JP2001519146A - Ｊｎｋ３調節物質およびその使用法 - Google Patents

Ｊｎｋ３調節物質およびその使用法

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Abstract

(57)【要約】 MAPキナーゼのc-Jun NH2末端キナーゼ（JNK）グループは、細胞が環境的ストレスに曝されると活性化される。脳におけるJNKの役割を、ニューロンイソ型JNK3をコードする遺伝子の標的破壊によって調べた。JNK3は急発作活性に対する正常な反応にとって必要であることが判明した。JNK3発現または活性を減少させる分子および化合物をスクリーニングする方法について記述する。そのような分子または化合物は、急発作障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、および虚血のような興奮毒性を含む傷害を治療するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は蛋白質キナーゼ発現または活性の阻害物質を検出するためのスクリー
ニングアッセイ法に関する。
【０００２】 発明の背景 アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、正常な発達過程、および環境
的ストレスに暴露された成人の脳における神経系の顕著な特徴である（クイダ（
Kuida）ら、Nature、384：368〜372、1996；ラタン（Ratan）ら、Neurochem.、6
2：376〜379、1994；ラッフ（Raff）ら、Science、262：695〜700、1993）。ス トレス誘発性のアポトーシスは多様な神経疾患に関係しており（トンプソン（Th
ompson）、Science、267：1456〜1462、1995）、これにはデノボ蛋白質合成およ
びRNA合成を必要とする（マーチン（Martin）ら、J. Cell. Biol.、106：829〜8
44、1988；オッペンハイム（Oppenheim）ら、Dev. Biol.、138：104〜113、1990
）。c-Jun蛋白質発現の増加は、全体的な虚血後の神経損傷（ニューマン・ヘー フェリン（Neumann-Haefelin）ら、Cerebral Flow Matab. 14：206〜216、1994 ）またはインビボでの神経軸索の離断（ニューマン・ヘーフェリン（Neumann-Ha
efelin）、上記）に関連している。c-Junの発現およびリン酸化の増加は、イン ビトロで神経生長因子（NGF）を枯渇させた交感神経ニューロンがアポトーシス によって死滅する前に認められている（ハム（Ham）ら、Neuron、14：927〜939 、1995）。その上、ドミナント・ネガティブ変異体c-Junの発現またはc-Jun抗体
による処置によって、NGF枯渇交感神経ニューロンはアポトーシスから保護され る（ハム（Ham）ら、上記；エスタス（Estus）ら、J. Cell. Biol.、127：1717 〜1727、1994）。しかし、c-Jun欠損マウスは妊娠中期に死亡するために、スト レス誘発性のニューロンのアポトーシスにc-Junが必要であるか否かはインビボ で調べられていない（ヒルバーグ（Hilberg）ら、Nature、365：179〜181、1993
）。
【０００３】 蛋白質のリン酸化は環境的なストレスシグナルに対して反応するc-Junの活性 化に関与している一つの重要な作用機序である（ホィットマーシュ（Whitmarsh ）ら、J. Mol. Med.、74：589〜607、1996）。c-JunのN-末端キナーゼ（JNK、SA
PKとしても知られる）は、c-JunのNH2-末端活性化ドメイン上の２つの残基（63 位のセリンおよび73位のセリン）をリン酸化するセリン／トレオニン蛋白質キナ
ーゼである（ホィットマーシュ（Whitmarsh）ら、上記；デリヤール（Derijard ）ら、Cell、76：1025〜1037、1994；キリアキス（Kyriakis）ら、Nature、369 ：156〜160、1994）。マップキナーゼキナーゼ（MKK）4（SEK1としても知られる
）は環境的ストレスおよびマイトゲン因子に反応するJNKの直接活性化物質であ る（ホィットマーシュ（Whitmarsh）ら、上記；デリヤール（Derijard）ら、上 記；ニシナ（Nishina）ら、Nature 385：350〜353、1997；ヤン（Yang）ら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、94：3004〜3009、1997；サンチェス（Sanchez）ら、
Nature、372：794〜798、1994）。JNKはまた、AP-1転写因子複合体の成分として
機能するATF2およびその他のJunファミリー蛋白質もリン酸化する（ホィットマ ーシュ（Whitmarsh）ら、上記；グプタら（Gupta）、Science 267：389〜393、1
995；グプタら（Gupta）、EMBO J. 15：2760〜2770、1996）。JNKによるこれら の転写因子のリン酸化によって、AP-1転写活性が増大する（ホィットマーシュ（
Whitmarsh）ら、上記）。逆に、AP-1転写活性の誘導はMKK4を欠損する細胞では 選択的に遮断されている（ヤン（Yang）ら、上記）。
【０００４】 JNKは、インビボでの神経細胞死の一つのモデル系であるNGF分化PC12褐色細胞
腫（バティスタトウ（Batistatou）ら、J. Cell. Biol. 122：523〜532、1993）
のアポトーシスに関係している（サイア（Xia）ら、Science、270：1326〜1311 、1995）。分化したPC12細胞から神経生長因子（NGF）を枯渇すると、アポトー シス細胞死の前にJNK活性化が認められる（サイア（Xia）ら、上記）。JNKシグ ナル伝達経路の構成的に活性化された成分およびドミナントネガティブ変異体成
分を用いたトランスフェクション研究から、JNKがPC12細胞のNGF除去によって誘
発されたアポトーシスに関係していることが立証された（サイア（Xia）ら、上 記）。
【０００５】 異なる三つの遺伝子の選択的スプライシングによって生じたJNKイソ型10個が 同定されている（デリヤール（Derijard）ら、上記；キリアキス（Kyriakis）ら
、上記；グプタ（Gupta）ら、上記；マーチン（Martin）ら、Brain Res. Mol. B
rain Res.、35：47〜57、1996）。JNK1およびJNK2イソ型は脳を含むマウス組織 に広く発現しているが、JNK3イソ型は主に脳に発現されており、心臓および精巣
での発現の程度はこれより少ない。
【０００６】 発明の概要 本発明は、JNK3遺伝子を欠損するマウス（JNK3(-/-））が正常に発達して、興
奮毒性性の障害に対して抵抗性であること、ならびにJNK3がストレス誘発性の発
作活性、AP-1転写活性化、および海馬ニューロンのカイネート誘発アポトーシス
において何らかの役割を果たしているという発見に基づいている。このように、
JNK3はカイネート／グルタメート興奮毒性のメディエータであり、興奮毒性障害
を制限または防止する標的である。
【０００７】 本発明はまた、JNK3発現を調節する候補化合物を同定する方法を特徴とする。
本方法は、JNK3蛋白質を発現することができる細胞を、候補化合物が存在しない
場合に細胞がJNK3蛋白質を発現するために十分な条件および時間、化合物とイン
キュベートする段階を含む。次に、細胞におけるJNK3の発現を化合物の存在下で
測定する。また、JNK3の発現を、同じ条件および同じ時間で対照細胞においても
測定する。化合物の存在下でインキュベートした細胞と対照細胞とにおけるJNK3
発現量を比較する。JNK3発現に差があれば化合物がJNK3発現を調節することを示
している。本方法の一つの態様において、化合物はJNK3発現を減少させる。
【０００８】 もう一つの態様において、本発明は、JNK3活性を調節する候補化合物を同定す
る方法を特徴とする。方法は、候補化合物が存在しない場合に細胞がJNK3活性を
発現するために十分な条件および時間、JNK3活性を有する細胞と化合物とをイン
キュベートする段階を含む。次にJNK3の活性を化合物の存在下で細胞において測
定する。また、JNK3の活性を、同じ条件および同じ期間で対照細胞においても測
定する。化合物の存在下でインキュベートした細胞と対照細胞におけるJNK3活性
の量を比較する。JNK3活性に差があれば化合物がJNK3活性を調節することを示し
ている。本方法の一つの態様において、化合物はJNK3活性を減少させる。
【０００９】 本発明はまた、JNK3ポリペプチドの基質への結合を調節する化合物を同定する
方法を含む。本方法は選択した化合物の存在下および非存在下で基質に結合する
JNK3ポリペプチドの量を比較することを含む。JNK3ポリペプチドの基質への結合
量に差があれば、選択した化合物がJNK3ポリペプチドの結合を調節することを示
している。この方法の一つの態様において、JNK3ポリペプチドの基質への結合は
減少する。
【００１０】 本発明のもう一つの特徴は、少なくとも一つの不活化JNK3遺伝子を含む全能性
マウス細胞を製造する方法である。本方法は以下の段階を含む：a）複数の全能 性マウス細胞を提供する段階；b）ある配列を遺伝子に挿入することによって破 壊されたマウスJNK3遺伝子を含むDNA構築物を細胞に導入して、この破壊により 機能的JNK3の発現を阻害する段階；c）JNK3をコードする染色体配列と導入され たDNA構築物との間に相同的組換えが起こるように細胞をインキュベートする段 階；およびd）少なくとも一つの不活化JNK遺伝子を有する全能性マウス細胞を同
定する段階。
【００１１】 不活化JNK3遺伝子に関してホモ接合であるマウスを作製する方法も本発明の特
徴である。本方法は以下の段階を含む：a）少なくとも一つの不活化JNK3遺伝子 を含む全能性マウス細胞を提供する段階；b）細胞をマウスの胚に挿入し、その 胚を雌性マウスに植え込む段階；c）胚を新生児マウスに生育させる段階；d）新
生児マウスを性的成熟に達するまで飼育する段階；e）不活化JNK3遺伝子に関し てホモ接合であるマウスを得るために性的に成熟したマウス二匹を交配させる段
階。そのようなマウス（ホモ接合JNK3(-/-)）は興奮毒性障害に対して抵抗性で ある。
【００１２】 本発明はまた、興奮毒性を含む神経系の障害を有する、またはそのリスクを有
する患者を治療する方法も特徴とする。本方法は、JNK3発現を阻害する化合物の
治療的有効量、またはJNK3活性を阻害する化合物の治療的有効量を患者に投与す
ることを含む。アンチセンス核酸分子またはリボザイムは阻害化合物として用い
ることができる。これらの方法によって治療することができる障害には、アルツ
ハイマー病のような痴呆、ハンチントン病のような神経変性疾患、虚血のような
脳血管障害、筋萎縮性側索硬化症、熱または低温によって引き起こされたものを
含む外傷、運動神経疾患、パーキンソン病、またはてんかんを含む急発作疾患が
含まれる。下垂体、副腎、精巣、または膵臓（例えばβ細胞）に影響を及ぼす障
害のような神経内分泌障害は、JNK3調節物質によって治療することができる。
【００１３】 本発明はまた、導入遺伝子が哺乳動物の生殖細胞の染色体に組み入れられてお
り、JNK3遺伝子の発現を破壊する導入遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニ
ック哺乳動物を含む。本発明の一つの態様において、哺乳動物はマウスである。
哺乳動物の生殖細胞は、導入遺伝子に関してホモ接合となりえて、JNK3遺伝子発
現の破壊により結果としてヌル変異が生じる。本発明のもう一つの態様には、JN
K3遺伝子の発現を破壊する導入遺伝子を有する哺乳動物の細胞に由来する細胞株
が含まれる。
【００１４】 破壊されたマウスJNK3遺伝子を含むDNA構築物もまた、本発明の特徴である。 この破壊は、破壊が機能的JNK3の発現を阻害または改変するように、ある配列を
遺伝子に挿入することによって行われる。
【００１５】 特に明記していない限り、「JNK3」は、図1A〜5Bに示す配列（配列番号１〜12
；同様に、配列番号：１および配列番号：２に対応するゲンバンクアクセッショ
ン番号：U34819；配列番号：４および配列番号：５に対応するU34820；配列番号
：７および配列番号：８に対応するU07620；配列番号：９および配列番号：10に
対応するL27128；および配列番号：11および配列番号：12に対応するL35236も参
照のこと）のような、核酸およびポリヌクレオチドの双方を指すことができる。
配列番号：３および配列番号：６は、配列番号：７によって示される配列と共に
、配列番号：１および４によって示される配列間で推定されるオーバーラップに
基づく推定ヌクレオチド配列を表す。JNK3はまた、上記のアミノ酸配列と少なく
とも85％同一であるポリペプチド、およびそれらのポリペプチドをコードする核
酸を指す。これらの配列の例およびそれらを単離する方法はグプタ（Gupta）ら 、上記、1996；キリアキス（Kyriakis）ら、上記；マーチン（Martin）ら、Brai
n Res.Mol. Brain Res. 35：45〜57、1996；およびモヒト（Mohit）ら、Neuron
14：67〜78、1995に見ることができる。
【００１６】 「対照」細胞は、例えば遺伝子型および表現型から見て、比較される細胞と概
して同じであるが（例えば細胞は姉妹細胞となりうる）、試験化合物に暴露され
ない細胞である。
【００１７】 特に明記していない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科
学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味
と同じ意味を有する。本発明の実施または試験にあたっては、本明細書に記述の
ものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法お
よび材料を下に記述する。本明細書において言及した全ての出版物、特許出願、
特許およびその他の引用文献はその全文が組み入れられる。矛盾が生じる場合、
定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は説明のため
であって、制限すると解釈されない。
【００１８】 本発明のその他の特徴および長所は、以下の詳細な説明および請求の範囲から
明らかとなると思われる。
【００１９】 詳細な説明 JNK蛋白質キナーゼは、特定のグループのストレスシグナルに反応してc-Junを
リン酸化してその後AP-1転写活性を増加させる（ホィットマーシュ（Whitmarsh ）ら、上記；ヤン（Yang）ら、上記）。JNK3が神経特異的に発現されると、ニュ
ーロンは特に生理学的ストレスを受けやすくなる可能性がある。本明細書に記述
の実験において、JNK3欠損マウスではカイニン酸（KA）誘発急発作およびアポト
ーシスに対する顕著な抵抗性が認められている。KA神経毒性に対する抵抗性は、
JNK蛋白質キナーゼのJNK3イソ型によって媒介される特異的ストレス反応経路の 消失による可能性がある。第一に、野生型マウスではKAの投与によって、c-Jun のNH2-末端活性化ドメインのリン酸化が起こり、AP-1転写活性が著しく増加した
が、JNK3-欠損マウスではこれらの作用は起こらなかった。第二に、海馬の最も 易損性の領域内でリン酸化されたc-Junの持続的発現を認め、これはJNK活性がニ
ューロンのアポトーシスに至る可能性があることをさらに示している。
【００２０】 本明細書に報告した知見は、KA神経毒性が興奮性の回路に依存していることと
一致する（ナドラー（Nadler）ら、Brain Res. 195：47〜56、1980）。JNK3は神
経系に広く発現され、その活性は多くの異なるストレスシグナルによって増加す
るため（グプタ（Gupta）ら、上記）、JNK3は、多様な環境的傷害によって引き 起こされたストレス誘発性のアポトーシスに関係する可能性がある。
【００２１】 KA誘発性の興奮性神経毒性の重要なメディエータとしてJNK3を同定することは
、臨床的に意味がある。マウス、ラット、およびヒトJNK3のアミノ酸配列は非常
に保存されている（キリアキス（Kyriakis）ら、上記；グプタ（Gupta）ら、上 記；マーチン（Martin）ら、上記；モヒト（Mohit）ら、Neuron. 14：67〜78、1
995）。その上、ヒトJNK3遺伝子の発現はまた、神経系および内分泌系に限定さ れ、脳の多くの小領域に広く発現されている（グプタ（Gupta）ら、上記；モヒ ト（Mohit）ら、上記）。したがって、ヒトおよび齧歯類のJNK3蛋白質キナーゼ は関連するまたは同一の生理学的機能を有する可能性がある。興奮性アミノ酸の
神経毒性は、急性虚血から慢性神経変性疾患に至る多くの神経学的障害に関係し
ている（チョイ（Choi）、Neuron、1：623〜634、1988；リプトン（Lipton）ら 、N. Engl. J. Med. 330：613〜622、1994；ロスマン（Rothman）ら、Annu. Neu
rol. 19：105〜111、1986）。これまでの治療戦略は、NMDAタイプのグルタメー ト受容体のような、細胞表面チャンネルを通じてのカルシウムの流入防止に重点
が置かれていた。しかし今日まで、これらのアプローチからは多様な結果が得ら
れているにすぎない（リプトン（Lipton）ら、上記）。したがってJNK3は、興奮
性神経毒性がJNK3媒介アポトーシスを含む場合、治療的介入の標的となる。
【００２２】 下記の実験において、相同的組換えを用いてJNK3-欠損マウスを作製し、侵害 刺激に対するそれらの反応を調べた。強力な興奮毒性化学物質であるKAは、辺縁
系の急発作および神経細胞死を誘発する。KAの神経毒性はシナプス後部位でのグ
ルタメート受容体の直接刺激およびシナプス前部位からの興奮性アミノ酸の放出
の間接的な増加に由来する。KAを全身的に投与すると、c-Junおよびc-Fosを含む
様々な細胞性前初期遺伝子（cIEG）の発現を誘導することはよく知られている。
このように、KAを適用するとインビボで脳におけるストレス反応経路を誘発する
。下記に詳しく述べる実験は、KAが野生型マウスの脳においてc-Junのリン酸化 、およびAP-1転写活性の増加を誘導することを証明している。しかし、KAのこれ
らの作用はJNK3-欠損マウスの脳では著しく抑制されている。その上、JNK3-欠損
マウスはKA誘発急発作および海馬ニューロンのアポトーシスに対して著しい抵抗
性を示す。KAで処置したこれらの正常なマウスは、興奮毒性を含むヒトの神経系
障害の有用なモデルとなる。
【００２３】 これらの実験結果に基づき、JNK3は興奮毒性障害を制限するために特に優れた
標的であることが判明した。特に、JNK3は下記のように、JNK3遺伝子発現、JNK3
の基質への結合、およびJNK3の活性を調節する分子をスクリーニングするための
プロトコールを含むスクリーニングプロトコールにおいて標的となる。これらの
スクリーニングにおいて認められた、JNK3の発現または活性を有効に減少させる
分子は、てんかんのような急発作障害、虚血を含む脳血管障害、代謝不均衡（例
えば、低血糖症）、極度の熱または低温による損傷、外傷（例えば、放射線照射
、脊髄損傷、圧力およびイオン不均衡）、アルツハイマー病のような痴呆、パー
キンソン病、および神経変性疾患（例えば、ハンチントン病）、ならびに運動神
経疾患（筋萎縮性側索硬化症を含む）などの興奮毒性を含む神経系の障害を治療
するために用いられる薬剤候補である（トンプソン（Thompson）、Science、267
：1456〜1462、1995；コイル（Coyle）ら、Science、262：689〜695、1993）。
【００２４】 JNK3活性を阻害する分子のスクリーニング法 以下のアッセイ法およびスクリーニングはJNK3活性の有効な阻害剤である化合
物を同定するために用いることができる。アッセイ法およびスクリーニングは、
ライブラリからの分子の物理的選択および分子ライブラリにおける化合物のデジ
タルモデル、およびJNK3活性部位のデジタルモデルのコンピュータでの比較によ
って行うことができる。アッセイ法およびスクリーニングにおいて同定された阻
害物質は、JNK3に結合することによって（例えばマウスまたはヒト）、JNK3に結
合する細胞内蛋白質に結合することによって、JNK3とその基質との相互作用を妨
害する化合物によって、JNK3遺伝子の活性を調節する化合物によって、またはJN
K3遺伝子もしくはJNK3蛋白質の発現を調節する化合物によって作用する可能性が
あるが、これらに限定しない。
【００２５】 アッセイ法はまた、JNK3調節配列に結合する分子（例えば、プロモーター配列
）を同定し、それにより遺伝子発現を調節するために用いることができる。例え
ば、プラット（Platt）、J. Biol. Chem.、269：28558〜28562、1994を参照のこ
と。
【００２６】 本明細書に記述の方法によってスクリーニングすることができる化合物は、JN
K3蛋白質に結合する、またはその活性をいずれにせよ阻害するペプチドおよびそ
の他の有機化合物（例えば、ペプチド模倣体）を含むが、これらに限定しない。
そのような化合物は、ペプチド；例えばランダムペプチドライブラリ（例えば、
ラム（Lam）ら、Nature、354：82〜84、1991；ホウテン（Houghten）ら、Nature
354：84〜86、1991を参照のこと）、ならびにD-および／またはL-アミノ酸、ホ
スホペプチド（ランダムまたは部分的に縮重した、方向性を有するホスホペプチ
ドライブラリのメンバーを含むがこれらに限定しない；例えば、ソンギャング（
Songyang）ら、Cell 72：767〜778、1993を参照のこと）、および有機または無 機低分子を含む組合せ化学に由来する分子ライブラリのメンバーを含むがこれら
に限定しない可溶性ペプチドを含んでもよいが、これらに限定しない。
【００２７】 化合物および分子をスクリーニングして、JNK3遺伝子またはJNK3の発現の調節
に関係している他の何らかの遺伝子の発現に影響を及ぼす（例えば、遺伝子の調
節領域または転写因子と相互作用することによって）化合物を同定する。また、
化合物を、そのような蛋白質の活性（例えば、JNK3活性を阻害することによって
）、またはJNK3の調節に関係している分子の活性に影響を及ぼす化合物を同定す
るためにスクリーニングする。
【００２８】 コンピューターによるモデリングまたは検索技術を用いて、JNK3蛋白質の発現
もしくは活性を調節するために、調節する候補物質である化合物を同定する、ま
たは改変された化合物を同定することができる。例えば、JNK3蛋白質の活性部位
と相互作用する可能性がある化合物を同定する。JNK3の活性部位は、例えば分子
のアミノ酸配列の分析を含む当技術分野で既知の方法を用いて、JNK3と本来のリ
ガンド（例えば、ATF2またはc-Jun）によって形成された複合体の研究から同定 することができる。化学またはX線結晶学的方法を用いて、c-JunまたはATF2のよ
うな結合したリガンドの位置によってJNK3の活性部位を同定することができる。
【００２９】 活性部位の三次元構造は決定することができる。これは、完全な分子構造を決
定するために用いることが可能な、X線結晶学を含む既知の方法によって行うこ とができる。固相または液相NMRを用いて特定の分子内距離を測定することがで きる。構造分析のその他の方法を用いて部分的または完全な地理的構造を決定す
ることができる。地理的構造は、天然（例えば、c-JunもしくはATF2）または人 工的リガンドに結合したJNK3蛋白質について決定することができ、これによって
より正確な活性部位構造決定が得られる可能性がある。
【００３０】 コンピューターに基づく数値的モデリングを用いて、不完全または正確さが不
十分な構造を完成させることができる。使用できるモデリング法は、例えば蛋白
質または核酸のような特定のバイオポリマーに特異的なパラメータ化したモデル
、分子運動の計算に基づく分子動態モデル、熱集合に基づく統計学的な力学モデ
ル、または組み合わせたモデルである。ほとんどのタイプのモデルに関して、構
成原子とグループの間の力を表す標準的な分子力の場が必要であるが、これらは
物理化学において既知の力の場から選択することができる。上記のように決定し
た不完全またはより正確でない構造に関する情報は、これらのモデリング法によ
って計算した構造上の制約として組み込むことができる。
【００３１】 JNK3蛋白質の活性部位の構造を、モデリングによって、または方法の組合せの
いずれかによって実験的に決定した後、分子構造に関する情報と共に化合物を含
むデータベースを検索することによって、候補となる調節化合物を同定すること
ができる。そのような研究において同定された化合物は活性部位構造が一致し、
活性部位に適合し、または活性部位を定義するグループと相互作用する構造を有
する化合物である。検索によって同定された化合物はJNK3調節化合物の可能性が
ある。
【００３２】 これらの方法はまた、既知の調節化合物またはリガンドから、改良された調節
化合物を同定するために用いてもよい。既知の化合物の構造を改変して、本明細
書に示すように実験的およびコンピューターモデリング法を用いてその作用を決
定する。改変した構造をJNK3蛋白質の活性部位構造と比較して、リガンドもしく
は調節化合物に対する特定の改変が蛋白質とのその相互作用にどのように影響を
及ぼすかを決定する、または予想する。好ましい特異性または活性を有する改変
した調節化合物またはリガンドを得るために、例えば側鎖を変化させることによ
る組成物の全体的な変化を評価することができる。
【００３３】 本明細書の開示によって、JNK3蛋白質および関連する伝達および転写因子の活
性部位の同定に基づいて調節化合物を同定するために有用なさらなる実験的およ
びコンピューターモデリング法は、当業者によって開発することができる。
【００３４】 分子モデリング系の例はQUANTAプログラム、例えばCHARMm、MCSS/HOOKおよびX
-LIGAND（モレキュラー・シミュレーションズ、インク、サンジエゴ、カリフォ ルニア州）である。QUANTAは二次元および三次元モデリング、シミュレーション
、ならびに巨大分子および低分子有機物の分析のためのモデリング環境を提供す
る。特に、CHARMmはエネルギーの最小化および分子の動態機能を分析する。MCSS
/HOOKはCHARMmを通じて計算されたエネルギー論を用いて活性部位のリガンド結 合能の特徴を調べる。X-LIGANDは蛋白質リガンド複合体の電子密度パターンに、
リガンド分子を適合させる。このプログラムによって、分子の互いの挙動の相互
構築、改変、可視化、および分析も可能となる。
【００３５】 特定の蛋白質と相互作用する化合物のコンピューターモデリングを考察する論
文をさらに手本にすることができる。例えば、ロチビネン（Rotivinen）ら、Act
a Pharmaceutical Fennica 97：159〜166、1988；リプカ（Ripka）、New Scient
ist 54〜57（1988年６月16日）；マッキナリー＆ロスマン（McKinaly and Rossm
ann）、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29：111〜122、1989；ペリー＆デービ ース（Perry and Davies）、OSAR：「ドラッグデザインにおける定量的構造活性
相関（Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design）」、
189〜193頁（アランR.リス・インク、1989）；ルイス＆ディーン（Lewis and De
an）、Proc. R. Soc. Lond. 236：125〜140、141〜162、1989を参照のこと；お よび核酸成分に対するモデル受容体に関しては、アスキュー（Askew）ら、Am. J
. Chem. Soc. 111：1082〜1090を参照のこと。化学物質をスクリーニングおよび
描写するためにデザインされたコンピュータープログラムはMSI（上記）、アレ リックス・インク（ミシソーガ、オンタリオ州、カナダ）、およびハイパーキュ
ーブ・インク（ゲインズビル、フロリダ州）のような企業から入手できる。これ
らのアプリケーションは主に特定の蛋白質に特異的な薬剤に関してデザインされ
ている；しかし、それらはDNAまたはRNAの同定された領域に特異的な薬剤をデザ
インするために適合させてもよい。市販の化学ライブラリを候補化合物源として
用いることができる。そのような化学ライブラリは例えば、アークル、インク（
メッドフォード、マサチューセッツ州）から入手することができる。
【００３６】 上記のように、結合を変化させる化合物をデザインおよび産生することに加え
て、天然物、合成化学物質、およびペプチドを含む生物活性材料を含む既知の化
合物のライブラリを、阻害剤または活性化剤である化合物に関してスクリーニン
グすることができる。
【００３７】 上記の方法によって同定された化合物は、例えばJNK3遺伝子産物の生物学的機
能を詳しく調べる際に、およびJNK3活性が有害である障害の治療に、有用となる
可能性がある。本明細書に記述されるような化合物の有効性を試験するアッセイ
法に関してはさらに下記で述べる。
【００３８】 JNK3蛋白質および遺伝子に結合する化合物のインビトロスクリーニングアッセ イ法 インビトロ系を用いて、JNK3蛋白質またはそれらの蛋白質をコードする遺伝子
と相互作用することができる（例えば結合する）化合物を同定することができる
。そのような化合物は例えば、JNK3ポリペプチドもしくは核酸の活性を調節する
ために、その生化学を詳しく調べるために、またはJNK3発現によって引き起こさ
れたもしくは悪化した障害を治療するために有用となる可能性がある。これらの
化合物はそれ自身が正常な機能を破壊する可能性があり、または正常な機能を破
壊する化合物をスクリーニングするために用いることができる。
【００３９】 JNK3蛋白質に結合する化合物を同定するためのアッセイ法は、蛋白質と試験化
合物の反応混合物を、２つの成分が相互作用および結合するために十分な条件下
で調製した後、このように検出および／または単離することができる複合体を形
成することによって行われる。
【００４０】 JNK3蛋白質または核酸に結合することができる分子のスクリーニングアッセイ
法は、多くの方法を用いて実施することができる。例えば、JNK3蛋白質、ペプチ
ド、または融合タンパク質を固相上に固定して、試験化合物と反応させ、および
試験化合物の直接または間接標識によって複合体を検出するすることができる。
または、試験化合物を固定してJNK3ポリペプチドと反応させ、複合体を検出する
ことも可能である。マイクロタイタープレートを固相として用いて、固定した成
分を共有結合または非共有結合相互作用によって結合することができる。非共有
結合は分子を含む溶液で固相をコーティングし、乾燥させることによって得ても
よい。または、JNK3に特異的な抗体を用いて分子を固相表面に結合させる。その
ような表面は予め調製して保存しておいてもよい。JNK3抗体はコリガン（Coliga
n）ら、「免疫学の現行プロトコール（Current Protocols in Immunology）」、
ジョン・ウィリー＆サンズ、インク、1994、第１巻第２章を参照のこと）に記述
の従来の方法を用いて産生することができる。
【００４１】 このアッセイ法において、固定成分を含む被覆表面に、２つの成分の相互作用
および結合が起こる条件下で非固定成分を加える。次に、形成された複合体が固
相上に固定したままで残るような条件下で未反応成分を除去する（例えば洗浄に
よって）。複合体の検出は当技術分野で既知の多くの方法によって行うことがで
きる。例えば、アッセイ法の非固定成分は、放射活性または酵素標識によって予
め標識して、適当な手段によって検出してもよい。非固定部分を予め標識しない
場合、間接法を用いる。例えば、非固定部分がJNK3ポリペプチドである場合、JN
K3に対する抗体を用いて結合した分子を検出し、二次標識抗体を用いて複合体全
体を検出する。
【００４２】 または、反応は液相において実施し、反応産物を未反応成分から分離して、複
合体を検出（例えば、JNK3蛋白質に特異的な固定化抗体を用いて）することがで
きる。
【００４３】 細胞に基づくアッセイ法を用いてJNK3蛋白質と相互作用する化合物を同定する
ことができる。そのような蛋白質を本来発現している、またはそのような蛋白質
を発現するように遺伝子操作されている（例えばJNK3 DNAによるトランスフェク
ションもしくは形質導入によって）細胞株を用いることができる。例えば、試験
化合物を細胞培養に加えて、ATF2またはc-Junのリン酸化を下記のように測定す ることができる。試験化合物を含まない対照と比較して、試験化合物の存在下で
JNK3基質のリン酸化量が減少すれば、試験化合物がJNK3活性の阻害剤であること
を示している。
【００４４】 JNK3プロモーターに作用するJNK3発現の阻害剤は、JNK3プロモーターを含むゲ
ノム配列がリポーター、例えば、蛍のルシフェラーゼに融合しているキメラ遺伝
子を用いて同定することができる。このDNAで形質転換した培養細胞（ニューロ ンを含む）をルシフェラーゼ活性の発現に関してスクリーニングする。この高処
理アッセイ法においてルシフェラーゼ活性を阻害する化合物は、当技術分野で既
知の方法（例えば、アウスユベール（Ausubel）の「分子生物学の現行プロトコ ール（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ウィリー＆サン
ズ、1994を参照のこと）を用いて、内因性JNK3蛋白質（例えばウェスタンブロッ
ティングによって）およびJNK3 mRNA（ノザンブロッティングによって）の直接 測定によって確認することができる。
【００４５】 候補となる阻害化合物は動物モデルと同様に、細胞または組織培養においても
さらに調べることができる。例えば、JNK3を発現する細胞を試験化合物とインキ
ュベートする。処置細胞および非処置細胞から溶解物を調製して、既知の方法に
従ってウェスタンブロットを行う。ブロットをJNK3に特異的な抗体をプローブと
して調べる。無処置対照と比較して、試験化合物で処置した培養細胞においてJN
K3発現量が減少すれば、試験化合物がJNK3発現に関連した障害を治療する薬剤候
補であることを示している。
【００４６】 JNK3/JNK3基質相互作用を妨害する化合物のアッセイ法 JNK3とその基質との相互作用を妨害する分子は、蛋白質・蛋白質相互作用を検
出するアッセイ法を用いて同定することができる。例えば、酵母の２ハイブリッ
ド法は、インビボで蛋白質相互作用を検出する。しかし、候補分子が酵母細胞壁
を透過しない可能性があることからインビトロアッセイ法が好ましい。JNKC3と 基質との相互作用を破壊するそのような試験分子を調べるインビトロアッセイ法
の例には、固定化したJNK3または固定した基質（例えば、c-Jun）を用いること 、および固定した成分を細胞溶解物または精製蛋白質と共に試験分子の存在下お
よび非存在下においてインキュベートすることが含まれる。一般に、試験分子は
最も豊富に存在する成分（例えば固定したまたは溶液中の成分）の100倍モル過 剰の範囲で調べる。試験分子がアッセイ法の固定成分と相互作用すると予想され
る場合には、細胞溶解物または精製蛋白質を加える前にその成分とプレインキュ
ベートすることができる。非結合材料を洗浄して除去した後、結合した蛋白質を
当技術分野で既知の方法を用いて、抗体によって（例えば、ELISAもしくはウェ スタンブロット）または標識蛋白質（例えば、放射活性もしくは蛍光）を用いる
ことによって検出する。このようにして、JNK3に結合した基質量を減少させる試
験分子は、JNK3/JNK3基質相互作用を妨害する化合物として同定される。
【００４７】 インビボにおけるJNK3の作用を改善する化合物のアッセイ法 上記のように同定された化合物、またはインビトロでJNK3活性を阻害するその
他の候補化合物は、JNK3活性を含む障害の治療に有用となる可能性がある。これ
らの化合物はインビボアッセイ、例えばJNK3活性を含む障害の動物モデルにおい
て試験することができる。例えば、ALSのトランスジェニックマウスモデル（ブ ルイジン＆クリーブランド（Bruijn and Cleveland）ら、Neuropathol. Appl. N
eurobiol. 22：373〜387、1996；ダル・カント＆ガーネイ（Dal Canto and Gurn
ey）、Brain Res. 676：25〜40、1995；クリーブランド（Cleveland）ら、Neuro
logy 47：補則2、S54〜61）と同様に、PDAPPマウスのようなアルツハイマー病の
トランスジェニックモデルおよびその他のモデル（例えばロリング（Loring）ら
、Neurobiol. Aging 17：173〜182、1996）が記述されている。MPTP（1-メチル-
4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン）誘発ドーパミン作動神経毒性は、 齧歯類およびヒト以外の霊長類のパーキンソン病のモデルとして用いられている
（例えば、プルゼドボルスキ（Przedborski）ら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA
93：4565〜4571、1996）。
【００４８】 JNK3活性を阻害すると予想される試験化合物を、例えば上記のような様々な疾
患の典型のモデルとなる動物に投与する。次に処置した動物をJNK3活性の阻害に
関して解析する。そのような解析は間接的または推論的であってもよく、例えば
動物の健康の改善または生存によって試験化合物の有効性を示してもよい。解析
はまた、直接的であってもよく、JNK3またはc-Jun発現の減少は、試験化合物で 処置した動物から摘出した神経組織のノザン分析によって測定することができる
。無処置対照と比較して、処置動物からの試料中に存在するJNK3 mRNA量が減少 すれば、試験化合物がJNK3発現を阻害することを示している。c-Jun量が減少す れば、試験化合物がJNK3発現または活性を阻害することを示している。
【００４９】 アンチセンス構築物および治療 「アンチセンス」アプローチに基づく治療レジメは、JNK3 mRNAに相補的であ るオリゴヌクレオチド（DNAまたはRNAのいずれか）のデザインを含む。これらの
オリゴヌクレオチドは相補的mRNA転写物に結合して翻訳を防止できる。絶対的な
相補性は、好ましいが必要ではない。本明細書において述べるRNAの一部と「相 補的」である配列は、RNAとハイブリダイズして、安定な二本鎖を形成すること ができるように十分に相補的である配列である；二本鎖アンチセンス核酸の場合
、二本鎖DNAの一本鎖を試験してもよく、または三本鎖形成を解析してもよい。 ハイブリダイズ能はアンチセンス核酸の相補性の程度および長さの双方に依存す
るであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸の長さが長ければ長いほど、RNA との塩基ミスマッチはより多くなるがそれでも安定な二本鎖（または必要に応じ
て三本鎖）が形成される。当業者はハイブリダイズした複合体の融点を決定する
ために標準的な技法を用いることによって、ミスマッチの許容できる程度を確認
することができる。
【００５０】 メッセージの5'末端、例えばAUG開始コドンまでおよびそれを含む5'非翻訳配 列と相補的であるオリゴヌクレオチドは、一般に翻訳を阻害するために最も効果
的である。しかし、mRNAの3'非翻訳配列と相補的である配列もまた、翻訳を阻害
するために有効であることが示されている（ワグナー（Wagner）、Nature 372：
333、1984）。このように、JNK3の5'または3'非翻訳非コード領域は、JNK3 mRNA
の内因性ヒト相同体の翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて用
いることができる。mRNAの5'非翻訳領域と相補的なオリゴヌクレオチドはAUG開 始コドンの相補物を含むはずである。5'および3'領域の候補となるアンチセンス
配列の例はそれぞれ；5'-AAG AAA TGG AGG CTC ATA AAT ACC ACA GCT-3'（配列 番号：17）および5'-ATT GGA AGA AGA CCA AAG CAA GAG CAA CTA-3'（配列番号 ：18）である。
【００５１】 JNK3遺伝子のコード領域と相補的であるアンチセンスヌクレオチドを用いるこ
とができるが、転写された非翻訳領域と相補的なヌクレオチドが最も好ましい。
このタイプの候補配列の例は、5'-TAA GTA AGT AGT GCT GTA TGA ATA CAG ACA-3
'（配列番号：19）および5'-TAC TGG CAA TAT ATT ACA GAT GGG TTT ATG-3'（配
列番号：20）である。
【００５２】 mRNAコード領域と相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり効
率的でない翻訳の阻害剤であるが、本発明に従って用いることができる。JNK3 m
RNAの5'、3'またはコード領域とハイブリダイズするようにデザインされている か否かによらず、アンチセンス核酸は少なくとも長さがヌクレオチド６個でなけ
ればならず、好ましくは長さがヌクレオチド６〜約50個の範囲のオリゴヌクレオ
チドである。特定の局面において、オリゴヌクレオチドは長さが少なくとも10ヌ
クレオチド、または少なくとも50ヌクレオチドである。
【００５３】 標的配列の選択によらず、まずアンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現
を阻害できるか否かを評価するために、通常インビトロ試験を実施する。一般に
、これらの試験は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子阻害と非特異的生
物作用とを識別する対照を利用する。これらの試験において、標的RNAまたは蛋 白質のレベルを通常、内部対照RNAまたは蛋白質のレベルと比較する。さらに、 アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を対照オリゴヌクレオチ
ドを用いて得られた結果と比較することで考察を行う。対照オリゴヌクレオチド
は試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであること、およびオリゴヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列は、標的配列との特異的ハイブリダイゼーションを防止す
るために必要である以上にアンチセンス配列とは異ならないことが好ましい。
【００５４】 オリゴヌクレオチドは、DNA、もしくはRNAまたはキメラ混合物もしくはその誘
導体もしくは改変型、一本鎖もしくは二本鎖となりうる。オリゴヌクレオチドは
、例えば分子の安定性またはハイブリダイゼーションを改善するために、塩基部
分、糖部分、またはリン酸骨格で改変することができる。オリゴヌクレオチドは
、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞受容体をターゲティングするために）
または細胞膜（例えば、レッチンガー（Letsinger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 86：6553、1989；レマイター（Lemaitre）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 84：648、1987；PCT公開番号、国際公開公報第88/09810号に記述のように） もしくは血液脳関門（例えば、PCT公開番号、国際公開公報第89/10134号を参照 のこと）を通過して輸送を促進する物質、またはハイブリダイゼーション誘発切
断物質（例えば、クロール（Krol）ら、BioTechniques 6：958、1988を参照のこ
と）またはインターカレート物質（例えば、ツォン（Zon）、Pharm. Res. 5：53
9、1988を参照のこと）のようなその他の付加された群を含んでもよい。この目 的のため、オリゴヌクレオチドは、もう一つの分子、例えば、ペプチド、ハイブ
リダイゼーション誘発クロスリンク物質、輸送物質、またはハイブリダイゼーシ
ョン誘発切断物質に結合させることができる。
【００５５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下からなる群より選択される少なくと
も一つの改変された塩基部分を含んでもよいがこれらに限定しない：5-フルオロ
ウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサ
ンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウ
ラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチ ルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イ ノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2
,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシ ン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチ ルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシ
ン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチ オ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ウィブトキソシ
ン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-テオウラシル 、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢 酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、2
-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、および2,6-ジア
ミノプリン。
【００５６】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下からなる群より選択される少な
くとも一つの改変した糖部分を含むことができるが、これらに限定しない：アラ
ビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【００５７】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下からなる群より選択される、少
なくとの一つの改変したリン酸骨格を含むことができる：ホスホロチオエート、
ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホス
ホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、および
ホルムアセタールまたはこれらの骨格の類似体。
【００５８】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはα-アノマーオリゴヌクレオチドを含むこ とができる。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、その中で通常のβサブユニッ トとは対照的に鎖が互いに平行に並んでいる、相補的RNAと特異的二本鎖ハイブ リッドを形成する（ゴーティエ（Gautier）ら、Nucl. Acids. Res. 15：6625、1
987）。オリゴヌクレオチドは2'-O-メチルリボヌクレオチド（イノウエ（Inoue ）ら、Nucl. Acids. Res. 15：6131、1987）またはキメラRNA-DNA類似体（イノ ウエ（Inoue）ら、FEBS Lett. 215：327、1987）である。
【００５９】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは当技術分野において既知の標準的
な方法、例えば自動DNAシンセサイザー（例えばバイオサーチ社、アプライドバ イオシステムズ社等から販売されている製品）を用いることによって合成するこ
とができる。一例として、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドはスタイン
（Stein）ら（Nucl. Acids. Res. 16：3209、1988）の方法によって合成するこ とができ、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドは調整された孔を有するガ
ラスポリマー支持体を用いることによって調製することができる（サリン（Sari
n）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：7448、1988）。
【００６０】 アンチセンス分子はインビボでJNK3蛋白質を発現する細胞に輸送されなければ
ならない。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に輸送するために多くの方法が開発
されている；例えば、アンチセンス分子は組織部位に直接注射することができる
、または所望の細胞を標的とするようにデザインされた改変型のアンチセンス分
子（例えば、標的細胞表面に発現された受容体または抗原に特異的に結合するペ
プチドまたは抗体に結合したアンチセンス）を全身投与することができる。
【００６１】 しかし、内因性mRNAの翻訳を抑制するために十分なアンチセンス分子の細胞内
濃度を得ることはしばしば難しい。したがって、強いpol IIIまたはpol IIプロ モーターの制御下に置かれたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組換えDNA 構築物を用いたアプローチを用いてもよい。患者の標的細胞をトランスフェクト
するためにそのような構築物を用いると、内因性JNK3転写物と相補的塩基対を形
成する一本鎖RNAの十分量の転写が起こり、それによってそのmRNAの翻訳が妨げ られる。例えば、それが細胞に取り込まれて、アンチセンスRNAの転写を指向す るように、インビボでベクターを導入することができる。そのようなベクターは
、それが転写されて所望のアンチセンスRNAを生じることができる限り、エピソ ームとして留まる、または染色体に取り込まれることが可能である。
【００６２】 そのようなベクターは当技術分野で既知の組換えDNA技法によって構築するこ とができる。ベクターはプラスミド、ウイルス、または哺乳動物細胞の複製およ
び発現に用いられる当技術分野で既知の他のベクターとなりうる。アンチセンス
RNAをコードする配列の発現は、当技術分野において哺乳動物、好ましくはヒト 細胞において作用することが知られている如何なるプロモーターによっても行う
ことができる。このプロモーターは、誘導的もしくは構成的となりうる。適した
プロモーターにはSV40初期プロモーター領域（ベルノイスト（Bernoist）ら、Na
ture 290：304、1981）；ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復に含まれるプロモ ーター（ヤマモト（Yamamoto）ら、Cell 22：787〜797、1988）；ヘルペスチミ ジンキナーゼプロモーター（ワグナー（Wagner）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 78：1441、1981）；およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列（ブリンスタ ー（Brinster）ら、Nature 296：39、1988）が含まれるが、これらに限定しない
。構築物はまた、人工染色体上に含まれてもよい（例えば、哺乳動物の人工染色
体；MAC；ハリントン（Harrington）ら、Nature Genet. 15：345〜355、1997） 。
【００６３】 上記のいずれかの遺伝子治療アプローチによるJNK3アンチセンス核酸分子の産
生によって、JNK3蛋白質の細胞内レベルは無処置の個体に存在する量より少なく
なる。
【００６４】 リボザイム JNK3 mRNAの切断を触媒するようにデザインされるリボザイム分子もまた、こ れらのmRNAの翻訳およびJNK3 mRNAの発現を防止するために用いることができる （例えば、PCT公開番号、国際公開公報第90/11364号；サラバー（Saraver）ら、
Science 247：1222、1990を参照のこと）。部位特異的認識配列でmRNAを切断す る様々なリボザイムは、特異的mRNAを破壊するために用いることができるが、ハ
ンマーヘッドリボザイムを使用することが好ましい。ハンマーヘッド・リボザイ
ムは標的mRNAと相補的塩基対を形成する隣接領域によって指示される位置でmRNA
を切断する。唯一の要件は標的mRNAが以下の２つの塩基配列、すなわち5'-UG-3'
を有していることである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および産生は当技術
分野で周知である（ハセロフ（Haseloff）ら、Nature 334：585、1988）。好ま しくは、リボザイムは切断認識部位がJNK3 mRNAの5'末端近傍に存在するように 、すなわち有効性を増加させて非機能的mRNA転写物の細胞内蓄積を最小限にする
ように操作される。
【００６５】 ヒトJNK3において可能性があるリボザイム部位の例には、例えばヒトJNK3では
ヌクレオチド約224〜226位である開始メチオニンコドン、下流の開始部位と思わ
れるコドン（ヌクレオチド338〜340位）、およびヌクレオチド698〜670位；740 〜742位、および935〜937位を含むコード領域におけるさらなるコドンに対応す る5'-UG-3'部位が含まれる。
【００６６】 本発明のリボザイムはまた、テトラヒメナ・サーモフィラ（Tetrahymena Ther
mophila）に本来存在する酵素（IVSまたはL-19 IVS RNAとして知られる）のよう
なRNAエンドリボヌクレアーゼ（以降「セック」型リボザイムと呼ぶ）を含み、 これはセック（Cech）と共同研究者（ゾウグ（Zaug）ら、Science 224：574、19
84；ゾウグ（Zaug）ら、Science 231：470、1986；ツグ（Zug）ら、Nature 324 ：429、1986；PCT出願番号、国際公開公報第88/04300号；およびビーン（Been）
ら、Cell 47：207、1986）によって詳しく記述されている。セック型リボザイム
は標的RNA配列とハイブリダイズする８個の塩基対配列を有し、この後で標的RNA
の切断が起こる。本発明はJNK3蛋白質に存在する８個の塩基対活性部位配列を標
的とするそれらのセック型リボザイムを含む。
【００６７】 アンチセンスアプローチのように、リボザイムは改変したオリゴヌクレオチド
を含むことができ（例えば、安定性またはターゲティングを改善するため）、イ
ンビボでJNK3遺伝子を発現する細胞、例えば脳および脊髄に輸送されなければな
らない。好ましい輸送法は、トランスフェクトした細胞が内因性JNK3 mRNAを破 壊して翻訳を阻害するためにリボザイムの十分量を産生するように、強い構成的
pol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」DNA構
築物を用いることを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒であ
るため、有効性のために必要とされる細胞内濃度は低い。
【００６８】 上記のアプローチのいずれに関しても、治療的JNK3アンチセンスまたはリボザ
イム核酸分子構築物は、標的領域（例えば、急発作障害における活性の局所部位
、アルツハイマー病における海馬、パーキンソン病患者における黒質）に好まし
くは直接適用されるが、標的領域の近傍組織に適用すること、または標的領域を
流れる血管に適用することも可能である。
【００６９】 遺伝子療法のために、アンチセンスまたはリボザイムJNK3発現は、如何なる適
したプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス、シミアンウイルス40、
またはメタロチオネインプロモーター）によっても指向され、その産生は如何な
る所望の哺乳動物調節エレメントによっても調節される。例えば、望ましければ
、興奮毒性誘導下で細胞において選択的遺伝子発現を指向するエンハンサーを用
いて、急発作疾患を有する患者においてアンチセンスJNK3発現を指向することが
できる。
【００７０】 JNK3アンチセンスまたはリボザイム治療はまた、アンチセンスJNK3またはリボ
ザイムRNAを標的領域に直接投与することによっても得られる。このmRNAは標準 的な技法によって産生および単離することができるが、効率の高いプロモーター
（例えば、T7プロモーター）の制御下でアンチセンスJNK3 DNAを用いてインビト
ロ転写によって産生することが最も容易である。アンチセンスJNK3 RNAの標的細
胞への投与は、本明細書に記述の治療化合物の直接投与のための如何なる方法に
よっても行われる。
【００７１】 JNK3発現または活性を含む障害を治療する方法 本発明はまた、JNK3が障害的役割を有する場合の、特にヒトのような哺乳動物
における障害の治療を含む。急発作障害（例えば、てんかん）のような興奮毒性
、神経変性障害のような痴呆（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病）、
虚血のような脳血管障害、運動神経疾患（ALSを含む）、極度の熱または低温に よって引き起こされた損傷、外傷（例えば放射線照射、脊髄損傷、圧力、および
イオン不均衡）、代謝不均衡（例えば、低血糖症）、ならびにパーキンソン病を
含む多くの神経系の障害は、本明細書に記述の方法によって治療することができ
る。特定のいかなる理論に委ねることによっても本発明を制限することなく、実
質的な数の神経障害が少なくとも一部JNK3経路によって媒介される興奮毒性に起
因する。したがって、上記のように同定されたこの経路の阻害剤は、興奮毒性を
含む疾患の治療に有用である。
【００７２】 治療は、内因性JNK3遺伝子発現レベルを減少させるように、例えばJNK3 mRNA の翻訳を阻害または防止するためのアンチセンスまたはリボザイムアプローチ；
遺伝子の転写を阻害するための３重ヘリックスアプローチ；または遺伝子もしく
はその内因性プロモーターを不活化または「ノックアウト」するために標的化し
た相同的組換えを用いてデザインすることができる。本明細書に記述のアンチセ
ンス、リボザイムまたはDNA構築物は、標的細胞を含む部位；例えば脳または脊 髄の特定の領域に直接投与することができる。JNK3またはJNK3基質を認識する、
および発現されるように改変された、またはそうでなければ細胞に入る抗体また
は抗体の断片もまた、治療的に用いることができる。
【００７３】 有効量 本発明の化合物、例えばJNK3発現または活性を調節する化合物の毒性および治
療有効性は、標準的な薬学的技法によって、細胞培養または実験動物のいずれか
を用いてLD50（集団の50％に対して致命的な用量）およびED50（集団の50％に対
して治療的に有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果の用量
比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。大きい治療指数を 示すポリペプチドまたはその他の化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を
用いてもよいが、そのような化合物を罹患組織の部位に標的化する輸送系をデザ
インする場合には、非罹患組織に対して起こりうる損傷が最小限となり、それに
よって副作用を減少するように注意しなければならない。
【００７４】 細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて用いら
れる用量範囲を決定するために用いることができる。そのような化合物の用量は
好ましくは毒性をほとんどまたは全く示さないED50を含む循環中の濃度範囲内で
ある。用量は用いる投与剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変化
してもよい。本発明の方法において用いられる化合物に関して、治療的有効量は
細胞培養アッセイからまず推定することができる。細胞培養において決定された
IC50（すなわち、症状の半最大阻害を得る試験化合物の濃度）を含む循環中の血
漿濃度範囲が得られるように、動物モデルにおいて用量を決定してもよい。その
ような情報はヒトでの有効な用量をより正確に決定するために用いることができ
る。血漿中濃度は例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することが
できる。
【００７５】 製剤および使用 本発明に従って用いられる薬学的組成物は、一つ以上の生理学的に許容される
担体または賦形剤を用いて従来の方法で製剤化することができる。
【００７６】 したがって、化合物およびその生理学的に許容される塩および溶媒化合物は、
吸入（inhalation）もしくは通気（insufflation）（口または鼻のいずれかによ
って）、または経口、経頬、非経口、もしくは直腸投与によって投与するために
製剤化してもよい。
【００７７】 経口投与に関しては、薬学的組成物は例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン
処理したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、乳糖、微結晶セルロースまたはリン
酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまた
はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、またはグリコール酸ナトリ
ウムデンプン）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬
学的に許容される賦形剤を用いた従来の手段によって調製された錠剤またはカプ
セル剤の形であってもよい。錠剤は当技術分野で周知の方法によってコーティン
グしてもよい。経口投与用の液体製剤は例えば、溶液、シロップ剤または懸濁液
の剤形であってもよく、またはそれらは水もしくはその他の適した溶媒に使用前
に溶解する乾燥製剤の形状であってもよい。そのような液体製剤は懸濁剤（例え
ば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂肪）；乳化剤（
例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性溶媒（例えば、アーモンド油、油状
エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および保存剤（例えば、メチ
ルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような薬 学的に許容される添加剤によって従来の手段によって調製してもよい。調製物は
また緩衝塩、着香料、着色料、および甘味料を必要に応じて含んでもよい。経口
投与用製剤は、活性化合物の放出が制御されるように適切に製剤化してもよい。
【００７８】 バッカル剤投与に関しては、組成物は従来の方法で製剤化した錠剤またはトロ
ーチ剤の形であってもよい。
【００７９】 本発明の組成物を投与する好ましい方法は、中枢神経系、好ましくは脳、特に
障害部位の近傍または部位に直接、例えばアルツハイマー病では海馬、パーキン
ソン病では黒質、および急発作障害では局所部位に化合物を直接輸送することで
ある。したがって、投与は室内、くも膜下腔、または脳室内であってもよい。例
えば、直列フィルターを有するオマヤ・リザーバー・シャントは、脳槽空間に外
科的に留置することができる。適当な賦形剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）
を加えた治療化合物を処方に基づいて注射によってシャントに注入する。
【００８０】 吸入投与に関しては、本発明に従って用いられる化合物は、適した噴霧剤例え
ば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフ
ルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適した気体を用いて、加圧パックまた
はネブライザーからのエアロゾルスプレーの剤形で輸送すると都合がよい。加圧
エアロゾルの場合、投与単位は一定量を輸送するための弁を提供することによっ
て決定してもよい。化合物と、乳糖またはデンプンのような適した粉末基剤との
混合粉末を含む、例えばインヘラーまたはインサフレーターにおいて用いられる
ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化してもよい。
【００８１】 化合物は注射、例えば単回注射または持続的点滴注入による非経口投与のため
に製剤化することができる。注射用製剤は単位投与剤形、例えばアンプルまたは
保存剤を添加して複数回投与容器の形であってもよい。組成物は懸濁液、溶液ま
たは油性もしくは水性溶媒中での乳剤の剤形であってもよく、懸濁剤、安定剤お
よび／または分散剤のような処方用物質を含んでもよい。または、活性成分は使
用前に、適した溶媒、例えば滅菌発熱物質不含水に溶解する粉末剤形であっても
よい。
【００８２】 化合物はまた、例えばココアバターまたはその他のグリセリドのような従来の
坐剤基剤を含む坐剤または貯留浣腸のような直腸製剤に製剤化することができる
。
【００８３】 これまでに記述した製剤のほかに、化合物はデポー製剤として製剤化してもよ
い。そのような長時間持続型の製剤は植え込み（例えば、皮下もしくは筋肉内）
または筋肉内注射によって投与してもよい。このように、例えば化合物は適した
ポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳剤として）またはイ
オン交換樹脂と共に、または水溶性の低い誘導体、例えば水溶性の低い塩として
製剤化してもよい。
【００８４】 組成物は、必要に応じて、活性成分を含む一つ以上の単位投与剤形を含んでも
よいパックまたはディスペンサー装置の形であってもよい。パックは例えば、ブ
リスターパックのような金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パック
またはディスペンサー装置は投与説明書を添付してもよい。
【００８５】 本発明の治療的組成物は担体または賦形剤も含むことができ、その多くは当業
者に既知である。用いることができる賦形剤には、緩衝液（例えば、クエン酸緩
衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、ア
ルコール、アスコルビン酸、リン脂質、蛋白質（例えば、血清アルブミン）、ED
TA、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセ
ロールが含まれる。本発明の核酸、ポリペプチド、抗体または調節化合物は標準
的な投与経路によって投与することができる。例えば、投与は非経口、静脈内、
皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、被膜内、脊髄内、大槽内、腹腔
内、経頬、または経口となりうる。調節化合物は、対応する投与経路に応じて様
々な方法で製剤化することができる。例えば、液体溶液は摂取または注射するた
めに調製することができ；ゲルまたは粉末は摂取、吸入、または局所投与のため
に調製することができる。そのような製剤を作製する方法は周知であり、例えば
、「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」に見る ことができる。特に有用な投与経路は鼻または中枢神経系への直接注入であろう
と予想される。
【００８６】 実施例 実施例１．JNK3発現 マウスJNK3 cDNAの5'領域（ヌクレオチド62〜412位）に由来する351 bpの配列
をランダムプライミングによって[32P]で標識し、これをプローブとして用いてJ
NK3遺伝子の組織発現パターンを決定した。ノザンブロット分析は、精巣、腎臓 、骨格筋、肝臓、肺、脾臓、脳、および心臓から単離したポリ(A)+ mRNAの試料 ２ mgについて標準的な方法によって実施した。全てのノザンブロットは対照と して[32P]標識βアクチンをプローブとして調べ、各レーンにRNAの同程度の量が
ローディングされていることを確認した。脳では、2.7 kbの転写物に対応する強
いシグナルが、7.0 kb転写物に対応する弱いシグナルと共に検出された。2.7 kb
の転写物に対応する弱いシグナルは心臓においても検出された。精巣では2.4 kb
の転写物に対応するシグナルが検出された。JNK3発現は調べたその他の組織では
検出されなかった。
【００８７】 インサイチューハイブリダイゼーション分析から、JNK3が脳の多くの領域に発
現されていることが示された（マーチン（Martin）ら、上記）。したがって、マ
ウス脳の異なる領域（小脳、大脳皮質、海馬、中脳、視床、および脳幹）から、
TRIゾール試薬（ギブコ-BRL社）を用いて全RNA（10 mg）を単離し、上記のJNK3 プローブを用いてノザンブロットによって分析した。2.7 kbの転写物に対応する
シグナルは調べた脳の全ての切片において検出され、海馬に最も豊富に存在した
。
【００８８】 実施例２．JNK3遺伝子の標的破壊 JNK3欠損マウスを作製するために、内部４ kb Mscl-Spel JNK3ゲノム断片をPG
Kneoカセットに置換するようにターゲティングベクターをデザインした。JNK3遺
伝子地図、JNK3ターゲティングベクター、および変異JNK3遺伝子について予想さ
れる構造を図６に示す。制限酵素部位を示す（B、BamHI；Hp、HpaI；M、MscI；N
co、NcoI；R、EcoRI；Spe、SpeI）。10 kb NotI-EcoRI（NotI部位はベクターに 由来する）JNK3断片を129/Svマウス株のλFixIIファージライブラリ（ストラタ ジーン、インク）からクローニングした。ターゲティングベクターは、JNK3ゲノ
ム断片の5'末端からの4.0 kbのMscI断片、1.6 kb PGK-neoカセット（ネギシ（Ne
gishi）ら、Nature 376：435〜438、1995）、およびJNK3断片の3'末端の1.8 kb
SpeI-NcoI断片を、適当なリンカーを用いてpBluescript KSベクター（ストラタ ジーン、インク）に挿入することによって構築した。ターゲティングベクターは
、変異ES細胞の負の選択用JNK3ゲノム配列の5'末端に隣接する2.6 kb PGK tkカ セット（ネギシ（Negishi）ら、上記）を含む。JNK3遺伝子においてターゲティ ングベクターに置換された領域は、JNK3のアミノ酸211〜267位をコードする１と
２分の１のエキソンを含む（図5Bに示すように）。この領域は、JNKグループの 特徴であり、蛋白質キナーゼ活性にとって必要であるトリペプチド二重リン酸化
モチーフThr-Pro-Tyr（TPY）を含む（デリヤール（Derijard）ら、上記）。JNK3
座に示す２つの斜線の枠は、JNK3のサブドメインVIIIおよびIX（図5Bに示すJNK3
蛋白質のアミノ酸残基189〜267位をコードする）に対応する。
【００８９】 ターゲティングベクターはNotIで直鎖状にして、W9.5胚性幹（ES）細胞に電気
穿孔した。G418（200 mg/ml）（ギブコBRL社）およびガンシクロビル（２ mM） （シンテックス、パラアルト、カリフォルニア州）に抵抗性のトランスフェクタ
ントからゲノムDNAを単離して、サザンブロット分析によってスクリーニングし た。104個の独立したG418およびガンシクロビル抵抗性クローンのサザンブロッ ト分析によって、所望の相同的組換え事象を含む３個のクローンが明らかに示さ
れた（ターゲティング効率2.9％）。キメラマウスはこれらのES細胞をC57BL/6（
B6）マウス胚盤胞に注射することによって作製した。
【００９０】 これらのキメラマウスの尾に由来するEcoRI制限酵素処理DNAのサザンブロット
を放射性標識351 bp JNK3プローブを用いて調べた。EcoRI消化の結果、野生型に
対応する12 kbバンド（内因性対立遺伝子）および変異体に対応する4.2 kbバン ド（破壊された対立遺伝子）が得られた。
【００９１】 ２つのクローンは、破壊されたJNK3対立遺伝子の次世代マウスへの生殖系列伝
達を媒介する。ヘテロ接合体（+/-）を異種交配させると、ホモ接合体変異体マ ウス（-/-）を生じ、これはゲノムDNAのサザンブロット分析によって同定された
。マウス脳から単離した全RNAをノザンブロット分析によって調べた。ブロット をランダムプライミングした32P-標識マウスJNK3 cDNAプローブによって調べ、 次にこのプローブをはがして、マウスJNK1およびβアクチンcDNAプローブによっ
て連続的に再度プロービングした。脳における主なJNK3転写物は2.7 kbであり、
マウス脳におけるJNK1転写物は2.3および4.4 kbである。JNK3 cDNAプローブとハ
イブリダイズしたブロットは野生型（+/+）マウスでは転写物を検出したが、ホ モ接合ノックアウト（-/-）マウスでは検出しなかった。
【００９２】 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）分析を用いてJNK3転写物がホモ接合JN
K3（-/-）脳には存在しないことを確認した。JNK1プローブ（447 bp）をマウス 脳RNAからRT-PCR（Yangら、上記）によってアンプリマー5'-GTGTGCAGCTTATGATGC
TATTCTTGAA-3'（配列番号：21）および5'-CGCGTCACCACATACGGAGTCATC-3'（配列 番号：22）を用いて増幅した。マウス組織におけるJNK3 mRNAのRT-PCR検出（Yan
gら、上記）は、アンプリマー5'-CTGGAGGAGTTCCAAGATGTCTACT-3'（配列番号：23
）および5'-TGGAAAGAGCTTGGGGAAGGTGAG-3'（配列番号：24）を用いたRT-PCRによ
って行い、特異的537 bp DNA産物を生じた。マウス脳から単離したRNAは対照と してHPRTに特異的なプライマーを用いて増幅した。これらの実験からJNK3転写物
がホモ接合JNK3（-/-）脳には存在しないことが確認された。
【００９３】 JNK3（-/-）マウス脳はJNK3活性を欠損することを示すために蛋白質キナーゼ 解析を実施した。これらの実験では、基質GST-cJunを用いたゲル内蛋白質キナー
ゼ解析によってJNK1およびJNK2の免疫欠失後に、脳溶解物におけるJNK3キナーゼ
を測定した（デリヤール（Derijard）ら、上記）。野生型（+/+）およびホモ接 合ノックアウト（-/-）脳からのマウス海馬溶解物（30 μg）を解析したところ 、野生型では55 kDおよび46 kD JNK3イソ型を検出したが、JNK3（-/-）マウスで
は認められず、JNK3（-/-）マウス脳がJNK3キナーゼ活性を欠損することが確認 された。それと共に、これらのデータはJNK3遺伝子の標的破壊の結果、ヌル対立
遺伝子を生じることを示した。
【００９４】 JNK3（-/-）マウスは生殖能力を有し、大きさも正常であった。多様な組織の 組織学的調査では、心臓、肺、胸腺、脾臓、リンパ節、肝臓、腎臓および骨格筋
のヘマトキシリンおよびエオジン（H＆E）染色を用いて明らかな異常は認められ
なかった。JNK3（-/-）および野生型マウス脳は、錘体神経マーカー（MAP-2）、
ニューロン間マーカーであるカルビンジンおよびパルブアルブミン、星状細胞マ
ーカー（グリア筋原繊維酸性蛋白質；GFAP；ス（Hsu）ら、J. Histochem. Cytoc
hem. 29：577〜580、1981）、およびニスル染色（ス（Hsu）ら、上記）の免疫細
胞化学分析によって調べた。これらの試験はJNK3（-/-）マウスが脳の明らかに 正常な発育および構造的オーガニゼーションを有することを明らかにした。かな
りの数の運動神経ニューロンが野生型およびJNK3（-/-）マウスの顔面神経核に 認められた（生後10日での核１個あたりニューロン2150〜2300個、n＝４）。ニ ューロンを形態によって同定し、野生型およびJNK3（-/-）マウスの顔面神経核 全体の連続切片の二重盲検アッセイ法によって計数した。このように、JNK3（-/
-）マウスでは細胞死を含む明らかな発達異常を認めなかった。
【００９５】 実施例３．JNK3欠損マウスはKA誘導急発作に対して抵抗性である JNK（-/-）マウスおよびその野生型の同腹子にKA 30 mg/kgを腹腔内（i.p.） 投与して、急発作を誘発した（ベン・アリ（Ben-Ari）、上記）。野生型マウス では、KAの投与はまず、異常な姿勢を示す「狂ったような発作」を誘発し、その
後頭を振る行動（「濡れたイヌのように体を振ること」）、前肢の振せん、後肢
で立ち上がる、姿勢を保てない、および最終的に持続的な痙攣へと進行する。急
発作活動は典型的に注射後１時間で鎮静する。野生型およびへテロ接合体マウス
は、注射後30〜40分で後肢で立ち上がることを含む急発作の運動症状を発症する
。対照的に、JNK3（-/-）マウスははるかに軽度の症状を発症し、主に「狂った ような発作」および時折のミオクローヌス痙攣を含んだ。この用量では、JNK3（
-/-）マウスは大発作を発症せず、野生型およびヘテロ接合体マウスよりはるか に急速に回復した。JNK3（-/-）マウスは、KAのより高用量（45 mg/kg、i.p.） に限って野生型マウスと同等の重症度の急発作を発症した。しかし、KAのこの高
用量では、野生型マウスの60％以上が持続性の持続性クローヌス性痙攣のために
死亡したが、JNK3（-/-）マウスは全て生存した。これらの結果は、JNK3（-/-）
マウスは興奮毒性KAの作用に対して抵抗性であったことを示している。さらに、
JNK3（-/-）マウスは野生型マウスより速やかに薬物投与から回復した（図７） 。図７および８に示す急発作の分類は：１、動きの停止；２、短い攣縮を伴う頭
頸部のミオクローヌス攣縮；３、一側性のクローヌス活性；４、両側性の前肢持
続性クローヌス性活性；および５、しばしば死亡に至る姿勢緊張の喪失を伴う全
性持続性クローヌス活性である。
【００９６】 実施例４．ペンテトラゾール（PTZ）誘発急発作に対する抵抗性 KA誘発急発作に対する抵抗性は同腹子の間で異なるため（+/+および+/-は-/- マウスより抵抗性が低い）、認められた感受性の差はマウス系統の差に帰するこ
とはできない（シャウエッカー＆スチュワート（Schauwecker and Stewart）、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 94：4103〜4108、1997）。しかし、JNK3欠損マウス
のKA誘発急発作に対する抵抗性は、血液脳関門を通過する薬剤の減少またはGABA
（ガンマアミノ絡酸）阻害性シナプス後電位（IPSP）の増加、またはJNK3蛋白質
キナーゼによって媒介される特異的シグナル伝達経路の切断が原因となりうる。
これらの可能性を識別するために、もう一つのてんかん誘発性薬剤であるペンテ
トラゾール（PTZ）（シグマ社）に対するJNK3（-/-）および野生型マウスの反応
を調べた。PTZはGABA-IPSPsを遮断することによって急発作誘発能を有すること から選択された（ベン・アリ（Ben-Ari）ら、Neurosci. 6：1361〜1391、1981）
。
【００９７】 JNK3（-/-）マウスおよび野生型の同腹子は、PTZの調べた全ての用量（30、40
、50、60 mg/kg、i.p.；図８）において同等の重症度の急発作を発症した。その
上、KA誘発急発作において認められる運動症状の遅い進行とは異なり、PTZは注 射後５分以内に突然に全身性の持続性クローヌス性痙攣を誘発し、おそらくこれ
はそのてんかん誘発作用機序がGABA-IPSPの細胞外阻害を通じて単独で作用する ことを反映している。このように、JNK3（-/-）マウスにおけるKA毒性に対する 感受性が異なることは、神経系への薬剤輸送が不良である結果としても、または
神経回路における強力なGABA-IPSPsによっても説明できない。さらに、標準的な
方法を用いた免疫細胞化学によって、カイネート型のグルタメート受容体サブユ
ニットGluR5-7（ファーミンゲン社、カタログ番号60006E）の発現を調べた。
【００９８】 海馬CA1亜分野における錘体ニューロンは、Glu5-7抗体によって最も顕著に標 識された。野生型およびJNK3（-/-）マウスではいずれも、海馬のCA1亜分野にお
いて軽度に標識された細胞体から生じた先端樹状突起が顕著に標識されており、
これは霊長類の海馬と類似のパターンであった（グッド（Good）ら、Brain Rese
arch 624：347〜353、1993）。カイネート型サブユニットGluR5-7のほかに、様 々なグルタメート受容体サブタイプに必須であるGluR1サブユニットの発現パタ ーン、および細胞外カルシウムの流入を緩衝する可能性がある細胞内カルシウム
結合蛋白質パルブアルブミンおよびカルビンジンもまた、JNK3（-/-）と野生型 マウスとの間で同程度であった。これらのことから、これらの結果からは、JNK3
（-/-）マウスのKA誘発興奮毒性に対する抵抗性に関与している可能性がある明 白な構造異常が示されていない。
【００９９】 実施例５．c-JunのKA誘発リン酸化の減少 野生型マウスにおけるKAの全身投与は、JNK3蛋白質キナーゼによって媒介され
るストレス反応経路を誘発する可能性がある。この可能性を調べるために、KAが
野生型およびJNK3（-/-）マウスに対して同等レベルの侵害刺激となるか否かを 決定するために、前初期遺伝子c-fosおよびc-junの発現を調べた（モーガン（Mo
rgan）ら、Annu. Rev. Neurosci. 14：421〜451、1991；スメイネ（Smeyne）ら 、Nature 363：166〜169、1993；カソフ（Kasof）ら、J. Neurosci. 15：4238〜
4249、1995）。全RNAは、KA注射（30 mg/kg、i.p.）前および注射後0.5、２、４
または８時間目に屠殺したマウスの海馬から抽出し、ノザンブロットをマウスc-
fosおよびc-junプローブによって調べた。c-Junプローブはマウスc-Jun cDNAの ヌクレオチド888〜1094位（図９）に対応する207 bp断片であった。c-Fosプロー
ブはマウスc-Fos遺伝子の347 bp断片であった（エキソン４；塩基対2593〜2939 ）（図10）。JNK3（-/-）および野生型マウスはいずれも、c-fosおよびc-jun転 写物の同等レベルの迅速な誘導を示し、これは注射後４時間では次第に減少した
。
【０１００】 この現象をさらに明確にするために、海馬のシナプス回路と共にKA誘発c-Fos およびc-Jun免疫反応性の分布を調べた。これらの実験において、ホモ接合変異 体および対照野生型マウスを屠殺して、KA（30 mg/kg、i.p.）注射の２または６
時間後に４％パラホルムアルデヒドの経心臓還流によって固定した。双方の群の
脳を切除して、１時間、前固定し、ビブラトームで切片（厚さ40 mm）にした。 組織切片を、c-Jun（サンタクルズ、カタログ番号sc-45）、c-Fos（サンタクル ズ、カタログ番号sc-52）およびホスホ特異的c-Jun（Ser-73）（ニューイングラ
ンド・バイオラブズ、#9164S）の発現を検出するために免疫細胞化学によって処
理した。切片を一次抗体の溶液中で浮遊させ（PBSで200倍希釈）、室温で一晩イ
ンキュベートした。二次抗体インキュベーション、アビジン・ビオチン結合ペル
オキシダーゼ（ベクタステイン、エリートABCキット、ベクターラボラトリーズ ）およびDAB（3,3'-ジアミノベンジジン、シグマ社）反応は標準的な技法を用い
て実施した（ス（Hsu）ら、上記）。KAの非存在下では、検出可能なc-Fos発現は
認められず、歯状回内部にいくつかのc-Fos陽性細胞を認めたに過ぎなかった。K
A（30 mg/kg、i.p.）注射の２時間後、海馬領域全体にc-Fos免疫反応性の大きな
増加が認められ、これは野生型およびJNK3（-/-）マウスの双方で同じであった 。同時に、野生型およびJNK3（-/-）マウスの双方において歯状回および海馬のC
A3領域にc-Jun陽性細胞数の増加が認められた。KA注射の６時間後までに、c-Jun
発現は野生型およびJNK3（-/-）マウスの双方においてCA1領域まで拡大した。c-
Fosおよびc-Junの誘導は一般に、侵害刺激後のニューロン活性の指標として容認
されている（モーガン（Morgan）ら、上記）。c-Junおよびc-Fos標識細胞の誘導
レベル、時間経過、および分布が同等であったことから、JNK3（-/-）および野 生型マウスがKAの全身投与によって同レベルの侵害ストレスを受けやすいことが
示唆された。
【０１０１】 c-Junは、JNKによるNH2末端活性化ドメインのリン酸化によって活性化される 。リン酸化されたc-Junの発現はJNK様活性がJNK3（-/-）マウスに存在するか否 かを測定するもう一つの手段となる。リン酸化c-Junの発現はSer-73でリン酸化 されたc-Junに対して作製した抗体を用いて調べた（ホィットマーシュ（Whitmar
shら、上記；デリヤール（Derijard）ら、上記；キリアキス（Kyriakis）ら、上
記）。KAをチャレンジする前では、野生型またはJNK3（-/-）マウスのいずれに おいても抗体によって標識された細胞はなかった。KA注射の２時間後までに、野
生型マウスの歯状回および海馬のCA3/CA4領域に高レベルのリン酸化c-Junを認め
た。対照的に、JNK3（-/-）マウスではリン酸化c-Junの検出量は痕跡が見られる
程度の量であった。このように、JNK3（-/-）マウスではc-Junの持続的なリン酸
化のレベルは減少しているかまたは少なかった。
【０１０２】 さらに、野生型マウス海馬においてリン酸化c-Junの分布の動的な変化を認め た。KA注射後６時間までに、リン酸化c-Junの発現は歯状回では沈静化し、海馬C
A3領域の一部の領域へと移動した。より高倍率で見ると、細胞破壊の中心を取り
囲むようにリン酸化c-Junが発現されたことが明白になった。対照的に同じ時点 でJNK（-/-）マウスにはリン酸化c-Junによる標識は検出されなかった。海馬CA3
領域は、おそらくKA結合親和性が高いこと（ベルガー（Berger）ら、上記）およ
びCA3錘体神経間の興奮性シナプス連絡が強力であること（ウェストブルック（W
estbrook）ら、Brain Research 273：97〜109、1983）から、KA興奮毒性に対し て最も易損性の構造であると明確に示されている。これらの結果はKAによって誘
発されるc-Junのリン酸化にはJNK3が必要であることを示している。
【０１０３】 実施例６．KA誘発AP-1転写活性の低下 c-Junのリン酸化はAP-1転写活性の誘導の際の重要な初回事象であるため（ホ ィットマーシュ（Whitmarsh）ら、上記；ヤン（Yang）、上記）、JNK3（-/-）マ
ウスにおいて観察されたc-Junリン酸化の減少によってAP-1転写活性の誘導が減 少するか否かを調べた。JNK（-/-）マウスをトランスジェニックAP-1ルシフェラ
ーゼ（AP1-luc）マウスと交配させて（リンコン（Rincon）ら、Embo J. 13：437
0〜4381、1994）、子孫を戻し交配させた。JNK3（-/-）/API-Luc（-/+）マウス をJNK3（+/+）マウスと共に実験において用いて、JNK3の存在下または非存在下 でのKA誘発AP-1転写活性レベルを比較した。AP1-lucマウスは、ラットプロラク チンプロモーターが最小である場合にコンセンサスAP-1結合部位の４つのコピー
の制御下で蛍のルシフェラーゼ遺伝子を含む。これらのマウスにルシフェラーゼ
が発現されるのはAP-1調節エレメントの存在によることが確認されている。
【０１０４】 ルシフェラーゼ解析において、KA（30 mg/kg、i.p.）を注射後マウスを一定間
隔で屠殺して、相対的ルシフェラーゼ活性を溶媒（生理食塩水）を注射したマウ
スから得た海馬溶解物において検出されたルシフェラーゼ活性と比較した。マウ
スを断頭して、脳を解剖して脳組織を25 mM Hepes、pH 7.4、１％トライトン（ 登録商標）X-100、1 mM EDTA、１mMフェニルメチルスルホニルフルオライドおよ
び10 μg/mlロイペプチン（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）を含 む緩衝液に直ちに溶解させた。ルシフェラーゼ活性はリンコン＆フラベル（Rinc
on and Flavell、Embo. J. 13：4370〜4381、1994）に記述のように測定した。K
A（30 mg/kg、i.p.）の注射によって、ルシフェラーゼ活性の誘導によって証明 されるように、野生型マウスの海馬にAP-1転写活性が大きく誘導された。野生型
マウスにおけるルシフェラーゼ活性は６時間までに検出可能となり、その後徐々
に増加して３日目に最大となり少なくとも７日間持続した（図11）。対照実験は
、溶媒（生理食塩水）の注射によって、AP1-lucマウスにルシフェラーゼ活性が 誘導されなかったことを示した。
【０１０５】 野生型（+/+）およびJNK3（-/-）マウスから調製した海馬および小脳における
相対的ルシフェラーゼ活性をKA注射後に測定した。結果を図12に示す。それぞれ
の時点は個々の動物３〜５匹の平均値（+SEM）を表す。ルシフェラーゼ活性の誘
導は海馬で最も顕著であり、ここでは小脳および大脳皮質と比較してc-Junリン 酸化の著しく大きい誘導を認めた。AP-1活性の誘導は、野生型マウスの場合と比
較してAp1-luc導入遺伝子を有するJNK3（-/-）マウスでは有意に減少した。KA注
射の15時間後、JNK3（-/-）マウスと比較して野生型マウスの海馬におけるAP-1 活性はほぼ４倍大きかった。注射３日後、AP-1活性は野生型マウスの海馬ではJN
K3（-/-）マウスと比較して６倍以上高かった。これらのことから、これらのデ ータはJNK3遺伝子の破壊によって、インビボにおいて海馬におけるc-JunのKA誘 発リン酸化およびAP-1転写活性が抑制されたことを証明している。
【０１０６】 実施例７．KA誘発アポトーシスに対する抵抗性 他のてんかん誘発物質の中でもKAの一つの独自の特徴は神経細胞死の誘導能で
ある（ベン・アリ、上記；シュウォブ（Schwob）ら、上記）。細胞を破壊すると
いうこのような特性はAP-1転写活性の持続的レベルと平行しているため、AP-1が
KA誘発神経細胞死を媒介することが示唆されている（カソフ（Kasof）ら、上記 ；シュワルツチルド（Schwarzschild）ら、J. of Neurosci. 17：3455〜3466、1
997）。したがって、野生型およびJNK3（-/-）マウスの脳をKAによる処置後に調
べて、JNK3（-/-）マウスにおけるAP-1転写活性の低下によってニューロン障害 の程度が変化したか否かを決定した（ベン・アリ、上記；シュウォブ（Schwob）
ら、Neurosci. 5：991〜1014、1980）。
【０１０７】 これらの実験は以下のように実施した。野生型およびJNK3（-/-）マウスを屠 殺して、KA（30 mg/kg、i.p.）の注射後３日間４％パラホルムアルデヒドおよび
1.5％グルタルアルデヒドを経心臓還流することによって固定した。脳の半薄切 片および薄切片をビブラトームを用いて調製してエポンに抱埋した。ダイヤモン
ド管を有するミクロトームを用いて組織ブロックから厚さ１μmの半薄切片を調 製して、これをトルイジン・ブルー染色によって調べ、超薄切片に関しては電子
顕微鏡によって調べた。海馬に対する損傷をまず調べるためにニシル染色を用い
た（クルバー（Kluver）ら、J. Neuropath. Exp. Neuro. 12：400〜403、1953）
。GFAP免疫細胞化学も用いて海馬における細胞破壊を評価した（ス（Hsu）ら、 上記）。ニシル染色は上記のように実施した。アポトーシスを評価するために用
いられるTUNELアッセイは、蔗糖によって凍結から保護されている脳半球の凍結 切片（50 μm）を用いて実施した。TUNELアッセイは、ターミナルデオキシヌク レオチジル・トランスフェラーゼ（TdT）媒介dUTPニックエンド標識アッセイか ら改変した（ガブリエリ（Gavrieli）ら、J. Cell. Biol. 119：493〜501、1992
）。簡単に説明すると、生理食塩水を添加したスライド上に直接載せた組織切片
を２％トライトン（登録商標）X-100によって透過性にし（室温で20分）、0.32
U/μl TdT（ベーリンガー・マンハイム社、カタログ番号220582）および２μMジ
ゴキシゲニン-11-dUDP（ベーリンガー・マンハイム社、カタログ番号1573152） を用いて最終容量40 μlとしてニックエンドを標識するために２時間インキュベ
ートした。組織を、500倍に希釈した抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガー・マ ンハイム社、カタログ番号1333062）と共にインキュベートして、標準的な技法 を用いて免疫細胞化学のために処理した（ス（Hsu）ら、上記）。
【０１０８】 KAによって引き起こされた海馬に対する障害は、まずニスル染色液によって調
べた。KAによる細胞の喪失によって、CA3領域における錐体ニューロン染色が脱 色されるか、またはCA1亜分野全体での染色が散在性でまばらとなるかのいずれ かが生じた。ニスル染色液によって明らかにされた細胞破壊を確認するために、
TUNEL法を適用してアポトーシスを検出した。ニスル染色を示さない海馬CA3亜分
野では、小さい濃縮した核および陽性TUNEL標識細胞の集団を認めた。同様に、 濃縮核および破壊された先端樹状突起、ならびに強くTUNEL標識された無数の細 胞を示す錐体ニューロンが高い割合で、ニスル染色の減少を示した海馬CA1亜分 野に存在した。TUNEL法および核濃縮の形態は動的プロセスの一時点での細胞損 傷の程度を示しているに過ぎないため、損傷によって誘発されたGFAPの免疫染色
についても、海馬における細胞破壊程度の独立した評価として用いた。ニスル、
トルイジン、およびTUNEL染色のパターンと一致して、海馬CA3またはCA1領域の いずれかにおいて、強くGFAP標識された星状細胞数が増加していることが認めら
れた。このように、半薄切片のニスル染色、GFAP免疫細胞化学、TUNEL法、およ びトルイジン染色を組合せて用いて、マウス海馬におけるKA誘発損傷を分類した
。
【０１０９】 全体で野生型17例およびJNK3（-/-）マウス18例を調べた。結果を表１に示す （下記）。表は２組のデータから編集した。まず、野生型（n＝11）およびJNK3 （-/-）マウス（n＝10）をKA（30 mg/kg、i.p.）の単回注射後５日目に屠殺した
。次に、野生型（n＝６）およびJNK3（-/-）マウス（n＝８）にKA（30 mg/kg、i
.p.）を５日間連続して注射し、最後の注射後２日間調べた。野生型マウスにお ける海馬損傷の重症度は双方のプロトコールを用いた実験において同等であった
。細胞喪失なし／CA3病変／CA3+CA1病変の比は１回注射実験では２/７/２、およ
び複数回注射実験では２/２/２であった。
【表１】
【０１１０】 海馬CA3領域は野生型マウスにおいてKA誘発損傷を最も受けやすかった（9/17 、53％）。細胞の喪失はCA3領域におけるクリスタルバイオレット染色の減少に よって示された。死につつある細胞のDNA断片化を同定するTUNEL法を用いると（
ガブリエリ（Gavrieli）ら、上記）、障害を有する領域に標識した細胞のグルー
プを認めた。濃縮した核の集団は、トルイジンブルー染色を施した半薄切片のCA
3領域に認められた。KA誘発損傷の結果として、GFAPの強い免疫染色によって示 されるように、CA3領域に限定された選択的グリア増殖を認めた。野生型動物の 中には、大量の細胞喪失が海馬CA1領域全体に認められた動物もあった（4/17；2
4％）。同様に、CA1領域に対する損傷はクリスタルバイオレット染色の減少、陽
性TUNEL標識細胞、濃縮核、錐体ニューロンの破壊された先端樹状突起、ならび にGFAP陽性星状細胞の肥大および増殖から明らかであった。
【０１１１】 対照的に、調べたJNK3（-/-）マウス（n＝18）のいずれにも明らかな海馬損傷
を認めなかった。JNK3（-/-）マウスの半薄切片のニスル染色、TUNELアッセイ、
トルイジン・ブルー染色および海馬領域のGFAP免疫染色は、無処置の野生型マウ
スのものと識別できなかった。その上、JNK2（-/-）マウスはKAの半致死用量45
mg/kgによって同程度の重症度の急発作を発症した（持続的痙攣により、野生型 マウスの60％以上にとって致命的である用量）が、それにもかかわらず、細胞損
傷を認めた動物ははるかに小さい割合であった（2/15、13％；カイ二乗分析によ
ってp＜0.005、d.f.＝１）。
【０１１２】 アポトーシスを評価する方法（例えば、TUNELアッセイ）は、JNK3調節物質が アポトーシスに影響を及ぼすか否かを評価するために用いることができる。
【０１１３】 実施例８．KA誘発ニューロン損傷に関連した超構造的変化の電子顕微鏡分析 インビトロにおいて皮質ニューロンはグルタメート類似体であるN-メチル-D- アスパルテート（NMDA）の細胞外濃度に応じてアポトーシスまたは壊死のいずれ
かを起こす（ボンフォコ（Bonfoco）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：7162
〜7166、1995）。壊死は一般にデノボ蛋白質合成を含む能動的な細胞死プログラ
ムとは適合しない急性の機械的傷害の結果を表すと考えられるため、KA誘発ニュ
ーロン損傷においてアポトーシスと壊死とを識別することは重要である。TUNEL 結果（上記）はアポトーシスの関与を示している。KA誘導によるインビボでのニ
ューロンの死がアポトーシスであるか壊死的であるか否かをさらに調べるために
、電子顕微鏡を用いて変性した海馬ニューロンにおける超微細構造的変化を調べ
た。顕微鏡分析は、野生型マウスにおいて、アポトーシスの結果としてニューロ
ン損傷を示す一連の形態学的変化を示唆した。KA（30 mg/kg、i.p.）注射後の初
回事象は、錐体ニューロンにおける染色質が核膜の内表面上で隣接する電子的に
密な塊へと圧縮および分離されることであるように思われた。対照的に、KA注射
後のJNK3（-/-）マウスにおける海馬ニューロンの核は、均一な電子透過性の真 正染色質を含んだ。野生型マウスでは後期において、核輪郭の回旋および細胞質
の濃縮を認めた。野生型マウスの核膜の二重層構造は、これらの形態学的段階の
全てにおいてほとんど無傷のままであった。最終的に、変性したニューロンが崩
壊して、多くの膜結合アポトーシス小体を生じた。これらの形態学的特徴は全て
アポトーシスの特徴と一致する（ケール（Kerr）ら、Br. J. Cancer 26：239〜2
57、1972）。このように、KAは、JNK3欠損ニューロンには存在しない、損傷した
ニューロン内でアポトーシスに至る遺伝子プログラムを誘発するように思われた
。
【０１１４】 これらの結果は、c-JunのNH2-末端活性化ドメインのKA誘発リン酸化によってA
P-1転写活性およびニューロンのアポトーシスが増加することを示唆している。 特定の理論に拘束されることなく、KAによって引き起こされたニューロンのアポ
トーシスに至る一連の提案された分子事象を図13に示す。
【０１１５】 KAの全身投与は海馬CA3領域に特に局在する細胞の損傷を引き起こすが、スト レス誘発性のニューロンアポトーシスにおいてJNK3が重要であることは、この領
域に限定したものではない。CA3海馬ニューロンがKAに対して特に易損性である のは、その独自の細胞およびシナプス特徴によるためであることがいくつかの証
拠から示されている。第一に、海馬CA3およびCA4領域はKA受容体の密度が最も高
い（ベルガー（Berger）ら、Neurosci. Lett. 39：237〜242、1983）。第二に、
反復性のシナプス興奮は海馬CA3領域において特に強力である（マイルス（Miles
）ら、J. Physiol. （London）373：397〜418、1986）。CA3錐体ニューロンの反
復性の興奮は、JNK3シグナル伝達を継続させ、したがってKA興奮毒性を急速に誘
発する可能性がある。c-Junリン酸化が歯状回からCA3領域へと進行することが認
められたことは海馬のシナプス回路を暗示している。海馬構造内のトリシナプス
接続の図を図14に示す。最初のシナプスリレー（1）は、求心性穿孔経路（pp） から歯状回（DG）の顆粒細胞上に至る。第二のリレーは歯状回の苔状繊維からCA
3海馬ニューロンに至る。第三のリレー（3）は、シェーファー側副枝（Sch）に 沿って海馬CA3からCA1領域に至る。CA3領域では錐体ニューロンの反復性のシナ プス相互作用がある。
【０１１６】 実施例９．JNK3蛋白質キナーゼ活性の阻害剤の検出のためのアッセイ法 JNK3の阻害剤は蛋白質キナーゼ解析において同定することができる。これらの
解析は組織（例えば脳）から精製したJNK3、または組換え型酵素を用いたJNK3を
用いて行うことができる。組換え型JNK3は、標準的な技法を用いて細菌、酵母、
昆虫または哺乳動物細胞から単離することができる。内因性（天然の）JNK3の解
析法は当技術分野で既知であり、組換え型JNK3の解析法は既に記述されている（
グプタ（Gupta）ら、EMBO J. 15：2760〜2770、1996）。
【０１１７】 JNK3の蛋白質キナーゼ活性はインビトロアッセイにおいてATPおよびJNK3に対 する蛋白質基質を用いて測定することができる。これらの基質には転写因子ATF2
およびElk-1が含まれるが、これらに限定しない（グプタ（Gupta）ら、1996、上
記）。基質へのリン酸の取り込みはいくつかの方法によって測定することができ
る。一例は放射活性リン酸塩（例えば32P）の基質への取り込みを測定すること である。基質への取り込みは、トリクロロ酢酸による沈殿によって取り込まれて
いない放射活性を除去して、ホスホセルロース濾紙上で回収することによって、
またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定することができる。放射活
性はシンチレーション計数、リン画像化分析、またはオートラジオグラフィーに
よってモニターすることができる。一般に、自動高処理能スクリーニングのため
の方法は、放射活性材料を用いない。この目的のため、放射活性プローブを使用
せずにリン酸化した基質を検出する方法が用いられる。一つのアプローチにおい
て、基質の電気泳動移動度を調べる。例えば、ATF2は、Thr-69またはThr-71上で
のJNKによるリン酸化後に電気泳動移動度が著しく減少することを示している（ グプタ（Gupta）ら、Science 267：389〜393、1995）。
【０１１８】 第二のアプローチは免疫化学法を用いて基質のリン酸化を検出することである
（例えば、ELISA）。リン酸化した基質に特異的に結合する抗体は、調製され（ モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体）、および市販されている（例え
ば、ニューイングランド・バイオラブズ、プロメガコーポレーション、およびア
ップステート・バイオテクノロジー・インク）。次に、基質のリン酸化の程度を
、当技術分野で既知の方法を用いて、分光光度計または蛍光光度計による検出に
適した第二抗体カップリング分子を用いた標準的なELISA解析によって測定する 。
【０１１９】 JNK3を阻害する分子は高処理能スクリーニングにおいて同定することができる
。興奮毒性障害を治療するために好ましい候補である分子はJNK3を阻害するが、
関連するMAPキナーゼを含むその他の蛋白質キナーゼは阻害しない。ひとたび同 定された候補分子は組合せ化学法または関連する分子の合成によって最適にする
ことができる。これらの分子はJNK3療法に関して調べることができる候補薬剤で
ある。
【０１２０】 実施例10．JNK3活性化の阻害剤の検出アッセイ法 JNK蛋白質キナーゼは、蛋白質キナーゼサブドメインVIII内でのThrおよびTyr 上での二重のリン酸化によって活性化される（デービス（Davis）、Trends Bioc
hem. Sci. 19：470〜473、1994）。リン酸化を活性化するこれらの部位はJNK3に
おいて保存されている（グプタ（Gupta）ら、1996、上記）。JNK3のリン酸化を 妨害することによってJNK3の活性化を阻害する分子は、候補分子の存在下および
非存在下においてJNK3活性化を測定することによって同定することができる。JN
K3を発現する細胞、例えば、ニューロン細胞、神経内分泌細胞、または組換え型
JNK3を発現するように操作された細胞（グプタ（Gupta）ら、1996、上記）を、J
NK3を活性化させるために、環境的ストレス（例えば、脱分極、興奮毒性物質、 紫外線照射、熱、および無酸素に暴露する。JNK3活性化状態はいくつかの方法に
よって評価することができる。例えば、JNK3を単離して、候補阻害物質を含まな
くなるまで洗浄し、蛋白質キナーゼ解析によってJNK3の活性化状態をモニターす
る（上記）。または、JNK3の活性化は、JNK3のThrおよびTyrリン酸化（活性化）
型に結合する抗体を用いた免疫学的方法を用いてプロービングことができる。Th
rおよびTyrリン酸化酵素に特異的に結合する抗体は、調製することができ（モノ
クローナル抗体およびポリクローナル抗体）、および市販されている（例えば、
ニューイングランド・バイオラブズおよびプロメガ・コーポレーションから）。
次に基質のリン酸化の程度は、分光光度測定または蛍光光度検出にカップリング
した二次抗体を用いた標準的なELISA解析によって測定することができる。
【０１２１】 その他の態様 本発明はその詳細な説明と共に記述してきたが、前述の説明は本発明の範囲を
説明することを目的としており、添付の請求の範囲によって定義される本発明の
範囲を制限すると解釈してはならない。その他の局面、長所および改変は以下の
請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図1A】 ゲンバンクアクセッション番号U34819の核酸配列（配列番号：１）を示す。
【図1B】 ゲンバンクアクセッション番号U34819のアミノ酸配列（配列番号：２）を示す
。
【図1C】 配列番号：３の核酸配列を示す。
【図2A-2B】 ゲンバンクアクセッション番号U34820の核酸配列（配列番号：４）を示す。
【図2C】 ゲンバンクU34820のアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。
【図2D】 配列番号：６の核酸配列を示す。
【図3A-3B】 ゲンバンクアクセッション番号U07620の核酸配列（配列番号：７）を示す。
【図3C】 ゲンバンクアクセッション番号U07620のアミノ酸配列（配列番号：８）を示す
。
【図4A】 ゲンバンクアクセッション番号L27128の核酸配列（配列番号：９）を示す。
【図4B】 ゲンバンクアクセッション番号L27128のアミノ酸配列（配列番号：10）を示す
。
【図5A】 ゲンバンクアクセッション番号L35236の核酸配列（配列番号：11）を示す。
【図5B】 ゲンバンクアクセッション番号L35236のアミノ酸配列（配列番号：12）を示す
。
【図６】 野生型JNK3遺伝子座、ターゲティングベクター、および変異または破壊された
JNK3遺伝子座の図である。
【図７】 野生型およびJNK3(-/-)マウスのカイニン酸（KA）注射に対する一時的な反応 を示す棒グラフである。
【図８】 野生型およびJNK3(-/-)マウスのペンテトラゾール（PTZ）注射に対する一時的
な反応を示す棒グラフである。
【図9A】 マウスc-Junの核酸配列（ゲンバンクアクセッション番号X12740；配列番号：1
3）を示す。
【図9B】 マウスc-Junのアミノ酸配列（ゲンバンクアクセッション番号X12740；配列番 号：14）を示す。
【図10A-B】 マウスc-Fosの核酸配列（ゲンバンクアクセッション番号V00727；配列番号：1
5）を示す。
【図10C】 マウスc-Fosのアミノ酸配列（ゲンバンクアクセッション番号V00727；配列番 号：16）を示す。
【図11】 トランスジェニックAP-1ルシフェラーゼマウスと交配させたJNK3(-/-)マウス において、ルシフェラーゼ活性によって反映される、KA誘導後の様々な時間での
KA誘導AP-1活性のレベルを示す棒グラフである。
【図12】 JNK3(-/-)マウスおよび野生型(+/+)マウスの海馬（HP）および小脳（CB）にお
けるルシフェラーゼ活性の相対レベルによって反映される、KA-誘発AP-1活性の レベルを示す棒グラフである。
【図13】 KAによって引き起こされ、ニューロンのアポトーシスに至る、提案される一連
の分子的事象の図である。
【図14】 海馬構造内の３シナプス接続の図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 21/00 21/00 25/08 25/08 25/14 25/14 25/16 25/16 25/28 25/28 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｎ 5/10 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ (72)発明者 レイキック パスコ アメリカ合衆国 コネティカット州 ニュ ー ヘブン セイント ローナン 253 (72)発明者 ホイットマーシュ アラン ジェイ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ウ ォーセスター アンドーバー ストリート 25 (72)発明者 クアン チア−イ アメリカ合衆国 コネティカット州 ウォ ーリングフォード ウィッフルツリー ロ ード 35 (72)発明者 ヤン デレク ディ アメリカ合衆国 インディアナ州 カーメ ル スプリングブルック ラン 12416

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の段階を含む、JNK3発現を調節する化合物を同定する方
    法： JNK3蛋白質を発現することができる細胞を、化合物の非存在下で細胞がJNK3蛋
    白質を発現するために十分な条件および期間、該化合物と共にインキュベートす
    る段階； 化合物の非存在下で同一条件および同一期間、対照細胞をインキュベートする
    段階； 化合物の存在下で細胞におけるJNK3発現を測定する段階； 対照細胞におけるJNK3発現を測定する段階；および 発現レベルに差があれば化合物がJNK3発現を調節することを示している、化合
    物の存在下および非存在下でJNK3発現量を比較する段階。
  2. 【請求項２】 化合物がJNK3の発現を減少させる、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 以下の段階を含む、JNK3活性を調節する化合物を同定する方
    法： JNK3活性を有する細胞を、化合物の非存在下で細胞がJNK3活性を発現するため
    に十分な条件および期間、該化合物と共にインキュベートする段階； 化合物の非存在下で同一条件および同一期間、対照細胞をインキュベートする
    段階； 化合物の存在下で細胞におけるJNK3活性を測定する段階； 対照細胞におけるJNK3活性を測定する段階；および 活性レベルに差があれば化合物がJNK3活性を調節することを示している、化合
    物の存在下および非存在下でJNK3活性量を比較する段階。
  4. 【請求項４】 化合物がJNK3活性を低下させる、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 JNK3ポリペプチドと基質との結合を調節する化合物を同定す
    る方法であって、選択した化合物の存在下および非存在下において基質に結合し
    たJNK3ポリペプチドの量を比較する段階を含み、JNK3ポリペプチドの基質への結
    合量に差があれば、選択した該化合物がJNK3ポリペプチドの結合を調節すること
    を示す方法。
  6. 【請求項６】 JNK3ポリペプチドの基質への結合が減少している、請求項５
    記載の方法。
  7. 【請求項７】 少なくとも一つの不活化JNK3遺伝子を含む全能性マウス細胞
    を製造する方法であって、以下の段階を含む方法： a．複数の全能性マウス細胞を提供する段階； b．JNK3遺伝子が機能的JNK3の発現を阻害する遺伝子にヌクレオチド配列を挿 入することによって破壊される、破壊されたマウスJNK3遺伝子を含むDNA構築物 を細胞に導入する段階； c．JNK3をコードする染色体配列と導入されたDNA構築物との間に相同的組換え
    が起こるように細胞をインキュベートする段階；および d．少なくとも一つの不活化JNK遺伝子を含む全能性マウス細胞を同定する段階
    。
  8. 【請求項８】 以下の段階を含む不活化JNK3遺伝子のホモ接合マウスを製造
    する方法： a．少なくとも一つの不活化JNK3遺伝子を含む全能性マウス細胞を提供する段 階； b．マウス胚に細胞を挿入し、雌性マウスに胚を植え込む段階； c．胚を新生児マウスへと発生させる段階； d．新生児マウスを性的成熟に達するまで飼育する段階；および e．ホモ接合JNK3（-/-）マウスが興奮毒性障害に対して抵抗性である、不活化
    JNK3遺伝子に関してホモ接合（-/-）であるマウスを得るために、段階dの性的に
    成熟したマウス二匹を交配させる段階。
  9. 【請求項９】 興奮毒性を含む障害を有する、または興奮毒性を含む障害の
    危険性がある患者を治療する方法であって、JNK3発現を阻害する化合物の治療的
    有効量を患者に投与する段階を含む方法。
  10. 【請求項10】 化合物がアンチセンス核酸分子である、請求項９記載の方法
    。
  11. 【請求項11】 障害がアルツハイマー病、ハンチントン病、虚血、筋萎縮性
    側索硬化症、外傷、運動神経疾患、パーキンソン病、またはてんかんからなる群
    より選択される、請求項９記載の方法。
  12. 【請求項12】 導入遺伝子が哺乳動物の生殖細胞の染色体に組み込まれる、
    JNK3遺伝子の発現を破壊する導入遺伝子を有するヒト以外のトランスジェニック
    哺乳動物。
  13. 【請求項13】 マウスである、請求項12記載の哺乳動物。
  14. 【請求項14】 生殖細胞が導入遺伝子に関してホモ接合である、請求項12記
    載の哺乳動物。
  15. 【請求項15】 破壊の結果ヌル変異が起こる、請求項12記載の哺乳動物。
  16. 【請求項16】 請求項12記載の哺乳動物の細胞に由来する細胞株。
  17. 【請求項17】 機能的JNK3の発現を阻害または調節する遺伝子にヌクレオチ
    ド配列を挿入することを含む、破壊されたマウスJNK3遺伝子を含むDNA構築物。
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