dirigida por el potenciador se redujo aproximadamente un 60% por el tratamiento con TNFD y un 50% por el tratamiento con IL-10. La inhibición mediada por citoquinas de la expresión del potenciador se pudo mitigar parcialmente tratando conjuntamente las células con FGF- , FGF-2 ó FGF-9 (Fig 2B). Estos resultados son consistentes con el potencial de los factores de crecimiento procondrogénicos para disminuir o invertir el daño del cartílago en la inflamación articular de animales o humanos. 4. La actividad del ootenciador Col2 se correlaciona con la expresión relativa del ARNm de Sox9 en SW1353 Se determinó el efecto de los factores de crecimiento de condrocitos así como de citoquinas inhibidoras sobre la expresión de ARN de Sox9 en células SW 353 usando una PCR cuantitativa a tiempo real (TaqMan, PE Applied Biosystems). Las células se cultivaron y se trataron con factores de crecimiento o citoquinas como se ha descrito antes. Tras 48 horas, se recogieron las células y se preparó el ARN. Se validó un conjunto personalizado de sonda y cebador de Sox9 mediante un gráfico eficaz sobre varios registros y se cuantificó la expresión relativa de Sox9 respecto a la GAPDH. La expresión del ARNm de Sox9 se aumentó aproximadamente 1.5 veces por FGF-2 y el doble por FGF1 y FGF-9, mientras que TNFD y IL-1 ? disminuyeron la expresión de Sox9 en un 45% y un 60%, respectivamente (Fig. 3). Estos datos son consistentes con la expresión del potenciador Col2 en SW 353 estando reguladas, al menos en parte, al nivel de expresión de Sox9. 5. La expresión del indicador ootenciador Col2 se estimula por la presencia de concentraciones baias de IL-1n Se ha observado un aumento en la expresión de colágeno de tipo II (Col2) en humanos y perros durante el curso de la enfermedad osteoartrítica (Burton-Wurster N, Hui-Chou CS, Greisen HA, Lust G: Reduced deposition of col/agen in the degenerated articular cartilage of dogs with degenerative joint disease. Biochim Biophys Acta 718:74-84, 1982; Uusitalo H, Hiltunen A, Ahonen M, Gao TJ, Lefebvre V, Harley V, Kahari VM, Vuorio E: Accelerated up-regulation of L-Sox5, Sox6, y Sox9 by BMP-2 gene transfer during murine fracture healing. J Bone Miner Res 16:1837-1845, 2001). La expresión de Col2 parece ser superior en la enfermedad temprana a moderada y esto parece reflejar una respuesta de los condrocitos para intentar reparar la degeneración del cartílago. Fortuitamente, los condrocitos de pacientes de artrosis con enfermedad temprana a moderada también expresan niveles aumentados de IL-D y IL-1 D y éstos también disminuyen con la progresión de la enfermedad (Towle CA, Hung HH, Bonassar LJ, Treadwell BV, Mangham DC: Detection of interleukin-1 in the cartilage of patients with osteoarthritis: a possible autocrine/paracrine role in pathogenesis. Osteoarthrítis Cartilage 5:293-300, 1997). Por tanto, la expresión de IL-1 parece solaparse con la expresión de Col2. Aunque esto parece ser paradójico, se debería apreciar que los niveles de IL- encontrados en las articulados osteoartríticas proceden de los condrocitos y estos niveles se diferencian de los niveles muy elevados de citoquinas encontrados en la articulación reumatoide y procedentes principalmente de macrófagos. A diferencia que en las articulaciones reumatoides, los niveles de IL-1 son menores en la artrosis cuando la degradación del cartílago es mayor, lo que sugiere que la IL-1 no desempeña el mismo papel en la destrucción del cartílago en las dos enfermedades. Se determinó el efecto de dosis bajas de IL-1 ? en la expresión del potenciador de 48 pb Col2a1 en células SW1353 transfectadas. Sorprendentemente, niveles muy bajos de IL-1 ? (0.1 -1 pg/ml) estimularon la actividad del potenciador aproximadamente un en 150% (Fig. 4); aunque la magnitud de la inducción fue pequeña, esta respuesta se observó regularmente. La actividad del potenciador Col2 disminuyó según aumentaba la concentración de la IL-1 D por encima de 1 pg/ml, con una inhibición máxima que sucede entre 20 y 100 pg/mi. Se determinó el efecto de dosis crecientes de IL-1 ? en las dos respuestas. Como se muestra en la figura 4, no se detectó la inducción de IL-8 con concentraciones de IL-1 por debajo de 20 pg/ml, una concentración que causó una represión máxima del potenciador de 48 pb Col2a1. Por tanto, las células SW1353 parecen responder al intervalo dinámico de niveles de IL-1 ? con respuestas funcionales selectivas, haciéndolas potencial mente útiles en los modelos de artrosis y enfermedades reumatoides.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> PFIZER PRODUCT INC. <120> UN ENSAYO CELULAR HUMANO PARA DETERMINAR EL EFECTO DE COMPUESTO DE MUESTRA SOBRE LA EXPRESIÓN DEL POTENCIADOR COL2 <130> PC25156A <140> <141> <160> 4 <170> Patentln Ver. 2 .1 <210> 1 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Sonda sentido <400> 1 cgggatccgc caccatgaat ctcctggacc cctccatg 38 <210> 2 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Sonda antisentido <400> 2 cggaattcct caaggtcgag tgagctgt 28 <210> 3 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador sentido <400> 3 cacacagctc actcgacctt g 21 <210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador antisentido <400> 4 ttcggttatt tttaggatca tctcg 25

Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1- Un procedimiento para predecir el efecto de un compuesto de prueba sobre la actividad de condrocitos humanos que comprende: (a) transfectar las células del condrosarcoma humano SW1353 con un plásmido indicador que comprende sitios de unión al ADN de Sox9¡ (b) poner en contacto las células transfectadas con un compuesto de prueba durante un periodo desde aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas; y (c) determinar la actividad del indicador. 2. - Un procedimiento para detectar el efecto de un compuesto de prueba sobre la expresión de una construcción indicadora potenciadora Col2 que comprende: (a) transfectar las células del condrosarcoma humano SW1353 con un plásmido indicador que comprende sitios de unión al ADN de Sox9; (b) poner en contacto las células transfectadas con un compuesto de prueba durante un periodo desde aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas; y (c) determinar la actividad del indicador. 3. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado además porque el plásmido indicador comprende un promotor o regiones reguladoras de control que aparecen de forma natural y que tienen elementos de respuesta a Sox9. 4. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado además porque las células SW1353 se transfectan con el indicador de 48 pb Col2a1. 5. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el elemento de respuesta a Sox9 se selecciona de construcciones indicadoras con Col2, agrecano y Coh 1. 6. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque las construcciones indicadoras contienen elementos sintéticos de respuesta a Sox9. 7.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado además porque el compuesto de prueba se selecciona de! grupo que comprende moléculas pequeñas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y agentes biológicos o recombinantes, 8 - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado además porque el compuesto de prueba es un antagonista de la actividad de un represor de Sox9. 9.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado además porque el compuesto de prueba es un antagonista del receptor de citoquinas. 10.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado además porque el compuesto de prueba inhibe un factor de transcripción negativo, 11. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el factor de transcripción negativo es el NFDB. 12. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado además porque el compuesto de prueba inhibe una vía de señalización. 13. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el compuesto de prueba inhibe la vía de señalización de IKK. 14. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado además porque el compuesto de prueba es un agonista de una vía de señalización beneficiosa. 15. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 y 2, caracterizado además porque la vía de señalización beneficiosa es la vía de señalización de las MAPK. 16. - Una célula quimérica que comprende SW1353 transfectada con una construcción potenciadora Col2a1.