AT400370B - Elisa zur bestimmung des kc - genprodukts - Google Patents

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AT400370B
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Joerg Dr Berg
Alan Dr Cuthbertson
Margot Widerna
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Hafslund Nycomed Pharma
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors

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Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Die Erfindung betrifft einen   ELISA   (Enzyme-Linked   Immuno-Sorbent-Assay)   zur Bestimmung des KCGenprodukts. 



   Das KC-Genprodukt ist ein murines Polypeptid mit 72 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von etwa 7000 Dalton. Dieses Polypeptid ist ein Zytokin und wirkt als zellulärer Wachstumsfaktor. Bei Stimulation wird es von Zellen verschiedener Gewebe abgesondert, beispielsweise von   Fibroblasten   und Makrophagen. Im Knochenmark sind die   Fibroblasten   der Zelltyp, der das Bindegewebe enthält. Bindegewebszellen können dazu stimuliert werden, in vivo und in vitro, das KC-Gen-Produkt abzusondern. Dadurch wird die Produktion von Knochenmarkszellen erhöht. 



   KC-Genprodukt wird in in vitro Versuchen durch Protein-Dot-Blot oder Western-Blot oder durch einen biologischen Assay, der murine Knochenmark-Zellen   als "Responders" für   das KC-Genprodukt verwendet, bestimmt. 



   Protein-Dot Bot und Western-Bot sind nur eingeschränkt als qualitative Methoden geeignet, da die Empfindlichkeit dieser Tests im Bereich von mikro bis milli Gramm liegt. 



   Der biologische Assay ist sehr aufwendig, zur Auswertung müssen die   Knochenmarkzellkolonien   gezählt werden, die mit dem KG-Gen-Produkt reagiert haben. Diese Auswertung ist sehr fehleranfällig, da es von der Einschätzung der auswertenden Person abhängt, ob eine bestimmte Ansammlung von Zellen bereits als Zellkolonie gewertet wird oder nicht. 



   Es konnte nun ein   ELISA     (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent   Assay) gefunden werden, der eine objektive quantitative Auswertung erlaubt. 



   Gegenstand der Erfindung ist demnach ein   ELISA     (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay)   zur Bestimmung des KC-Genproduktes, der dadurch gekennzeichnet ist, dass auf einer ELISA-Platte eine gereinigte Antikörperlösung aufgetragen wird, anschliessend das das KC-Genprodukt enthaltende Material in Lösung oder Suspension aufgebracht wird, die so hergestellte Platte mit einem biotinylierten Antikörper gefolgt von Streptavidin-alkalische-Phosphatase-Konjugat und einem lichtabsorbierenden oder chemiluminiszierendem Substrat behandelt wird und einer Substratreaktion unterworfen wird, worauf die Auswertung mittels Lichtabsorptions- oder Chemiluminiszenzmessung erfolgt. 



   Für die Herstellung der Antikörper wird von der bekannten Aminosäuresequenz des KC-Genprodukts ein Peptid über die Aminosäuren 59 - 72 durch Festphasensynthese hergestellt. Das Peptid wird an ein Lysin-Gerüst, das aus 6-Lysin-Molekülen besteht, gekoppelt und so octamerisiert um ein multiples antigenes Peptid (MAP) zu erhalten. Dieses MAP wird in phosphatgepufferter   Kochsalzlösung   gelöst und mit komplettem Freund's Adjuvant zu einer Emulsion vermischt. Kanninchen werden vorerst mit 1 mg MAP subcutan immunisiert. Alle folgenden Immunisierungen erfolgen mit unvollständigem Freund's Adjuvant anstelle von vollständigen Freund's Adjuvant. Auf diese Weise werden die Tiere dreimal geimpft. 



   Anschliessend wird der Serum-Titer der Bindung an das MAP und ebenso an ein synthetisches   KC-Gen-   Produkt KC5-72 (biologisch aktive Form, Aminosäuren 5-72) durch   ELISA   bestimmt. 



   Um grössere Mengen an Serum für die Antikörperreinigung zu erhalten, werden die Tiere ausgeblutet und das Serum durch Zentrifugieren des koagulieren Blutes geerntet. Anschliessend werden die Antikörper durch Protein-A-Affinitätschromatographie aus dem Serum isoliert. Ein Teil der gereinigten Antikörper wird mit Biotin durch stochastische Koppelung an Lysinreste der Polypeptidketten der Antikörpermoleküle markiert. 



  Anschliessend werden die biotinylierten Antikörper erneut auf Bindung an KC 5-72 und zusätzlich auf die Bindung an Streptavidin getestet. 



   Für die Durchführung des   ELISA   werden die gereinigten Antikörper in   Boratsalzlösung   verdünnt und auf eine ELISA-Mikrotiterplatte aufgetragen. 



  Die ELISA-Mikrotiterplatten werden mit einem   Blockierungsreagenz,   (beispielsweise Boehringer Blockierungsreagenz Nr. 111224589) blockiert und anschliessend mit einer Mischung aus Phosphatpuffer, Polyoxyethylensorbitan (Tween 20, beispielsweise Sigma Nr. P1379) und Natriumazid (PBST) gewaschen. Das MAP, zu dem die Antikörper reagiert werden, KC 5 - 72 oder das Material, das das KC-Genprodukt enthält, wird verdünnt, beispielsweise mit Tris-gepuffeter   Salzlösung   und mit Rinderserumalbumin und Natriumazid versetzt. 



   Diese Lösung wird auf die ELISA-Mikrotiterplatte aufgetragen und bei erhöhter Temperatur (etwa 37 C) reagieren gelassen. Anschliessend wird die Mikrotiterplatte mit PBST gewaschen, die wie oben beschrieben, hergestellten biotinylierten Antikörper aufgebracht, und wiederum bei erhöhter Temperatur (etwa   370 C)   reagieren gelassen. Die Mikrotiterplatte wird erneut mit PBST gewaschen und   Streptavidin-alkalische-   Phosphatase-Konjugat zugefügt. Danach wird die an die Mikrotiterplatte gebundene Enzymaktivität bestimmt.

   Für das lichtabsorbierende Verfahren kann beispielsweise   p-Nitrophenylphosphat   als Substrat eingesetzt, für das Chemoluminiszenzverfahren kann beispielsweise   Dinatrium-3- (4-methoxyspiro [1, 2,-     Dioxetan-3, 2'-tricyclodecan]-4-yl) -phenylphosphat   (AMPPD) CAS [124951-96-8] verwendet werden. Die ent- 

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 sprechenden Substrate werden für eine bestimmte Zeitdauer inkubiert und der Grad der Farbentwicklung beziehungsweise die Menge der Emission von Lichtquanten durch Lichtabsorptions- oder Chemiluminiszensmessung bestimmt. 



  Beispiel 1 : 
 EMI2.1 
 
2Mikrotiterplatte aufgebracht (50   LI/Näpfchen,   über Nacht,   4. C).   Die Mikrotiterplatte wurde mit 250   LI   Boehringer Blockierungsreagenz Nr. 1112585 pro Näpfchen bei   37. C   30 min lang blockiert. Anschliessend wurden die Platten 4 mal mit Phsophat-gepufferter   Salzlösung,   angereichert mit 0, 05 % Tween 20 und 0, 02 % Natriumazid (PBST), gewaschen. 



   KC   5 - 72   wurde mit Tris-gepufferter Salziösung versetzt mit 0, 1 % Rinderserumalbumin und 0, 02 % Natriumazid verdünnt. Etwa 100 LI dieser Lösung wurden pro Näpfchen aufgebracht. Nach 2 Stunden bei   37. C   wurde die Platte 4 mal mit PBST und die biotinylierten Antikörper wurden 1, 5 Stunden bei   37. C   einwirken gelassen (2   ng/ml   in PBST versetzt mit 0, 1 % Rinderserumalbumin und 0, 02 % Natriumazid, 100   u. i/Näpfchen).    



  Die Platten wurden anschliessend wie oben beschrieben gewaschen und   Streptavidin- alkalische-Phosphata-   se-Konjugat wurde 1 h bei   37.   C zugefügt (100  l/Näpfchen, 1: 3000). Nach   4maligem   Waschen wurde pNitrophenylphosphat (1   mg/mi   in Diethanolamin-Puffer, pH 9, 2) zugefügt. 



  Nach 15 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Absorption bei der Wellenlänge von 405 mm gemessen. 



  Die Referenzmessung wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm durchgeführt. 



  Die Ergebnisse sind in Abb. 1 zusammengestellt. Die Nachweisgrenze betrug 250 pg/ml. 



  Beispiel 2 : 
C6-Zellen, die Knochenmarkstromazelltypen darstellen, wurden in Detergens-Puffer Iysiert und mit Trisgepufferter Salzlösung versetzt mit 0, 1 % Rinderserumalbumin und 0, 02 % Natriumazid verdünnt. Die ELISA-Platten wurden wie in Beispiel 1 beschrieben vorbereitet, der Assay analog durchgeführt. 



  Die Ergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt. 



  

Claims (3)

  1. Patentansprüche 1. ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) zur Bestimmung des KC-Genproduktes, dadurch ge- kennzeichnet, dass auf einer ELISA-Platte eine gereinigte Antikörperlösung aufgetragen wird, anschlie- ssend das das KC-Genprodukt enthaltende Material in Lösung oder Suspension aufgebracht wird, die so hergestellte Platte mit einem biotinylierten Antikörper gefolgt von Streptavidin-alkalische-Phosphatase- Konjugat und einem lichtabsorbierenden oder chemiluminiszierendem Substrat behandelt wird und einer Substratreaktion unterworfen wird, worauf die Auswertung mittels Lichtabsorptions- oder Chemilu- miniszenzmessung erfolgt.
  2. 2. ELISA zur Bestimmung von KC-Gen-Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung mittels Lichtabsorptionsmessung nach Behandlung mit p-Nitrophenylphosphat erfolgt.
  3. 3. ELISA zur Bestimmung von KC-Gen-Produkt nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Auswertung mittels Chemiluminszenzmessung nach Behandlung mit Dinatrium-3- (4- methoxyspiro [1, 2-Dioxetan-3, 2'-tricyclodecan]-4-yl) -phenylphosphat erfolgt.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0352713A1 (de) * 1988-07-27 1990-01-31 Tropix, Inc. Verfahren und Kompositionen zur Erzeugung verstärkter Chemilumineszenz von 1,2-Dioxetanen

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0352713A1 (de) * 1988-07-27 1990-01-31 Tropix, Inc. Verfahren und Kompositionen zur Erzeugung verstärkter Chemilumineszenz von 1,2-Dioxetanen

Non-Patent Citations (2)

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Title
C.A.108(5)1988:35975X; C.A.115(15)1991:156531C; *
C.A.117(17)1992:169057U; C.A.119(5)1993:47019D; *

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