DE112022000500T5 - Enzym-fluoreszenz-testsatz für komplementaktiviertes c1s sowie ein testverfahren und dessen anwendung - Google Patents

Enzym-fluoreszenz-testsatz für komplementaktiviertes c1s sowie ein testverfahren und dessen anwendung Download PDF

Info

Publication number
DE112022000500T5
DE112022000500T5 DE112022000500.9T DE112022000500T DE112022000500T5 DE 112022000500 T5 DE112022000500 T5 DE 112022000500T5 DE 112022000500 T DE112022000500 T DE 112022000500T DE 112022000500 T5 DE112022000500 T5 DE 112022000500T5
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
activated
recombinant
complement
fluorescence
substrate peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE112022000500.9T
Other languages
English (en)
Inventor
Sheng Xia
Jun Ye
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University
Original Assignee
Jiangsu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University filed Critical Jiangsu University
Publication of DE112022000500T5 publication Critical patent/DE112022000500T5/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21042—Complement subcomponent C1s (3.4.21.42)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung gehört zum Gebiet der Biotechnologie und bezieht sich insbesondere auf einem Enzym-Fluoreszenz-Testsatz für komplementaktiviertes C1s sowie ein Testverfahren und dessen Anwendung. Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, das Niveau der enzymatischen Aktivität von aktiviertem C1s in einer Probe nachzuweisen, basierend auf rekombinanten C1s-Antikörpem, die in immunmagnetische Kügelchen eingekapselt sind, spezifischem Einfangen von C1s in zu testenden C1s-Standards oder -Proben, magnetischer Trennung und, nach Beseitigung unspezifischer Bindungen, Zugabe von FRET fluorophor-markiertem aktiviertem C1s-Enzymsubstratpeptid, gefolgt vom Nachweis des Fluoreszenzsignals im Reaktionssystem mittels eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts; durch Nachweis von Änderung des Fluoreszenzsignals im Reaktionssystem wird die enzymatische Aktivität von aktiviertem C1s in einer Probe quantitativ nachgewiesen. Der Testansatz und das Verfahren in der vorliegenden Erfindung zeichnen sich durch hohe Empfindlichkeit, hohe Spezifität, geringe Fehlerquote, einfache und bequeme Handhabung aus. Es kann die enzymatische Aktivität von C1s in menschlichem oder tierischem Blut und Körperflüssigkeiten nachweisen und den klassischen Aktivierungsstatus von Komplement im Körper genau beurteilen.

Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung gehört zum Gebiet der Biotechnologie und bezieht sich insbesondere auf einem Enzym-Fluoreszenz-Testsatz für komplementaktiviertes C1s sowie ein Testverfahren und dessen Anwendung.
  • STAND DER TECHNIK
  • Komplement ist eine von den natürlichen Immunmolekülen, die aus einer Vielzahl von Komplementmolekülen und ihren regulatorischen Molekülen besteht, die eine wichtige Rolle bei der Immunantwort spielen. Unter normalen physiologischen Bedingungen sind Komplementmoleküle größtenteils inaktiv; wenn die Immunantwort aktiviert wird, werden Komplementmoleküle aktiviert und entfalten verschiedene biologische Aktivitäten. Der Komplementaktivierungsweg, der mit dem Komplementmolekül C1 (C1) beginnt, wird als klassischer Weg der Komplementaktivierung bezeichnet. C1 ist ein pentamerer makromolekularer Komplex (C1qC1r2C1s2), der aus den drei Untereinheiten C1q, C1r und C1s in einem Verhältnis von 1:2:2 in Gegenwart von Ca2+ besteht. Davon hat C1q sechs identische Immunoglobulin (Ig)-Bindungsstellen. Wenn zwei oder mehr dieser Bindungsstellen an die Komplementbindungsstelle des Fc-Segments von IgM oder IgG im Immunkomplex binden, wird die C1q-Konformation verändert und führt anschließend zur Aktivierung der Untereinheit C1r. Aktiviertes C1r führt wiederum zur Aktivierung von C1s. Aktiviertes C1s ist enzymatisch aktiv und spaltet Komplement C4 und C2, so dass die anschließend aktivierte Komplementkomponente eine Transmembranpore in der Zielzellmembran (d. h. ein Membran-Angriffskomplex) bilden kann. Die Aktivierung von C1s steht im Zusammenhang mit der Entstehung, Entwicklung und Prognose von Infektionen, Tumoren, Kälteagglutininkrankheit, thrombozytopenischer Purpura, systemischem Lupus erythematodes und anderen Krankheiten.
  • In den letzten Jahren wurden für Krankheiten wie die Kälteagglutininkrankheit (CAD), die autoimmune hämolytische Anämie mit warmen Antikörpern (WAIHA), das herpetiforme Pemphigoid (BP) und die Antikörper-vermittelte Transplantatabstoßung (AMR) erste therapeutische Wirkstoffe entwickelt, die auf C1s abzielen und in klinischen Studien getestet werden. C1s liegen unter normalen physiologischen Bedingungen in einem Zustand von Zymogen vor und können ihre biologisch aktiven Wirkungen nur entfalten, wenn das C1s-Enzym aktiviert wird und zu aktiviertem C1s wird. Daraus folgt, dass nur der genaue Nachweis von aktiviertem C1s in einer Probe die Aktivierung des klassischen Komplementwegs und den Funktionsstatus von aktiviertem C1s korrekt widerspiegeln kann. Daher ist der Nachweis von Veränderungen der C1s-Aktivität in vivo von großer Bedeutung für das Verständnis der Mechanismen der Krankheitsentwicklung, des Krankheitsstatus und der individualisierten Behandlung klinischer Erkrankungen. Zu den derzeitigen Nachweismethoden für C1s gehören der bidirektionale Diffusionstest, ELISA und Gelatinase-Profiling-Techniken, aber diese Methoden können nur den Gesamtproteingehalt von C1s in klinischen Blutproben nachweisen und nicht wirksam zwischen dem aktivierten und nicht aktivierten Status von C1s unterscheiden, d. h. sie können die enzymatische Aktivität von C1s nicht objektiv widerspiegeln. Es besteht daher die Notwendigkeit, einen empfindlichen und spezifischen Test für die enzymatische Aktivität von aktiviertem C1s zu entwickeln, um den klinischen Bedarf für den Nachweis von aktiviertem Cs1 in Proben zu decken.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • In Anbetracht des Stands der Technik stellt die vorliegende Erfindung ein Enzym-Fluoreszenz-Testsatz für komplementaktiviertes C1s und ein Verfahren zum Nachweis von komplementaktiviertem C1s bereit. Der bereitgestellte Testsatz ist zum Nachweis von komplementaktivierten C1s in menschlichem und tierischem Blut und Körperflüssigkeiten (Pleuraflüssigkeit, Aszites, Liquor usw.) vorgesehen, um den Komplementaktivierungsstatus in vivo zu beurteilen und den Bedarf an einem Nachweis der Komplementaktivität in Anwendungen wie der klinischen Krankheitsdiagnose, der individualisierten Behandlung und Prognosebeurteilung sowie der Erforschung von Krankheitsmechanismen zu decken.
  • Um den oben genannten Aufgaben zu lösen, bietet die vorliegende Erfindung die folgenden technischen Lösungen an:
    • Die vorliegende Erfindung stellt einen rekombinanten C1s-spezifischen Antikörper bereit, wobei die Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette des spezifischen Antikörpers in Seq_1 gezeigt ist und die Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kette des spezifischen Antikörpers in Seq_2 gezeigt ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein immunmagnetisches Kügelchen bereit, wobei das Kügelchen an den rekombinanten spezifischen C1s-Antikörper gekoppelt ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Enzym-Fluoreszenz-Testsatz für komplementaktiviertes C1s bereit, wobei der Testsatz die immunmagnetischen Kügelchen umfasst; der Testsatz umfasst ferner einen C1s-Standard, ein Substratpeptid, einen Phosphatpuffer und einen Tris-Puffer.
  • Ferner hat das Substratpeptid einen FRET (Fluoreszenzenergie-Co-Transfer) - Fluorophor-Markierung, dessen vollständigen Sequenz 2Abz-GYLGRSYKVG-Lys(Dnp)D-OH markiert ist.
  • Das Substratpeptid hat Abz (fluoreszierende Gruppe R) am N-Ende und Dnp (fluoreszenzlöschende Gruppe Q) am C-Ende.
  • Der C1s-Standard ist ein menschlicher oder rekombinanter C1s-Standard.
  • Der Phosphatpuffer (PBS, pH 7,4) umfasst die folgenden Komponenten: 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na2HPO4, 0,002 M KH2PO4.
  • Der Tris-Puffer umfasst die folgenden Komponenten: 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,2% (Gewicht /Volumen) Polyethylenglykol 8000.
  • Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Enzym-Fluoreszenz-Testverfahren für komplementaktiviertes C1s bereit, wobei das Testverfahren die folgenden Schritte umfasst:
    • (1) Herstellen von dem mit einem rekombinanten C1s-Antikörper gekoppelten immunmagnetischen Kügelchen;
    • (2) Mischen einer zu untersuchenden Probe oder eines Standards mit dem mit einem rekombinanten C1s-Antikörper gekoppelten immunmagnetischen Kügelchen, um resuspendiertes immunmagnetisches Kügelchen zu erhalten;
    • (3) Zugeben des resuspendierten immunmagnetischen Kügelchens zu dem Substratpeptid für die enzymatische Verdauungsreaktion;
    • (4) Nachweisen des Fluoreszenzsignals im Überstand mittels eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts;
    • (5) Erstellen einer Standardkurve durch lineare Anpassung unter Verwendung eines doppelt logarithmischen mathematischen Log-Log-Modells der kleinsten Quadrate mit der enzymatischen Aktivität von C1s als horizontaler Koordinate und der Fluoreszenzintensität als vertikaler Koordinate. Ausgehend von der enzymatischen Aktivität des Standards und des Fluoreszenzsignals wurde die enzymatische Aktivität von aktiviertem C1s in der zu untersuchenden Probe berechnet.
  • In Schritt (3) hat das Substratpeptid Abz am N-Ende und Dnp am C-Ende; die Sequenz des Substratpeptids ist 2Abz-YVGRSYRG-Lys(Dnp)-NH2.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung des obigen Substratpeptids bei der Herstellung eines Ansatzes zum Nachweis des Aktivierungsstatus von C1s bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines rekombinanten C1s-spezifischen Antikörpers bei der Herstellung eines Testsatzes zum Nachweis des Aktivierungszustands von C1s bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines immunmagnetischen Kügelchens bei der Herstellung eines Ansatzes zum Nachweis des Aktivierungszustands von C1s bereit.
  • Im Verglich mit dem Stand der Technik hat die vorliegende Erfindung den vorteilhaften Effekt wie folgt:
    • Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, das Niveau der enzymatischen Aktivität von aktiviertem C1s in einer Probe nachzuweisen, basierend auf rekombinanten C1s-Antikörpern, die in immunmagnetische Kügelchen eingekapselt sind, spezifischem Einfangen von C1s in zu testenden C1s-Standards oder -Proben, magnetischer Trennung und, nach Beseitigung unspezifischer Bindungen, Zugabe von fluorophor-markiertem aktiviertem C1s-Enzymsubstratpeptid, gefolgt vom Nachweis des Fluoreszenzsignals im Reaktionssystem mittels eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts; durch Nachweis von Änderung des Fluoreszenzsignals im Reaktionssystem wird die enzymatische Aktivität von aktiviertem C1s in einer Probe quantitativ nachgewiesen. Der Testansatz und das Verfahren in der vorliegenden Erfindung zeichnen sich durch hohe Empfindlichkeit, hohe Spezifität, geringe Fehlerquote, einfache und bequeme Handhabung aus. Es kann die enzymatische Aktivität von C1s in menschlichem oder tierischem Blut und Körperflüssigkeiten nachweisen und den klassischen Aktivierungsstatus von Komplement im Körper genau beurteilen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
    • 1 zeigt eine schematische Darstellung des Enzym-Fluoreszenz-Testsatzes für aktiviertes C1s-Enzym;
    • 2 zeigt eine SDS-PAGE-Elektrophorese eines rekombinanten C1s-Antikörpers;
    • 3 zeigt ein SEC-HPLC-Plot eines rekombinanten C1s-Antikörpers;
    • 4 zeigt eine schematische Darstellung des Spezifitätstests für rekombinante C1s-Antikörper;
    • 5 zeigt ein Vergleich der Bindungsspezifität des rekombinanten C1s-Antikörpers mit dem Nachweisantigen;
    • 6 zeigt eine Darstellung der Wirkung verschiedener Konzentrationen von C1s-Standards auf ein Substratpeptid3; dabei zeigt A die Kinetik der enzymatischen Reaktion der aktivierten C1s-Standards auf die Wirkung des Substratpeptids; B zeigt die Korrelation zwischen der Konzentration von aktiviertem C1s und der Reaktionsgeschwindigkeit;
    • 7 zeigt eine Darstellung von Standardkurven verschiedener enzymatischen Aktivität von C1s-Standard gegen Fluoreszenzintensitätswerte.
  • KONKRETE AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen und Ausführungsbeispielen näher beschrieben. Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen lediglich dazu, die technischen Lösungen der vorliegenden Erfindung deutlicher zu veranschaulichen, und können nicht dazu verwendet werden, den Schutzbereich der Erfindung zu begrenzen. Experimentelle Methoden, für die in den folgenden Ausführungsbeispielen keine spezifischen Bedingungen angegeben sind, werden entsprechend den im Fachgebiet üblichen Methoden und Bedingungen oder entsprechend der Fachbeschreibung ausgewählt. Die Reagenzien und Rohstoffe, die in den folgenden Ausführungsformen nicht als spezifische Bestandteile angegeben sind, sind im Handel erhältlich.
  • Die Serumprobe der vorliegenden Erfindung wurde vom Taizhou Volkskrankenhaus bezogen; das Interferenztest-A-Kit wurde von Hysenmecom Medical Electronics (Shanghai) Co. bezogen, das SDS-PAGE-Reduktionsgel und das Nicht-Reduktionsgel wurden von BBI Life Sciences Ltd. bezogen, das Kopplungsmittel war 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) von Diamond, das magnetische Kügelchen ist von Merck Pharmaceuticals (Jiangsu) Co, das C1r-Protein, das doppelsträngige C1r, das nicht aktivierte C1s-Protein und das doppelsträngige aktivierte C1s-Protein sind von Complement Technology, und MASP1 und MASP2 sind von Abnova.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen rekombinanten C1s-spezifischen Antikörper und ein mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) (Abz/Dnp-Farbstoffkombination) markiertes Substratpeptid, und darauf einen Enzym-Fluoreszenz-Testsatz für komplementaktiviertes C1s sowie ein Testverfahren und dessen Anwendung zur Verfügung. Der rekombinante Anti-C1s-Antikörper wird in magnetische Kügelchen eingekapselt und als immunmagnetische Kügelchen hergestellt; nach dem Waschen und magnetischen Trennen zur Entfernung des Überstands werden zu testende C1s-Standards oder Proben zugegeben; der an die immunmagnetischen Kügelchen gebundene Anti-C1s-Antikörper fängt C1s in der flüssigen Phase ein; nach dem Waschen und magnetischen Trennen zur Beseitigung der ungebundenen Komponenten wird das Substratpeptid zugegeben. Aktivierte C1s sind wichtige enzymatisch aktive Moleküle, die den klassischen Aktivierungsweg des Komplementsystems einleiten. Aktivierte C1s im Komplementsystem haben Serinprotease-Aktivität und spalten spezifisch die Komplementproteine C4 und C2. Die Spaltstellen der C4- und C2-Proteine wurden als zentrale Aminosäuresequenzstellen für die enzymatische Verdauung des Substratpeptids ausgewählt, bei den zentralen Aminosäuresequenzen sind an links und rechts mehrere Aminosäuren hinzugefügt wurden, um das grundlegende Substratpeptid für enzymatische Verdauung herzustellen. Anschließend werden Abz (Fluoreszenzanteil R) und Dnp (Fluoreszenzlöschanteil Q) an die linke und rechte Seite dieses Peptids angehängt, um das fluoreszierende Substratpeptid für enzymatische Verdauung herzustellen. Wenn das zu testende System keine aktiven C1s enthält, ist das Peptid intakt und der Abstand zwischen der das Peptid markierenden R-Gruppe und der Q-Gruppe beträgt zwischen 10 Å und 100 Å. Die Q-Gruppe löscht die von der R-Gruppe emittierte Fluoreszenz, so dass in dem zu testenden System kein Fluoreszenzsignal zu erkennen ist. Sind in dem zu testenden System aktive C1s vorhanden, wird das Substratpeptid von den aktivierten C1s gespalten, und die Q- und R-Gruppen des Substratpeptids befinden sich auf getrennten Enzymsegmenten, wobei die Q-Gruppe nicht mehr von der R-Gruppe gelöscht ist, sondern die Q-Gruppe ein erkennbares Fluoreszenzsignal emittiert, dessen Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Menge von aktiviertem C1s liegt.
  • Somit kann die aktivierte C1s-Enzymaktivität in der zu untersuchenden Probe durch den Nachweis von Änderungen der Fluoreszenzintensität quantifiziert werden. In Anbetracht der möglichen Interferenz anderer Proteine (z. B. MASP2) in Serum und Plasma mit dem Substratpeptid für Enzymverdauung werden bei der vorliegenden Erfindung rekombinante C1s-Antikörper-gekoppelte magnetische Kügelchens (immunmagnetische Kügelchens) verwendet, um C1s spezifisch einzufangen, und dann werden die andere ungebundene störende Substanzen magnetisch eluiert, und dann wird das Substratpeptid für Enzymverdauung von spezifisch aktiviertem C1s hinzugefügt, durch Erfassen der Änderung der Fluoreszenzintensität des Substratpeptids wird die Aktivität von C1s ermittelt.
  • 1 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens für das Enzym-Fluoreszenz-Testverfahren für aktiviertes C1s; wie in 1 zu sehen ist, werden C1s in dem zugegebenen C1s-Standard oder der zu testenden Probe spezifisch mit immunmagnetischen Kügelchen eingefangen, durch magnetische Trennung abgetrennt, und nach Entfernung des unspezifischen Konjugats wird das FRET-Fluorophor-markierte aktivierte C1s-Enzymsubstratpeptid zugegeben, die enzymatische Reaktion wird durchgeführt, und dann wird das Fluoreszenzsignal im Reaktionssystem durch ein Mikrotiterplatten-Lesegerät nachgewiesen.
  • Beispiel 1: Rekombinante Expression und Identifizierung von C1s-Antikörpern
  • Gemäß der Aminosäuresequenz der schweren Kette des rekombinanten C1s-Antikörpers, wie in Seq_1 gezeigt, nämlich:
    • EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISSG GSHTYYLDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCARLFTGYAMDYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKY GPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SLGK, die Aminosäuresequenz der leichten Kette des rekombinanten C1s-Antikörpers wie in Seq_2 SEQ ID NO: 2 beschrieben, d. h:
      • QIVLTQSPATLSLSPGERATMSCTASSSVSSSYLHWYQQKPGKAPKLWIYSTSNLA SGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCHQYYRLPPITFGQGTKLEIKRTVA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC. Taizhou Baiying Biotechnology Ltd. Wurde mit Rekombinante Expression des C1s-Antikörpers mit HEK293T-System beauftragt. Die rekombinanten C1s-Antikörper wurden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Molekularausschlusschromatographie-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (SEC-HPLC) analysiert und identifiziert. 2 zeigt die SDS-PAGE-Elektrophorese des rekombinanten C1s-Antikörpers; wie in 2 dargestellt, kann der rekombinante C1s-Antikörper auf dem reduzierenden SDS-PAGE-Gel mit zwei Banden bei 49 KD bzw. 23 KD Molekulargewicht nachgewiesen werden, während auf dem nicht reduzierenden Gel nur eine Bande bei 144 KD vorhanden ist. 3 ist ein SEC-HPLC-Diagramm des rekombinanten C1s-Antikörpers; wie in 3 gezeigt, zeigen die SEC-HPLC-Ergebnisse, dass die Reinheit des erhaltenen rekombinanten C1s-Antikörpers 95,5% beträgt.
  • Beispiel 2: Analyse der Antigenbindungsspezifität des rekombinanten C1s-Antikörpers
  • 4 ist eine schematische Darstellung des rekombinanten C1s-Antikörper-Spezifitätstests. In diesem Beispiel wird die Analyse der Antigenbindungsspezifität des rekombinanten C1s-Antikörpers durch ein indirektes ELISA-Verfahren gemäß der in 4 gezeigten schematischen Darstellung des rekombinanten C1s-Antikörper-Spezifitätstests durchgeführt. Dies umfasst die folgenden Schritte:
    • 200 µL (1 µg/ml) des Nachweisantigens (einkettiges, nicht aktiviertes C1s-Protein, doppelsträngiges, aktiviertes C1s-Protein oder C1r-Protein) werden in jede Vertiefung der ELISA-Platte gegeben, und die Platte wird vorsichtig geschüttelt, so dass der Antikörper den Boden der Plattenvertiefungen bedeckt. Über Nacht bei 4°C inkubieren; nach dreimaligem Waschen der Platte mit warmem PBS-Puffer werden 200 µL Blockierungslösung (10 mM PBS, 1% BSA, 0,1 Kasein) zur Blockierung zugegeben. Die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert; die Platte wurde fünfmal mit PBS-Puffer gewaschen; 100 µl rekombinanter C1s-Antikörper wurden zugegeben (die Anfangskonzentration der ersten Vertiefung betrug 10 µg/ml. 7 Vertiefungen wurden dann in einem 1/4-Gradienten nach unten verdünnt, um Wiederholungsvertiefungen einzurichten); die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert; die Flüssigkeit in der Platte wurde trocken geschüttelt und die Platte wurde fünfmal mit 200 µl warmem PBS-Puffer gewaschen; 100 µl verdünnter sekundärer Antikörper (Goat anti-Human-IgG-HRP) wurde in jede Vertiefung der Platte gegeben; die Platte wurde 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert; die Platte wurde trocken geschüttelt und 5 Mal mit 200 µl warmem PBS-Puffer gewaschen; 100 µl Farbentwicklungslösung (TMB) wurde in jede Vertiefung gegeben, und nach 10 Minuten Inkubation wurde 50 µl Terminierungslösung (0,25 M HCl) zugegeben, um die Farbentwicklungsreaktion zu beenden; der Wert der optischen Dichte wurde bei 450 nm an Mikrotiterplatten-Lesegerät abgelesen.
  • Der Bindungsstatus des rekombinanten C1s-Antikörpers an das einzelsträngignicht aktivierte C1s-Protein, das doppelsträngige aktivierte C1s-Protein und das C1r-Protein wurde getrennt analysiert. 5 zeigt einen Vergleich der Bindungsspezifität des rekombinanten C1s-Antikörpers mit dem Nachweisantigen; wie in 5 gezeigt, hat der rekombinante C1s-Antikörper eine starke Bindungsfähigkeit an das doppelsträngige aktivierte C1s-Protein, eine schwache Bindungsfähigkeit an das einzelsträngige nicht aktivierte C1s-Protein und keine Bindung an das C1r-Protein. Es ist zu erkennen, dass der rekombinante C1s-Antikörper eine bessere Antigenbindungsspezifität für das aktivierte C1s-Protein aufweist, wodurch aktiviertes C1s spezifisch erkannt und der Zweck des Nachweises von C1s für den Status der enzymatischen Aktivität erreicht werden kann.
  • Beispiel 3: Screening von Substratpeptiden
  • Aktivierte C1s im Komplementsystem haben Serinprotease-Aktivität und spalten spezifisch die Komplementproteine C4 und C2. Die Spaltstellen der C4- und C2-Proteine wurden als zentrale Aminosäuresequenzstellen für die enzymatische Verdauung des Substratpeptids ausgewählt, bei den zentralen Aminosäuresequenzen sind an links und rechts mehrere Aminosäuren hinzugefügt wurden, um das grundlegende Substratpeptid für enzymatische Verdauung herzustellen. Anschließend werden Abz (Fluoreszenzanteil R) und Dnp (Fluoreszenzlöschanteil Q) an die linke und rechte Seite dieses Peptids angehängt, um das fluoreszierende Substratpeptid für enzymatische Verdauung herzustellen. Die drei vorab entworfenen Substratpeptide wurden von Shanghai Ketai Biotechnology Ltd. synthetisiert. Die Sequenzen der drei Substratpeptide lauten wie folgt:
    • Substratpeptid 1: 2Abz-GLQRALEI-Lys(Dnp)-NH2;
    • Substratpeptid 2: 2Abz-SLGRKIQ-Lys(Dnp)-NH2;
    • Substratpeptid 3: 2Abz-GYLGRSYKVG-Lys(Dnp)D-OH;
  • Die Km- und Kcat-Werte der drei oben genannten Substratpeptide, die durch aktivierte C1s gespalten werden, wurden separat bestimmt und in drei Wiederholungen gemittelt, wobei die Bestimmungsschritte Folgendes umfassten:
    • (1) 40 µL des Substratpeptidstandards wurden in die erste Vertiefung gegeben; das gleiche Volumen der Substratpeptidlösung, die mit Tris-Puffer auf unterschiedliche Endkonzentrationen (245,7 µM, 122,9 µM, 61,4 µM, 30,7 µM, 7,7 µM, 0 µM) verdünnt wurde, wurde jeweils in die anderen Vertiefungen gegeben;
    • (2) 2,5 µL doppelsträngiges aktiviertes C1s (1 mg/mL) in jede Vertiefung geben und Tris-Puffer auf 100 µL ergänzen.
    • (3) Das Mikrotiterplatten-Lesegerät wurde bei 360/40 Anregungslichtwellen und 460/40 Emissionslichtwellen alle 5 Minuten für 2 Stunden nachgewiesen, und die Fluoreszenzsignaländerungen wurden aufgezeichnet.
    • (4) Graphpad Prism 5.0 wurde zur Datenverarbeitung verwendet, um die Vmax- und Km-Werte abzuleiten. Nach der Formel Kcat = Vmax/Molekulargewicht. Die Km- und Kcat-Werte wurden berechnet, und der höchste Kcat/Km-Wert wurde als Kandidaten-Substratpeptid angegeben. Tabelle 1 zeigt die Kcat/Km-Werte für die Wirkung von aktiviertem C1s auf verschiedene Substratpeptide.
    Tabelle 1: Vergleich der Kcat/Km-Werte für die Wirkung von aktiviertem C1s auf verschiedene Substratpeptide
    Substrat Kcat/Km
    Substratpeptid 1 1,67±0,89
    Substratpeptid 2 1,45±0,61
    Substratpeptid 3 15,38±2,69
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Substratpeptid 1 vs. 3: t=12,461, p<0,001; Substratpeptid 2 vs. 3: t=12,664, p<0,001. Substratpeptid 3 funktionierte am besten mit einem Kcat/Km-Wert von 15,38, so dass Substratpeptid 3 als Substratpeptid für das aktivierte C1s gewählt wurde.
  • Wenn das zu testende System keine aktiven C1s enthält, ist das Peptid intakt und der Abstand zwischen der das Peptid markierenden R-Gruppe und der Q-Gruppe beträgt zwischen 10 Å und 100 Å. Die Q-Gruppe löscht die von der R-Gruppe emittierte Fluoreszenz, so dass in dem zu testenden System kein Fluoreszenzsignal zu erkennen ist. Sind in dem zu testenden System aktive C1s vorhanden, wird das Substratpeptid von den aktivierten C1s gespalten, und die Q- und R-Gruppen des Substratpeptids befinden sich auf getrennten Enzymsegmenten, wobei die Q-Gruppe nicht mehr von der R-Gruppe gelöscht ist, sondern die Q-Gruppe ein erkennbares Fluoreszenzsignal emittiert, dessen Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Menge von aktiviertem C1s liegt. 6 ist ein Diagramm der Wirkung verschiedener Konzentrationen von C1s-Standards auf das Substratpeptid; in dem Diagramm ist A die Kinetik der enzymatischen Reaktion der Wirkung aktivierter C1s-Standards auf das Substratpeptid; B ist die Korrelation zwischen der Konzentration aktivierter C1s und der Reaktionsgeschwindigkeit; wie aus 6 ersichtlich, ändert sich die Fluoreszenzintensität, die durch die Wirkung aktivierter C1s auf das Substratpeptid erzeugt wird, kontinuierlich mit der Änderung der Zeit, und die verschiedenen Konzentrationen aktivierter C1s haben eine bessere Auflösung.
  • Beispiel 4: Bestimmung der enzymatischen Aktivität von C1s-Standards
  • Die vorliegende Erfindung befasst sich mit der enzymatischen Aktivität von aktiviertem C1s in den zu untersuchenden Proben. Daher muss die enzymatische Aktivität der für die Untersuchung verwendeten C1s-Standards bestimmt und später für die Erstellung von Standardkurven der enzymatischen C1s-Aktivität eingesetzt werden. Der Test für die enzymatische Aktivität des aktivierten C1s wurde mit der N-Carboxybenzyl-benzyloxy-löslicher Thiobenzylester/5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)-Farbentwicklungsmethode durchgeführt. Die spezifischen Testschritte umfassen:
    • (1) Materialien: ① Analytischer Puffer: 50 mM Tris, 250 mM NaCl, pH 8,0;
    • ② Substrat: N-Carboxybenzyl-benzyloxy-löslicher Thiobenzylester (ZKSBzl), gelöst in 10 mM Dimethylsulfoxid;
    • ③ 5,5'Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB), gelöst in 10 mM Dimethylsulfoxid;
    • (2) Bestimmung der C1s-Aktivitätseinheiten:
    • 1. C1s-Standard mit analytischem Puffer auf 0,2 µg/mL verdünnen;
    • 2. DNTB in einer Endkonzentration von 200 µM und das Substrat in einer Endkonzentration von 1000 µM in den Analysepuffer geben;
    • 3. 50 µL von 0,2 ng/µL C1s in die Platte geben;
    • 4. 50 µL von 1000 µM Substrat/200 DTNB-Mischung in die Vertiefungen geben, um die Reaktion zu starten;
    • 5. Ablesen des Absorptionswertes bei 405 nm für 5 Minuten mittels eineis Mikrotiterplatten-Lesegerätes;
    • (3) Berechnung der aktivierten C1s:
    Specific Activity ( p m o l / m i n / μ g )   = Adjusted  V m a x ∗ ( OD / min ) × well volume ( L ) × 10 12 pmol / mol ext .coeff** ( M − 1 cm − 1 ) × path corr .*** ( cm ) × amount of enzyme ( μ g )
    Figure DE112022000500T5_0001
    • *Adjusted for Substrate Blank; **Using the extinction coefficient 13260 M1cm1;
    • ***Using the path correction 0,320 cm.
    • (4) Nachweisergebnisse: Die enzymatische Aktivität von 1 µg/mL C1s betrugt 0,91 pmol/min/pg. Die enzymatische Aktivität von C1s wird in folgenden Untersuchungen definiert.
  • Beispiel 5: Methodische Etablierung und optimale Reaktionszeit für den Enzym-Fluoreszenz-Test von aktiviertem C1s
  • 1. Herstellung des Puffers: ① Binging Puffer: 0,1 M Morpholin-Ethansulfonsäure (MES, pH 5,0);
    • ② Washing Buffer: TBS mit 0,05% Tween20;
    • ③ Blocking Buffer: enthält 0,05M Tris, 1,0% BSA, 0,05% Tween20;
    • ④ Desired Buffer: Tris-Puffer mit 0,05% Tween20 und BSA;
    • ⑤ Tris-Puffer: 0,05M Tris, 0,15M NaCl, 0,2% (Gew. /v) Polyethylenglykol 8000.
  • 2. Herstellung von immunmagnetischem Kügelchen (rekombinante C1s-Antikörper-gekoppeltes magnetisches Kügelchen):
    • (1) Nehmen 10 mg magnetische Kügelchens (carboxylierte magnetische Kügelchens von Merck, Partikelgröße 1 µm) und waschen dreimal mit 1 mL Binging-Puffer, und Wirbelschwingen.
    • (2) 20 µg des rekombinanten C1s-Antikörpers aus Beispiel 1 pro 1 mg magnetische Kügelchens zugeben, Mischen und 15 min bei Raumtemperatur (25°C) Wirbeln.
    • (3) 50 µg Kopplungsmittel pro 1 mg magnetische Kügelchens zugeben, Mischen und 1 h lang bei Raumtemperatur Wirbeln.
    • (4) 1 mL Binging-Puffer zugeben und 3 h bei Raumtemperatur Wirbeln.
    • (5) 4 Mal Waschen mit 0,5 ml Washing Buffer.
    • (6) Resuspendieren der magnetischen Kügelchens mit 1 mL Desired Buffer, um rekombinante C1s-Antikörper-gekoppelte magnetische Kügelchens in einer Konzentration von 5 mg/mL zu erhalten; Lagern bei 4°C.
  • 3 Nachweisen von aktiviertem C1s:
    • (1) 60 µL rekombinante C1s-Antikörper-gekoppelte magnetische Kügelchens nehmen und umrühren, den Überstand durch magnetische Trennung entfernen, 200 µL PBS-Puffer hinzufügen und mischen, den Überstand erneut durch magnetische Trennung entfernen, 2 Mal Waschen.
    • (2) 10 µL der zu testenden Probe oder verschiedene Konzentrationen des aktivierten C1s-Standards (verdünnt auf 100 µL) werden durch PBS-Puffer mit rekombinanten C1s-Antikörper-gekoppelten magnetischen Kügelchens gemischt, und 10 min bei Raumtemperatur vertikal gemischt. Dann Verwerfen des Überstands. Auf der Grundlage der in Beispiel 4 bestimmten enzymatischen Aktivität der C1s-Standards wurden die enzymatische Aktivität der verschiedenen Konzentrationen der C1s-Standards wie in Tabelle 2 dargestellt umgerechnet.
    Tabelle 2: Enzymatische Aktivität der C1s-Standards in verschiedenen Konzentrationen (µg/mL)
    Konzentr ation 1 Konzentr ation 2 Konzentr ation 3 Konzentr ation 4 Konzentr ation 5 Konzentr ation 6 Konzentr ation 7
    µg/mL 200 100 50 25 12,5 6,25 0
    Pmol/mi n/µg 182 91 45,5 22,8 11,4 5,7 0
    • (3) Waschen 3 Mal mit 100 µL PBS-Puffer;
    • (4) Magnetische Kügelchens mit 90 µL Tris-Puffer resuspendieren;
    • (5) Zugaben von 10 µL des Substratpeptids 3 in einer Konzentration von 1 µg/mL;
    • (6) Der Nachweis erfolgte mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei einer Anregungslichtwelle von 360/40 und einer Emissionslichtwelle von 460/40, wobei die optimale Reaktionszeit von 1 h als Nachweispunkt angegeben wird. Das Fluoreszenzsignal wurde gemessen und aufgezeichnet. Die Standardkurve wurde durch das doppelt logarithmische mathematische Modell der kleinsten Quadrate mit der aktivierten C1s-Enzymaktivität als horizontale Koordinate und dem Fluoreszenzsignal als vertikale Koordinate erstellt.
  • 7 ist ein Diagramm der Standardkurven für C1s-standards mit verschiedener enzymatischer Aktivität gegen Fluoreszenzintensitätswerte. Wie in 7 gezeigt, beträgt das R2= 0,9985 für die Standardkurve bei einer Testzeit von 60 Minuten, und es wurde kein Hook-Effekt im Bereich der Dosis-Wirkungs-Kurve festgestellt.
  • Beispiel 6: Empfindlichkeitsuntersuchung
  • In diesem Beispiel wurden Empfindlichkeitsuntersuchungen für das Enzym-Fluoreszenz-Testverfahren für aktives C1s durchgeführt. In dieser Ausführungsform wurden Empfindlichkeitsexperimente für den Fluoreszenztest des aktiven C1s-Enzyms durchgeführt. Der Nullwert-Kalibrator (A) wurde 20 Mal gemäß den Schritten von Beispiel 5 wiederholt und der Mittelwert (M) und die Standardabweichung (SD) seines VA wurden berechnet. Der Mittelwert von VA plus das Zweifache der Standardabweichung, d. h. M+2SD, wurde vom Hintergrundwert abgezogen und dann zur Dosis-Wirkungs-Kurve addiert, um einen Konzentrationswert zu erhalten, der die Empfindlichkeit der Methode für die Bestimmung von aktiviertem C1s darstellt. Die minimale Nachweisgrenze für die enzymatische Aktivität von C1s wurde mit 1,64 pmol/min/µg berechnet.
  • Beispiel 7: Wiederfindungsuntersuchung
  • In diesem Beispiel wurden Wiederfindungsuntersuchungen für das Enzym-Fluoreszenz-Testverfahren für aktives C1s durchgeführt.
  • Drei Serumproben aus dem Taizhou Volkskrankenhaus wurden ausgewählt, wobei das Substratpeptid 3 als Reaktionssubstrat verwendet wurde. Die enzymatische Aktivität von aktiviertem C1 in den Serumproben wurde nach den Schritten in Beispiel 5 bestimmt; die Aktivität von aktiviertem C1 in den Serumproben wurde mit 33,49 pmol/min/pg, 33,82 pmol/min/ µg, 4,19 pmol/min/ µg bestimmt. Aktivierte C1 wurden den Plasmaproben mit 45,50 pmol/min/ µg, 45,50 pmol/min/ µg, 91 pmol/min/ µg (in einem Volumenverhältnis von 1:1) zugesetzt und erneut nach der Methode in Beispiel 5 getestet. Jede Probe wurde dreimal parallel gemessen, die Messwerte wurden aufgezeichnet und berechnet. Die Wiederfindung wurde nach der Formel Wiederfindung = (Gehalt nach Zugabe des Standards- Gehalt der Probe) / Menge des zugegebenen Standards × 100% berechnet.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Wiederfindungsraten des Testverfahrens 91,21%, 102,75%, 90,35% betragen. Es ist ersichtlich, dass die Wiederfindungsergebnisse im Bereich von 90% bis 110% lagen.
  • Beispiel 8: Präzisionsuntersuchung
  • Unter Bezugnahme auf das EP-5-Dokument des American Committee for Clinical Laboratory Standardization (NCCLS) wurden drei Proben mit hohem, mittlerem und niedrigem Wert aus den vom Taizhou Volkskrankenhaus gesammelten Serumproben ausgewählt, um die Präzision des Testverfahrens zu bewerten, und die experimentellen Daten sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 3: Intra- und Inter-Chargen-Präzisionstests des Enzym-Fluoreszenz-Testverfahren für das aktivierte C1s
    Intra-Chargen (n=10) Inter-Chargen (n=10)
    M SD CV (%) M SD CV (%)
    niedriger Wert 5,34 0,47 8,80 5,07 0,48 9,47
    mittlerer Wert 27,06 1,65 6,10 28,39 2,66 9,37
    Hoher Wert 77,80 5,20 6,68 75,17 6,37 8,47
  • Anmerkung: M - Mittelwert; SD - Standardabweichung; CV - Variationskoeffizient Wie aus Tabelle 3 ersichtlich, betrugen die Intra-Chargen-CV-Werte für die drei Proben 6,68%, 6,10% und 8,80% für die hohen, mittleren bzw. niedrigen Proben. Die CV-Werte zwischen den Chargen betrugen 8,47%, 9,37% bzw. 9,47%. Die Variationskoeffizienten innerhalb und zwischen den Chargen waren kleiner als 10,0%. Es ist ersichtlich, dass das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Testverfahren eine gute Präzision aufweist und die im EP-5-Dokument des NCCLS spezifizierten Anforderungen erfüllt.
  • Beispiel 9: Kreuzreaktivitätsuntersuchung
  • In diesem Beispiel wird die Spezifität des aktivierten C1s-Enzyms untersucht. Mögliche störende antigene Substanzen (Komplementanaloga) wie doppelkettiges C1r, MASP1 und MASP2 wurden im Serum getestet. Doppelkettiges C1r, MASP1 und MASP2 wurden mit PBS-Puffer zu 0,66 mg/mL, 5 mg/mL bzw. 5 mg/mL verdünnt; jedes Komplementanalogon wurde gemäß dem Verfahren in Beispiel 5 getestet. Berechnen der Kreuzreaktionsrate der einzelnen Substanzen. Kreuzreaktionsrate gemessener Wert/theoretischer Wert × 100%. Tabelle 4 zeigt die Kreuzreaktivitätstestdaten des Enzym-Fluoreszenz-Testverfahrens für das aktivierte C1s. Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, betrugen die Kreuzreaktivitätsraten 0,3%, 0,3% und 0,04% für doppelkettiges C1r, MASP1 bzw. MASP2. Die Kreuzreaktivitätsraten betrugen alle weniger als 0,5%. Es ist ersichtlich, dass die Kreuzreaktivität mit doppelkettigem C1r, MASP1 und MASP2 gering war und die aktivierten C1s in den Serumproben mit hoher Nachweisspezifität spezifisch identifiziert werden konnten. Tabelle 3 : Kreuzreaktivitätstest des Enzym-Fluoreszenz-Testverfahrens für das aktivierte C1s
    Störende Substanzen Gemessene Konzentration Praktische Konzentration Kreuzreaktivitätsrat (%)
    Doppelkettiges C1r 0,91 pmol/min/µg (1 µg /mL) 660 µg/mL 0,15
    MASP 1 1,82 pmol/min/µg (2 µg /mL) 5000 µg/mL 0,04
    MASP2 1,64 pmol/min/µg (1,8 µg /mL) 5000 µg/mL 0,04
  • Beispiel 10: Antistörungsuntersuchung
  • Bilirubin, Chylus und Hämoglobin in den klinischen Proben wurden als potenzielle Störfaktoren für den Versuch betrachtet. Mit Hilfe des Antistörungsuntersuchung-A-Kits wurden verschiedene Konzentrationen von Bilirubin (Endkonzentrationen von 0, 0,06, 0,14, 0,20 mg/ml), Chylus (Endkonzentrationen von 0, 600, 1400, 2000 FTU) und Hämoglobinlösung (Endkonzentrationen von 0, 1,5, 3,5, 5 mg/ml) zu den hohen, mittleren bzw. niedrigen Konzentrationen der Standards hinzugefügt. Die mittleren Konzentrationen der hohen, mittleren und niedrigen Werte der verschiedenen gemessenen Störsubstanzen wurden von den entsprechenden mittleren Konzentrationen ohne die Störsubstanzen subtrahiert, und die Differenz wurde als Prozentsatz der mittleren Konzentration der Kontrollprobe ohne die Störsubstanzen berechnet. Ein Prozentsatz von weniger als 5% bedeutet, dass die entsprechende Konzentration des Störers den Test nicht stört, während ein Prozentsatz von mehr als 5% bedeutet, dass sie den Test stört. Tabelle 5: Bilirubin-Antistörungsuntersuchung für das Enzym-Fluoreszenz-Testverfahren für das aktivierte C1s (n=4)
    0 mg/mL 0,06 mg/mL 0,14 mg/mL 0,20 mg/mL
    niedriger Wert (pmol/min/µg) 5,50 ± 0,32 5,85 ± 0,32 5,70 ± 0,25 5,61 ± 0,42
    mittlerer Wert (pmol/min/µg) 29,78 ± 2,82 31,04 ± 2,32 30,80 ± 1,31 26,93 ± 2,09
    Hoher Wert (pmol/min/µg) 56,59 ± 2,65 57,01 ± 4,59 55,50 ± 4,50 55,86 ±3,15
    Tabelle 6: Chylus-Antistörungsuntersuchung für das Enzym-Fluoreszenz-Testverfahren für das aktivierte C1s (n=4)
    0 FTU 600 FTU 1400 FTU 2000 FTU
    niedriger Wert (pmol/min/µg) 5,78 ± 0,57 5,87 ± 0,30 5,68 ± 0,68 5,53 ± 0,95
    mittlerer Wert (pmol/min/µg) 32,20 ± 2,22 33,09 ± 3,26 29,63 ± 1,58 33,94 ± 2,81
    Hoher Wert (pmol/min/µg) 56,57 ± 2,10 55,96 ± 2,30 54,20 ± 5,40 55,36 ± 5,51
    Anmerkung: FTU, Trübung von Formazin
    Tabelle 7: Hämoglobin- Antistörungsuntersuchung für das Enzym-Fluoreszenz-Testverfahren für das aktivierte C1s (n=4)
    0 mg/mL 1,5 mg/mL 3,5 mg/mL 5 mg/mL
    niedriger Wert (pmol/min/µg) 6,24 ± 0,43 6,00 ± 0,59 6,2 ± 0,56 6,37 ± 0,51
    mittlerer Wert (pmol/min/µg) 30,66 ± 2,90 29,47 ± 1,15 28,16 ± 2,68 28,23 ± 1,45
    Hoher Wert (pmol/min/µg) 58,02 ± 4,10 60,57 ± 3,66 56,23 ± 4,58 59,50 ±5,13
  • Wie aus den Tabellen 5, 6 und 7 hervorgeht, lagen die Untersuchungsergebnisse bei hohen Bilirubin-Konzentrationen (0,20 mg/mL), hoher Chylus (2000 FTU) und hohen Hämoglobin-Konzentrationen (4 mg/mL) innerhalb des zulässigen Bereichs der Messabweichung (die Ergebnisse basierten auf einem CV von weniger als 10%). Die Ergebnisse zeigten, dass das erfindungsgemäße Testverfahren von Bilirubin (0,20 mg/mL), Chylus (2000 FTU) und Hämoglobin (5 mg/mL) nicht gestört wurde. Die bei den oben genannten - Antistörungsuntersuchungen gemessenen Daten entsprachen alle den Anforderungen.
  • Spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurden oben im Detail beschrieben, aber sie sind nur als Beispiele gedacht und die Erfindung ist nicht auf die oben beschriebenen spezifischen Ausführungsformen beschränkt. Für den Fachmann fallen alle gleichwertigen Modifikationen und Substitutionen der vorliegenden Erfindung ebenfalls in den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung. Dementsprechend fallen gleichwertige Abwandlungen und Modifikationen, die ohne Abweichung von Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden, in den Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung.

Claims (7)

  1. Rekombinantes C1s-spezifischer Antikörper, dadurch gekennzeichnet, die Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette des spezifischen Antikörpers in Seq_1 gezeigt ist und die Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kette des spezifischen Antikörpers in Seq_2 S gezeigt ist.
  2. Immunmagnetisches Kügelchen, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunmagnetische Kügelchen an dem Rekombinanten C1s-spezifischen Antikörper nach Anspruch 1 gekoppelt sind.
  3. Enzym-Fluoreszenz-Testsatz für komplementaktiviertes C1s, dadurch gekennzeichnet, dass der Testsatz das immunmagnetische Kügelchen nach Anspruch 2 umfasst, wobei der Testsatz ferner einen C1s-Standard, ein Substratpeptid, einen Phosphatpuffer und einen Tris-Puffer umfasst.
  4. Testsatz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die vollständige Sequenz der FRET- Fluorophor-Markierung des Substratpeptids 2Abz-GYLGRSYKVG-Lys(Dnp)D-OH ist.
  5. Testsatz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Substratpeptid eine fluoreszierende Gruppe R, die an das N- Ende gebunden ist, und eine fluoreszenzlöschende Gruppe Q, die an das C- Ende gebunden ist, aufweist; wobei der C1s-Standard ein humaner oder rekombinanter C1s-Standard ist.
  6. Testsatz nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Phosphatpuffer die folgenden Komponenten umfasst: 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na2HPO4, 0,002 M KH2PO4; wobei der Tris-Puffer die folgenden Komponenten umfasst: 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,2% Polyethylenglykol 8000.
  7. Enzym-Fluoreszenz-Testverfahren für komplementaktiviertes C1s, dadurch gekennzeichnet, dass das Testverfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) Herstellen von dem mit einem rekombinanten C1s-Antikörper gekoppelten immunmagnetischen Kügelchen; (2) Mischen einer zu untersuchenden Probe oder eines Standards mit dem mit einem rekombinanten C1s-Antikörper gekoppelten immunmagnetischen Kügelchen, um resuspendiertes immunmagnetisches Kügelchen zu erhalten; (3) Zugeben des resuspendierten immunmagnetischen Kügelchens zu dem Substratpeptid für die enzymatische Verdauungsreaktion, wobei die Sequenz des Substratpeptids 2Abz-GYLGRSYKVG-Lys(Dnp)D-OH ist; (4) Nachweisen des Fluoreszenzsignals im Überstand mittels eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts; (5) Erstellen einer Standardkurve durch lineare Anpassung unter Verwendung eines doppelt logarithmischen mathematischen Log-Log-Modells der kleinsten Quadrate mit der enzymatischen Aktivität von C1s als horizontaler Koordinate und der Fluoreszenzintensität als vertikaler Koordinate, wobei ausgehend von der enzymatischen Aktivität des Standards und des Fluoreszenzsignals die enzymatische Aktivität von aktiviertem C1s in der zu untersuchenden Probe berechnet wird. 8. Verwendung des rekombinanten C1s-spezifischen Antikörpers nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Enzym-Fluoreszenz-Testsatz für komplementaktiviertes C1s. 9. Verwendung des immunmagnetischen Kügelchens nach Anspruch 2 zur Herstellung eines Testsatzes zum Nachweis des Aktivierungszustands von C1s. 10. Verwendung des Substratpeptids nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Testsatzes zum Nachweis des Aktivierungszustands von C1s.
DE112022000500.9T 2022-05-19 2022-08-26 Enzym-fluoreszenz-testsatz für komplementaktiviertes c1s sowie ein testverfahren und dessen anwendung Pending DE112022000500T5 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210563184.7 2022-05-19
CN202210563184.7A CN114874329A (zh) 2022-05-19 2022-05-19 一种补体活化C1s酶荧光检测试剂盒及检测方法与应用
PCT/CN2022/115117 WO2023221325A1 (zh) 2022-05-19 2022-08-26 一种补体活化C1s酶荧光检测试剂盒及检测方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE112022000500T5 true DE112022000500T5 (de) 2024-02-29

Family

ID=82678182

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE112022000500.9T Pending DE112022000500T5 (de) 2022-05-19 2022-08-26 Enzym-fluoreszenz-testsatz für komplementaktiviertes c1s sowie ein testverfahren und dessen anwendung

Country Status (4)

Country Link
CN (1) CN114874329A (de)
DE (1) DE112022000500T5 (de)
GB (1) GB2622924A (de)
WO (1) WO2023221325A1 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114874329A (zh) * 2022-05-19 2022-08-09 江苏大学 一种补体活化C1s酶荧光检测试剂盒及检测方法与应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4693970A (en) * 1985-06-21 1987-09-15 Becton, Dickinson And Company Immunoassay using complement
US20070254322A1 (en) * 2006-05-01 2007-11-01 Romaschin Alexander D Complement-based analyte assay
US20100291106A1 (en) * 2009-05-06 2010-11-18 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting complement protein c3b
EP3138581B1 (de) * 2011-03-17 2019-01-02 The University of Birmingham Umgelenkte immuntherapie
EP2914291B1 (de) * 2012-11-02 2022-02-23 Bioverativ USA Inc. Anti-komplement-c1s-antikörper und verwendungen davon
SG11201907583TA (en) * 2017-03-14 2019-09-27 Bioverativ Usa Inc Methods for treating complement-mediated diseases and disorders
KR20230047492A (ko) * 2020-08-18 2023-04-07 오메로스 코포레이션 보체 인자 d의 검출을 위한 단클론성 항체, 조성물 및 방법
CN114874329A (zh) * 2022-05-19 2022-08-09 江苏大学 一种补体活化C1s酶荧光检测试剂盒及检测方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114874329A (zh) 2022-08-09
GB202311504D0 (en) 2023-09-06
WO2023221325A1 (zh) 2023-11-23
GB2622924A (en) 2024-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69429192T3 (de) Ein verfahren zur bestimmung von kollagenfragmenten in körperflüssigkeiten, ein testkit und mittel zur durchführung des verfahrens, und seine verwendung zur feststellung von mit dem kollagenmetabolismus assoziierten störungen
DE2812943A1 (de) Verfahren und reagens zur bestimmung des biologisch aktiven heparins im plasma
DD202178A5 (de) Verfahren und reagens zur untersuchung von antigen-antikoerper-reaktionen
EP1318405B1 (de) Verfahren zur Diagnose von Sepsis unter Bestimmung löslicher Cytokeratinfragmente
DE69730479T2 (de) Marker und immunologisches Reagens für Dialyse verbundenen Amyloidosis, Diabetes Mellitus und Diabetes Mellitus-Komplikationen
DE112022000500T5 (de) Enzym-fluoreszenz-testsatz für komplementaktiviertes c1s sowie ein testverfahren und dessen anwendung
EP1318403B1 (de) Verfahren zur Diagnose von Sepsis unter Bestimmung von S100B
DE19920704C1 (de) Verwendung eines gegen Harn-Trypsin-Inhibitors gerichteten Antikörpers für die Diagnose des Ausbruchs von AIDS
DD251208A5 (de) Immunologisches verfahren zur erkennung maligner zellen mit metadatischer zellaktivitaet
EP1318404B1 (de) Verfahren zur Diagnose von Sepsis unter Bestimmung von CA 19-9
EP1318402B1 (de) Verfahren zur Diagnose von Sepsis unter Bestimmung von CA 125
EP0826965B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Faktor V-Mangelplasma und ein so erhaltenes Mangelplasma
DE69628878T2 (de) Methode zur Bestimmung von Cholinesterase und Methode zur Unterscheidung zwischen Leberzirrhose und Hepatitis
EP2839290B1 (de) Verfahren zur präsymptomatischen diagnostik von zöliakie und glutensensitivität
DE102009034119A1 (de) Verfahren, insbesondere Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), zum in vitro Nachweis von Amyloid beta Autoantikörpern, Mikrotiterplatte und Testkit
DE69021631T2 (de) Diagnostische Zusammenstellung zum Nachweis von rheumatischer Arthritis.
DE102020114278A1 (de) Bestimmung krankheitsspezifischer Protein-Aggregate in Stuhlproben
EP0431567B1 (de) Verfahren zum Nachweis eines kleinzelligen Bronchial-Karzinoms
EP1562046A1 (de) Diagnose von Sepsis durch selektive Bestimmung der Konzentration der Cu/Zn Superoxiddismutase (Cu/Zn SOD) in Patientenproben
DE60010118T2 (de) Assay für isomerisierte und/oder optisch invertierte proteine
EP0534444A1 (de) Verfahren zur Bestimmung von Fibrin
DE3834233A1 (de) Verfahren zur aktivitaetsbestimmung von transglutaminasen
EP1008852B1 (de) Verfahren zum spezifischen Nachweis von glykosilierten Proteinen
EP0335884B1 (de) Immunenzymatischer test mit detektion durch farbumschlag im sichtbaren spektralbereich
EP0947832A1 (de) Immunologisches Verfahren zur Bestimmung von PSA

Legal Events

Date Code Title Description
R012 Request for examination validly filed