CN103558395B - Smad3基因在检测上尿路上皮癌中的应用 - Google Patents

Smad3基因在检测上尿路上皮癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用，属于基因工程技术领域。所述的应用是指通过RT-PCR反应对尿路上皮组织样本中的SMAD3基因的mRNA表达量与正常尿路上皮组织中的SMAD3基因的mRNA表达量进行对比，当样本中SMAD3基因的mRNA表达量高于正常SMAD3基因的mRNA表达量时，该样本为上尿路上皮癌样本；也可以通过对样本尿路上皮组织进行免疫组化测定，当样本尿路上皮组织的染色指数≥5时，该样本尿路上皮组织中SMAD3高表达，该样本为上尿路上皮癌样本。本发明具有为UTUC患者的诊断提供了一种新的诊断性指标，并且SMAD3基因能够预测T2和T3患者生存差异的优点。

Description

SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用。
背景技术
成年人肾癌包括起源于肾实质和肾盂的恶性肿瘤。肾癌中最主要的类型是肾实质癌而肾盂癌相对罕见（大约占10%）。几乎所有的肾盂癌都是上尿路上皮癌(UTUC)，UTUC大约占病理诊断肾癌的8.4%，大约占所有尿路上皮癌的5%。UTUC是一种起源于输尿管口到肾盏的移行（尿路）上皮细胞的恶性肿瘤。人们对UTUC的认识不足，并且这些认识通常基于膀胱移行细胞癌，这是因为人们认为他们有共同的危险因素，如吸烟和使用含有乙酰对氨基苯酚类镇痛药。我们从Lughezzani等人的文献了解到：在过去的几年中，一些与UTUC进程相关的分子标志物如细胞增殖（EFGR）、新生血管形成（如HIF-1α）、细胞粘附（如钙粘附素和β-链蛋白）、细胞凋亡（如Bcl-2）和细胞周期控制（P53）等推动着UTUC的临床实践向前发展。但是多变量分析证明p53并不能作为独立的预后指标。虽然肿瘤的分期以及肿瘤的病理学分级仍被认为是最可信的临床结果预测指标。然而，其它一些肿瘤研究却表明：用分子标志物判断生存预后要比病理学分级更好。为了证明在预后生存方面分子标志物优于病理学分级，在这项研究中，我们并不是简单的选择性的测试几个基因序列，而是以全基因组mRNA表达谱为基础尽可能找出与预后有关的所有基因。
人们已经证明：在确定肿瘤特异性标志物、亚型和预测治疗结果方面，利用微阵列或第二代测序技术进行大规模的mRNA表达谱绘测的方法是有效的。这种方法使得同时对成千上万的基因乃至整个基因组扫描的系列研究成为可能，因此这种方法可以促进对肿瘤的全面理解并有利于高敏感性和高特异性的生物标志物的发现。与微阵列技术相比，基于序列的分析不产生mRNA杂交序列并且避免重复性,它可以在无限的动态范围中测量基因表达水平。
发明内容
本发明通过基于序列的分析,我们揭示了在UTUC患者中SMAD3的表达上调，并确定SMAD3的蛋白表达可以作为UTUC患者重要的并且独立的预后评价指标。虽然病理 TNM分期可以预测T1和T2或T1和T3生存差异,但是分子标记却能够预测T2和T3患者生存差异,这个不能通过TNM分期来预测。本发明的结果不仅描述了UTUC的分子特性，并且提供了UTUC的潜在的预后标志物；更重要的是,为功能与临床验证提供了一个丰富的案例。
本发明的目的在于公开了SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用。
上述技术方案所述的SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用，其中，SMAD3基因在上尿路上皮癌中表达上调。
上述技术方案所述的SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用，包括下述步骤：
(1)、取样本尿路上皮组织，提取尿路上皮组织的RNA；
(2)、对样本的尿路上皮组织RNA进行逆转录，得到样本尿路上皮组织的cDNA；
(3)、以步骤(2)获得的尿路上皮组织cDNA为模版，以引物对P为引物，进行RT-PCR反应，将样本尿路上皮组织中的SMAD3基因的mRNA表达量与正常尿路上皮组织中的SMAD3基因的mRNA表达量进行对比，当样本中SMAD3基因的mRNA表达量高于正常SMAD3基因的mRNA表达量时，该样本为上尿路上皮癌样本；其中引物对P为：
SMAD3上游引物：5’-CCCCACCACTCCAGCAGACCTT-3’，
SMAD3下游引物：5’-TGAACACGCACCTCCCAATCAGTA-3’。
上述技术方案所述的SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用，其中，所述RT-PCR的条件为：50℃2分钟、95℃2分钟，1个循环；95℃15秒、55℃30秒、72℃40秒，40个循环。
上述技术方案所述的SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用，其中，所述的应用是通过对样本尿路上皮组织进行免疫组化测定，当样本尿路上皮组织的染色指数≥5，该样本尿路上皮组织中SMAD3高表达，该样本为上尿路上皮癌样本。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过实验揭示了SMAD3基因在上尿路上皮癌中高表达，为UTUC患者的诊断提供了一种新的诊断性指标。
2、本发明的SMAD3基因能够预测T2和T3患者生存差异，而TNM分期却不能用来预测T2和T3生存差异。
附图说明：
1、图1为SMAD3的mRNA的表达在UTUC患者的肿瘤组织和正常对照组织之间的对比结果图。
2、图2为运用免疫组化染色显示SMAD3在肿瘤组织中和正常组织中的不同显色效果图。
3、图3为SMAD3的高表达与病人的预后的关系，其中Low为SMAD3低表达，High为SMAD3高表达。
4、图4为SMAD3作为预后指标分子标记物与TNM分期的对比试验结果图，其中Low为SMAD3低表达，High为SMAD3高表达。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用作进一步的说明。
一、样本与试剂：
(一)、样本：
1、所有患者在术前都未经放疗或化疗；2、患者都是由中山肿瘤中心进行病理诊断和临床诊断后确诊的；3、年龄大于18岁；4、肿瘤组织是术中通过电切或全切获得的；5、样本组织都是新鲜组织，切下后30分钟内放入RNAlater中，并在4℃冷藏过夜，其后-80℃低温储存；6、经HE染色，肿瘤细胞超过80%的肿瘤组织；7、正常肾组织在病理学检查中显示正常的肾小管和肾小球且无肿瘤细胞污染。
手术切除的新鲜组织立即沉浸在RNAlater（Qiagen公司；德国）中，并4℃冷藏过夜以便溶液深入浸润组织，其后-80℃低温储存。另一方面，苏木精-伊红（HE）染色检测肿瘤细胞的百分比，筛选出肿瘤细胞超过80%的肿瘤组织作进一步的研究。正常肾组织的病理学检查显示正常的肾小管和肾小球且无肿瘤细胞污染。根据2002美国癌症联合委员会（AJCC）分期系统，对每名患者的肿瘤进行分期或重新分期。
(二)、试剂：
(1)、RNAlater；
(2)、DNase I(RNase Free，美国，Promega)；
(3)、Trizol试剂溶液(Invitrogen；Carlsbad,美国)；
(4)、oligo(dT)18beads(Invitrogen,美国)；
(5)、逆转录酶(M-MLV)(Fermentas；美国)；
(6)、RT-PCR仪(ABI7000)美国应用生物系统公司。
本发明中涉及到上述试剂的使用均按照试剂使用说明中的步骤进行操作。
试验例1：RT-PCR检测SMAD3基因的mRNA在上尿路上皮癌中表达上调：
(一)、样本信息：
10例患者的信息如表1所示：
表1      样本信息
(二)、方法：
1、样本RNA提取：
(1)、将尿路上皮癌组织和正常邻近组织的样本放入RNAlater中进行保藏；
(2)、按照Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)说明书的步骤对尿路上皮癌组织和正常邻近组织的样本中的总RNA进行提取，步骤如下：
a、匀浆处理（Homogenization）：
按10-30mg组织加入1ml TRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，从匀浆中提取总RNA。
b、分层（Phase Separation）：
(a)、样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。
步骤：4℃12,000rpm离心10分钟，取上清。
(b)、每1ml TRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。
c、RNA沉淀（RNA Precipitation）：
4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水 相，RNA主要在水相中，把水相（通常可吸取550μl）转移到新管中；
(3)、按照RNase-free的DNase I使用说明书中的步骤消除步骤(2)中总RNA的DNA污染；
2、使用逆转录酶合成cDNA：
对RNase free的PCR管中的样本尿路上皮组织RNA用oligo(dT)18beads进行逆转录，得到样本尿路上皮组织的cDNA；
(1)、Microtube管中配制表2所示的模板RNA/引物混合液，全量6μl。
表2    模板RNA/引物混合液 
试剂名称 使用量
RNA（已提取） 1ng
Specific Primer（oligo(dT)18beads）（10μM） 1μl
灭菌蒸馏水 up to6μl
(2)、70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。
(3)、离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。
(4)、在上述Microtube管中配制表3所示的反转录反应液。
表3  反转录反应液 
试剂名称 使用量
上述模板RNA/引物变形溶液 6ul
5×M-MLV Buffer 2μl
dNTP Mixture（各10mM） 0.5μl
RNase Inhibitor（40U/μl） 0.25μl
RTase M-MLV（RNase H-）（200U/μl） 1μl
灭菌蒸馏水 up to10μl
(5)、42℃保温1小时。
(6)、70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或者PCR扩增等，PCR扩增时cDNA溶液的使用量为1μl～5μl。
3、RT-PCR检测：
(1)、RT-PCR反应体系组成(共15μl)，如表4所示：：
表4  RT-PCR反应体系
总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15μl每管分装至8连管中；表4中的GAPDH为一个内部控制，其中各引物序列为：
SMAD3上游引物：5’-CCCCACCACTCCAGCAGACCTT-3’，
SMAD3下游引物：5’-TGAACACGCACCTCCCAATCAGTA-3’；
GAPDH上游引物：5’-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，
GAPDH下游引物：5’-GACTCCGACCTTCACCTTCC-3’。
(2)、cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1:10或1:5。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序；
(3)、把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒；
(4)、将八连管放入RT-PCR仪(ABI7000)中进行扩增，扩增条件为：50℃(2分钟)和95℃(2分钟)，1个循环；95℃(15秒)，55℃(30秒)和72℃(40秒)，做40个循环。计算出各样本的回归曲线，并且根据SPSS软件(Version17.0SPSS Inc.)计算出相对数量mRNA的循环阈值。目标基因的相对表达水平被标准化为内参基因GAPDH的几何平均数。通过比较阈值周期(2-ΔCT)对我们的数据进行分析，结果如图1所示。
试验例二：免疫组化检测SMAD3基因的蛋白质在上尿路上皮癌中表达上调：
1、目的：为了审查癌症相关基因的临床意义，我们将SMAD3分为高蛋白表达组和低蛋白表达组。然后使用GraphPad Prism6进行Kaplan-Meier分析，在分析中运用时序检验来检验表达模式与预后之间的相关性。并使用SPSS17.0进行多变量Cox回归分析。此外，利用蛋白表达（免疫组化染色指数评分）来评估两个皮尔森tail系数，以测试这三个基因的相关性。
2、方法：进行免疫组化(参见Wu S,Wang Y,Sun L,Zhang Z,Jiang Z,Qin Z,et al.Decreased expression of dual-specificity phosphatase9is associated with poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma.BMC cancer.2011;11:413.)。简而言之，福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）切片，用二甲苯脱蜡。用3%的过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性和10%牛血清白蛋白阻止非特异性结合。标本加用第一抗体（Abcam，MA，USA），在4℃环境中孵育过夜，用抗体稀释液代替第一抗体获得阴性对照。此后，切片在37℃下MaxVisionTMHRP-Polymer anti-Mouse IHC Kit(Maixin,Fujian,China)处理15-20分钟，3- 氨基-9-乙基咔唑浸泡，Mayer苏木精复染，脱水，最后以晶体析出。
根据报道的标准(参见Tsuchiya A,Sakamoto M,Yasuda J,Chuma M,Ohta T,Ohki M,Yasugi T,Taketani Y,Hirohashi S:Expression profiling in ovarian clear cell carcinoma:identification of hepatocyte nuclear factor-1beta as a molecular marker and a possible molecular target for therapy of ovarian clear cell carcinoma.Am J Pathol2003,163:2503-2512；Saussez S,Cucu DR,Decaestecker C,Chevalier D,Kaltner H,AndréS,Wacreniez A,Toubeau G,Camby I,Gabius HJ,Kiss R:Galectin 7(p53-induced gene1):a new prognostic predictor of recurrence and survival in stage IV hypopharyngeal cancer.Ann Surg Oncol2006,13:999-1009.；和Bao S,Ouyang G,Bai X,Huang Z,Ma C,Liu M,Shao R,Anderson RM,Rich JN,Wang XF:Periostin potently promotes metastatic growth of colon cancer by augmenting cell survival via the Akt/PKB pathway.Cancer Cell2004,5:329-339.)，对石蜡切片的免疫组化染色程度进行评估，其中：0为没有阳性细胞，<5%染色指数为1，6%～25%染色指数为2，26%～50%染色指数为3，51%～75%染色指数为4，>75%染色指数为5。根据平均光密度，对染色强度进行分级：0级，无染色；1级，弱染色（淡黄色）；2级，中度染色（黄色）；和3级，强染色（棕色）。癌细胞蛋白表达的比例和染色强度被用来计算染色指数。我们根据染色指数值来评估SMAD3在良性和恶性病变尿路上皮组织的表达，分值为0、1、2、3、4、5、6、8、9、10、12和15。在总体生存率异质性大小的基础上制定蛋白表达的临界值。染色指数≥5为高表达，而染色指数≤4为低表达。
3、SMAD3的免疫组化与患者生存率分析：
为了检验SMAD3作为预后指标的意义，运用GraphPad Prism6进行Kaplan-Meier分析，在分析中运用时序检验来检验表达模式与预后之间的相关性的方法，对104名尿路上皮癌患者(该104例患者的信息见表5的“患者编号”、“性别”、“年龄”和“TNM”列所示)的肿瘤组织和邻近的正常组织的福尔马林固定石蜡包埋切片进行了免疫组化分析，以检测这些蛋白质的表达情况。所有患者在手术之前没有接受化疗和放疗。
如图2所示，SMAD3在肿瘤组织中显色很高，但在正常组织中显色明显。基于SMAD3蛋白质的表达，我们将104名病人平分为染色指数≥5和染色指数≤4两组。如图3所示，SMAD3的高表达预示病人的预后不良（p<0.0001）。
表5      参与验证试验的病人信息
试验例三：作为预后指标分子标记物与TNM分期的对比试验：
为了检验分子标志物能否作为独立的预后指标，我们将使用SPSS17.0进行COX分析，结果显示SMAD3的表达情况可作为UTUC患者总生存数的独立的预测因素（p<0.001，表6）。
为了检验TNM分期与生存率之间的关联性，同时还采用GraphPad Prism6进行Kaplan-Meier分析，在分析中运用时序检验来检验表达模式与预后之间的相关性，将验证队列(104名免疫组化患者组成一个队列)分为三组，分别为T1(n=62)，T2(n=16)，T3(n=25)。如图4A所示，T1组的总体生存率要明显优于T2组(p=0.015)和T3组(p<0.0001)。尽管TNM分期可独立预测生存率(p<0.001，表6)，但是它不能预测T2和T3亚组之间患者生存率的差异(p=0.094)。对于预后的预测，接下来我们将检验一下SMAD3是否更优于TNM分期。如图4B所示，SMAD3可以区分T2和T3组中高风险亚组(p<0.0001)，在T2和T3组中的病人，SMAD3作为分子标志物可以更好的预后。综上所述，SMAD3所表达的蛋白质比TNM分期有着更好的预测效果。
表6运用COX分析在UTUC患者中不同的预测指标与总生存率的关系
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  深圳市第二人民医院
 
<120>  SMAD3基因在检测上尿路上皮癌中的应用
 
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gactccgacc ttcaccttcc                                                   20

Claims (5)

1.SMAD3基因在制备用于检测上尿路上皮癌材料中的应用。
2.根据权利要求1所述的SMAD3基因在制备用于检测上尿路上皮癌材料中的应用，其特征在于：SMAD3基因表达上调。
3.根据权利要求1或2所述的SMAD3基因在制备用于检测上尿路上皮癌材料中的应用，包括下述步骤：
(1)、取上尿路上皮癌样本，提取样本的RNA；
(2)、对样本的RNA进行逆转录，得到样本的cDNA；
(3)、以步骤(2)获得的样本cDNA为模版，以引物对P为引物，进行RT-PCR反应，得到表达上调的SMAD3基因的mRNA表达量；其中引物对P为：
SMAD3上游引物：5’-CCCCACCACTCCAGCAGACCTT-3’，
SMAD3下游引物：5’-TGAACACGCACCTCCCAATCAGTA-3’。
4.根据权利要求3所述的SMAD3基因在制备用于检测上尿路上皮癌材料中的应用，其特征在于，所述RT-PCR的条件为：50℃2分钟、95℃2分钟，1个循环；95℃15秒、55℃30秒、72℃40秒，40个循环。
5.根据权利要求1或2所述的SMAD3基因在制备用于检测上尿路上皮癌材料中的应用，其特征在于：所述的应用是对上尿路上皮癌样本进行免疫组化测定。
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