JP2006500915A - Col2エンハンサー発現に対するサンプル化合物の効果を測定するためのヒト細胞分析 - Google Patents

Col2エンハンサー発現に対するサンプル化合物の効果を測定するためのヒト細胞分析 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒト軟骨細胞活性(成長)/分化/細胞外マトリックス生成)に関し、加えて、これら活性の指標としてのSox9転写因子およびColtエンハンサーの効果に関する。本発明はまた、キメラ細胞、および、このような細胞を利用した分析に関し、Sox9およびColt発現/活性により測定された軟骨細胞活性に対するサンプル化合物の効果を予測するのに有用である。

Description

本発明は、ヒト軟骨細胞活性(成長)/分化/細胞外マトリックスの生成)に関し、および、このような活性の測定としてのSox9転写因子およびCol2エンハンサーの効果に関する。本発明はまた、キメラ細胞、および、このような細胞を利用した分析に関し、Sox9およびCol2発現/活性により測定された、軟骨細胞活性に対するサンプル化合物の効果を予測するのに有用である。
関節軟骨の進行性の破壊は、変形性関節症やリウマチ様関節炎に共通している。この組織は、関節の機能に必要な潤滑性や圧縮性を提供している。従って、関節軟骨が減少すると、痛みや罹患率が増加する。関節軟骨は、コラーゲンとプロテオグリカンが豊富な細胞外マトリックスと、それらを生産する軟骨細胞とで構成されている。従って、軟骨細胞は、正常な軟骨の機能や、それに影響を及ぼす関節炎性および変性性の病気を理解するのに重要である。単離された軟骨細胞は、細胞培養においてほとんど増殖能がなく、線維芽細胞様細胞に脱分化する傾向がある。研究用のヒト細胞源、特に病気ではない組織からのヒト細胞源は、明白な倫理上および実質上の理由で非常に不足している。従って、我々の軟骨細胞の生物学的知識のほとんどは、動物での研究またはそれらの培養組織および細胞から得られたものである。
重度の骨格異常に罹ったヒト被験体からの遺伝学的研究は、我々の軟骨細胞の生物学的な理解に役立つ。ヒトSox9遺伝子の1つの対立遺伝子の機能/発現を欠損させる突然変異が、彎曲肢異形成症として知られるまれな重度の骨格奇形症候群の原因と同定された(Wagner T,Wirth J,Meyer J,Zabel B,Held M,Zimmer J,Pasantes J,Bricarelli FD,Keutel J,Hustert E,.;Autosomal sex reversal and camptomelic dysplasia are caused by mutations in and around the SRY−related gene SOX9.Cell 79:1111〜1120,1994年;Wright E,Hargrave MR,Christiansen J,Cooper L,Kun J,Evans T,Gangadharan U,Greenfield A,Koopman P:The Sry−related gene Sox9 is expressed during chondrogenesis in mouse embryos.Nat Genet 9:15〜20,1995年)。
男性患者は、XY性転換を示し(Wagner T,Wirth J.Meyer J,Zabel B,Held M.Zimmer J,Pasantes J,Bricarelli FD,Keutel J,Hustert E.:Autosomal sex reversal and camptomelic dysplasia are caused by mutations in and around the SRY−retated gene SOX9.Cell 79:1111〜1120,1994年)、発生、男性性決定におけるSox9のその他の主要な役割が確認される。
Sox9遺伝子の対立遺伝子を1つだけ発現するように操作されたマウス(Sox9+/−)は、ヒト骨格症候群の表現型模写に近い状態を示し(Bi W,Huang W,Whitworth DJ,Deng JM,Zhang Z,Behringer RR,de Crombrugghe B:Haploinsufficiency of Sox9 results in defective cartilage primordia and premature skeletal mineralization.Proc Natl Acad Sci USA 98:6698〜6703.2001年)、全ての軟骨原基およびそれから生じる骨の形成不全を示す。その上、野生型細胞とSox9−/−ES細胞(β−ガラクトシダーゼを発現する)とのキメリズムにより得られたマウスにより、Sox9発現は、細胞が間充織凝集に取り込まれ、軟骨構造を形成するのに必須であることが示された(Bi W,Deng JM,Zhang Z,Behringer RR,de Crombrugghe B:Sox9 is required for cartilage formation.Nat Genet 22:85〜89,1999年)。
Sox9発現が損なわれた、または、高められた、遺伝学的に改変されたマウスはそれぞれ、XYまたはXX性転換を示し(Bishop CE,Whitworth DJ,Qin Y,Agoulnik AI,Agoulnik IU,Harrison WR,Behringer RR,Overbeek PA:A transgenic insertion upstream of sox9 is associated
with dominant XX sex reversal in the mouse.Nat Genet 26:490〜494,2000年:Vidal VP,Chaboissier MC,de Rooij DG,Schedl A:Sox9
induces testis development in XX transgenic mice.Nat Genet 28:216〜217,2001年)、マウス、同様にヒトにおける、性決定におけるSox9の役割が確認されている。
Sox9は、HMG−boxタンパク質ファミリーのメンバーである。このタンパク質ファミリーは、DNAの副溝に結合する点でまれであり、通常はタンパク質パートナーと協同して遺伝子発現を調節する(Kamachi Y,Uchikawa M,Kondoh H:Pairing SOX off:with partners in the regulation of embryonic development.Trends Genet 16:182〜187,2000年で総論されている)。
hLSox5およびSox6は、Sox9と協力して一部重複した役割を果たし、Col2a1やアグリカンなどの軟骨細胞標的遺伝子の発現を調節すると考えられる(Smits P,Li P,Mandel J.Zhang Z,Deng JM,Behringer RR,de Croumbrugghe B,Lefebvre V:The
transcription factors L−Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation.Dev
Cell 1:277〜290,2001年;Lefebvre V,Behringer RR,de Crombrugghe B:L−Sox5,Sox6 and Sox9 control essential steps of the chondrocyte differentiation pathway.Osteoarthritis Cartilage 9 Suppl A:S69〜S75,2001年)。
Sox9はまた、HMG様部位との相互作用により「副軟骨コラーゲン(minor cartilage collagen)」であるCol11a2を調節するが、これは、プロモーター中(Bridgewater LC,Lefebvre V,de Crombrugghe B:Chondrocyte−specific enhancer elements in the Col11a2 gene resemble the Col2a1 tissue−specific enhancer.J Biol Chem 273:14998〜15006,1998年)、および、イントロンエンハンサー内(Liu Y,Li H,Tanaka K.Tsumaki N,Yamada Y:Identification of an enhancer sequence within the first intron required for cartilage−specific transcription of the alpha2(XI)collagen gene.J Biol Chem 275:12712〜12718,2000年)の両方でなされる。
Sox9は、軟骨マトリックスタンパク質の発現を調節する多くのシグナル伝達経路を統合すると考えられる。このようなシグナルとしては、前肥大軟骨細胞で、軟骨表現型を正に調節するシグナル、例えばFGFやBMP−2、同様に副甲状線ホルモンが挙げられる(Murakami S,Kan M,McKeehan WL,de Crombrugghe B:Up−regulation of the chondrogenic Sox9 gene by fibroblast growth factors
is mediated by the mitogen−activated protein kinase pathway.Proc Natl Acad Sci USA 97:1113〜1118,2000年;Uusitalo H,Hiltunen A,Ahonen M.Gao TJ,Lefebvre V,Harley V,Kahari VM,Vuorio E:Accelerated up−regulation of L−Sox5,Sox6,and Sox9 by BMP−2 gene transfer during murine fracture healing.J Bone Miner Res 16:1837〜1845,2001年)。
また、サイトカインおよびレチノイン酸によるマトリックス発現の阻害は、Sox9阻害にも関連する(Murakami S,Lefebvre V,de Crombrugghe B:Potent inhibition of the master chondrogenic factor Sox9 gene by interleukin−1 and tumor necrosis factor−alpha.J Biol Chem 275:3687〜3692,2000年);Sekiya I,Koopman P,Tsuji K,Merlin S,Harley V,Yamada Y,Shinomiya K,Niguji A,Noda M:Transcriptional suppression of Sox9 expression in chondrocytes by retinoic acid.J Cell Biochem 81:71〜78,2001年)。
研究により、Sox9活性は、発現レベルと翻訳後修飾との両方によって調節されることが示された(Huang W,Zhou X,Lefebvre V,de Crombrugghe B:Phosphorylation of SOX9 by Cyclic AMP−Dependent Protein Kinase A Enhances SOX9’s Ability To Transactivate a Col2a1 Chondrocyte−Specific Enhancer.Mol Cell Biol 20:4149〜4158,2000年)。
Sox9は、「主要軟骨形成性転写因子(Master Chondrogenic Transcription Factor)」と名付けられている(Murakami
S,Lefebvre V,de Crombrugghe B:Potent inhibition of the master chondrogenic factor Sox9 gene by interleukin−1 and tumor necrosis factor−alpha.(J Biol Chem 275:3
687〜3692,2000年)。それゆえに、軟骨の破壊を食い止め、修復を誘導する方策を考察するには、軟骨の発達、組織の維持、および、病気の経過におけるSox9機能を理解することが重要である。
軟骨細胞発達、並びにII型コラーゲンおよびアグリカン遺伝子発現の調節の重要な決定因子として、Sox9転写因子が取り上げられている。Sox9転写因子は、軟骨細胞によるCol2の発現/活性において役割を果たすことがわかっている。
Sox9の存在レベルとCol2の発現/活性との相互関係を示すことができるモデルを構築することが有用であると思われる。また、様々な化合物を試験して、それらがSox9発現/活性に効果を有するかどうかを測定することができるモデルを開発することも有用であると思われる。
我々の理解のほとんどは、遺伝学的に改変されたマウスの研究と、インビトロでのマウス軟骨細胞の機能的分析に基づいている。軟骨細胞発達のいくつかの特性が模擬されているように開発されたマウス細胞系も有用であるが、様々な化合物のCol2発現に対する効果を測定するのに用いることができるヒト細胞系の利点が極めて有用であり得る。従って、ヒト軟骨細胞の機能および病気の経過におけるSox9の可能な役割をより良く特徴付けるには、マウスで同定されたSox9調節経路が保存されたヒト細胞系を同定することが望ましい。
軟骨細胞でのCol2エンハンサー活性を高め、コラーゲン再生を容易にすることが望ましい。様々な化合物をスクリーニングして、Col2発現に対するそれらの効果を測定することが有用であろう。あいにくにも、軟骨細胞は、インビトロでほとんど増殖能がなく、線維芽細胞様細胞に分化する傾向があるため、化合物を試験するのに軟骨細胞を用いることは不可能である。
従って、本発明の目的は、化合物をスクリーニングして、軟骨細胞においてCol2エンハンサー活性を改変するそれらの能力を測定することができる細胞系および分析方法を提供することである。
本発明は、ヒト軟骨細胞活性への試験化合物の効果を予測する方法に関する。本方法は、以下の工程:SW1353ヒト軟骨肉腫細胞をSox9DNA結合部位を含むレポータープラスミドでトランスフェクトすること;トランスフェクトされた細胞と、試験化合物とを、約2〜約24時間接触させること;および、レポーターの活性を測定すること、を含む。
本発明はまた、Col2発現/活性に対する様々な化合物の効果を模擬することができるキメラ細胞系を提供する。本細胞系は、Sox9DNAレポーター結合部位を含むプラスミドでトランスフェクトされたSW1353細胞を含む。
SW1353細胞系が、様々な化合物によるCol2発現の調節に反応する軟骨細胞の挙動をモデル化できることが分かった。SW1353細胞が、Sox9DNA結合部位を含むレポータープラスミドでトランスフェクトされている場合、この細胞は、導入された化合物が、Sox9レベルを変化させて間接的にCol2a発現/活性レベルを変化させることにおいて有効かどうかを測定するための分析として用いることができ、従って、軟骨細胞の分化に対する導入された化合物の効果を、程度の差はあるが予測するためのツー
ルとして作用し得る。
一過性トランスフェクション研究により、Sox9依存性Col2エンハンサーレポーターコンストラクトの基礎的な発現は、Sox9発現ベクターの共発現により高めることができることが示される。マウスSox9発現/活性の既知の調節因子のパネルをエンハンサー分析で試験した結果、リアルタイムPCRを用いた内因性Sox9遺伝子の発現と相互関係を示した。
SW1353細胞系は、初期のマウス軟骨細胞で観察されるCol2エンハンサー活性に対するサイトカインおよび成長因子の様々な効果(例えば、FGF−1およびFGF−2による刺激、ならびに、IL−1βおよびTNFαによる抑制)を再現する。これら効果と、Sox9のmRNAレベルの変化とは、相互関係を示す。本発明者らは、FGF−9が、Sox9発現とCol2エンハンサー活性を刺激することを発見した。加えて、Col2エンハンサー活性に対するIL−1β用量の効果を入念に試験したところ、実際には、極めて低いレベルのサイトカインではエンハンサー活性を刺激するが、IL−8発現を刺激するのに十分なより高い用量では阻害が起こることが示される。
この発見は、変形性関節症の自然な進行と関連を有する。軟骨細胞は、初期の変形性関節症に反応してCol2発現を増加させて修復を試み、IL−1の自己分泌発現と相互関係を示すため、これらの結果は、これら2つの因果関係を示す。本発明者らは、SW1353細胞が、Col2を刺激する低いレベルから、抑制して異化反応を誘導するより高いレベルまでの、IL−1レベルの動的な範囲に反応できることを示す。
添付図面において:
図1Aは、一過性にトランスフェクトされたSW1353細胞でのSox9共発現による、48bpのCol2a1Lucエンハンサーレポーターの基礎的な発現の刺激を示す。
図1Bは、Sox9発現プラスミドでトランスフェクトされたSW1353細胞のウェスタンブロットを示す。
図2は、48bpのCol2a1エンハンサーレポーターの活性化または抑制による、SW1353細胞の成長因子およびサイトカインへの反応を示す。
図3は、SW1353細胞におけるSox9発現に対する、FGFおよびサイトカインの逆の効果を示す。
図4は、SW1353の生物学的反応の動的な範囲を、IL−1β濃度の関数として示す。
本発明は、ヒト軟骨細胞の分化への試験化合物の効果を予測する方法に関する。本方法は、以下の工程:SW1353ヒト軟骨肉腫細胞を、Sox9DNA結合部位を含むレポータープラスミドでトランスフェクトすること;トランスフェクトされた細胞と、試験化合物とを、約2〜約24時間接触させること;および、レポーターの活性を測定すること、を含む。本発明はまた、Col2発現/活性に対する様々な化合物の効果を模擬することができるキメラ細胞系を提供する。この細胞系は、Sox9DNAレポーター結合部位を含むプラスミドでトランスフェクトされたSW1353細胞を含む。
本発明により、SW1353細胞が初期のマウス軟骨細胞で同定された様々なシグナル伝達経路をモデル化しており、それゆえに、マウス系で得られた実験結果をヒト系に置き換えるのに有用であることが示される。
FGF−1およびFGF−2は、Sox9mRNAレベルを増加させ、それに対応する、Sox9依存性の48bpのCol2a1エンハンサーコンストラクト活性を増加させることがわかった。これは、損傷した軟骨の正常な修復を試みた際の軟骨細胞の正常な反応による関節の修復、または、治療的介入のための方策を考察する場合の関節の修復のいずれかに関連を有する。例えば、突然変異IIA型コラーゲン遺伝子の発現により誘導された損傷を修復しようとしているマウスの関節において、Sox9発現が増加する(Salminen H,Vuorio E,Saamanen AM:Expression of Sox9 and type IIA procollagen during attempted repair of articular cartilage damage in a transgenic mouse model of osteoarthritis.Arthritis Rheum 44:947〜955,2001年)。
インサイチュ分析によれば、Sox9発現は、このモデルの修復組織に存在する増殖性の、および代謝活性の軟骨細胞のほとんどと一致することが示された。また、ウサギモデルにおいて、FGF−2に対する中和抗体により全層の軟骨欠損の修復がブロックされるが、その一方で、FGF−2を注入することにより修復が改善されることから、内因性FGF−2の発現も関節損傷の修復と相互関係を示す(Salminen H,Vuorio E,Saamanen AM:Expression of Sox9 and type IIA procollagen during attempted repair of articular cartilage damage in a transgenic mouse model of osteoarthritis.Arthritis Rheum 44:947〜955,2001年)。従って、Sox9は、前軟骨形成性の成長因子の投入と、修復に必要な軟骨細胞の遺伝子の発現との間の直接的な関係を提供する。
本発明は、ヒト軟骨細胞様細胞系において、FGF−9がSox9発現およびSox9活性を刺激することを開示する。これらの発見と一致して、ニワトリ軟骨細胞培養物の成長とマトリックス生成を刺激するという点において、FGF−9およびFGF−2が、全FGFファミリーメンバーのなかでも最も有効であることがわかった(Praul CA,Ford BC,Leach RM:Effect of fibroblast growth factors 1,2,4,5,6,7,8,9,and 10 on avian chondrocyte proliferation.J Cell Biochem 84:359〜366,2002年)。上述したように、FGF−9発現は、軟骨腫症患者の関節における良性の軟骨小結節の成長に関連する。これらの結果より、刺激またはFGF−9/FGFR/Sox−9シグナル伝達経路は、軟骨損傷の修復を刺激することにおいて価値を有することが示される。
FGF−9は、FGFR2cとFGFR3bの両方を介してシグナル伝達し(Santos−Ocampo S,Colvin JS,Chellaiah A,Ornitz
DM:Expression and biological activity of mouse fibroblast growth factor−9.J Biol Chem 271:1726〜1731,1996年)、FGFR3が欠失したマウスは、重度の軟骨形成不全を有する(Colvin JS,Bohne BA,Harding GW,McEwen DG,Ornitz DM:Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3.Nat Genet 12:390〜397,1996年))。
しかしながら、FGF9欠失マウスは、正常な軟骨が誘導した構造を有するが、その代わりにXY性転換と肺の形成不全を示す(Colvin JS,Green RP,Schmahl J,Capel B,Ornitz DM:Male−to−female
sex reversal in mice lacking fibroblast
growth factor 9.Cell 104:875〜889,200;Colvin JS,White AC,Pratt SJ,Ornitz DM:Lung
hypoplasia and neonatal death in Fgf9−null mice identify this gene as an essential regulator of lung mesenchyme.Development 128:2095〜2106,2001年)。
これは、その他のFGFによりFGF−9の欠失が補われ、正常な軟骨の発達を回復することができるが、その逆は真ではないことを示す;その他のFGF受容体は、発達中の軟骨でFGFR3の欠失を機能的に置き換えることは不可能である。
SW1353細胞と、初期のマウス軟骨細胞との類似性としては、異化反応が挙げられ、この異化反応は、リウマチ様の関節において、炎症性サイトカインにより誘導され、軟骨を破壊する。この細胞系における観察結果そのものは新しくはないが、Sox9レベル/活性の抑制への関連は新規である。本発明者らは、極めて低いレベルのIL−1bが、48bpのCol2a1エンハンサーの発現を刺激することを発見し、この発見により、変形性関節症の関節でみられる軟骨細胞のIL−1発現とII型コラーゲン合成の増加とが相互関係を示すという逆説的な結果を説明することができる。従って、IL−1の低いレベルの自己分泌発現は、実際に、軟骨細胞による有益な反応を促進させて、変質する関節を修復させることが可能である。IL−1βによるCol2発現の抑制は、不死化ヒト軟骨細胞系で報告されているが、IL−1レベルの動的な範囲に特異的に反応するSW1353の能力の発見は新規であり、特にヒト軟骨細胞モデルで有用である。
SW1353細胞の機能的な反応により、それらは、発達中または修復中の骨を含む軟骨細胞よりも、ヒアリン軟骨からなる軟骨細胞の典型であり得ることが示される。生後のSox9の機能としては、成長骨における前肥大軟骨細胞の維持が挙げられる。このような研究により、Sox9活性は、発現レベルと翻訳後修飾その両方により制御されることが示された。前肥大軟骨細胞において、Sox9活性は、PTHrP処理への反応においてタンパク質キナーゼA(PKA)により刺激される(Huang W,Chung UI,Kronenberg HM,de Crombrugghe B:The chondrogenic transcription factor Sox9 is a
target of signaling by the parathyroid hormone−related peptide in the growth plate of endochondral bones.Proc Natl Acad
Sci USA 98:160〜165,2001年;Huang W,Zhou X,Lefebvre V,de Crombrugghe B:Phosphorylation of SOX9 by Cyclic AMP−Dependent Protein Kinase A Enhances SOX9’s Ability To Transactivate a Col2a1 Chondrocyte−Specific Enhancer.Mol Cell Biol 20:4149〜4158,200014)。
本発明者らは、48bpのCol2a1エンハンサーでトランスフェクトされたSW1353細胞での、PTHrPのSox9活性に対する効果を未だ観察していないが、該細胞はcAMP類似体に反応し、エンハンサー発現が約2倍に増加する(LBおよびJS,観察結果は未公開)。またSW1353細胞は、TGFα、BMP−2、−4、および−6には反応を示さないと考えられ(データは示さず)、それらの表現型が骨より軟骨に近いことに一致する。従って、SW1353細胞は、Sox9シグナル伝達経路、特に軟骨に最も関連するSox9シグナル伝達経路を研究するのに有用なモデルと考えられる。
FGF/FGF受容体シグナル伝達は、インビトロでの軟骨細胞の成長および分化に対して甚大な効果を有する。しかしながら、このファミリーには、4種のFGF受容体と、22種のリガンドがあるため、生理学的に関連する相互作用の測定は極めて複雑である。マウス軟骨細胞と不死化軟骨細胞モデル細胞系(ATDC5、および、C3H10T1/2)において、48bpのLucレポーターは、FGF−1やFGF−2などの前軟骨形成性の因子によって誘導されるが、もっぱら上皮細胞に限定的なFGFRIIIb受容体を介してのみシグナル伝達するFGF−7では誘導されない(Murakami S,Kan M,McKeehan WL,de Crombrugghe B:Up−regulation of the chondrogenic Sox9 gene by
fibroblast growth factors is mediated by the mitogen−activated protein kinase pathway.Proc Natl Acad Sci USA 97:1113〜1118,2000年)。
このレポータープラスミドは、48bpのCol2a1エンハンサーの5個のタンデムリピートを含み、インビボでの軟骨細胞特異的な発現を指示するのに十分なSox9結合部位を含む最小限の配列を包含する(Zhou G,Lefebvre V,Zhang
Z,Eberspaecher H,de Crombrugghe B:Three
high mobility group−like sequences within a 48−base pair enhancer of the Col2a1
gene are required for cartilage−specific expression in vivo.J Biol Chem 273:14989〜14997,1998年)。
一方で、LSox5およびSox6などの追加のタンパク質がこのエンハンサーフラグメントに結合し、軟骨細胞特異的な発現の促進を補助し(Lefebvre V,Behringer RR,de Crombrugghe B:L−Sox5,Sox6 and Sox9 control essential steps of the chondrocyte differentiation pathway.Osteoarthritis Cartilage 9 Suppl A:S69〜S75,2001年)、Sox9結合が、完全な活性に必要である(Zhou G等J Biol Chem 273:14989〜14997,1998年)。
FGF−9は、有効な軟骨形成性の因子であり、FGFR3bとFGFR2cを介してシグナル伝達する。構成的に活性なFGFR3を生産する突然変異により、軟骨形成不全、低軟骨形成症、および、致死性骨異形成などの骨格奇形が引き起こされ、軟骨細胞成長と分化とのバランスが壊される(Weksler NB,Lunstrum GP,Reid ES,Horton WA:Differential effects of fibroblast growth factor(FGF)9 and FGF2 on proliferation,differentiation and terminal differentiation of chondrocytic cells in vitro.Biochem J 342 Pt3:677〜682,1999年)。
その上、FGF−9の過剰発現は、滑膜における軟骨小結節の形成を特徴とするまれな病気、軟骨腫症に関係する。これらの研究により、幹細胞の軟骨細胞への分化の制御におけるFGF−9の中心的な役割が示される。
これまでの研究により、Col2エンハンサー活性は、Sox9発現と相互関係を示す
ことが示された。例えば、初期のマウス軟骨細胞において、FGF−2は、Sox9mRNAおよびタンパク質発現を刺激し、サイトカインは、それらを抑制することから、Sox9が、Col2発現およびアグリカン発現の調節における主要な媒体であることが示される。
1.Sox9発現コンストラクト
ヒトSox−9哺乳動物発現コンストラクトを作製するために、不死化ヒト軟骨細胞様細胞T/C−28a4の培養物からのmRNAをRNeasyキット(キアゲン)で精製した。全体で1.5Kbのコード領域(GenBankデータベース,寄託番号Z46629)は、逆転写(クロンテックのアドバンテージRTキット)、続いて以下のプライマーを用いてPCR反応(ロシュのExpand High Fidelity PCRキット)を行って得られた:センス5’−CGGGATCCGCCACCATGAATCTCCTGGACCCCTTCATG−3’、および、アンチセンス5’−CGGAATTCCTCAAGGTCGAGTGAGCTGT−3’。PCR産物をpcDNA3.1(+)(インビトロジェン)にサブクローニングし、配列を確認した。
2.細胞培養
試薬は、特に他の規定がない限り、インビトロジェンから購入した。SW1353ヒト軟骨肉腫細胞(ATCC#HTB−94)を、10%FBS、10μg/mlゲンタマイシンを含むDMEMで培養し、0.25%トリプシン−EDTAを用いて継代培養した(1週間に2回)。
3.トランスフェクション実験
トランスフェクションの24時間前に、培養容器の表面面積に応じて10mlの成長培地またはそれと同等物の中で、1フラスコあたり〜106個の細胞で、T−75に細胞をプレーティングした。各トランスフェクションのために、24μlのTransIt(パンベラ(PanVera))をOptiMEM(250μl)に希釈し、12μgのレポータープラスミドCol2a1エンハンサーコンストラクト(48bpのCol2a1)を加えた。15〜30分間インキュベートした後、成長培地を細胞から除去し、DNA−トランスフェクション試薬の複合液をOptiMEMで最終体積10mlに希釈し、細胞に加えた。7時間後、トランスフェクション培地を新しい培地で交換した。トランスフェクトして24時間後、細胞を、培地単独または指定された因子で処理した。トランスフェクトして48時間後、細胞を回収し、LucLiteとTopCount LSCプレートリーダー(パッカード)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
4.ウェスタンブロッティング
24ウェルの培養皿の単層培養から、トリスグリシンサンプル緩衝液(インビトロジェン)を添加することによって細胞溶解物を調製した。4〜20%ポリアクリルアミド勾配ゲル(インビトロジェン)に等量の溶解物をローディングし、電気泳動した。半乾式装置(バイオ・ラッド)を用いてゲルをニトロセルロース(インビトロジェン)にトランスファーした。ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いてメンブレンをブロックした。Sox9抗体を、50%ウェスタンブロッキング試薬50%TBS−Tで1:1000にして用いた。二次抗体は、HRP(ピアス)に結合させたウサギ抗マウスIgGであった。ピアス社製のECL試薬を用いて、ブロットを展開させた。化学発光をルミイメージャー(Lumi−Imager)(ロシュ)で画像化した。
5.Taqman RNA分析
DNアーゼ処理を含むRNeasyキット(キアゲン)を製造元のプロトコールに従って用いて(ただしDNアーゼの第2アプリケーションを用いた)、75cmの培養皿から
RNAを調製した。ランダムヘキサマープライマーと、PEバイオシステムズの逆転写試薬を用いて、10〜20μlのRNA(1〜4μg)からcDNAを調製した。Taqman反応では、cDNA(8μl)、ならびに、2×PEユニバーサルPCRマスターミックス(PEバイオシステムズ)、900nMのPCRプライマー、および、200nMのFAM−TAMRAプローブが用いられた。PE5700を用いて45サイクルの標準的な条件で反応液(50μl)をサイクル処理し、定量した。GeneAmp5700ソフトウェアミックス(PEバイオシステムズ)を用いて、全サンプルにつき閾値を直線の範囲に合わせてデータを分析した。正規化群(GAPDH)を対応する遺伝子特異的な値から引くことにより、ΔCtを計算した。処理済みのΔCtをコントロールΔCtから引くことにより、ΔΔCtを計算した。2ΔΔCtを計算することによってフォールディング誘導を決定した。データは、コントロールサンプルに対する増加%として報告した。
6.Taqmanプライマーおよびプローブ
Z46629
CACACAGCTCACTCGACCTTG
Sox9(+1868)フォワードプライマー
TTCGGTTATTTTTAGGATCATCTCG
Sox9(−1943)リバースプライマー
FRETプローブ:FAM−CCCACGAAGGGCGACGATGG−TAMRA。
結果
1.Col2エンハンサー活性は、Sox9レベルの増加に反応する
我々は、トランスフェクトされたSW1353細胞における48bpのCol2a1エンハンサーコンストラクト(48bpのCol2a1)の活性を分析した。SW1353細胞を、一定量のレポーター(0.25μg)を用いて、増加量のSox9発現コンストラクトまたは空のベクターを用いて、または用いずにトランスフェクトした。
基本のルシフェラーゼ活性は、48bpのCol2a1レポーター単独(図1A)をエンハンサーを含まないコントロールコンストラクト(同じCol2由来の最小限プロモーター(p89)を含む)として用いて検出された。これは実質的に不活性であり(活性5%未満)、SW1353細胞は正常にエンハンサー活性を刺激する転写因子を発現するであろうことが示された。
Sox9発現プラスミドの効果を測定するために、増加量のSox9発現プラスミド(20:1、10:1、2:1、および、1:1)を用いてコトランスフェクションを行った。その結果、用量依存性でエンハンサー活性が増加したこと、および、Sox9レベルが限定的であることが示された。大量のSox9発現プラスミド(1:1)を含ませると、レポーター活性がわずかに減少した。
二連のトランスフェクションから調製した細胞抽出物からウェスタンブロットを作製したところ、Sox9発現が確認された(図1B)。最も高いDNA濃度(0.25μg)で、免疫反応性のバンドが出現し、このバンドは66kDのマーカーと共に移動しており、Sox9と予測された68kDのサイズとちょうど一致した(レーン5)。2〜10倍少ない発現プラスミドのトランスフェクションで、同じサイズのタンパク質が観察された(レーン4および3)。さらに長く露光させたところ、20:1のトランスフェクションで、Sox9発現プラスミドを導入していない細胞で、抗Sox9免疫反応性のタンパク質がわずかに検出された。
2.SW1353細胞は前軟骨形成性の線維芽細胞成長因子に反応する
我々は、48bpのCol2a1エンハンサーのトランスフェクション分析により、これら線維芽細胞成長因子に対するSW1353細胞の反応性を分析した。FGF−1(200ng/ml)、FGF−2(5.9ng/ml)を培養に添加することにより、48bpのエンハンサー発現が3〜4倍増加したが、一方で、FGF−7(200ng/ml)については、発現は効果がなかった(図2)。これら結果により、SW1353細胞において、FGF−1とFGF−2のシグナル伝達経路が保存されていることが示される。
エンハンサー活性に対するFGF−9の効果を試験するため、Col2レポーターでトランスフェクトされたSW1353細胞の培養にFGF−9を加えた。FGF−9(200ng/ml)は、エンハンサー発現を4倍まで刺激した(図2)。この結果により、SW1353細胞は、機能的FGFR3bおよび/またはFGFR2c受容体を発現することが示され、さらに、軟骨細胞の生物学の研究において、それらが有効であることが確認された。
3.SW1353において、前炎症性サイトカインはCol2エンハンサー活性を抑制する
初期のマウス軟骨細胞でIL−1βとTNFαがCol2エンハンサー活性を抑制する能力は、NFkB依存性であり、Sox9発現の減少と一致する。
SW1353細胞を48bpのCol2a1レポーターでトランスフェクトし、次に、ビヒクル、TNFα(10ng/ml)、または、IL−1β(10ng/ml)で処理した(図2A)。その結果によれば、これらの物質が、IL−8発現(示す)とマトリックスメタロプロテアーゼ(示さず)を刺激できることが示されたことから、SW1353細胞は、機能的なTNFとIL−1受容体を発現することがわかった。
エンハンサーにより生じたルシフェラーゼ発現は、TNFα処理では約60%、IL−1β処理では50%減少した。サイトカインが介在するエンハンサー発現の阻害は、FGF−1、FGF−2またはFGF−9のいずれかで細胞を共に処理することによって部分的に軽減することができた(図2B)。これらの結果は、前軟骨形成性の成長因子が、動物またはヒトの関節の炎症において軟骨損傷を減少または回復させる可能性と一致する。
4.Col2エンハンサー活性は、SW1353における関連するSox9mRNA発現と相互関係を示す
SW1353細胞における、Sox9 RNA発現に対する軟骨細胞成長因子および抑制性サイトカインの効果は、リアルタイム定量PCR(TaqMan,PEアプライドバイオシステムズ)を用いて測定された。細胞を培養し、上で説明した成長因子またはサイトカインで処理した。48時間後、細胞を回収し、RNAを調製した。注文生産したSox9プライマープローブセットを、いくつかの対数に対する効果プロットにより確認し、相対的Sox9発現を、GAPDHと比較して定量した。
Sox9mRNA発現は、FGF−2では約1.5倍、FGF1およびFGF−9では2倍増加したが、一方で、TNFαおよびIL−1βでは、Sox9発現は、それぞれ45%および60%減少した(図3)。これらのデータは、少なくとも部分的にSox9発現レベルで調節されたSW1353におけるCol2エンハンサー発現と一致する。
5.Col2エンハンサーレポーターの発現は、低いレベルのIL−1βの存在により刺激される
II型コラーゲン(Col2)発現の増加がヒトおよびイヌの両方で変形性関節症の経過中に観察されている(Burton−Wurster N,Hui−Chou CS,Greisen HA,Lust G:Reduced deposition of
collagen in the degenerated articular cartilage of dogs with degenerative joint disease.Biochim Biophys Acta 718:74〜84,1982年;Uusitalo H,Hiltunen A,Ahonen M,Gao TJ,Lefebvre V,Harley V,Kahari VM,Vuorio E:Accelerated up−regulation of L−Sox5,Sox6,and Sox9 by BMP−2 gene transfer during murine fracture healing.J Bone Miner Res 16:1837〜1845,2001年)。
Col2発現は、初期で最大になり、病気を緩和するようであり、これは、軟骨細胞による反応を反映させて、変質する軟骨の修復を試みているものと考えられる。これに一致して、初期に病気が緩和されたOA患者からの軟骨細胞も、増加したレベルのIL−βおよびIL−1βを発現し、これらも病気の進行と共に減少する(Towle CA,Hung HH,Bonassar LJ,Treadwell BV,Mangham DC:Detection of interleukin−1 in the cartilage of patients with osteoarthritis:a possible autocrine/paracrine role in pathogenesis.Osteoarthritis Cartilage 5:293〜300,1997年)。
従って、IL−1発現は、Col2発現と重複していると考えられる。これは逆説的のようにみえるが、変形性関節症の関節で観察されるIL−1レベルは軟骨細胞由来であって、これらのレベルは、主としてマクロファージ由来の、リウマチ様の関節で観察されるサイトカインの極めて高いレベルとは区別されることに留意すべきである。リウマチ様の関節とは異なり、OAにおいて、軟骨分解が最大である場合に、IL−1レベルは最も低く、これは、IL−1は、これら2つの病気で軟骨破壊において同じ役割を有さないことを示す。
トランスフェクトされたSW1353細胞での、48bpのCol2a1エンハンサー発現に対する低いIL−1β用量の効果が測定された。驚くべきことに、極めて低いレベルのIL−1β(0.1〜1pg/ml)が、エンハンサー活性を約150%刺激した(図4);しかしながら、誘導の規模はそれほど大きくなく、この反応は、常に観察された。Col2エンハンサー活性は、IL−1β濃度が1pg/mlを超えて増加する場合には減少し、濃度が20〜100pg/mlで最大の阻害が生じた。
2つの反応に対する増加するIL−1β用量の効果が測定された。図4で示すように、IL−1が20pg/ml未満の濃度の場合では、48bpのCol2a1エンハンサーの最大の抑制を引き起こす濃度だが、IL−8の誘導は検出されなかった。それゆえに、SW1353細胞は、選択的な機能的な反応を伴い、IL−1βレベルの動的な範囲に反応すると考えられ、変形性関節症とリウマチ様疾患との両方のモデルで有用とすることができる。
一過性にトランスフェクトされたSW1353細胞でのSox9共発現による、48bpのCol2a1Lucエンハンサーレポーターの基礎的な発現の刺激を示す。 Sox9発現プラスミドでトランスフェクトされたSW1353細胞のウェスタンブロットを示す。 48bpのCol2a1エンハンサーレポーターの活性化または抑制による、SW1353細胞の成長因子およびサイトカインへの反応を示す。 SW1353細胞におけるSox9発現に対する、FGFおよびサイトカインの逆の効果を示す。 SW1353の生物学的反応の動的な範囲を、IL−1β濃度の関数として示す。

Claims (15)

  1. 1a.ヒト軟骨細胞活性への試験化合物の効果を予測する方法であって、
    (a)SW1353ヒト軟骨肉腫細胞を、Sox9DNA結合部位を含むレポータープラスミドでトランスフェクトすること;
    (b)トランスフェクトされた細胞と、試験化合物とを、約2〜約24時間接触させること;および、
    (c)レポーターの活性を測定すること、
    を含む上記方法、および
    1b.Col2エンハンサーレポーターコンストラクトの発現への試験化合物の効果を検出する方法であって、
    (a)SW1353ヒト軟骨肉腫細胞を、Sox9DNA結合部位を含むレポータープラスミドでトランスフェクトすること;
    (b)トランスフェクトされた細胞と、試験化合物とを、約2〜約24時間接触させること;および、
    (c)レポーターの活性を測定すること、
    を含む、上記方法。
  2. レポータープラスミドは、Sox9反応要素を有する天然に存在するプロモーターまたは調節制御領域を含む、請求項1に記載の方法。
  3. SW1353細胞は、48bpのCol2a1レポーターでトランスフェクトされる、請求項1に記載の方法。
  4. Sox9反応要素は、Col2、アグリカン、および、Col11レポーターコンストラクトから選択される、請求項2に記載の方法。
  5. レポーターコンストラクトは、合成Sox9反応要素を含む、請求項4に記載の方法。
  6. 試験化合物は、低分子化合物、抗体、抗体フラグメント、および、生物学的物質または組換え物質からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
  7. 試験化合物は、Sox9リプレッサー活性のアンタゴニストである、請求項1に記載の方法。
  8. 試験化合物は、サイトカイン受容体のアンタゴニストである、請求項1に記載の方法。
  9. 試験化合物は、負の転写因子を阻害する、請求項1に記載の方法。
  10. 負の転写因子は、NFkBである、請求項9に記載の方法。
  11. 試験化合物は、シグナル伝達経路を阻害する、請求項1に記載の方法。
  12. 試験化合物は、IKKシグナル伝達経路を阻害する、請求項10に記載の方法。
  13. 試験化合物は、有益なシグナル伝達経路のアゴニストである、請求項1に記載の方法。
  14. 有益なシグナル伝達経路は、MAPK経路である、請求項1に記載の方法。
  15. Col2a1エンハンサーコンストラクトでトランスフェクトされたSW1353を含
    むキメラ細胞。
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