KR20100063719A - Ｎａｐ 유사 및 ｓａｌ 유사 펩티드 모의체를 사용한 신경보호 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경보호 펩티드인 NAPVSIPQ(NAP) 및 SALLRSIPA(SAL)를 모방한 펩티드, 및 뉴런 기능 장애, 신경퇴행성 장애, 인지기능 결핍, 신경정신 장애, 및 자가면역 질환 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

ＮＡＰ 유사 및 ＳＡＬ 유사 펩티드 모의체를 사용한 신경보호{NEUROPROTECTION USING NAP-LIKE AND SAL-LIKE PEPTIDE MIMETICS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2007년 8월 24일 출원된 미국 가출원 번호 제60/957,790호(이는 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다)의 이점을 주장한다.

기술분야

본 발명은 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체, 폴리펩티드, 또는 그로부터 유래된 소분자, 및 뉴런 기능 장애, 신경퇴행성 장애, 인지기능 결핍, 신경정신 장애, 및 자가면역 질환 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.

8개의 아미노산으로 구성된 펩티드(NAPVSIPQ, 서열 번호 1)인 NAP는 활성-의존적 신경보호 단백질(ADNP: activity-dependent neuroprotective protein)로부터 유래된 것이다(미국 특허 번호 제6,613,740호; 문헌 [Bassan et al, J. Neurochem . 72: 1283-1293 (1999)]). 설치류와 인간의 ADNP 유전자 내의 NAP 서열은 동일하다(미국 특허 번호 제6,613,740호; 문헌 [Zamostiano, et al, J. Biol . Chem. 276:708-714 (2001)]).

세포 배양물에서 NAP는 매우 다양한 독소에 대하여 펨토몰 농도로 신경보호 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Bassan et al, 1999; Offen et al., Brain Res. 854:257-262 (2000)]). 알츠하이머병 병상 중 일부를 모의하는 동물 모델에서, NAP는 역시 보호적 성질을 띠었다(문헌 [Bassan et al., 1999; Gozes et al, J. Pharmacol . Exp . Ther. 293:1091-1098 (2000)]; 또한, 미국 특허 번호 제6,613,740호도 참조). 정상의 노화된 래트에서는 NAP를 비내 투여한 결과, 모리스 수중 미로(Morris water maze) 수행능이 개선되었다(문헌 [Gozes et al., J. Mol . Neurosci. 19:175-178 (2002)]). 추가로, NAP는 아포프토시스를 감소시키고(문헌 [Leker et al., stroke 33:1085-1092 (2002)]), 염증을 감소시킴으로써 마우스 폐쇄성 두부 손상에 의해 유발되는 손상을 감소시켜(문헌 ([Beni Adani et al, J. Pharmacol. Exp. Ther. 296:57-63 (2001)]; [Romano et al, J. Mol Neurosci. 18:37-45 (2002)]; [Zaltzman et al, NeuroReport 14:481-484 (2003)])) 허혈 손상 이후의 경색 부피와 운동 기능 결핍을 감소시켰다. 태아 알코올 증후군 모델에서, 알코올을 복강내로 주사한 이후의 태아 사망은 NAP 치료에 의해 억제되었다(문헌 [Spong et al., J. Pharmacol . Exp . Ther. 297:774-779 (2001)]; 또한, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 00/53217 참조). 방사성 표지된 펩티드를 사용하여 실시된 이들 연구에서는 NAP가 혈액 뇌장벽을 통과할 수 있고, 비내 치료 이후(문헌 [Gozes et al., 2000]) 또는 정맥내 주사 이후(문헌 [Spong et al., 2001])에 설치류의 뇌에서 검출될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

ADNF-9 또는 ADNF-1로도 공지되어 있는, 9개의 아미노산으로 구성된 펩티드(SALLRSIPA, 서열 번호 19)인 SAL은 가장 짧은 활성 형태의 ADNF로서 동정되었다(미국 특허 번호 제6,174,862호 참조). SAL은 시험관내 분석법 및 생체내 질환 모델에서 중추 신경계의 뉴런을 각종 상해에 대한 반응에서 생존할 수 있게 유지시켜 준다고 밝혀졌다(예로서, 문헌 [Gozes et al., 2000; Brenneman et al ., J. Pharmacol . Exp . Ther. 285:619-627 (1998)]). D-SAL은 안정적이며, 경구적으로 이용가능한 SAL의 모든 D-아미노산 유도체이며(문헌 [Brenneman, et al., J Pharmacol Exp Ther. 309: 1190-7 (2004)]), 이는 놀랍게도, 테스트된 상기 중추 신경계에서의 SAL과 유사한 생물학적 활성(효력 및 효능)을 보인다. ADNF-1 복합체는 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 03/022226에 기재되어 있다.

신경활성 펩티드, 예로서, NAP 및 SAL은 심지어 단일의 보존적 아미노산 치환에도 극도로 민감한 것으로 여겨진다. 예로서, 문헌 ([Brenneman et al., J. Pharm. Ex . Ther ., 285:619-627 (1998)] 및 [Wilkemeyer et al., Proc . Natl . Acad. Sci , USA, 100:8543-8 (2003)])을 참조한다. 따라서, NAP 및 SAL이 모범적인 신경활성 펩티드이긴 하지만, 펩티드 중심 서열의 보존적인 펩티드 변이까지 치료학적으로 유효하다고 예측할 수는 없다. 따라서, 본 분야에 있어 진보가 이루어지기는 하였지만, 여전히 추가의 신경활성 펩티드가 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구 사항 등을 해소시켜 준다.

본 발명의 간단한 요약

본 발명은 생물학적으로 활성인 NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체, 및 이들 펩티드를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체의 화학식은 (R¹)_a-(R²)-(R³)_b이다. R¹은 1 내지 약 40개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열이며, 여기서, 각각의 아미노산은 천연적으로 발생된 아미노산 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다. R²는 하기 서열 중 하나이다: NATLSIHQ(서열 번호 4), STPTAIPQ(서열 번호 6), NAVLSIHQ(서열 번호 2), NATLSVHQ(서열 번호 3), NATLSIVHQ(서열 번호 5), NTPVSIPQ(서열 번호 7), APVSIPQ(서열 번호 8), NTPISIPQ(서열 번호 9), NAPVSIP(서열 번호 10), NAPVAVPQ(서열 번호 11), NARVSIPQ(서열 번호 12), DAPVSVPQ(서열 번호 13), ALLRSIPA(서열 번호 20), ALLRSIP(서열 번호 21), AMLRSIPA(서열 번호 22), ALLRAIPA(서열 번호 23), SALLRSIP(서열 번호 24), SALLRAIP(서열 번호 25), ALLRTIPA(서열 번호 26), 및 ALLRSVPA(서열 번호 27). R³은 1 내지 약 40개의, 독립적으로 선택된 아미노산, 예로서, 천연적으로 발생된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함하는 아미노산 서열이다. a 및 b는 독립적으로 선택되며, 0 또는 1이다. 서열 NAPVSIPQ(서열 번호 1) 또는 SALLRSIPA(서열 번호 19)는 특별히 상기 화학식으로부터 제외된다.

하나의 실시태양에서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 중심 서열, 즉, NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6)로부터 선택되는 R²를 포함한다.

또다른 실시태양에서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드는 오직 중심 아미노산 서열만을, 즉, 오직 R²만을 포함한다. 다시 말해, a 및 b는 0이다.

하나의 실시태양에서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드는 중심 아미노산 서열, 즉, R² 중 적어도 하나의 D-아미노산을 포함한다.

하나의 실시태양에서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드의 각각의 아미노산, 즉, R²는 D-아미노산이다.

또다른 실시태양에서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 적어도 하나의 보호기를 포함한다.

하나의 실시태양에서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 중심 아미노산 서열 NATLSIHQ(서열 번호 4)를 포함한다. 추가의 실시태양에서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 중심 아미노산 서열 NATLSIHQ(서열 번호 4)로 구성된다. 추가의 실시태양에서, 중심 아미노산 서열 NATLSIHQ(서열 번호 4)은 적어도 하나의 D-아미노산을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 중심 아미노산 서열 NATLSIHQ(서열 번호 4)의 각각의 아미노산은 D-아미노산이다.

하나의 실시태양에서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 중심 아미노산 서열 STPTAIPQ(서열 번호 6)를 포함한다. 추가의 실시태양에서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 중심 아미노산 서열 STPTAIPQ(서열 번호 6)로 구성된다. 추가의 실시태양에서, 중심 아미노산 서열 STPTAIPQ(서열 번호 6)는 적어도 하나의 D-아미노산을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 중심 아미노산 서열 STPTAIPQ(서열 번호 6)의 각각의 아미노산은 D-아미노산이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 화학식을 갖는 NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 또한 제2의 신경보호 폴리펩티드, 예로서, NAPVSIPQ(서열 번호 1) 또는 SALLRSIPA(서열 번호 19)를 포함하는 신경보호 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

또다른 측면에서 본 발명은 치료를 필요로 하는 피험체에게 치료학적 유효량의 상기 기술된 화학식을 갖는 NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체를 투여하여 피험체에서 신경퇴행성 장애, 인지기능 결핍, 자가면역 질환, 말초 신경 독성, 운동 기능 장애, 감각 기능 장애, 불안, 우울증, 정신분열병, 정신병, 태아 알코올 증후군과 관련된 병태, 망막 변성을 포함하는 병태, 학습 및 기억에 영향을 주는 질병, 또는 신경정신 장애를 치료 또는 예방하는 것인, 피험체에서 신경퇴행성 장애, 인지기능 결핍, 자가면역 질환, 말초 신경 독성, 운동 기능 장애, 감각 기능 장애, 불안, 우울증, 정신분열병, 정신병, 태아 알코올 증후군과 관련된 병태, 학습 및 기억에 영향을 주는 질병, 또는 신경정신 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체를 투여하는 것은 하기 아미노산 서열: NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6) 중 하나를 포함한다.

도 1: 4시간 동안 200 mM ZnCl ₂ 와 함께 인큐베이션시킨 이후, 펩티드가 성상 세포의 생존에 미치는 효과. 그래프는 펩티드 1개당 적어도 3회에 걸쳐 수행된 실험을 도시하는데, 여기서, 상기 실험은 매 실험당 5번 실시하는 것을 한벌로 하였다. NATLSIHQ(서열 번호 4): * =p < 0.05; ** =p < 0.005, *** =p < 0.0005; STPTAIPQ(서열 번호 6): # =p < 0.05 (음성 대조군(어떤 것도 첨가되지 않은 것) 대비).
도 2: 베타 아밀로이드로의 중독 이후, 펩티드가 신경아교 배양물의 생존에 미치는 효과. 그래프는 펩티드 1개당 3회에 걸쳐 수행된 실험을 도시하는데, 여기서, 상기 실험은 매 실험당 5번 실시하는 것을 한벌로 하였다. NATLSIHQ(서열 번호 4): * =p < 0.05; ** =p < 0.005; STPTAIPQ(서열 번호 6): # =p < 0.05. (음성 대조군(어떤 것도 첨가되지 않은 것) 대비).

정의

"NAP 유사 펩티드 모의체" 및 "NAP 유사 펩티드"라는 어구는 동등하게 NAP (NAPVSIPQ)(서열 번호 1)와 유사성을 갖는 펩티드 및 모의체, 둘 모두를 의미한다. 따라서, 상기 어구는 하기 화학식을 갖는 서열을 포함하는 펩티드 및 모의체를 의미한다: (R¹)_a-(R²)-(R³)_b, 상기 식에서, R¹ 및 R³은 독립적으로 선택되고, 1 내지 약 40개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열이며, 여기서, 각각의 아미노산은 천연적으로 발생된 아미노산 및 아미노산 유사체로 구성된 군으로 독립적으로 선택되고; R²는 NAP 유사 펩티드, 예로서: NAVLSIHQ(서열 번호 2), NATLSVHQ(서열 번호 3), NATLSIHQ(서열 번호 4), NATLSIVHQ(서열 번호 5), STPTAIPQ(서열 번호 6), NTPVSIPQ(서열 번호 7), APVSIPQ(서열 번호 8), NTPISIPQ(서열 번호 9), NAPVSIP(서열 번호 10), NAPVAVPQ(서열 번호 11), NARVSIPQ(서열 번호 12), DAPVSVPQ(서열 번호 13), NXPVSIPQ (서열 번호 14), NXP+SIPQ(서열 번호 15), NAPV++PQ(서열 번호 16), NAXVSIPQ(서열 번호 17) 및 +APVS+PQ(서열 번호 18)이며, 여기서, X는 임의의 아미노산을 의미하고, +는 보존적인 아미노산을 의미하며; a 및 b는 독립적으로 선택되고, 0 또는 1이며, 단, NAP 유사 펩티드 모의체는 NAP가 아니다. 상기 어구는 또한 예를 들면, 적게는 하나의 아미노산 또는 많게는 아미노산 전부 모두가 D 입체형상인 D-아미노산 유사체를 의미한다.

"SAL 유사 펩티드 모의체" 및 "SAL 유사 펩티드"라는 어구는 동등하게 SAL(SALLRSIPA)(서열 번호 19)과 유사성을 갖는 펩티드 및 모의체, 둘 모두를 의미한다. 따라서, 상기 어구는 하기 화학식을 갖는 서열을 포함하는 펩티드를 의미한다: (R¹)_a-(R²)-(R³)_b, 상기 식에서, 상기 식에서, R¹ 및 R³은 독립적으로 선택되고, 1 내지 약 40개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열이며, 여기서, 각각의 아미노산은 천연적으로 발생된 아미노산 및 아미노산 유사체로 구성된 군으로 독립적으로 선택되고; R²는 SAL 유사 펩티드 예로서: ALLRSIPA(서열 번호 20), ALLRSIP(서열 번호 21), AMLRSIPA(서열 번호 22), ALLRAIPA(서열 번호 23), SALLRSIP(서열 번호 24), SALLRAIP(서열 번호 25), ALLRTIPA(서열 번호 26), ALLRSVPA(서열 번호 27), A+LRSIPA(서열 번호 28), ALLR+IPA(서열 번호 29), SALLR+IP(서열 번호 30), 및 ALLRS+PA(서열 번호 31)이며, 여기서, X는 임의의 아미노산을 의미하고, +는 보존적인 아미노산을 의미하며; a 및 b는 독립적으로 선택되고, 0 또는 1이며, 단, SAL 유사 펩티드 모의체는 SAL이 아니다. 상기 어구는 또한 예를 들면, 적게는 하나의 아미노산 또는 많게는 아미노산 전부 모두가 D 입체형상인 D-아미노산 유사체를 의미한다.

"ADNF 폴리펩티드"라는 어구는 NAPVSIPQ(서열 번호 1)("NAP"로서도 지칭됨) 또는 SALLRSIPA(서열 번호 19)("SAL"로서도 지칭됨)의 아미노산 서열을 포함하는 활성 중심 부위를 갖고, 예로서, 문헌 ([Hill et al, Brain Res. 603:222-233 (1993)]; [Brenneman & Gozes, J. Clin. Invest. 97:2299-2307 (1996)]; 및 [Forsythe & Westbrook, J. Physiol . Lond. 396:515 (1988)])에 의해 기재된 시험관내 피질 뉴런 배양물 분석법을 사용하여 측정된 바, 신경영양/신경보호 활성을 갖는 하나 이상의 활성에 의존하는 신경영양 인자(ADNF: activity dependent neurotrophic factors)를 의미한다. ADNF 폴리펩티드는 예로서, 시험관내에서든 생체내에서든 중추 신경계에서 기원한 뉴런에 대해 신경보호/신경영양 작용을 보이는 ADNF I 폴리펩티드, ADNF III 폴리펩티드, 그의 대립유전자, 다형 변이체, 유사체, 종간 상동체, 그의 임의의 하위서열(예로서, SALLRSIPA(서열 번호 19) 또는 NAPVSIPQ(서열 번호 1)) 또는 친유성 변이체일 수 있다. "ADNF 폴리펩티드"는 또한 ADNF I 폴리펩티드와 ADNF III 폴리펩티드의 혼합물일 수 있다.

활성에 의존하는 신경보호 단백질(ADNP)로도 명명되는, "ADNF III 폴리펩티드" 또는 "ADNF III"이라는 어구는 NAPVSIPQ(서열 번호 1)("NAP"로서도 지칭됨)의 아미노산 서열을 포함하는 활성 중심 부위를 갖고, 예로서, 문헌 ([Hill et al, Brain Res. 603, 222-233 (1993)]; 및 [Gozes et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93, 427-432 (1996)])에 의해 기재된 시험관내 피질 뉴런 배양물을 분석법 사용하여 측정된 바, 신경영양/신경보호 활성을 갖는 하나 이상의 활성에 의존하는 신경영양 인자(ADNF)를 의미한다. ADNF 폴리펩티드는 예로서, 시험관내에서든 생체내에서든 중추 신경계에서 기원한 뉴런에 대해 신경보호/신경영양 작용을 보이는 ADNF III 폴리펩티드, 그의 대립유전자 또는 다형 변이체, 유사체, 종간 상동체, 또는 그의 임의의 하위서열(예로서, NAPVSIPQ)(서열 번호 1)일 수 있다. ADNF III 폴리펩티드 범위는 약 8개의 아미노산부터 시작될 수 있고, 예로서, 8개-20개, 8개-50개, 10개-100개, 또는 또는 1000개 이상의 아미노산을 가질 수 있다.

전장의 인간 ADNF III의 분자량 예측치는 123,562.8 Da(>1000개 아미노산 잔기)이고, pi 이론치는 약 6.97이다. 상기 기술된 바와 같이, ADNF III 폴리펩티드는 Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(서열 번호 1)("NAPVSIPQ" 또는 "NAP"로서도 지칭됨)의 아미노산 서열을 포함하는 활성 부위를 갖는다. 문헌 ([Zamostiano et al, J. Biol . Chem. 276:708-714 (2001)] 및 [Bassan et al, J. Neurochem. 72:1283-1293 (1999)])을 참조한다. 달리 명시하지 않는 한, "NAP"는 Asn-Ala-Pro의 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 아닌, Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(서열 번호 1)의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 지칭하는 것이다. ADNF III의 전장의 아미노산 및 핵산 서열은 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 98/35042, WO 00/27875, 미국 특허 번호 제6,613,740호 및 제6,649,411호에서 살펴볼 수 있다. 인간 서열에 대한 수탁 번호는 NP_852107이다(또한, 문헌 [Zamostiano et al, 상기 문헌 동일] 참조).

"ADNF I"이라는 용어는 분자량이 약 14,000 달톤이고, pi가 8.3 ± 0.25인, 활성에 의존하는 신경영양 인자 폴리펩티드를 의미한다. 상기 기술한 바와 같이, ADNF I 폴리펩티드는 Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (서열 번호 19) ("SALLRSIPA" 또는 "SAL" 또는 "ADNF-9"로서도 지칭됨)의 아미노산 서열을 포함하는 활성 부위를 갖는다. 문헌 ([Brenneman & Gozes, J. Clin . Invest. 97:2299-2307 (1996)], [Glazner et al, Anat . Embryol. ((Bed). 200:65-71 (1999)], [Brenneman et al, J. Pharm . Exp . Ther., 285:619-27 (1998)], [Gozes & Brenneman, J. Mol . Neurosci. 7:235-244 (1996)], 및 [Gozes et al, Dev . Brain Res. 99: 167-175 (1997)])을 참조한다. 달리 명시하지 않는 한, "SAL"은 Ser-Ala-Leu의 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 아닌, Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(서열 번호 19)의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 지칭하는 것이다. ADNF I의 전장의 아미노산 서열은 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 96/11948에서 살펴볼 수 있다.

"피험체"라는 용어는 생애 어느 단계에 있든 상관없이 임의의 포유동물, 특히, 인간을 의미한다.

"접촉시키는"이라는 용어는 본원에서 하기와 같은 용어: ~와 조합시키는, ~에 첨가하는, ~과 혼합하는, ~상에 통과시키는, ~와 함께 인큐베이션시키는, ~상에서 유동시키는이라는 것과 상호교환적으로 사용된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산은 임의의 종래 방법, 예로서, 비경구, 경구, 국소, 비내, 및 흡입 경로에 의해 "투여"될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 비경구 및 비내 또는 흡입 경로가 사용된다.

"생물학적으로 활성인"이라는 용어는 시험관내 또는 생체내에서 천연적으로 발생된 생물학적 분자의 기능을 활성화시키기 위해 또는 억제시키기 위해 상기 분자와 상호작용하게 되는 펩티드 서열을 의미한다. "생물학적으로 활성인"이라는 용어는 본원에서 가장 보편적으로는 시험관내에서든 생체내에서든 중추 신경계에서 기원한 뉴런에 대해 신경보호/신경영양 작용을 보이는 NAP 유사 펩티드 모의체를 지칭하는데 사용된다. 따라서, 본 발명은 예로서, 신경독소로 처리된 대뇌 피질 배양물에서 테스트하였을 때에 NAP와 동일하거나 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드 하위서열을 제공한다(문헌 [Gozes et al Proc . Natl Acad . Sci . USA 93:427-432 (1996)] 참조). 펩티드는 또한 적어도 2-10%만큼, 바람직하게는 10% 초과로 NAP-튜불린 결합과 경쟁할 수 있는 그의 능력을 측정하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 테스트할 수 있다.

"신경퇴행성 장애 또는 인지기능 결핍"이라는 어구는 하기 병태들: 대뇌 기저핵에 영향을 주는 퇴행성 병태(헌팅톤병, 윌슨병, 흑질 선조체변성, 피질 기저핵 변성), 뚜렛 증후군, 파킨슨병, 진행성 핵상 마비, 진행성 연수 마비, 가족성 연축성 대마비, 척수근 위축증, ALS 및 그의 변종, 치상핵적핵 위축증, 올리브다리 소뇌 위축증, 부신생물성 소뇌 변성, 및 도파민 독성을 비롯한 중추신경 운동계 질환: 감각 뉴런에 영향을 주는 질환, 예로서, 프리이드라이히 운동실조증, 당뇨병, 말초 신경병증, 및 망막 뉴런 변성; 대뇌 변연계 및 피질계 질환, 예로서, 대뇌 아밀로이드증, 피크 위축증, 및 레트 증후군; 알츠하이머병, 파킨슨병, AIDS 관련 치매, 라이 병, 미만성 루이소체 질환, 간질, 다계통 위축증, 길랑 바레 증후군, 리소좀 저장 장애, 예로서, 지질갈색소증, 다운증후군 후기의 퇴행성 단계, 알퍼스병, CNS 변성 결과로서 현기증, ALS, 피질기저 변성, 및 진행성 핵상 마비를 비롯한, 다발성 뉴런 시스템 및/또는 뇌간에 관여하는 신경퇴행성 병상; 발달 지연 및 학습 장애와 관련된 병상, 다운증후군, 및 산화적 스트레스 유도성 뉴런 사멸; 노화 및 만성 알코올 중독 또는 약물 남용으로 유발되는 병상, 예로서, (i) 알코올 중독의 경우, 청반, 소뇌, 콜린성 기저 전뇌의 뉴런 변성, (ii) 노화의 경우, 인지기능 장애 및 운동 장애를 일으키는 소뇌 뉴런 및 피질 뉴런 변성, 및 (iii) 만성 암페타민 남용의 경우, 운동 장애를 일으키는 대뇌 기전핵 뉴런 변성; 초점성 외상으로부터 유발되는 병리학적 변화, 예로서, 뇌졸증, 초점성 허혈, 혈관 부전, 저산소성 허혈성 뇌병증, 고혈당증, 저혈당, 폐쇄성 두부 외상, 및 직접 외상; 치료 약물 및 치료법의 부작용으로서 유발된 병상(예로서, NMDA 부류의 글루타메이트 수용체의 길항제인 항경련제 투약에 대한 반응으로 대상피질 및 후각뇌피질 뉴런의 변성)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"말초 신경 독성"은 각종 기법에 의해 피험체에서 확인할 수 있고 진단될 수 있다. 전형적으로, 운동 기능 장애, 근육 쇠약, 또는 후각, 시각 또는 청각 상의 변화, 또는 심부 건 반사, 진동 감각, 피부 감각, 보행 및 균형, 근력, 기립 혈압, 및 만성 또는 간헐적 통증 상의 변화에 의해 측정될 수 있다. 인간에서 이들 증상은 또한 종종 PNS 및 CNS, 둘 모두에서의 독성 효과를 입증한다. 결국, 신경 독성으로부터 유발될 수 있는 가능성을 지닌 말초 신경병증은 수백 가지가 존재한다. PNS 활성 범위를 반영하면, 증상은 감각, 운동, 또는 자율신경계 작용을 포함할 수 있다. 이는 이환된 신경의 유형 및 증상 발생 기간에 따라 분류될 수 있다. 말초 신경 독성은 화학요법제(항암제, 항미생물제 등)에 의해, 그리고 질환 과정(예로서, 미국 특허 출원 번호 제11/388,634호 참조)에 의해 유도될 수 있다.

"망막 변성을 포함하는 병태"는 레이저 유도성 망막 손상 및 안과 질환, 예로서, 녹내장, 색소성 망막염, 어셔 증후군, 동맥 또는 정맥 폐색, 당뇨 망막병증, 수정체후부 섬유증식증 또는 미숙아 망막병증(R.L.F./R.O.P.: retrolental fibroplasias or retinopathy of prematurity), 망막층간분리, 격장 변성, 및 황반 변성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"정신(mental) 장애" 또는 "정신병" 또는 "정신 질환" 또는 "정신(psychiatric) 또는 신경정신(neuropsychiatric) 질환 또는 병 또는 장애"는 문헌 [Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition, (DSM IV)](문헌 [Benitez-King G. et al, Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2004 Dec;3(6):515-33. Review]도 참조)에 기재된 바와 같이, 기분 장애(예로서, 주요 우울증, 조증, 및 양극성 장애), 정신증 장애(예로서, 정신분열병, 정신분열정동 장애, 정신분열형 장애, 망상 장애, 단기 정신병적 장애, 및 공유 정신증적 장애), 인격 장애, 불안 장애(예로서, 강박 반응성 장애 및 주의력 결핍 장애) 뿐만 아니라, 기타 다른 정신 장애, 예로서, 물질 관련 장애, 소아 장애, 치매, 자폐 장애, 적응 장애, 섬망, 다발 경색 치매, 및 뚜렛 장애를 의미한다. 전형적으로, 상기 장애들은 복합적인 유전 및 생화학적 성분을 갖는다.

"기분 장애"는 장기간 동안 개체가 경험하게 되는 감정 톤 또는 감정 상태의 분열을 의미한다. 기분 장애는 주요 우울증 장애(즉, 단극성 장애), 조증, 불쾌감, 양극성 장애, 기분저하증, 순환기분장애 및 다수의 기타 다른 장애를 포함한다. 예로서, 문헌 [Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition, (DSM IV)]를 참조한다.

"주요 우울증 장애," "주요 우울성 장애," 또는 "단극성 장애"는 하기 증상들 중 어느 것을 포함하는 기분 장애를 의미한다: 슬픔, 불암감, 또는 공허감 지속; 죄책감, 무가치감 또는 무기력; 성 생활과 같이, 한때 즐겼던 취미 및 활동에 대한 흥미나 쾌락 상실; 활동력(energy) 감소, 피로감, 활동의 "둔화"; 집중 곤란, 기억력 장애, 또는 결정과정의 어려움; 불면증, 새벽에 깨기, 또는 수면과다; 식욕 부진 및/또는 체중 감소 또는 과식 및 체중 증가; 죽음 또는 자살에 대한 생각 또는 자살 시도; 불안 또는 과민성; 또는 예로서, 두통, 소화 장애, 및 만성 두통과 같이 치료에 반응이 없는 지속적인 신체적 증상. 우울증에 대한 각종 하위유형은 예로서, DSM IV에 기재되어 있다.

"양극성 장애"은 극단적인 기분을 나타내는 기간이 교대로 번갈아가며 나타나는 것을 특징으로 하는 기분 장애이다. 양극성 장애를 앓는 사람은 보통 매우 고양된 기분 또는 쉽게 화내는 기분(조증)에서부터 슬프고 절망적인 기분(우울증)으로, 그리고 다시 원 상태의 기분으로 되돌아 오고, 그 중간 중간에는 정상적인 기분을 나타내는 기간도 있는, 순환형 기분 변동을 경험하게 된다. 양극성 장애의 진단에 대해서는 예로서, DSM IV에 기재되어 있다. 양극성 장애는 양극성 장애 I(주요 우울증을 포함하거나 포함하지 않는 조증) 및 양극성 장애 II(주요 우울증을 포함하는 경조증을 포함하며, 이는 예로서, DSM IV를 참조한다

"불안," "불안 장애," 및 "불안 관련 장애"는 불안, 공포, 전조에 대한 주관적인 느낌을 특징으로 하는 정신 증후군을 의미하며, 그 예로는 공황 장애, 범불안 장애, 주의력 결핍 장애, 주의력 결핍 과다활동 장애, 강박 반응성 장애, 및 스트레스 장애, 예로서, 급성 스트레스 장애 및 외상후 스트레스 장애를 포함한다. 이들 장애에 대한 진단 기준은 당업자에게 주지되어 있다(예로서, 문헌 [Harrison 's Principles of Internal Medicine, pp. 2486-2490 (Wilson et al., eds., 12th ed. 1991) and DSM IV] 참조).

"자가면역 질환"은 자가면역 질환, 예로서, 다발 경화증, 중증 근육무력증, 길랑 바레 증후군(항인지질 증후군), 전신 홍반 루푸스, 베체트 증후군, 쇼그렌 증후군, 류마티스 관절염, 하시모토병/갑상선 기능저하성 갑상선염, 원발성 담즙성 간경변, 혼합형 결합 조직 질환, 만성 활동 간염, 그레이브스병/갑상선기능항진증, 공피증, 만성 특발성 혈소판 감소성 자반병, 당뇨 신경병증 및 패혈 쇼크를 의미한다(예로서, [Schneider A. et al, J Biol Chem . 279:55833-9 (2004)] 참조).

"운동 기능 장애"는 근육 쇠약 및 보행, 균형, 및 근력 상의 변화를 포함한다. "감각 기능 장애"는 후각, 시각 또는 청각 상의 변화, 또는 심부 건 반사, 진동 감각, 피부 감각 또는 만성 또는 간헐적 통증 상의 변화에 의해 측정될 수 있다. 종종 감각 기능 장애는 질환과 관련이 있으며, 이는 예로서, 다리 또는 하퇴에서의 통증 또는 저리는 느낌(pins-and-needles), 작열감, 네발기기, 또는 따끔거림(prickling sensation)으로서 경험할 수 있다. 인간에서, 운동 및 감각 기능 장애, 이 둘 모두는 화학 물질(예로서, 화학요법제) 또는 질환 상태에 의해 유발될 수 있는 PNS 및 CNS, 둘 모두에서의 효과를 나타낸다.

"폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 일반적으로, 펩티드는 짧은 폴리펩티드를 의미한다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연적으로 발생된 아미노산의 유사체 또는 모의체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산 중합체를 의미한다.

"아미노산"이라는 용어는 천연적으로 발생된 아미노산 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모의체를 의미한다. 천연적으로 발생된 아미노산에는 유전자 코드에 의해 코딩된 아미노산 뿐만 아니라, 추후 변형된 아미노산, 예로서, 하이드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이 있다. 이러한 적용 목적으로, 아미노산 유사체는 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기에 결합하는 탄소를 갖는 화합물, 예로서, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 의미한다. 그러한 유사체는 변형된 R 기(예로서, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 이러한 적용 목적으로, 아미노산 모의체는 아미노산의 일반 화학적 구조와는 다른 구조를 갖지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 의미한다.

아미노산은 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 01/12654에 개시된 바와 같이, 비천연적으로 발생된 D-키랄성(이는 본 화합물의 경구 이용가능성과 기타 다른 약물과 유사한 특징을 개선시킬 수 있다)을 갖는 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체, 및 잠재적으로는 아미노산 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체 모두 D-키랄성을 가질 것이다. 반감기와 작용 지속기간을 장기화시키는 D-아미노산을 사용함으로써 펩티드의 치료학적 용도는 향상될 수 있다. 그러나, 많은 수용체들은 L-아미노산을 더욱 강하게 선호하지만, D-펩티드의 일례는 천연적으로 발생된 L-펩티드와 등가의 활성을 갖는 것으로 보고되어 있으며, 그 예로는 공극 형성 항생제 펩티드, 베타 아밀로이드 펩티드(독성에는 변화가 없음), 및 CXCR4 수용체에 대한 내인성 리간드가 있다. 이와 관련하여, NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체 또한 D-아미노산 형태로 활성을 유지한다.

아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고되는 바에 따라, 그의 보편적으로 공지되어 있는 3문자 기호 또는 1분자 기호로 지칭될 수 있다. 유사하게, 뉴클레오티드는 그의 보편적으로 인정받은 1문자 코드로 지칭될 수 있다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열, 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나, 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는, 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(모든 모든) 코돈 중 세번째 위치에 있는 코돈이 혼합형 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 이루어질 수 있다(문헌 ([Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; [Rossolini et al., Mol . Cell . Probes 8:91-98 (1994)])). 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 기능적으로 동일한 핵산 다수가 소정의 임의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해서 알라닌으로 지정되는 모든 위치에 있는 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서 기술된 바와 같은 상응하는 코돈들 중 어느 것으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이가 "침묵 변이"인데, 이는 보존적으로 변형된 변이들 중 한 종류이다. 폴리펩티드를 코딩하는, 본원에 있는 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 핵산 중 각각의 코돈(단, 보통은 메티오닌에 대한 유일의 코돈인 AUG와 보통은 트립토판에 대한 유일의 코돈인 TGG는 제외)은 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생산할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각 기술되어 있는 서열 중에 암시되어 있다.

아미노산 서열에 관하여, 코딩된 서열 중 단일의 아미노산 또는 소수의 아미노산을 변경, 부가, 또는 결실시키는 개개의 치환, 결실 또는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열로의 부가가, 그러한 변경을 통해 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환되는 것인 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 주시되어 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자의 추가적인 것이며, 이들을 제외시키지 않는다.

하기에 있는 군들은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌(A), 글리세린(G);

2) 세린(S), 트레오닌(T);

3) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

4) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

5) 시스테인(C), 메티오닌(M);

6) 아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H);

7) 이소류신(I), 류신(L), 발린(V); 및

8) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W) (예로서, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조).

본원에서 제공되는 핵산 및 폴리펩티드 서열의 많은 보존적 변이가 기능적으로 동일한 생성물을 형성한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들면, 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 "침묵 치환"(즉, 코딩되는 폴리펩티드를 변경시키지 않는 핵산 서열의 치환)은 아미노산을 코딩하는 모든 핵산 서열의 암시적인 특성이다. 유사하게, 아미노산 서열 중 하나 또는 수개의 아미노산에서의 "보존적 아미노산 치환"은 고도로 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환된 것이거나, 또는 개시된 아미노산 서열과 또는 아미노산을 코딩하는 개시된 핵산 서열과 고도로 유사한 것으로서 쉽게 확인할 수 있는 것이다.

추가로, 특정 보호기가 본 발명에 따라 펩티드에 첨가될 수 있다. 보호기는 펩티드의 N 말단 종단이나 C 말단 종단에, 또는 그 양쪽 모두에 첨가될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "보호기"라는 용어는 관능기가 비반응성이 되도록 만들지만, 관능기를 그의 원 상태로 회복시키기 위해서는 제거될 수도 있는 것인 화합물을 의미한다. 그러한 보호기가 당업계의 숙련인에게 주지되어 있으며, 이는 문헌 ["Protective Groups in Organic Synthesis", 4th edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, John Wiley & Sons, New York, 2006]에 개시되어 있는 화합물을 포함한다. 보호기의 예로는 Fmoc (9-플루오레닐메틸 카르바메이트, Boc, 벤질옥시-카르보닐(Z), 알록(알릴옥시카르보닐), 및 리소그래피 보호기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"단리된," "정제된," 또는 "생물학적으로 순수한"이라는 용어는 그의 천연 상태에서 발견되는 것과 같이 보통 그와 함께 동반되는 성분들이 실질적으로 또는 본질적으로는 존재하지 않는 물질을 의미한다.

"충분한 양" 또는 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"이란 관심의 대상이 되는 활성을 나타내거나, 주관적으로는 증상(들)을 완화시키거나, 임상의 또는 기타 유자격 관찰자의 기록에 따르면 객관적으로는 확인할 수 있을 정도로 개선시키는, 소정의 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체의 양이다. 치료학적 적용에 있어서, 본 발명의 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분한 양으로 환자에게 투여된다. 이를 달성하는데 적합한 양을 "치료학적 유효 투여량"으로서 정의한다. 투여량 범위는 사용되는 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체, 특정 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체의 투여 경로 및 효력, 및 약학 조성물 중 추가 치료학적 화합물의 존재 여부에 따라 달라진다.

발현 또는 활성의 "억제제," "활성제," 및 "조절 인자"란 발현 또는 활성에 대한 시험관내 및 생체내 분석법을 사용하여 확인된 바, 예로서, 리간드, 효현제, 길항제 및 그의 상동체 및 모의체와 같이, 각각 억제 분자, 활성화 분자, 또는 조절 분자를 의미하는 것으로 사용된다. "조절 인자"라는 용어는 억제제 및 활성제를 포함한다. 억제제는 예로서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제시키거나, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 결합하거나, 그의 자극 또는 효소적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 차단하거나, 그의 활성화를 감소, 방해, 지연시키거나, 불활성화시키거나, 탈감작시키거나, 그의 활성을 하향조절시키는 제제, 예로서, 길항제이다. 활성제는 예로서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도 또는 활성화시키거나, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 결합하거나, 그의 활성을 자극하거나, 증가시키거나, 개시하거나, 활성화시키거나, 그의 활성화 또는 효소적 활성을 증진시키거나, 그의 활성을 감작 또는 상향조절시키는 제제, 예로서, 효현제이다. 조절 인자로는 천연적으로 발생된 리간드, 길항제, 효현제, 작은 화학적 분자 및 합성 리간드, 길항제, 효현제, 작은 화학적 분자 등을 포함한다. 억제제 및 활성제를 확인하는 분석법은 예로서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재하에서 추정의 조절 인자 화합물을 세포에 적용시킨 후, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 미치는 기능적 효과를 측정하는 단계를 포함한다. 잠재적인 활성제, 억제제, 또는 조절 인자로 처리된, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 시료 또는 어세이를, 억제제, 활성제, 또는 조절 인자를 포함하지 않는 대조군 시료와 비교함으로써 그 효과 정도를 조사한다. (조절 인자로 처리되지 않은) 대조군 시료의 상대 활성치를 100%로 지정한다. 억제는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성치가 대조군과 비교하여 약 80%일 때, 임의로 50% 또는 25-1%일 때에 억제된 것이다. 활성화는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성치가 대조군과 비교하여 110%, 임의로 150%, 임의로 200-500%, 또는 1000-3000% 이상으로 높을 때 활성화된 것이다.

본원에서 사용되는 바, "테스트 화합물" 또는 "약물 후보물질" 또는 "조절 인자"라는 용어 또는 문법상 같은 의미를 지닌 용어는 천연적으로 발생되거나 합성된 임의의 분자, 예로서, 단백질, 올리고펩티드(예로서, 길이가 약 5 내지 약 25개인 아미노산, 바람직하게는, 길이가 약 10 내지 20개, 또는 12개 내지 18개의 아미노산, 바람직하게, 길이가 12개, 15개 또는 18개인 아미노산), 유기 소분자, 다당류, 지질, 지방산, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 등을 기술한다. 테스트 화합물은 다양성 범위가 충분한 테스트 화합물의 라이브러리, 예로서, 조합 또는 무작위 라이브러리의 형태일 수 있다. 테스트 화합물은 임의로 융합 파트너, 예로서, 표적 화합물, 구제 화합물, 이량체화 화합물, 안정화 화합물, 어드레스 지정 가능한 화합물, 및 기타 다른 기능성 부분에 연결된다. 통상, 예로서, 억제 활성과 같은 몇몇 바람직한 특성 또는 활성을 갖는 테스트 화합물("선도 화합물"이라 명명됨)을 확인하고, 상기 선도 화합물의 변이체를 형성하고, 상기 변이체 화합물의 특성 및 활성을 평가함으로써 유용한 특성을 갖는 신규의 화학적 엔티티를 생성한다. 대개는 그러한 분석을 위해 고효율 스크리닝(HTS: high throughput screening) 방법이 사용된다.

"유기 소분자"는 분자량이 약 50 달톤 초과 내지 약 2500 달톤 미만, 약 2000 달톤 미만, 약 100 내지 약 1000 달톤 사이, 또는 약 200 내지 약 500 달톤 사이인, 천연적으로 발생되거나 합성된 유기 분자를 의미한다.

본 발명의 상세한 설명

I. 개요

본 발명자들은 앞서, NAP(NAPVSIPQ, 서열 번호 1)가 뇌 튜불린과의 상호작용을 통해서(문헌 [Divinski et al, J. Biol . Chem . 279, 28531-28538 (2004)]), 및 튜불린 조립체를 자극하여 미세소관 조립체와 관련된 신경돌기 성장을 증가시킴으로써(문헌 [Gozes and Spivak-Pohis, Curr Alzheimer Res, 3: 197-199 (2006)]) 뉴런과 아교세포를 보호한다는 것을 밝혀낸 바 있다. 친화성 크로마토그래피에 의해 NAP는 베타 III 튜불린과 특이적으로 상호작용한다는 것도 밝혀졌다(문헌 [Divinski et al, J. Neurochem , 98, 973-984 (2006)]). 유사하게, SAL은 신경보호를 부여하는 것으로 밝혀졌다(예로서, 문헌 ([Gozes et al., 2000]; [Brenneman et al., 1998])). 종래에는 8개의 아미노산으로 이루어진 NAP 중심 서열과 9개의 아미노산으로 이루어진 SAL 중심 서열이 변형되면 기능도 상실하는 것으로 여겨졌다. 본 출원은 NAP 및 SAL 중심 서열과 서열 유사성을 갖고, 예로서, 뉴런 세포 생존 촉진과 같은 생물학적 기능도 갖는 펩티드에 관해 처음으로 시범 설명하는 것이다. NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 동정된 바 있고, 이는 본원 표 1 및 2에 열거되어 있다. NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체: NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6) 중 적어도 2개에서 생물학적 활성이 관찰되었다. 이들 분자는 신경퇴행성 질환 또는 신경퇴행성 장애 치료용의 치료학적 분자로서 사용될 수 있다.

II . NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체의 디자인 및 합성

예로서, 본원에 기술된 바와 같이, 체계적으로 한번에 하나씩 아미노산을 활성 중심 부위의 N 또는 C 말단에 부가하고, 생성된 펩티드를 생물학적 활성에 대해 스크리닝함으로써 중심 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체 활성 부위를 포함하는 폴리펩티드 및 펩티드를 변형시킬 수 있다. 추가로, 상기 펩티드에서 각종 아미노산 잔기의 측쇄가 이룬 기여는 특정된 아미노산, 예로서, Ala를 사용한 체계적인 스캔을 통해 조사할 수 있다. NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 또한 제조할 수 있다.

NAP 유사 및 SAL 유사 서열과 특성을 갖는 펩티드는 예로서, 공식적으로 입수가능한 데이타베이스에서 살펴볼 수 있는 서열을 갖는 공지의 단백질부터 유래할 수 있다. 일례로 NCBI, OMIM, 유니프로트KB/스위스프로트(UniProtKB/Swiss-Prot), EMBOSS 쌍 정렬 알고리즘(EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms), 클러스탈W(ClustalW), T코피(Tcoffee), BLAST, RADAR, PROSITE, 계통수(Phylogenetic Tree), 및 셀렉톤(Selecton)을 포함한다.

NCBI(미국 국립 생명공학 정보 센터: National Center for Biotechnology Information, USA)는 MEDLINE으로부터의 1천 600만개에 달하는 인용과, 지난 1950년대부터 시작되는 생의학 논문에 대한 기타 다른 생명 과학 저널을 소장하는 미국 국립 의학 도서관 서비스인 펍메드(PubMed)를 포함한다. 펍메드는 논문 전문과 기타 다른 관련 자료로 연결시켜 주는 링크를 포함한다. NCBI는 또한 인간 유전자 및 유전병에 관한 카탈로그인 OMIM(인류 멘델 유전 형질 전산자료: Online Mendelian Inheritance in Man)을 개발하였다. OMIM은 텍스트 정보, 참고 문헌, MEDLINE으로의 링크 및 엔트레즈(Entrez) 시스템 상의 서열 기록, 및 NCBI 등의 추가 관련 자료로 연결시켜 주는 링크를 포함한다.

유니프로트KB/스위스프로트는 컴퓨터로 주석 처리한 그의 보충 사양인 유니프로트KB/TrEMBL(UniProtKB/TrEMBL)과 함께, 공식적으로 입수가능한 단백질 서열 모두에 접근할 수 있도록 하는 수동적으로 주석 처리한 단백질 지식베이스이다. 상기 데이타베이스는 기타 다른 데이타베이스와의 통합성, 최소의 중복성 및 많은 주해(예로서, 단백질 기능, 번역후 변형, 도메인 및 부위, 2차 구조, 4차 구조, 단백질 서열 중의 결손과 관련된 질환, 변이체 등)라는 3가지 뚜렷한 기준을 가지고 본 데이타베이스와 기타 다른 단백질 서열 베이스를 구별짓는다.

EMBOSS는 "유럽 분자 생물학 관련 오픈 소스 소프트웨어 패키지(The European Molecular Biology Open Software Suite)"이다. EMBOSS 쌍 정렬 도구는 두 서열을 비교하는데 사용된다. 클러스탈W는 DNA 또는 단백질에 대한 다목적 다중 서열 정렬 프로그램이다. 클러스탈W는 분기 서열에 대한 다중 서열 정렬을 형성하는데, 이는 생물학적으로 의미가 있고, 선택된 서열에 대하여 최대로 매치되는 값을 계산하고, 동일성, 유사성, 및 차이를 볼 수 있도록 한 줄로 정렬시킨다. T코피는 클러스탈W와 유사한 또다른 옵션이다.

베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(BLAST: Basic Local Alignment Search Tool)은 서열 간의 국부적으로 유사한 부위를 찾아낸다. 상기 프로그램은 뉴클레오티드 또는 단백질 서열을 서열 데이타베이스와 비교하고, 매치되는 부분의 통계학적 유의 수준을 계산한다. BLAST는 서열 사이의 기능적 및 진화론적 유연 관계를 추론하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 유전자 계열의 구성원들을 동정하는데에도 도움이 될 수 있다.

PROSITE는 단백질을 그의 서열 유사성에 기초하여 제한된 갯수의 계열로 분류하는 단백질 계열 및 도메인에 관한 데이타베이스이다. 특정 계열에 속하는 단백질 또는 단백질 도메인은 일반적으로 기능적 속성을 공유하고, 공통된 선조로부터 유래된 것이다. PROSITE는 현재 1000개 이상의 단백질 계열 또는 도메인에 특이적인 패턴과 프로파일을 보유하고 있다. 이러한 기호는 각각 상기 단백질의 구조와 기능에 관한 배경 정보를 제공하는 기록과 함께 제공된다.

계통수는 (Saitou 및 Nei)의 NJ(이웃 연결(Neighbour Joining)) 방법에 의존하는데, 이는 먼저 다중 정렬로부터 모든 서열 쌍 간의 거리(분기율(%))를 계산한 후, NJ 방법을 거리 매트릭스를 적용시킨다. 셀렉톤을 통해서는 단일 아미노산 부위의 선택력을 검출할 수 있다. Ka/Ks 비로도 알려져 있는 비동의적(아미노산 변경) 치환 대 동의적(침묵) 치환의 비는 각각의 아미노산 부위에서의 양성 선택 및 정화 선택, 이 둘 모두를 추정하는데 사용된다.

당업자는 소정의 핵산 서열을 변경시키는 다수의 방법들에 대해 잘 알고 있을 것이다. 그러한 주지 방법으로는 부위 지정 돌연변이유발법, 축퇴성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR 증폭, 핵산을 함유하는 세포를 돌연변이 유발제 또는 방사선에 노출시키는 방법, 원하는 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성법(예로서, 거대 핵산 생산을 위해 결찰 및/또는 클로닝 방법과 함께 사용되는 화학적 합성법) 및 기타 다른 주지 기법(문헌 [Giliman & Smith, Gene 8:81-97 (1979)]; [Roberts et al, Nature 328:731-734 (1987)]) 참조)을 포함한다.

상응하는 핵산 서열을 교체하고, 폴리펩티드를 발현시킴으로써 폴리펩티드 서열을 변경시키는 것이 가장 보편적인 방법이다. 그러나, 폴리펩티드 서열은 임의적으로 또한 임의의 원하는 폴리펩티드 생산을 위해서 상업적으로 이용가능한 펩티드 합성기를 이용함으로써 합성적으로 제조될 수 있다(문헌 ([Merrifield, Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)]; [Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis (2nd ed. 1984)]) 참조).

제공되는 서열과, 일반적으로 단백질과 관련하여 당업계에 알려져 있는 정보에 기초하여 당업자는 본 발명의 원하는 핵산 또는 폴리펩티드를 선택할 수 있다. 단백질과 핵산의 성질에 관한 정보를 통해서 당업자는 본원에 개시된 핵산과 폴리펩티드와 유사하거나 등가인 활성을 갖는 적절한 서열을 선택할 수 있다. 상기 정의부에 전형적인 보존적 아미노산 치환이 기재되어 있다.

적합한 분석법으로 스크리닝 기법에 의해서 폴리펩티드는의 원하는 특징에 대해서 평가한다. 예를 들면, 폴리펩티드의 면역학적 특징 상의 변화는 적절한 면역학적 분석법에 의해서 검출할 수 있다. 예로서, 표적 핵산에 대한 핵산 하이브리드화, 단백질의 산화 환원 반응 또는 열적 안전성, 소수성, 단백질 분해에 대한 감도, 또는 응집 경향과 같은 기타 다른 특성의 변화는 모두 표준 기법에 따라 분석된다. 이에, NAP 유사 또는 SAL 유사 모의체 활성 부위를 포함하는 폴리펩티드는 예로서, 뉴런 세포 사멸에 대한 감소 또는 억제와 같은 생물학적 활성에 대하여 평가된다.

더욱 특히, 본 발명의 소펩티드는 당업자에게 공지되어 있는 적합한 분석법 및 동물 모델을 사용함으로써 스크리닝될 수 있다.

이러한 분석법과 모델을 사용함으로써 당업계의 숙련인은 본 발명의 교시에 따라서 다수의 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체를 원하는 활성을 갖는 모의체에 대해 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 매우 다양한 주지 기법을 통해 제조될 수 있다. 상대적으로 짧은 크기의 펩티드는 전형적으로 종래 기법에 따라 고체상 지지체 상에서, 또는 용액 중에서 합성된다(예로서, 문헌 [Merrifield, Am . Chem . Soc. 85:2149-2154 (1963)] 참조). 다양한 자동 합성기와 서열 분석기는 상업적으로 이용가능하며, 이는 공지된 프로토콜에 따라서 사용될 수 있다(예로서, 문헌 [Stewart & Young, Solid phase Peptide Synthesis (2nd ed. 1984)] 참조). 서열의 C 말단 아미노산이 불용성 지지체에 부착되어 있고, 이어서, 서열 중 나머지 아미노산이 순차적으로 첨가되는 것인 고체상 합성법이 본 발명의 펩티드를 화학적으로 합성하는데 있어 바람직한 방법이 된다. 고체상 합성 기법은 문헌 ([Barany & Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides : Analysis , Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.]; [Merrifield et al 1963]; [Stewart et al. 1984])에 기재되어 있다. NAP 및 관련 펩티드는 표준 Fmoc 프로토콜을 사용하여 합성된다(문헌 [Wellings & Atherton, Methods Enzymol. 289:44-67 (1997)]).

상기 기법 이외에도, 본 발명에서 사용하기 위한 펩티드는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 생성하는 단계, 특정 프로모터의 제어하에 발현 카세트 중에 핵산을 배치하는 단계, 및 숙주 세포에서 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 당업자에게 공지된 재조합적으로 공학처리되는 세포로는 세균, 효모, 식물, 사상성 진균, 곤충(특히, 바큘로바이러스 벡터 사용), 및 포유동물 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

선택된 숙주에서 발현시키기 위해서 재조합 핵산을 적절한 제어 서열에 작동가능하게 연결시킨다. E. 콜라이(E. coli)의 경우, 예시적인 제어 서열로는 T7, trp, 또는 람다 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 바람직하게는, 전사 종결 신호를 포함한다. 진핵 세포의 경우, 제어 서열로는 전형적으로 프로모터, 및 바람직하게는, 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로 바이러스 등으로부터 유래된 인핸서, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하며, 이는 스플라이스 도너 및 억셉터 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 플라스미드는 주지 방법에 의해 선택된 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 그러한 방법으로 예를 들면, E. 콜라이의 경우에는 염화칼슘 형질전환 방법, 및 포유동물 세포의 경우에는 인산칼슘 처리 또는 전기천공 방법을 포함한다. 플라스미드로 형질전환된 세포는 플라스미드에 포함되어 있는 유전자, 예로서, amp, gpt, neo, 및 hyg 유전자가 부여하는 항생제에 대한 내성에 의해서 선별될 수 있다.

일단 재조합 펩티드가 발현되고 나면, 황산암모늄 침전법, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 비롯한, 당업계의 표준 방법에 따라 재조합 펩티드를 정제할 수 있다(예로서, 문헌 ([Scopes, Polypeptide Purification (1982)]; [Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Polypeptide Purification (1990)]) 참조). 임의의 추가 단계로는 발현 단백질을 더 높은 정도로 단리시키는 단계, 및 필요하다면, 펩티드를 절단하거나 다르게는 변형시키는 단계(임의로 단백질을 재생시키는 것 포함)를 포함한다.

화학적인 합성, 생물학적인 발현 또는 정제 이후에, 펩티드(들)는 구성 펩티드의 천연 입체 형태와는 실질적으로 다른 입체 형태를 가질 수 있다. 이러한 경우, 펩티드를 변성시키고 환원시킨 후에 펩티드를 바람직한 입체 형태로 재폴딩시키는데 도움이 된다. 펩티드를 환원시키고 변성시키는 방법 및 재폴딩시키는 방법은 당업자에게 주지되어 있다(문헌 ([Debinski et al, J. Biol . Chem. 268:14065-14070 (1993)]; [Kreitman & Pastan, Bioconjug . Chem . 4:581-585 (1993)]; 및 [Buchner et al, Anal . Biochem . 205:263-270 (1992)]) 참조). 예를 들면, (Debinski) 등은 구아니딘-DTE 중에서의 봉입체 펩티드 변성 및 환원을 기술하였다. 이어서, 산화된 글루타티온 및 L 아르기닌을 함유하는 산화환원 완충액 중에서 재폴딩시킨다.

당업자는 펩티드의 생물학적 활성을 감소시키지 않으면서 펩티드를 변형시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 표적 분자의 클로닝, 발현, 또는 융합 펩티드로의 혼입을 촉진시키기 위해 일부 변형이 이루어질 수 있다. 그러한 변형은 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들면, 아미노 말단에 메티오닌을 부가하여 개시 부위를 제공하거나, 양쪽 말단에 추가의 아미노산(예로서, 폴리 His)을 배치하여 편리한 위치에 제한 부위, 또는 종결 코돈이나 정제 서열이 위치할 수 있도록 하는 것을 포함한다.

III . NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체의 기능 분석법 및 치료학적 용도

NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체의 생물학적 활성을 측정하는 한가지 방법은 뉴런 세포를 사멸로부터 보호할 수 있는 그들의 능력에 대해 분석하는 것이다. 그러한 분석법은 (문헌 [Brenneman & Gozes, J. Clin . Invest . 97:2299-2307 (1996)])에 기재되어 있는 바와 같이 제조된, 해리된 대뇌 피질 배양물을 사용함으로써 실시된다. 테스트 패러다임은 테트로도톡신(TTX)으로 공처리된 배양물에 테스트 펩티드를 첨가하는 것으로 구성된다. TTX는 이들 배양물 중에서 아포프토시스 사멸을 일으키는 바, 상기와 같은 "프로그램된 세포 사멸," 및 이러한 유형의 세포 기전을 일으키는 모든 다른 수단에 대한 효능을 입증하는 모델 물질로서 사용된다. 테스트 기간은 5일간 지속되며, 뉴런을 계수하고, 특징적인 형태에 의해서, 및 뉴런에 대한 면역 세포 화학적 마커: 예로서, 뉴런 특이 에놀라제를 사용하여 이루어지는 확인에 의해서 동정한다. 기타 세포 기반 분석법은 예로서, 베타 아밀로이드 단백질 또는 고수준의 ZnCl₂에 노출된 뉴런 세포의 생존을 촉진시킬 수 있는 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드의 능력에 대해 분석하는 것을 포함한다. 이러한 분석법은 본원 실시예 2에서 시연된다. NAP 유사 및 SAL 유사 단백질에 의해 촉진된 뉴런 세포 생존은 또한 신경독소, 예로서, HIV로부터의 외피 단백질인 gp120, 및 N-메틸-D-아스파르트산의 존재하에서 측정될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 뉴런 세포 사멸을 감소시키는데 충분한 양으로 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체와 뉴런 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴런 세포 사멸을 감소시키는 방법을 제공한다. 추가의 측면에서, NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 그의 활성 중심 부위 내에, 바람직하게는, 활성 중심 부위의 N 말단 및/또는 C 말단에 적어도 하나의 D-아미노산을 포함한다. 또다른 바람직한 측면에서, 중심 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드의 각각의 아미노산은 D-아미노산이다. 바람직한 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 예로서, NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6)를 포함한다.

본 발명의 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 신경계 장애를 치료하는데, 및 뉴런 세포 사멸을 예방하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 NAP 유사 펩티드 모의체는 척수 뉴런, 해마 뉴런, 대뇌 피질 뉴런 및 콜린성 뉴런을 포함하나, 이에 한정되지 않는 뉴런 세포의 사멸을 예방하는데 사용될 수 있다. 더욱 특히, 본 발명의 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 (1) HIV로부터의 외피 단백질인 gp120; (2) N-메틸-D-아스파르트산(흥분독성); (3) 테트로도톡신(전기 활동 차단); 및 (4) 알츠하이머병에서 뉴런 변성과 관련된 물질인 β 아밀로이드 펩티드와 관련된 세포 사멸을 예방하는데 사용될 수 있다. 바람직한 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 예로서, NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6)를 포함한다.

따라서, 본 발명의 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 HIV 바이러스로 감염된 환자에게 유효량의, 본 발명의 NAP 유사 펩티드 모의체를 투여함으로써 gp120 유도성 뉴런 세포 사멸을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 또한 뉴런 세포 사멸을 예방하는데 충분한 양으로 본 발명의 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체와 뉴런 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, N-메틸-D-아스파르테이트 자극에 의해 유도된 흥분독성과 관련이 있는 뉴런 세포 사멸을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 또한 뉴런 세포 사멸을 예방하는데 충분한 양으로 본 발명의 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체를 알츠하이머병 환자 또는 알츠하이머병 장애가 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 β 아밀로이드 펩티드에 의해 유도된 세포 사멸을 감소시키는데 사용될 수 있다. NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 또한 알츠하이머병 환자 또는 알츠하이머병 장애가 있는 환자에서 콜린성 차단에 의해 유발된 학습 장애를 경감시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 알츠하이머병 환자에서 단기 기억 및/또는 관계 기억을 개선시키는데 사용될 수 있다. 바람직한 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체로는 예로서, NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6)를 포함한다.

유사하게, 본 발명의 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 다수의 기타 다른 신경계 질환 및 신경계 기능부전과 관련된 뉴런 세포 사멸을 예방하는데 유사한 방식으로 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 사실이다. 본 발명의 치료학적 적용 및 진단학적 적용이 도움이 되는 병상으로는 예로서, 하기: 대뇌 기저핵에 영향을 주는 퇴행성 병태(헌팅톤병, 윌슨병, 흑질 선조체변성, 피질 기저핵 변성), 뚜렛 증후군, 파킨슨병, 진행성 핵상 마비, 진행성 연수 마비, 가족성 연축성 대마비, 척수근 위축증, ALS 및 그의 변종, 치상핵적핵 위축증, 올리브다리 소뇌 위축증, 부신생물성 소뇌 변성, 및 도파민 독성을 비롯한 중추신경 운동계 질환; 감각 뉴런에 영향을 주는 질환, 예로서, 프리이드라이히 운동실조증, 당뇨병, 말초 신경병증, 망막 뉴런 변성; 대뇌 변연계 및 피질계 질환, 예로서, 대뇌 아밀로이드증, 피크 위축증, 및 레트 증후군; 알츠하이머병, 파킨슨병, AIDS 관련 치매, 라이 병, 미만성 루이소체 질환, 간질, 다계통 위축증, 길랑 바레 증후군, 리소좀 저장 장애, 예로서, 지질갈색소증, 다운증후군 후기의 퇴행성 단계, 알퍼스병, CNS 변성 결과로서 현기증을 비롯한, 다발성 뉴런 시스템 및/또는 뇌간에 관여하는 신경퇴행성 병상; 발달 지연 및 학습 장애와 관련된 병상, 다운증후군, 및 산화적 스트레스 유도성 뉴런 사멸; 노화 및 만성 알코올 중독 또는 약물 남용으로 유발되는 병상, 예를 들면, 알코올 중독의 경우, 청반, 소뇌, 콜린성 기저 전뇌의 뉴런 변성; 노화의 경우, 인지기능 장애 및 운동 장애를 일으키는 소뇌 뉴런 및 피질 뉴런 변성; 및 만성 암페타민 남용의 경우, 운동 장애를 일으키는 대뇌 기전핵 뉴런 변성; 초점성 외상으로부터 유발되는 병리학적 변화, 예로서, 뇌졸증, 초점성 허혈, 혈관 부전, 저산소성 허혈성 뇌병증, 고혈당증, 저혈당, 폐쇄성 두부 외상, 또는 직접 외상; 치료 약물 및 치료법의 부작용으로서 유발된 병상(예로서, NMDA 부류의 글루타메이트 수용체의 길항제인 항경련제 투약에 대한 반응으로 대상피질 및 후각뇌피질 뉴런의 변성, 예로서, 화학요법 치료로부터 유발된 말초 신경병증, 및 레이저를 사용한 눈 치료법으로부터 유발된 망막 손상)을 비롯한, 뉴런 세포 사멸 및/또는 준치사 뉴런 병상을 일으키는 병태(질환 및 상해)를 포함한다. 본 발명의 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 또한 자가면역 질환, 예로서, 다발 경화증 및 정신 장애, 예로서, 정신분열병 및 우울증을 치료하는데에도 사용될 수 있다. 바람직한 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체로는 예로서, NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6)를 포함한다.

따라서, 뉴런 세포 사멸을 감소시키는 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 1997년 2월 7일 출원된 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 98/35042, 및 1998년 11월 6일 출원된 미국 특허 번호 제6613740호에 기재된 다양한 방법을 사용함으로써 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체의 디자인 및 합성에 관하여 상기 기술된 교시와 본원에 기술된 분석법을 사용함으로써 당업계의 숙련인은 그의 활성 중심 부위 내에 적어도 하나의 D-아미노산을 포함하는 다른 생물학적으로 활성인 NAP 유사 펩티드 모의체를 동정할 수 있다는 것을 자명한 것으로 쉽게 인식할 수 있을 것이다. 예를 들면, 문헌 ([Brenneman et al., Nature 335:639-642 (1988)], 및 [Dibbern et al, J. Clin . Invest. 99:2837-2841 (1997)])은 HIV로부터의 외피 단백질(gp120)과 관련된 뉴런 세포 사멸을 감소시킬 수 있는 ADNF 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 분석법을 교시한다. 또한, 문헌 ([Brenneman et al., Dev . Brain Res. 51:63-68 (1990)], 및 [Brenneman & Gozes, J. Clin . Invest. 97:2299-2307 (1996)])은 N-메틸-D-아스파르테이트에 의한 자극에 의해서 유도된 흥분독성과 관련된 뉴런 세포 사멸을 감소시킬 수 있는 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 분석법을 교시한다. 예로서, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 98/35042에 기재된 기타 다른 분석법 또한 기타 다른 생물학적으로 활성인 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체를 동정하는데 사용될 수 있다.

또한, 뉴런 세포 사멸을 감소시키는 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체는 생체내에서 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, 콜린성 차단과 관련된 학습 기능부전 및 기억 기능부전에 대해 보호할 수 있는 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체의 능력을 테스트할 수 있다. 예를 들면, 콜린성 차단은 래트에서 콜리노톡신 AF64A의 투여에 의해 일으킬 수 있고, ADNF 폴리펩티드는 비내 투여될 수 있으며, 수중 미로 실험을 실시할 수 있다(문헌 [Gozes et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:427-432 (1996)]). 효능이 있는 NAP 유사 펩티드 모의체로 치료를 받은 동물의 학습 능력과 기억 능력은 대조군에 비하여 향상될 것이다.

추가로, 알츠하이머병과 관련된 뉴런 세포 사멸로부터 보호하거나 그를 감소시킬 수 있는 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체의 능력은 생체내에서 스크리닝될 수 있다. 이러한 실험을 위해서는 아포지단백질 E(ApoE) 결핍 동형접합성 마우스가 사용될 수 있다(문헌 ([Plump et al., Cell 71 :343-353 (1992)]; [Gordon et al., Neuroscience Letters 199: 1-4 (1995)]; [Gozes et al, J. Neurobiol . 33:329-342 (1997)])).

면역 세포 증식을 억제시킬 수 있는 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체의 능력은 문헌 [Offen et al. J Mol Neurosci . 15(3): 167-76 (2000)] 및 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 04/060309(상기 두 문헌 모두 MOG 유도성의 만성 EAE 마우스 모델을 기재하고 있으며, 이들은 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이 분석될 수 있다. STOP 단백질 결핍 마우스는 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체의 항정신분열병 활성을 평가하는데 사용될 수 있는, 정신분열병에 관해 당업계에서 인정받은 모델이다. 예로서, 문헌 [Andrieux et al., Genes & Develop., 16:2350-2364 (2002)](이는 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 인용된다)을 참조한다. NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체의 항불안 활성은 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 04/080957(이는 이는 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 인용된다)에 개시된, 마우스 모델 및 모리스 수중 미로를 사용함으로써 평가될 수 있다. NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체에 의한 말초 신경 독성의 감소는 래트 모델, 및 로타 로드 테스트(rota-rod test) 및 발바닥 테스트를 사용함으로써 평가될 수 있다. 예로서, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 06/099739(이는 이는 본원에서 모든 목적을 위해 참고로 인용된다)를 참조한다.

IV . 약물 발견

튜불린이 NAP와 상호작용하는 단백질이라는 것을 확인하고, 튜불린 중 NAP 유사 서열을 발견하게 됨으로써 예로서, 신경퇴행성 장애(예로서, 알츠하이머병, AIDS 관련 치매, 헌팅톤병, 및 파킨슨병), 인지기능 결핍, 말초 신경 독성, 운동 기능 장애, 감각 기능 장애, 불안, 우울증, 정신병, 망막 변성을 포함하는 병태, 학습 및 기억에 영향을 주는 질병, 또는 신경정신 장애, 뉴런 세포 사멸 및 산화적 스트레스와 관련된 질병, HIV 관련 복합성 치매, 뇌졸증, 두부 외상, 대뇌 마비, 태아 알코올 증후군과 관련된 병태, 및 자가면역 질환, 예로서, 다발 경화증과 같은 뉴런 장애 치료를 위한 추가 약물 발견에 대한 표적으로서 튜불린 및 튜불린 유래 펩티드를 사용할 수 있게 되었다. 그러한 치료제는 또한 출생 전 및 출생 후, 둘 모두에서 학습 및 기억을 향상시키는 방법에도 사용될 수 있다. 온전한 튜불린 구조체와, 치환제로서의 NAP를 사용하여 NAP와 동일한 부위에 결합하는 제제를 찾아내기 위한 실험을 수행할 수 있다(예로서, 문헌 ([Katchalski-Katzir et al, Biophys Chem. 100(1-3):293-305 (2003)]; [Chang et al., J Comput Chem. 24(16): 1987-98 (2003)])에 기재).

확인된 바와 같이, 제제들 중 적어도 일부는 결합 활성에 대한 유망한 조절 인자이기 때문에 본 발명의 폴리펩티드 또는 튜불린에 결합할 수 있는 제제에 대하여 스크리닝함으로써 예비 스크린을 수행할 수 있다. 결합 분석법은 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드를 하나 이상의 테스트 제제와 접촉시키고, 상기 단백질과 테스트 제제가 충분한 시간 동안 결합 복합체를 형성할 수 있도록 하는 단계를 포함한다. 형성된 임의의 결합 복합체는 다수의 확립된 분석 기법들 중 임의의 것을 사용함으로써 검출될 수 있다. 단백질 결합 분석법은 공침전, 비변성 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 공이동, 및 웨스턴 블롯 상에서의 공이동을 측정하는 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(예로서, 문헌 [Bennet and Yamamura, Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods , in Neurotransmitter Receptor Binding (Yamamura et al., eds.), pp. 61-89 (1985)] 참조). 상기 분석법에서 사용되는 단백질은 천연적으로 발현되거나, 클로닝되거나, 합성될 수 있다.

초기에 상기 스크리닝 방법들 중 임의의 것에 의해서 확인된 제제를 추가로 테스트하여 명백한 활성을 확인할 수 있다. 그러한 연구는 적합한 폴리뉴클레오티드 모델을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 상기 방법의 기본 포맷은 초기 스크린 동안 확인된 선도 화합물을 인간에 대한 모델로서의 역할을 하는 동물에게 투여한 후, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현 또는 활성이 사실상 상향조절되었는지 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 확인 연구에서 사용된 동물 모델은 일반적으로 어떤 종류의 포유동물이든 상관없다. 적합한 동물의 구체적인 예로는 영장류, 마우스, 및 래트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 폴리펩티드의 조절 인자로 테스트된 제제는 임의의 작은 화학적 화합물, 또는 생물학적 엔티티, 예로서, 단백질, 당, 핵산, RNAi, 또는 지질일 수 있다. 전형적으로 테스트 화합물은 작은 화학적 분자 및 펩티드일 것이다. 주로 수성 용액 또는 유기 용액(특히 DMSO계 용액) 중에 용해될 수 있는 화합물이 사용되기는 하지만, 본질적으로 임의의 화학적 화합물이 본 발명의 분석법에서 잠재적인 조절 인자 또는 리간드로서 사용될 수 있다. 분석 단계를 자동화하고, 임의의 편리한 공급원으로부터 입수한 화합물을, (예로서, 로보트식 어세이 중 미량역가 플레이트 상의 미량역가 포맷으로) 전형적으로 동시에 진행되는 어세이에 제공하여 거대 화학 라이브러리를 스크리닝할 수 있는 분석법을 디자인하였다. 시그마(Sigma)(미주리주 세인트루이스 소재), 알드리치(Aldrich)(미주리주 세인트루이스 소재), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트루이스 소재), 플루카 케미카-바이오케미카 아날리티카(Fluka Chemika-Biochemica Analytika)(스위스 부크스 소재) 등을 비롯한, 화학적 화합물의 공급업체가 다수 존재한다는 것을 이해할 것이다. 조절 인자는 또한 본 발명의 mRNA(예로서, 안티센스 분자, 리보자임, DNA자임 등) 수준을 감소시킬 수 있도록 디자인된 제제 또는 mRNA로부터의 번역 수준을 감소시킬 수 있도록 디자인된 제제를 포함한다.

하나의 바람직한 실시태양에서, 고효율 스크리닝 방법은 다수의 잠재적인 치료학적 화합물(잠재적인 조절 인자 또는 리간드 화합물)을 포함하는 조합 화학 또는 펩티드 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 이어서, 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 분석법으로 상기 "조합 화학 라이브러리" 또는 "리간드 라이브러리"를 스크리닝하여 예로서, 튜불린 결합과 같은 원하는 특징적인 활성을 나타내는 라이브러리 구성원(특히 화학 물질 종 또는 하위부류)을 확인한다. 그렇게 확인된 화합물은 종래 "선도 화합물"로서의 역할을 할 수 있거나, 그 자체로 잠재적인 치료제 또는 실제 치료제로서 사용될 수 있다. 활성 소분자에 대해 스크리닝하는데 이용될 수 있는 라이브러리로는 어베일러블 케미칼 디렉토리(ACD: Available Chemical Directory, 278,000개의 화합물), ACD 스크리닝 라이브러리(>1,000,000개의 화합물), CRC 컴바인 케미칼 디렉토리(CRC Combined Chemical Dictionary)(~350,000개의 화합물), 아니섹스(Anisex)(115,000개의 화합물), 메이브릿지(Maybridge)(62,000개의 화합물), 더웬트(Derwent) 및 NCI 라이브러리를 포함한다.

V. 발견된 화합물의 활성에 대한 분석

추가의 약물 발견 방법은 신경보호 활성에 대해 스크리닝하는 것을 포함한다. 그러한 활성은 예로서, 문헌 ([Divinski et al. (2006)] 및 [Gozes et al. (2005)])에 기재되어 있는 바와 같이, 뉴런 스트레스 및 생존에 대한 고전적 조직 배양물 모델에서 테스트될 수 있다. 이러한 분석법은 당업계에 공지되어 있고, 이는 테스트 화합물이 미세소관 재구성, 신경돌기 성장, 및 독성 인자로부터의 보호에 미치는 효과에 초점을 맞춘다.

동물 모델에서 신경보호를 테스트하는 생체내 분석법 또한 당업계에 공지되어 있다. 다양한 테스트 물질이 운동 활성에 미치는 효과를 측정하는 테스트로는 예로서, 래트에서 진행되는 로토로드(rotorod) 테스트를 포함한다. 테스트 물질이 감각 활성에 미치는 효과를 측정하는데에는 후각능이 사용될 수 있다. 그러한 분석법은 예로서, 미국 출원 공개 번호 2006/0247168에 기재되어 있다.

태아 알코올 증후군에 대하여 잘 확립된 모델을 사용하여 테스트 화합물의 효능을 테스트할 수 있다(문헌 [Webster et al., Neurobehav . Toxicol 2:227-234 (1980)]). 이러한 패러다임은 알코올 투여로부터 발생된 심각한 산화적 스트레스에 대한 효능을 테스트하는 것이다(문헌 [Spong et al., 2001]). 이러한 모델을 통해 심각한 산화적 스트레스와 태아 알코올 증후군에 대하여 효능이 있는 제제에 관한 관련 평가가 신속하게 이루어질 수 있다. 테스트 화합물의 보호 효과를 평가하기 위해 태아 사망수를 측정할 수 있다.

예로서, 레이저 수술 환경에서와 같이 레이저에 노출된 망막 세포에 대해 테스트 화합물이 미치는 보호 효과를 테스트하는 실험은 미국 가출원 번호 제60,776,329호에 기재되어 있다. 간략하면, 래트를 레이저 광응고에 노출시킨 후에 즉시 보호 화합물을 전신으로 또는 유리체내로 처리하였다. 동물을 희생시키고, 망막 조직 절편을 조직학적 이상 및 형태학적 이상에 대하여 관찰하였다.

상기 논의한 바와 같이, 면역 세포 증식을 억제시킬 수 있는 능력, 항정신분열병 활성, 항불안 활성, 및 말초 신경 독성을 감소시킬 수 있는 능력에 대해서 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체의 조절 인자를 평가할 수 있다.

VI . 약제학적 투여

본 발명은 약제학적 투여를 위한 다수의 신경보호 NAP 유사 및 SAL 유사 펩티드 모의체 및 조성물을 제공한다. 예를 들면, 약학 조성물은 본원에 기술된 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체 중 하나, 또는 조합된 1 초과의 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체를 포함할 수 있다. 바람직한 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체로는 예로서, NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6)를 포함한다. 약학 조성물은 NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체와 함께 조합된 추가의 신경보호 화합물, 예로서, ADNF 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 신경보호 ADNF 폴리펩티드는 NAP(서열 번호 1) 또는 SAL(서열 번호 19)을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. NAP 유사 펩티드 모의체는 적어도 하나의 D-아미노산을 포함할 수 있고, 많게는 아미노산 전부 모두가 D-키랄성일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 추가의 신경보호 펩티드는 적어도 하나의 D-아미노산, 및 많게는 D-아미노산 전부 모두를 갖는다.

본 발명의 약학 조성물은 각종 약물 전달 시스템에 사용하기에 적합하다. 혈액 뇌장벽을 통과할 수 있는 능력을 갖는 펩티드는 당업자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 예를 들면, 전신으로, 비내로 투여하는 방식 등의 방법으로 투여될 수 있다. 혈액 뇌장벽을 통과할 수 있는 능력이 없는 거대 펩티드는 당업자에게 주지되어 있는 기법을 사용하여 대뇌실내(ICV) 주사를 통해 또는 캐뉼라를 통해 포유동물의 뇌로 투여될 수 있다(예로서, 문헌 ([Motta & Martini, Proc . Soc . Exp . Biol . Med. 168:62-64 (1981)]; [Peterson et al, Biochem . Pharamacol. 31:2807-2810 (1982)]; [Rzepczynski et al, Metab . Brain Dis. 3:211-216 (1988)]; [Leibowitz et al, Brain Res . Bull. 21:905-912 (1988)]; [Sramka et al, Stereotact . Fund . Neurosurg. 58:79-83 (1992)]; [Peng et al, Brain Res. 632:57-67 (1993)]; [Chem et al, Exp . Neurol . 125:72-81 (1994)]; [Nikkhah et al, Neuroscience 63:57-72 (1994)]; [Anderson et al, J. Comp . Neurol 357:296-317 (1995)]; 및 [Brecknell & Fawcett, Exp. Neurol . 138:338-344 (1996)]) 참조).

본 발명에서 사용하기에 적합한 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed. 1985)]에서 살펴볼 수 있다. 추가로, 약물 전달 방법에 관한 간략한 리뷰를 위해서는 문헌 [Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]을 참조한다. 적합한 투여량 범위는 본원에서 제공한 실시예 뿐만 아니라, 국제 PCT 출원 공개 번호 WO 9611948에도 기재되어 있다.

따라서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 조합된, 본원 상기에 기술된 폴리펩티드들 중 하나 이상을 포함하는 치료학적 조성물 또는 약제를 제공하는데, 여기서, 상기 폴리펩티드의 양은 치료학적 효과를 제공하는데 충분한 양이다.

치료학적 적용에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는 비경구, 국소, 경구, 비내, 폐내(예로서, 흡입에 의함), 전신, 또는 국부 투여를 비롯한 임의의 유효한 수단에 의한 투여 목적의 약학 조성물 중에 포함된다. 비경구 투여를 위해, 약학 조성물은 예로서, 정맥내, 피하, 진피내, 또는 근육내로 투여된다. 비내 펌프, 국소용 패취, 및 점안제 또한 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해되어 있거나 현탁된, 상기 기술된 바와 같은 폴리펩티드의 용액을 포함하는 비경구 투여용의 조성물을 제공한다. 예를 들면, 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글리세린, 하이알루론산 등과 같은 각종 수성 담체가 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 종래의 주지 멸균 기법에 의해 멸균처리될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수성 용액은 그 자체로 또는 동결건조된 상태의 용도로 패킹될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여에 앞서 멸균 용액과 조합될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건과 유사한 조건을 만들기 위해 필요한, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있으며, 그 예로는 pH 조절제 및 완충제, 등장도 조절제, 습윤제 등으로서, 예를 들면, 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등을 포함한다.

고체 조성물의 경우, 예로서, 약제학적 등급의 만닛톨, 락토스, 전분, 스테아린산마그네슘, 사카린나트륨, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 비롯한, 종래의 비독성 고체 담체가 사용될 수 있다. 경구 투여용의 약제학적으로 허용가능한 비독성 조성물은 보통 사용되는 부형제, 예로서, 앞서 나열한 담체들 중 임의의 것, 및 일반적으로는 10-95%의 활성 성분, 및 더욱 바람직하게는, 25%-75%의 농도로 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다.

에어로졸 투여의 경우, 폴리펩티드는 계면활성제 및 추진제와 함께 미세 분할된 형태로 공급되는 것이 바람직하다. 당연히 계면활성제는 비독성이어야 하며, 추진제 중에서 가용성인 것이 바람직하다. 그러한 제제 중 대표적인 것으로는 6 내지 22개의 탄소 원자를 함유하는 지방산, 예로서, 카프로산, 옥탄산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산과 지방족 다가 알코올 또는 그의 폐환형 무수물의 에스테르 또는 부분 에스테르가 있다. 혼합형 에스테르, 예로서, 혼합형 또는 천연 글리세리드가 사용될 수 있다. 예로서, 비내 전달용의 렉시틴과 같이, 필요에 따라 담체도 포함할 수 있다. 일례로 1 ml당 7.5 mg NaCl, 1.7 mg 시트르산 1수화물, 3 mg 이인산나트륨 2수화물 및 0.2 mg 염화벤즈알코늄 용액(50%)을 포함하는 용액을 포함한다(문헌 [Gozes et al, J Mol Neurosci. 19(1-2): 167-70 (2002)]).

치료학적 적용에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드는 신경퇴행성 장애, 인지기능 결핍, 및 기타 다른 병태의 증상을 감소시키거나 제거하는데 충분한 양으로 또는 학습 및 기억을 향상시키는데 충분한 양으로 환자에게 투여된다. 이를 달성하는데 적합한 양을 "치료학적 유효 투여량"으로서 정의한다. 본 용도에 유효한 양은 예를 들면, 사용되는 특정 폴리펩티드, 예방하고자 하는 질환 또는 질병의 유형, 투여 방식, 환자의 체중 및 일반 건강 상태, 및 처방 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.

예를 들면, 1일 1회로(예로서, 저녁에 1회) 투여되는, 100 ng 내지 10 mg 용량 범위에 포함된 폴리펩티드의 양이 치료학적 유효량이 될 것이다. 별법으로, 투여량은 상기 범위에 포함되지 않을 수 있거나, 상기와는 다른 스케줄로 투여될 수 있다. 예를 들면, 투여량 범위는 0.0001 mg/kg 내지 10,000 mg/kg일 수 있고, 바람직하게는 1회 투여당 약 0.001 mg/kg, 0.1 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 50 mg/kg 또는 500 mg/kg이 될 수 있다. 투여량은 매시간마다, 매 4, 6 또는 12시간마다, 식사와 함께, 매일, 매 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일마다, 매주, 매 2, 3, 4주마다, 매월, 또는 매 2, 3, 또는 4개월마다, 또는 그의 임의 조합 방식으로 투여될 수 있다. 투약 기간은 치료하고자 하는 병태에 따라서 단일(급성인 경우) 투약일 수 있거나, 몇일, 몇주, 몇개월 또는 몇년간에 걸쳐 지속될 수 있다. 당업자는 적합한 투여량을 결정할 수 있고, 이는 문헌 ([Gozes et al, 2000]; [Gozes et al, 2002]; [Bassan et al 1999]; [Zemlyak et al, Regul . Pept . 96:39-43 (2000)]; [Brenneman et al, Biochem . Soc. Trans. 28: 452-455 (2000)]; [Erratum Biochem Soc . Trans. 28:983]; [Wilkemeyer et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100:8543-8548 (2003)]; [Alcalay et al, Neurosci Lett. 361:128-31 (2004)]; 및 [Gozes et al., CNS Drug Rev., 11(4):353-68 (2005)])에 보고된 예비 데이타에 의존할 수 있다.

실시예

실시예 1: NAP 유사 및 SAL 유사 서열 검색

생물 정보학 검색에 착수하여 (예로서, 미세소관과의 상호작용을 통해) 신경보호를 제공하는 NAP 유사 또는 SAL 유사 서열이 기타 다른 단백질에도 존재하는지 여부, 및 NAP와 유사하며 신경보호를 제공하는 튜불린 특이 서열이 존재하는지 여부를 처리하였다.

NAP 및 SAL 서열을 다수의 상이한 검색 엔진: NCBI, OMIM, 유니프로트KB/스위스프로트, EMBOSS 쌍 정렬 알고리즘, 클러스탈W, T-코피, BLAST, RADAR, PP서치, PROSITE, 계통수, 및 셀렉톤에 제출하였다.

인간 튜불린 단백질에 대한 검색에 있어 유니프로트KB/스위스프로트에서는 필드 설명 튜불린, 및 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유기체에 대한 논리 연산자를 사용하였다. 두 서열 간에 유사성이 최대인 영역을 찾기 위해서 EMBOSS에서는 워터 정렬(water alignment)을 이용한 블로섬62(Blosum62)를 사용하였다. 다중 정렬은 클러스탈W로부터 얻었고, 추가로 잘뷰(Jalview) 에디터를 사용하였다.

BLAST, 및 유사 프로그램인 RADAR 및 PP서치의 경우, 인간 베타3 튜불린과 그의 오솔로그를 의문 서열로 사용하였다. 셀렉톤의 경우, 튜불린의 CDS와 12개의 오솔로그 유기체를 입력 파일로서 FASTA 포맷으로 제출하였다.

결과를 하기와 표 1에 요약한다. 단백질-단백질 상호작용 및 GTP 결합에 중요한, 튜불린내 존재하는 구조적 요소는 NAP와 상당한 상동성을 나타낸다:

NAVLSIHQ(서열 번호 2)- 튜불린 베타1

NATLSVHQ(서열 번호 3)- 튜불린 베타2

NATLSIHQ(서열 번호 4)- 튜불린 베타3

다양한 튜불린 하위유니트에 대한 NCBI 단백질 수탁 번호는 하기와 같다:

튜불린 베타1 Q9H4B7

튜불린 베타 2a Q13885

튜불린 베타 2b Q9BVA1

튜불린 베타 2c P68371

튜불린 베타 3 Q13509

튜불린 베타 4 P04350

튜불린 베타 5 P07437

튜불린 베타 6 Q9BUF5

알파 튜불린을 제외한, 각 튜불린 베타1, 베타2, 및 베타3에서 관찰되는 서열은 NAVLSIHQ(서열 번호 2), NATLSVHQ(서열 번호 3), 및 NATLSIHQ(서열 번호 4)이다. 상기 서열은 아미노산 184부터 아미노산 191까지에 걸쳐 있다. 이 서열은 미세소관내의 베타와 알파 튜불린 사이의 종방향 접촉에 있어서 중요한 것으로 예측되는 영역과 겹치는데, 이는 즉, 이량체화될 때 은폐되는 분자 상단의 상대적으로 노출된 영역에 위치한다. 상기 서열은 또한 베타 튜불린의 GTP 결합 포켓, 특히 리보스 결합과 관련된 영역에서 가까운 위치에 존재한다(문헌 ([Nogales and Wang (2006) Curr Opin Cell Biol, 18, 179-184]; [Nogales and Wang (2006) Curr Opin Struct Biol , 16, 221-229])).

상동성이 >50%이지만, NAP에서 관찰되는 2개의 프롤린은 보존되지 않았다. 프롤린이 대개는 단백질-단백질 상호작용과 관련이 있다는 점을 감안하면, NAPVSIPQ(서열 번호 1)는 여전히 미세소관과 몇몇 내인성 결합을 유지하면서, 추가로 단백질 결합 또는 단백질 상호작용 파괴 활성을 가지게 될 수 있다.

NAPVSIPQ(서열 번호 1)에 대한 상동성이 증가된 기타 다른 서열로는 STPTAIPQ(서열 번호 6)(수탁 번호 Q7KZS6)를 포함하는데, 이 서열은 튜불린 절편과, 로돕신 계열로부터의 G-단백질 커플링된 수용체와 관련이 있는 절편, 이 둘 모두를 포함한다. 후자의 절편은 색소 침착과 관련된 멜라노코르틴 1 수용체와 유사성을 갖는다.

예로서, 시트레이트 리아제와 같은 기본 단백질을 사용함으로써 추가 서열의 유사성을 관찰하였다(표 1). ATP 시트레이트 리아제는 많은 조직에서 세포질 아세틸-CoA의 합성을 담당하는 1차 효소이다. 이는 신규 지질 합성에서 중추적인 역할을 한다. 신경 조직에서는 (유사성에 의해) 아세틸콜린의 생합성에 관여할 수 있다.

NAP(NAPVSIPQ) 서열 상동 관계
의문 1 NAPVSIPQ 8 (서열 번호 1) NXPVSIPQ (서열 번호 14) 대상 3 NTPVSIPQ 10 (서열 번호 7)	DNA 프리마제 액시도보랙스 종(Acidovorax sp.) JS42
의문 2 APVSIPQ 8 (서열 번호 8) APVSIPQ (서열 번호 8) 대상 217 APVSIPQ 223 (서열 번호 8)	시트레이트 리아제, 알파 서브유니트 써모시누스 카르복시디보란스(Thermosinus carboxydivorans) Nor1
의문 1 NAPVSIPQ 8 (서열 번호 1) NXP+SIPQ (서열 번호 15) 대상 215 NTPISIPQ 222 (서열 번호 9)	추정 시트레이트 리아제 알파 서브유니트 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) str. 만프레도(Manfredo)
의문 1 NAPVSIPQ 8 (서열 번호 1) NXP+SIPQ (서열 번호 15) 대상 158 NTPISIPQ 165 (서열 번호 9)	시트레이트 리아제 알파 서브유니트 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)
의문 1 NAPVSIPQ 8 (서열 번호 1) NXP+SIPQ (서열 번호 15) 대상 215 NTPISIPQ 222 (서열 번호 9)	쇄 A, 시트레이트의 추정 알파 서브유니트의 결정 구조 쇄 B, 시트레이트의 추정 알파 서브유니트의 결정 구조 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)로부터 유래된 시트레이트와의 복합체 중 리아제 노쓰이스트 구조 게노믹스 표적 Smr 12(Casp 표적)
의문 1 NAPVSIPQ 8 (서열 번호 1) NXP+SIPQ (서열 번호 15) 대상 215 NTPISIPQ 222 (서열 번호 9)	시트레이트 리아제 알파 쇄/시트레이트 CoA- 트랜스퍼라제 스트렙토코커스 피오게네스 MGAS10270]
의문 1 NAPVSIPQ 8 (서열 번호 1) NXP+SIPQ (서열 번호 15) 대상 215 NTPISIPQ 222 (서열 번호 9)	시트레이트 리아제 알파 서브유니트 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)
의문 1 NAPVSIP 7 (서열 번호 10) NAPVSIP (서열 번호 10) 대상 102 NAPVSIP 108 (서열 번호 10)	링(RING) 핑거 도메인 단백질 네오사토리아 휘세리비(Neosartorya fischeri) NRRL 181
의문 2 APVSIPQ 8 (서열 번호 8) APVSIPQ (서열 번호 8) 대상 453 APVSIPQ 459 (서열 번호 8)	선형 그라미시딘 신테타제 서브유니트 D 마이코박테리움 에이비움(Mycobacterium avium) 104
의문 2 APVSIPQ 8 (서열 번호 8) APVSIPQ (서열 번호 8) 대상 453 APVSIPQ 459 (서열 번호 8)	PstA 마이코박테리움 에이비움
의문 2 APVSIPQ 8 (서열 번호 8) APVSIPQ (서열 번호 8) 대상 461 APVSIPQ 467 (서열 번호 8)	PstA 마이코박테리움 에이비움 아종(Mycobacterium avium subsp .) 파라투베르쿨로시스(paratuberculosis) K-10
의문 1 NAPVSIPQ 8 (서열 번호 1) NAPV++PQ (서열 번호 16) 대상 760 NAPVAVPQ 767 (서열 번호 11)	글루코스 억제 매개인자 단백질 피치아 스티피티스(Pichia stipitis) CBS 6054
의문 1 NAPVSIPQ 8 (서열 번호 1) NAXVSIPQ (서열 번호 17) 대상 73 NARVSIPQ 80 (서열 번호 12)	어드헤신 계열 단백질 그라눌리박터 베데스덴시스(Granulibacter bethesdensis) CGDNIH1
의문 1 NAPVSIPQ 8 (서열 번호 1) +APVS+PQ (서열 번호 18) 대상 314 DAPVSVPQ 321 (서열 번호 13)	양이온 유출 계열 단백질 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Pf-5

SAL(SALLRSIPA) 서열 상동 관계
의문 2 ALLRSIPA 9 (서열 번호 20) ALLRSIPA (서열 번호 20) 대상 614 ALLRSIPA 621 (서열 번호 20)	포스파티딜이노시톨 글리칸, 부류 G, 다니오 레리오(Danio rerio)
의문 2 ALLRSIPA 9 (서열 번호 20) ALLRSIPA (서열 번호 20) 대상 53 ALLRSIPA 60 (서열 번호 20)	열 쇼크 단백질 60 살모 살라르(Salmo salar)
의문 2 ALLRSIP 8 (서열 번호 21) ALLRSIP (서열 번호 21) 대상 259 ALLRSIP 265 (서열 번호 21)	올리고펩티드/디펩티드 ABC 수송체, ATP아제 서브유니트 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) RKU-1
의문 2 ALLRSIPA 9 (서열 번호 20) A+LRSIPA (서열 번호 28) 대상 346 AMLRSIPA 353 (서열 번호 22)	올리고펩티드/디펩티드 ABC 수송체, ATP아제 서브유니트 부르크홀데리아 피마툼(Burkholderia phymatum) STM815
의문 2 ALLRSIPA 9 (서열 번호 20) ALLR+IPA (서열 번호 29) 대상 254 ALLRAIPA 261 (서열 번호 23)	올리고펩티드/디펩티드 ABC 수송체, ATP아제 서브유니트 부르크홀데리아 피마툼 STM815
의문 2 ALLRSIP 8 (서열 번호 21) ALLRSIP (서열 번호 21) 대상 272 ALLRSIP 278 (서열 번호 21)	ABC 펩티드 수송체, ATP 결합 성분 로도코커스 종(Rhodococcus sp .) RHA1
의문 1 SALLRSIP 8 (서열 번호 24) SALLR+IP (서열 번호 30) 대상 124 SALLRAIP 131 (서열 번호 25)	ATP아제와 유사, H+ 수송, V1 서브유니트 E 유사 이소형 2 라투스 노르베기쿠스(Rattus Norvegicus)
의문 2 ALLRSIPA 9 (서열 번호 20) A+LRSIPA (서열 번호 28) 대상 346 AMLRSIPA 373 (서열 번호 22)	글루코스 억제성 분열 단백질 A 로세이플렉수스 카스텐홀지이(Roseiflexus castenholzii) DSM 13941
의문 2 ALLRSIPA 9 (서열 번호 20) A+LRSIPA (서열 번호 28) 대상 346 AMLRSIPA 353 (서열 번호 22)	글루코스 억제성 분열 단백질 A 클로로플렉수스 아그레간스(Chloroflexus aggregans) DSM 9485
의문 2 ALLRSIPA 9 (서열 번호 20) A+LRSIPA (서열 번호 28) 대상 346 AMLRSIPA 353 (서열 번호 22)	글루코스 억제성 분열 단백질 A 헤르페토시폰 아우란티아쿠스(Herpetosiphon aurantiacus) ATCC 23779
의문 2 ALLRSIPA 9 (서열 번호 20) A+LRSIPA (서열 번호 28) 대상 364 AMLRSIPA 371 (서열 번호 22)	글루코스 억제성 분열 단백질 A 로세이플렉수스 종(Roseiflexus sp .) RS-1 길이 = 679
의문 1 SALLRSIP 8 (서열 번호 24) SALLR+IP (서열 번호 30) 대상 288 SALLRAIP 295 (서열 번호 25)	PAS/PAC 센서 신호전달 히스티딘 키나제 스티그마텔라 아우란티아카(Stigmatella aurantiaca) DW4/3-1
의문 2 ALLRSIP 8 (서열 번호 21) ALLRSIP (서열 번호 21) 대상 312 ALLRSIP 318 (서열 번호 21)	조절 단백질, LuxR 마리프로펀더스 페로옥시단스(Mariprofundus ferrooxydans) PV-1
의문 2 ALLRSIPA 9 (서열 번호 20) ALLR+IPA (서열 번호 29) 대상 189 ALLRTIPA 196 (서열 번호 26)	테트라트리코펩티드 TPR_2 헤르페토시폰 아우란티아쿠스 ATCC 23779
의문 2 ALLRSIPA 9 (서열 번호 20) ALLRS+PA (서열 번호 31) 대상 406 ALLRSVPA 413 (서열 번호 27)	코엔자임 F390 신테타제/페닐아세틸 CoA 리가제 메타노쿨레우스 마리스니거(Methanoculleus marisniger) JR1
의문 2 ALLRSIP 8 (서열 번호 21) ALLRSIP (서열 번호 21) 대상 134 ALLRSIP 140 (서열 번호 21)	금속 의존성 포스포하이드롤라제 액시도박테리아 박테리움(Acidobacteria bacterium) 엘린(Ellin)345

실시예 2: 신경보호 활성 분석법.

NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6)는 NAP 유사 펩티드이다. 이들 펩티드가 ZnCl₂ 및 베타 아밀로이드 중독 이후의 성상 세포 및 뉴런 생존에 미치는 효과를 테스트하였다.

A. 방법:

1. 대뇌 피질 성상 세포

세포 배양물을 앞서 기술된 바와 같이 제조하였다(문헌 ([McCarthy KD, de Vellis J., J. Cell Biol, 85:890-902 (1980)]; [Gozes I et al., J. Pharmacol . Exp. Ther., 257:959-66 (1991)])). 신생 마우스(Harlan Biotech Israel Ltd.(이스라엘 레호보트 소재))의 머리를 절단하여 희생시키고, 뇌를 제거하였다. 피질을 절개하고, 뇌척수막을 제거하였다. 가위를 사용하여 조직을 잘게 자르고, 20분 동안 37℃ 10% CO₂의 인큐베이터내 행크 평형 염 용액(HBSS: Hank's balanced salts solution, Biological Industries(이스라엘 베이트 하에멕 소재)), 15 mM HEPES 완충액(pH 7.3)(Biological Industries(이스라엘 베이트 하에멕 소재)) 및 0.25% 트립신(Biological Industries(이스라엘 베이트 하에멕 소재))에 놓았다. 이어서, 세포를, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium, Sigma(이스라엘 레호보트 소재)) 중 10% 열 불활성화된 우태아 혈청(Biological Industries(이스라엘 베이트 하에멕 소재)), 0.1% 황산겐타마이신 용액(Biological Industries(이스라엘 베이트 하에멕 소재)) 및 0.1% 페니실린-스트렙토마이신-니스타틴 용액(Biological Industries(이스라엘 베이트 하에멕 소재))을 함유하는, 8 ml의 용액 D1에 놓었다. 세포를 가라앉힌 후, 2.5 ml의 D1을 함유하는 새 튜브로 옮기고, 파스퇴르(Pasteur) 피펫을 사용하여 가루로 만들었다. 본 과정을 2번 더 반복하였다. 일단 세포 모두가 현탁되고 나면, 혈구계(Neubauer improved(독일 소재))를 사용하여 세포 밀도를 측정하고, D1 15 ml당 1x10⁶개의 세포를 각 75 ㎠ 플라스크(Corning(미국 뉴욕주 코닝 소재))에 접종하였다. 세포를 37℃ 10% CO₂에서 인큐베이션시켰다. 24시간 후에 배지를 교환해주고, 세포가 합류될 때까지(1주) 세포를 배양하였다.

2. 대뇌 피질 성상 세포 계대배양

대뇌 피질 성상 세포를 함유하는 플라스크를 진탕시켜 존재 가능성이 있는 잔여 뉴런 및 희소돌기아교세포를 제거하였다. 이어서, 플라스크를 10 ml 냉 HBSSx1, HEPES 15 mM으로 세척하였다. 5 ml 베르센-트립신 용액(BioLab(이스라엘 예루살렘 소재))을 각각의 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 5분 동안 실온에서 인큐베이션시켜 성상 세포를 제거하였다. 이어서, 플라스크를 진탕시켜 세포를 제거하였다. 베르센-트립신 용액을 5 ml D1로 중화시켰다. 세포 현탁액을 수집하고, 10분 동안 100 g에서 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 세포를 96웰 플레이트(Corning(미국 뉴욕주 코닝 소재))에 플레이팅하고(각 플라스크당 2개의 플레이트에 플레이팅), 세포가 합류될 때까지 37℃ 10% CO₂에서 인큐베이션시켰다.

3. 혼합형의 신경 아교세포 배양물

상기 기술된 바와 같이, 신생 래트를 사용하여 대뇌 피질 성상 세포 배양물을 제조하였다. D1 중 세포를 현탁시킨 후, 이를 5분 동안 100 g에서 원심분리하고, 상등액을 버렸다. 세포 펠릿을 DMEM 중 5% 열 불활성화된 말 혈청(Biological Industries(이스라엘 베이트 하에멕 소재)), 0.1% 겐타마이신, 0.1% 페니실린-스트렙토마이신-니스타틴 용액, 1% N3(배양물 중 뉴런 발생에 필수적인 한정 배지 성분, (문헌 [Romijn HJ, Brain Res., 254:583-9 (1981)]), 15 ㎍/ml 5'-플루오로-2-데옥시우리딘(FUDR, Sigma(이스라엘 레호보트 소재)), 및 3 ㎍/ml 우리딘(Sigma(이스라엘 레호보트 소재))를 함유하는 용액 D2에 재현탁시켰다. 세포를 혈구계로 계수하고, D2에 희석시키고, 17,000개의 세포/웰/96웰 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 제조된 8일된 성상 세포 상에 시딩하였다. 그 다음날 FUDR과 우리딘을 포함하지 않는 D2로 배지를 교체하였다. 실험을 실시하기 이전에 1주 동안 37℃ 10% CO₂에서 세포를 성장시켰다.

4. MAP2 분석

뉴런 특이 항체인 MAP2를 사용하여 베타 아밀로이드 중독 이후, 신경아교 배양물 중의 뉴런 생존에 대해 분석하였다. 혼합형 신경아교 배양물 제조 후 1주 경과시에 세포 성장 배지를 흡인시키고, 새로운 D2 배지를 세포에 첨가하였다. 10^-19 M 내지 10^-5 M의 오름차순 농도로 NATLSIHQ(서열 번호 4) 또는 STPTAIPQ(서열 번호 6)와 함께, 물에 용해시키고 적어도 2주간 37℃에서 응집시킨 0.25 μM 베타 아밀로이드 1-42(American Peptide Company(미국 캘리포니아주 써니베일 소재))를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 5일 동안 10% CO₂ 하에 37℃에서 인큐베이션시켰다.

베타 아밀로이드 및 펩티드 첨가 후 5일 경과시에는 각 웰로부터 배지를 제거하고, 냉 메탄올을 첨가함으로써 세포를 고정시켰다. 세포를 밤새도록 냉장고에 방치하였다. 앞서 기술된 바와 같이 세포를 항-MAP2를 사용하여 면역염색하고(문헌 [Brooke SM et al., Neurosci . Lett ., 267:21-4 (1999)]): 메탄올을 제거하고, 세포를 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)로 4회에 걸쳐 세척하였다. 밤새도록 4℃에서 PBS 중의 5% 무지방 우유 중에서 세포를 인큐베이션시켜 비특이 항체 결합을 차단시켰다. 이어서, 차단 용액을 제거하고, 항MAP2 (1:1000; Sigma(이스라엘 레호보트 소재))를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, PBS로 4회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 비오틴화된 항마우스 IgG(1:200, Vector Laboratories(미국 캘리포니아주 벌링앰 소재))을 각 웰에 첨가하고, 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, PBS로 4회에 걸쳐 세척하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 제조된 ABC 시약(Vector Laboratories(미국 캘리포니아주 벌링앰 소재))과 함께 세포를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, PBS로 4회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 제조사의 프로토콜에 따라 제조된 ABC 시약(Vector Laboratories(미국 캘리포니아주 벌링앰 소재))을 각 웰에 첨가하고, 세포를 암실에서 실온하에 20분 동안 인큐베이션시켰다. ELISA 플레이트 판독기에서 405 nm로 플레이트를 판독하였다. 블랭크로서는 비처리 세포를 함유하고 1차 항체를 포함하지 않는 웰을 사용하였다.

5. MTS 분석법

ZnCl₂에 의한 중독 이후의 성상 세포의 생존에 관해 MTS 분석법을 사용하여 테스트하였다. 성상 세포를 96 웰 플레이트에 계대배양한 후 1주 경과시에 성상 세포 성장 배지를 흡인시키고, 200 μM ZnCl₂ 및 오름차순의 농도로(농도 범위: 10^-16 - 10^-7 M) NATLSIHQ(서열 번호 4) 또는 STPTAIPQ(서열 번호 6)를 함유하는 새로운 배지를 세포에 첨가하였다. 세포를 4시간 동안 10% CO₂ 하에 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 셀티터 96 아쿠오우스(Celltiter 96 Aqueous) 비방사성 세포 증식 분석법(Promega(미국 위스콘신주 매디슨 소재))을 사용하여 MTS 분석법을 실시하였는데, 이는 제조사의 설명서에 따라 실시되었으며, ELISA 플레이트 판독기에서 490 nm로 판독하였다.

B. 결과:

결과를 도 1 및 2와, 하기 표 2에 나타낸다. 두 펩티드 모두 신경보호 분석법에서 활성인 것으로 나타났다. 신경아교세포 및 성상 세포, 둘 모두의 생존에 대한 분석법에서 NATLSIHQ(서열 번호 4)의 효능은 STPTAIPQ(서열 번호 6)의 효능보다 컸다.

본 발명은 신경영양 및 신경보호 활성과, 잠재적인 추가의 치료학적 활성을 제공하기 위해 NAP 또는 SAL과 유사성을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 비롯한, 새로운 부류의 튜불린 결합 펩티드 모의체를 기술한다는 것을 이해할 것이다. 변형은 종래의 치환, 40개의 아미노산 N- 또는 C 말단 첨가, 친지질화(lipophylization), 아세틸화 등을 포함한다.

상기 기술한 실시예는 본 발명의 효과를 예시하고자 하는 것이며, 하기 기술하는 특허청구범위에 의해 주시되는 본 발명의 실시태양 또는 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 기타 다른 변이체는 당업계의 숙련인에게 쉽게 자명해질 것이며, 첨부된 특허청구범위에 포함된다. 본 명세서에서 인용된 모든 공개문헌, 데이타베이스, 진뱅크 서열, GO 용어, 특허, 특허 출원은 마치 각각의 개별 공개문헌 또는 특허 출원이 구체적이면서 개별적으로 참고로 인용된다고 명시된 바와 같이, 그의 전문이 참고로 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> Gozes, Illana Stewart, Alistair Maor, Maya Furman-Assaf, Sharon Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Allon Therapeutics Inc. <120> Neuroprotection Using NAP-Like and SAL-Like Peptide Mimetics <130> 019856-000810PC <140> WO PCT/CA08/01497 <141> 2008-08-22 <150> US 60/957,790 <151> 2007-08-24 <160> 31 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP neuroactive peptide, NAP <400> 1 Asn Ala Pro Val Ser Ile Pro Gln 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 2 Asn Ala Val Leu Ser Ile His Gln 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 3 Asn Ala Thr Leu Ser Val His Gln 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 4 Asn Ala Thr Leu Ser Ile His Gln 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 5 Asn Ala Thr Leu Ser Ile Val His Gln 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 6 Ser Thr Pro Thr Ala Ile Pro Gln 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 7 Asn Thr Pro Val Ser Ile Pro Gln 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 8 Ala Pro Val Ser Ile Pro Gln 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 9 Asn Thr Pro Ile Ser Ile Pro Gln 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 10 Asn Ala Pro Val Ser Ile Pro 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 11 Asn Ala Pro Val Ala Val Pro Gln 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 12 Asn Ala Arg Val Ser Ile Pro Gln 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <400> 13 Asp Ala Pro Val Ser Val Pro Gln 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <221> MOD_RES <222> (2)...(2) <223> Xaa = any amino acid <400> 14 Asn Xaa Pro Val Ser Ile Pro Gln 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <221> MOD_RES <222> (2)...(2) <223> Xaa = any amino acid <221> MOD_RES <222> (4)...(4) <223> Xaa = Ile, Leu or Val <400> 15 Asn Xaa Pro Xaa Ser Ile Pro Gln 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <221> MOD_RES <222> (5)...(5) <223> Xaa = Ser or Thr <221> MOD_RES <222> (6)...(6) <223> Xaa = Ile, Leu or Val <400> 16 Asn Ala Pro Val Xaa Xaa Pro Gln 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <221> MOD_RES <222> (3)...(3) <223> Xaa = any amino acid <400> 17 Asn Ala Xaa Val Ser Ile Pro Gln 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic NAP-like peptide <221> MOD_RES <222> (1)...(1) <223> Xaa = Asn or Gln <221> MOD_RES <222> (6)...(6) <223> Xaa = Ile, Leu or Val <400> 18 Xaa Ala Pro Val Ser Xaa Pro Gln 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL neuroactive peptide; SAL; ADNF-9; ADNF-1 <400> 19 Ser Ala Leu Leu Arg Ser Ile Pro Ala 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <400> 20 Ala Leu Leu Arg Ser Ile Pro Ala 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <400> 21 Ala Leu Leu Arg Ser Ile Pro 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <400> 22 Ala Met Leu Arg Ser Ile Pro Ala 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <400> 23 Ala Leu Leu Arg Ala Ile Pro Ala 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <400> 24 Ser Ala Leu Leu Arg Ser Ile Pro 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <400> 25 Ser Ala Leu Leu Arg Ala Ile Pro 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <400> 26 Ala Leu Leu Arg Thr Ile Pro Ala 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <400> 27 Ala Leu Leu Arg Ser Val Pro Ala 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <221> MOD_RES <222> (2)...(2) <223> Xaa = Ile, Leu or Val <400> 28 Ala Xaa Leu Arg Ser Ile Pro Ala 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <221> MOD_RES <222> (5)...(5) <223> Xaa = Ser or Thr <400> 29 Ala Leu Leu Arg Xaa Ile Pro Ala 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <221> MOD_RES <222> (6)...(6) <223> Xaa = Ser or Thr <400> 30 Ser Ala Leu Leu Arg Xaa Ile Pro 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic SAL-like peptide <221> MOD_RES <222> (6)...(6) <223> Xaa = Ile, Leu or Val <400> 31 Ala Leu Leu Arg Ser Xaa Pro Ala 1 5

Claims (18)

1. 하기 화학식을 갖는 NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체:
   (R¹)_a-(R²)-(R³)_b
   상기 식에서,
   R¹은 1 내지 약 40개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열이며, 여기서, 각각의 아미노산은 천연적으로 발생된 아미노산 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
   R²는 NATLSIHQ(서열 번호 4), STPTAIPQ(서열 번호 6), NAVLSIHQ(서열 번호 2), NATLSVHQ(서열 번호 3), NATLSIVHQ(서열 번호 5), NTPVSIPQ(서열 번호 7), APVSIPQ(서열 번호 8), NTPISIPQ(서열 번호 9), NAPVSIP(서열 번호 10), NAPVAVPQ(서열 번호 11), NARVSIPQ(서열 번호 12), DAPVSVPQ(서열 번호 13), ALLRSIPA(서열 번호 20), ALLRSIP(서열 번호 21), AMLRSIPA(서열 번호 22), ALLRAIPA(서열 번호 23), SALLRSIP(서열 번호 24), SALLRAIP(서열 번호 25), ALLRTIPA(서열 번호 26), 및 ALLRSVPA(서열 번호 27)로 구성된 군에서 선택되는 구성원이고;
   R³은 1 내지 약 40개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열이며, 여기서, 각각의 아미노산은 천연적으로 발생된 아미노산 및 아미노산 유사체로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고;
   a 및 b는 독립적으로 선택되고, 0 또는 1이며,
   단, NAP 유사 또는 SAL 유사 펩티드 모의체는 서열 NAPVSIPQ(서열 번호 1) 또는 SALLRSIPA(서열 번호 19)를 포함하지 않는다.
2. 제1항에 있어서, R²가 NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6)로 구성된 군에서 선택되는 구성원인, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체.
3. 제1항에 있어서, a 및 b가 0인, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체.
4. 제1항에 있어서, R² 중 1 이상의 아미노산이 D-아미노산인, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체.
5. 제1항에 있어서, R²의 각 아미노산이 D-아미노산인, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체.
6. 제1항에 있어서, 1 이상의 보호기를 더 포함하는 것인, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체.
7. 제1항에 있어서, 펩티드 모의체가 NATLSIHQ(서열 번호 4)인, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체.
8. 제1항에 있어서, 펩티드 모의체가 STPTAIPQ(서열 번호 6)인, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 1 이상의 아미노산이 D-아미노산인, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체.
10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 각각의 아미노산이 D-아미노산인, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체.
11. 제7항 또는 제8항에 있어서, 1 이상의 보호기를 더 포함하는 것인, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체.
12. 제1항의 NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체를 포함하는 약학 조성물.
13. 제12항에 있어서, NAPVSIPQ(서열 번호 1) 및 SALLRSIPA(서열 번호 19)로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 신경보호 폴리펩티드를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
14. 피험체에서 신경퇴행성 장애, 인지기능 결핍, 자가면역 질환, 말초 신경 독성, 운동 기능 장애, 감각 기능 장애, 불안, 우울증, 정신분열병, 정신병, 태아 알코올 증후군과 관련된 병태, 망막 변성을 포함하는 병태, 학습 및 기억에 영향을 주는 질병, 또는 신경정신 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    이러한 치료 또는 예방이 필요한 피험체에게 제1항의 NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체의 치료 유효량을 투여하여, 피험체에서 신경퇴행성 장애, 인지기능 결핍, 자가면역 질환, 말초 신경 독성, 운동 기능 장애, 감각 기능 장애, 불안, 우울증, 정신분열병, 정신병, 태아 알코올 증후군과 관련된 병태, 망막 변성을 포함하는 병태, 학습 및 기억에 영향을 주는 질병, 또는 신경정신 장애를 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는, 예방 또는 치료 방법.
15. 제14항에 있어서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체가 NATLSIHQ(서열 번호 4) 및 STPTAIPQ(서열 번호 6)로 구성된 군에서 선택되는 구성원인, 예방 또는 치료 방법.
16. 제14항에 있어서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체가 비내 투여되는 것인, 예방 또는 치료 방법.
17. 제14항에 있어서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체가 경구 투여되는 것인, 예방 또는 치료 방법.
18. 제14항에 있어서, NAP 유사 펩티드 모의체 또는 SAL 유사 펩티드 모의체가 정맥내 또는 피하 투여되는 것인, 예방 또는 치료 방법.

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