CN101563363B - 用于治疗疾病的靶向补体因子h - Google Patents

Abstract

本发明提供CR2-FH分子，其包括包含CR2蛋白质或其片段的CR2部分以及包含因子H蛋白质或其片段的FH部分，以及包括CR2-FH分子的药物组合物。还提供的是使用该组合物治疗疾病的方法，其中涉及补体旁路，例如年龄相关性黄斑变性、类风湿关节炎和缺血再灌注。

Description

用于治疗疾病的靶向补体因子H

相关申请

本申请要求在2006年6月21日提交的临时申请号60/815,748的优先权权益，其内容通过引用其全部被并入。

技术领域

本申请涉及治疗牵涉补体旁路的疾病的组合物和方法。具体地，本申请涉及治疗牵涉补体旁路的疾病的CR2-FH分子及其用途。关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本申请是在由美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的授权(合同)号：AI47469、AI31105和EY13520的政府支持下进行的。

背景技术

补体是一系列血液蛋白质的总称，并且是免疫系统的主要效应子机制。补体在许多自身免疫、炎症和缺血性疾病的病理学上起着重要作用，并且也是造成许多与生物不相容性相关的疾病状态的原因。不适当的补体激活及其在宿主细胞上的沉积由于产生强有力的炎症介质可导致补体介导的靶结构细胞溶解以及组织破坏。

补体可以通过三个途径之一激活：经典途径、凝集素途径和旁路途径。经典途径是通过补体系统蛋白质Clq结合到抗原-抗体复合物、五聚环蛋白或凋亡细胞而激活的。五聚环蛋白包括C-反应蛋白和血清淀粉样P成分。凝集素途径是借助于甘露糖结合凝集素被微生物糖类引发的。旁路途径是在这样的病原体的表面上被激活的，所述病原体不带电荷或具有正电荷特性并且没有表达或不含补体抑制剂。这是由于被称为C3“空转(tickover)”的过程，该过程自动发生，涉及构象改变的C3与B因子的相互作用，并且导致活性C3b在病原体或其它表面上的固定。当某些抗体妨碍含IgA免疫复合体的内源调节机制时或者当补体调节蛋白的表达减少时，也可以引发旁路途径。此外，当通过经典或凝集素途径沉积到靶上的C3b然后结合B因子时，旁路途径被一种被称为“扩增环(amplificationloop)”的机制激活。Muller-Eberhard，1988，Ann.Rev.Biochem.57：321。例如，Holers及同事已经表明，当初始补体激活后炎症细胞被募集时，旁路途径在局部损伤位点被扩大。Girardi等，J. Clin.Invest.2003，112：1644。通过该旁路途径惊人的补体扩增然后通过一种机制发生，所述机制涉及另外产生损伤的固定补体的细胞，局部合成旁路途径成分，或者更有可能因为携带预成形的C3和备解素(血清灭菌蛋白)的这些渗入的炎症细胞极大增加了具体在那个位点的激活。

当循环的B因子结合激活的C3时，就引发旁路途径激活。该复合体然后被循环的D因子切割产生酶活性片段C3bBb。C3bBb切割C3产生C3b，其引起炎症并且也进一步扩大激活过程，产生正的反馈环。H因子(FH)是补体旁路的主要调节剂(抑制剂)。它通过与B因子竞争结合C3b而起作用。C3b与H因子的结合也导致C3b被I因子降解为非活性形式C3bi(也被称为iC3b)，因此对补体激活施加了进一步的抑制。H因子的实际血浆浓度为大约500μg/ml，在流体相中提供补体调节，但是其与细胞的结合是一种被调节的现象，其可以通过存在负电荷表面以及固定的C3b、C3bi或C3d而增强。Jozsi等，Histopathol(2004)19：251-258。

补体激活的下调已经在动物模型和体外研究中被证实对于治疗几种疾病适应症是有效的，例如系统性红斑狼疮和肾小球肾炎(Y. Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.；1996，93：8563-8568)、类风湿性关节炎(Y. Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1995；92：8955-8959)、心肺分流和血液透析(C.S.Rinder，J. Clin.Invest.，1995；96：1564-1572)、器官移植中的超急性排斥(T.J.Kroshus等，Transplantation，1995；60：1194-1202)、心肌梗塞(J.W.Homeister等，J. Immunol，1993；150：1055-1064；H.F.Weisman等，Science，1990；249：146-151)、再灌注损伤(E.A.Amsterdam等，Am.J.Physiol.，1995；268：H448-H457)以及成人呼吸窘迫综合症(R.Rabinovici等，J.Immunol.，1992；149：1744-1750)。此外，其它炎症状况和自身免疫病/免疫复合物病也与补体激活紧密相关(B.P.Morgan.Eur.J. Clin.Invest.，1994：24：219-228)，包括热损伤、重症哮喘、过敏性休克、肠炎、风疹、血管性水肿、血管炎、多发性硬化症、重症肌无力、膜增殖性肾小球肾炎和干燥综合症。补体抑制剂和其用途也公开在WO04/045520和美国专利号6,521,450中。

本文所引用的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容通过引用以其全部在此被并入。

发明内容

本发明一方面提供CR2-FH分子，其包括：a)包含CR2或其片段的CR2部分，和b)包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供CR2-FH分子，其包括：a)包含CR2或其片段的CR2部分，和b)包含FH或其片段的FH部分，其中CR2-FH分子能结合CR2配体并且其中CR2-FH分子能抑制旁路途径的补体激活。在一些实施方式中，提供的是分离的CR2-FH分子。在一些实施方式中，提供的是包括CR2-FH分子的组合物(例如药物组合物)。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分以融合蛋白的形式直接或间接地相互融合。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分通过化学交联剂被连接。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分是非共价连接的。

在一些实施方式中，提供的是CR2-FH融合蛋白，其包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供CR2-FH分子，其包括：a)包含CR2或其片段的CR2部分以及b)包含FH或其片段的FH部分，其中CR2-FH分子能结合CR2配体并且其中CR2-FH分子能抑制旁路途径的补体激活。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分直接相互融合(即连接的)。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分通过氨基酸连接体序列连接。在一些实施方式中，所述CR2部分的C-末端与所述FH部分的N-末端连接(直接或间接地)。在一些实施方式中，所述CR2部分的N-末端与所述FH部分的C-末端连接(直接或间接地)。

在一些实施方式中，CR2-FH分子包括两个或多个(例如两个、三个、四个、五个或更多个中之一)CR2部分。这些CR2部分可以相同或不同，例如依据氨基酸序列、结构和/或功能。例如，在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括：1)两个或多个包含CR2或其片段的CR2部分，以及2)包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括：1)两个或多个包含CR2或其片段的CR2部分以及2)包含FH或其片段的FH部分，其中CR2-FH分子能结合CR2配体并且其中CR2-FH分子能抑制旁路途径的补体激活。

在一些实施方式中，CR2-FH分子包括两个或多个(例如两个、三个、四个、五个或更多个中之一)FH部分。这些FH部分可以相同或不同，例如依据氨基酸序列、结构和/或功能。例如，在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括：1)包含CR2或其片段的CR2部分，以及2)两个或多个包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括：1)包含CR2或其片段的CR2部分，以及2)两个或多个(例如2个)包含FH或其片段的FH部分，其中CR2-FH分子能结合CR2配体并且其中CR2-FH分子能抑制旁路途径的补体激活。

在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括：1)两个或多个包含CR2或其片段的CR2部分以及2)两个或多个包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括：1)两个或多个包含CR2或其片段的CR2部分以及2)两个或多个(例如2个)包含FH或其片段的FH部分，其中CR2-FH分子能结合CR2配体并且其中CR2-FH分子能抑制旁路途径的补体激活。

在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括：1)全长CR2以及2)包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括：1)CR2的片段以及2)包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括：1)CR2部分，其包括CR2的至少前两个N-末端SCR结构域，以及b)包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括：1)CR2部分，其包括CR2的至少前四个N-末端SCR结构域，以及b)包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，CR2-FH分子能结合CR2配体并且抑制旁路途径的补体激活。在一些实施方式中，CR2-FH分子包括两个或多个FH部分。在一些实施方式中，所述FH部分包括全长FH。在一些实施方式中，所述FH部分包括FH的片段。在一些实施方式中，所述FH部分包括FH的至少前四个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，所述FH部分包括FH的至少前五个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，所述FH部分缺少肝素结合位点。在一些实施方式中，所述FH部分包括具有多态性的FH或其片段，其针对年龄相关性黄斑变性具有保护性。

在一些实施方式中，提供的是CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)，其包括：a)包括配体结合位点的CR2部分；和(b)包含FH或其片段的FH部分，所述配体结合位点是下列中任意一种(并且在一些实施方式中选自下列)：(1)CR2SCR的B链或B-C环上的位点，其包含相对于SEQ ID NO：1的片段G98-G99-Y100-K101-I102-R103-G104-S105-T106-P107-Y108，(2)在CR2SCR2的B链上的位点，其包含相对于SEQ ID NO：1的位置K119，(3)包含相对于SEQ IDNO：1的V149-F150-P151-L152的片段和(4)CR2SCR2的片段，其包括相对于SEQID NO：1的T120-N121-F122。在一些实施方式中，CR2-FH分子能结合CR2配体并且抑制旁路途径的补体激活。在一些实施方式中，所述CR2部分进一步包括保持配体结合位点的三维结构所必需的序列。在一些实施方式中，CR2-FH分子包括两个或多个FH部分。在一些实施方式中，所述FH部分包括全长FH。在一些实施方式中，所述FH部分包括FH的片段。在一些实施方式中，所述FH部分包括FH的至少前四个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，所述FH部分包括FH的至少前五个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，所述FH部分缺少肝素结合位点。在一些实施方式中，所述FH部分包括具有多态性的FH或其片段，其针对年龄相关性黄斑变性具有保护性。

在一些实施方式中，提供的是CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)，其包括：a)CR2部分，其包括CR2的至少前两个N-末端SCR结构域，以及b)FH部分，其包括FH的至少前四个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，CR2-FH分子能结合CR2配体并且抑制旁路途径的补体激活。在一些实施方式中，所述CR2部分包括CR2的至少前3、4、5、6、7或更多个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，所述FH部分包括FH的至少前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括(并且在一些实施方式中由下列组成或基本上由下列组成)：a)CR2部分，其包括CR2的前四个N-末端SCR结构域，以及b)FH部分，其包括FH的前五个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括(并且在一些实施方式中由下列组成或基本上由下列组成)：a)CR2部分，其包括CR2的前四个N-末端SCR结构域，以及b)两个或多个(例如两个)FH部分，其包括FH的前五个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，CR2-FH分子包括(并且在一些实施方式中由下列组成或基本上由下列组成)：a)CR2部分，其包括SEQ ID NO：1的氨基酸23至271，以及b)FH部分，其包括SEQ ID NO：2的氨基酸21至320。在一些实施方式中，CR2-FH分子包括(并且在一些实施方式中由下列组成或基本上由下列组成)：a)CR2部分，其包括SEQID NO：1的氨基酸23至271，以及b)两个或多个(例如两个)FH部分，其包括SEQ ID NO：2的氨基酸21至320。

在一些实施方式中，CR2-FH是这样的融合蛋白，所述融合蛋白具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23中任意一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，CR2-FH分子是具有这样的氨基酸序列的融合蛋白，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23中任意一个具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任一百分比的同一性。在一些实施方式中，CR2-FH是这样的融合蛋白，其包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23中任意一个至少约400、450、500、550或更多个连续氨基酸。在一些实施方式中，CR2-FH分子是这样的融合蛋白，其被具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24中任意一个的核酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方式中，CR2-FH分子是被具有这样的核酸序列的多核苷酸编码的融合蛋白，所述核酸序列与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：22和SEQ IDNO：24中任意一个具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任一百分比的同一性。本文还包括编码本文描述的CR2-FH融合蛋白的多核苷酸。例如，在一些实施方式中，提供的是编码这样的融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包括包含CR2或其片段的CR2部分以及包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，所述多核苷酸还包括编码可操作地连接在编码CR2-FH融合蛋白的序列的5’端的信号肽的序列。在一些实施方式中，连接序列被用于连接CR2部分和FH部分。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23中任意一个的氨基酸序列的CR2-FH融合蛋白。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的CR2-FH融合蛋白，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3？、SEQ IDNO：22和SEQ ID NO：24中任意一个的核酸序列具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任一百分比的同一性。还提供的是包含编码CR2-FH融合蛋白的多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸的宿主细胞以及产生CR2-FH融合蛋白的方法，所述方法包括在合适的条件下培养宿主细胞以表达所述融合蛋白以及从宿主细胞培养物中回收所述融合蛋白。

在另一方面，提供的是药物组合物，其包括CR2-FH分子和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子和适合于给人施用的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子和适合于眼内注射的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子和适合于局部施用于眼睛的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子和适合于静脉注射的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子和适合于注射到动脉(例如肾动脉)、肝或肾的药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子(例如CR2融合蛋白)，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，CR2-FH分子能结合CR2配体并且抑制旁路途径的补体激活。在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)，CR2-FH分子包括：a)CR2部分，其包括CR2的至少前两个N-末端SCR结构域，以及b)FH部分，其包括FH的至少前四个N-末端SCR结构域，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)，CR2-FH分子包括(并且在一些实施方式中由下列组成或基本上由下列组成)：a)CR2部分，其包括CR2的前四个N-末端SCR结构域，以及b)FH部分，其包括FH的前五个N-末端SCR结构域，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)，CR2-FH分子包括(并且在一些实施方式中由下列组成或基本上由下列组成)：a)CR2部分，其包括SEQ ID NO：1的氨基酸23至271，以及b)FH部分，其包括SEQ ID NO：2的氨基酸21至320，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包括具有这样的氨基酸序列的CR2-FH融合蛋白，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23中任意一个具有至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物适合于输送给眼睛(例如通过眼内注射或者通过局部输送给眼睛)。在一些实施方式中，所述药物组合物适合于静脉内注射。在一些实施方式中，所述药物组合物适合于注射到动脉(例如肾动脉)、肝或肾。在一些实施方式中，所述组合物适合于眼内、静脉内、动脉内、皮下、气管内或吸入给药。

在另一方面，本发明提供治疗个体中涉及补体旁路的疾病的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的本文所述的组合物(例如药物组合物)。在一些实施方式中，所述方法包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，所述方法包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分，其中CR2-FH分子能结合CR2配体并且其中CR2-FH分子能抑制旁路途径的补体激活。在一些实施方式中，要治疗的疾病是涉及局部炎症的疾病。在一些实施方式中，要治疗的疾病是与FH缺乏(包括例如FH水平降低、FH活性降低或者缺乏野生型或保护型FH)有关的疾病。在一些实施方式中，要治疗的疾病不是与FH缺乏有关的疾病。在一些实施方式中，要治疗的疾病是玻璃疣(脉网膜小疣，drusen)相关的疾病。在一些实施方式中，要治疗的疾病不涉及经典补体途径。

在一些实施方式中，提供的是治疗个体黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性或AMD)的方法，其包括给个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，要治疗的疾病是干性AMD。在一些实施方式中，要治疗的疾病是湿性AMD。在一些实施方式中，CR2-FH分子通过静脉给药进行给药。在一些实施方式中，CR2-FH分子通过眼内注射进行给药。在一些实施方式中，CR2-FH分子通过局部给药于眼睛进行给药(例如以滴眼剂的形式)。

在一些实施方式中，AMD的一个或多个方面是通过本发明的方法进行治疗的。例如，在一些实施方式中，提供的是一种治疗(例如减少、延迟、消除或预防)个体眼睛中玻璃疣形成的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是一种治疗(例如减少、延迟、消除或预防)个体眼睛中炎症的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是一种治疗(例如减少、延迟、消除或预防)个体中感光细胞减少的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是一种治疗(包括例如减少、延迟或阻止)个体眼睛中视力或视野丧失的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是一种治疗新血管形成(例如脉络膜新生血管或CNV)的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。也预期了治疗AMD的其它方面。

本文所述的方法也用于治疗某些肾病。例如，在一些实施方式中，提供的是治疗膜增殖性肾小球肾炎II型(MPGN II)的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗溶血性尿毒综合症(HUS)的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗狼疮肾炎的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。

在一些实施方式中，提供的是治疗缺血再灌注(包括例如肾缺血再灌注和肠缺血再灌注)的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。

还提供的是治疗器官移植排斥的方法。例如，在一些实施方式中，提供的是延迟个体中急性血管排斥(例如抗体介导的心脏移植排斥)的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。

在一些实施方式中，提供的是提高个体中器官移植存活的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是提高个体中器官移植存活的方法，其包括用包括CR2-FH分子的组合物灌注要移植到个体的器官，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是提高器官移植捐赠者存活的方法，其包括给所述器官移植捐赠者施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。

在一些实施方式中，提供的是治疗类风湿性关节炎的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。

还提供的是用于本文所述方法的单位剂型、试剂盒和制品。

应当理解，本文所述各种实施方式的一种、一些或所有特性可以进行组合以形成本发明的其它实施方式。

附图说明

图1提供示例性CR2-FH表达质粒和CR2-FH蛋白质的示意图。对于CR2-FH表达质粒，k是指Kozak序列，5是指CD5信号肽，1是指任选的连接体，s是指终止密码子和聚腺苷酸信号。对于CR2-FH蛋白质(带有或没有信号肽)，5是指CD5信号肽，1是指任选的连接体。

图2提供人类CR2的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和人类FH的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3提供示例性人类CR2-FH融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)和编码人类CR2-FH融合蛋白的示例性多核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。

图4-6提供本文所述的CR2-FH分子的示例性氨基酸序列(SEQ IDNOs：5-10)。“nnn”表示任选的连接体。

图7提供本文所述信号肽的示例性氨基酸序列(SEQ ID NOs：11、13和25)和编码所述信号肽的示例性多核苷酸序列(SEQ ID NOs：12、14和26)。

图8提供小鼠CR2的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)和小鼠FH的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。

图9提供示例性小鼠CR2-FH融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO：17)和编码小鼠CR2-FH加上所述信号肽的示例性多核苷酸序列(SEQ IDNO：18)。

图10提供CR2NLFHFH——不带连接体序列的含有CR2部分和两个FH部分的小鼠CR2-FH融合蛋白——的示例性DNA序列(SEQ ID NO：19)。

图11提供CR2LFHFH——含有通过连接体序列连接到两个FH部分的CR2部分的小鼠CR2-FH融合蛋白——的示例性DNA序列(SEQ ID NO：20)。

图12A提供采用小鼠的CR2-FH融合蛋白(CR2-fH)和仅H因子(fH)在体外酵母聚糖补体实验中获得的数据的图形表示。图12B提供采用FH的前五个SCR结构域(FH15)和CR2的前四个结构域(CR2)在体外酵母聚糖补体实验中获得的数据的图形表示。

图13提供采用小鼠带有连接体的CR2-FH融合蛋白(CR2LFH)、不带连接体的CR2-FH融合蛋白(CR2NLFH)、带有连接体的CR2-FH-FH(CR2LFHFH)和CR2-Crry在体外酵母聚糖补体实验中获得的数据的图形表示。

图14A和14B提供采用具有一个FH部分(CR2-fH)或两个FH部分(CR2-fHH)的小鼠CR2-FH融合蛋白在肠缺血和再灌注损伤的动物模型中获得的数据的图形表示。

图15A提供如通过血清尿素氮(SUN)所测量的CR2-fH对肾功能影响的图示。图15B提供CR2-fH对肾形态的影响的图示。图15C和15D提供用小鼠C3的FTIC结合抗体温育的对照小鼠(15C)和CR2-fH治疗小鼠(15D)的肾切片的免疫荧光染色结果。

图16提供在用或没用CR2-fH治疗的小鼠中a-和b-波视网膜应答结果。

图17A和17B提供来自对照小鼠(17A)和通过静脉注射用CR2-fH治疗的小鼠(17B)的小鼠视网膜损伤的同工凝集素-b染色。图17C显示基于图17A和17B的同工凝集素-b染色的损伤大小的量化。

图18A和18B提供来自对照小鼠(18A)和通过眼内注射用CR2-fH治疗的小鼠(18B)的小鼠视网膜损伤的同工凝集素-b染色。图18C显示基于图18A和18B的同工凝集素-b染色的损伤大小的量化。

图19提供用单剂量CR2-fH(CR2-fH)、多剂量CR2-fH(CR2-fH(m))和对照缓冲液(PBS)处理的小鼠心脏移植物接受者的存活曲线。

图20提供示例性人类CR2-FH融合蛋白(被称为人类CR2-fH或CR2fH)的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)和编码人类CR2-fH加上信号肽的示例性多核苷酸序列(SEQ ID NO：22)。编码信号肽的序列被加以下划线。

图21提供含有两个FH部分的人类CR2-FH融合蛋白(被称为人类CR2-FH2或人类CR2fH2)的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO：23)和编码人类CR2-FH2加上信号肽的示例性多核苷酸序列(SEQ ID NO：24)。编码信号肽的序列被加以下划线。

图22A显示人类CR2fH和CR2fH2对旁路途径特异性C3b向酵母聚糖颗粒上沉积的抑制。图22B显示人类CR2fH和人类CR2fH2对旁路途径介导的红细胞溶解的抑制。

图23显示小鼠CR2-FH对由胶原-抗胶原抗体(collagen-anti-collageantibodies)免疫复合体诱导的C3激活的影响。Y轴显示平均OD值。

图24显示采用来自C4-/C4-敲除小鼠的血清进行的小鼠CR2-FH在钙足量缓冲液中的滴定。Y轴显示平均OD值。

具体实施方式

本发明提供CR2-FH分子、包含CR2-FH分子的组合物(例如药物组合物)以及通过施用该组合物治疗其中涉及补体旁路的疾病的方法。CR2-FH分子包括CR2部分和FH部分。CR2部分负责将所述分子靶向输送至补体激活位点，并且FH部分负责特异性抑制旁路途径的补体激活。初步研究已经表明，CR2-FH分子，尤其是含有所述CR2蛋白质的前四个N-末端SCR结构域以及H因子蛋白质的前五个N-末端SCR结构域的CR2-FH融合蛋白，在体外具有靶向活性和补体抑制活性。该分子明显比缺乏CR2部分的H因子分子更具有活性，其表明将FH靶向补体激活位点在治疗其中涉及补体旁路的疾病例如黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性)方面将是有效的治疗工具。该观测结果是令人惊讶的，这是由于FH在血浆中相对高的浓度以及长期持有的看法——与血浆直接接触的细胞已经被完全覆盖以FH。Jozsi等，Histopathol.(2004)19：251-258。

因此，一方面提供的是CR2-FH分子，其包括：a)包含CR2或其片段的CR2部分以及b)包含FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是分离的CR2-FH分子。在一些实施方式中，提供的是包括CR2-FH分子的组合物(例如药物组合物)。例如，在一些实施方式中，提供的是包括CR2-FH分子和适合于全身(例如静脉注射)或局部(例如眼内注射或注射到包括肾动脉在内的动脉)给药于个体的药学上可接受载体的药物组合物。

另一方面，提供的是治疗在个体中涉及补体旁路的疾病的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分以及b)包括FH或其片段的FH部分。通过本发明的方法可以治疗的合适的疾病包括例如黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性)、类风湿性关节炎、缺血再灌注、器官移植排斥以及肾病例如MPGN II、HUS和狼疮肾炎。

还提供的是用于本文所述方法的单位剂型、试剂盒和制品。

对“所述组合物(the compositions)”和“组合物(compositions)”的一般指代包括并适用于本发明的组合物。

如本文所使用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非另外指明。例如“一个(a)”FH部分包括一个或多个FH部分。

本文对“大约(about)”某一数值或参数的指代包括(并描述)涉及那个值或参数本身的实施方式。例如，涉及“大约X”的描述包括“X”的描述。

应当理解，本文所述的本发明的方面和实施方式包括“由方面和实施方式组成”和/或“基本上由方面和实施方式组成”。

CR2-FH分子和包括CR2-FH分子的组合物

本文提供的是CR2-FH分子和包含CR2-FH分子的组合物(例如药物组合物)。

本文所使用的“CR2-FH分子”是指包括CR2或其片段(所述“CR2部分”)以及FH或其片段(所述“FH部分”)的非天然发生的分子。所述CR2部分能结合CR2的一个或多个天然配体并且因此负责将所述分子靶向传递到补体激活的位点。所述FH部分负责特异性地抑制补体旁路的补体激活。CR2-FH分子的所述CR2部分和FH部分可以通过本领域已知的任何方法连接在一起，只要这两部分的期望功能性被保持。

本文所述的CR2-FH分子因而一般具有结合于CR2配体和抑制旁路途径的补体激活的双重功能。“CR2配体”是指与天然发生的CR2蛋白质结合的任何分子，其包括但不限于C3d、iC3b、C3dg、C3d以及与CR2的二个N-末端SCR结构域结合的C3b的细胞结合片段。CR2-FH分子可以以这样的结合亲合性例如结合于CR2配体，所述结合亲合性为所述CR2蛋白质的大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中任何一个。结合亲合性可以通过本领域已知的任何方法进行测定，包括例如表面等离子体共振、量热法滴定、ELISA和流式细胞术。在一些实施方式中，CR2-FH分子具有CR2的下列性质中的一种或多种：(1)与C3d结合、(2)与iC3b结合、(3)与C3dg结合、(4)与C3d结合以及(5)与结合于CR2的两个N-末端SCR结构域的C3b的细胞结合片段相结合。

本文所述的CR2-FH分子一般能抑制旁路途径的补体激活。CR2-FH分子可以是比天然发生的FH蛋白质更有效的补体抑制剂。例如，在一些实施方式中，CR2-FH分子具有这样的补体抑制活性，其为所述FH蛋白质的补体抑制活性的大约1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、40或更多倍中任何一个。在一些实施方式中，CR2-FH分子具有小于大约100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM或10nM中任何一个的EC50。在一些实施方式中，CR2-FH分子具有大约5-60nM的EC50，包括例如8-50nM、8-20nM、10-40nM和20-30nM中任何一个。在一些实施方式中，CR2-FH分子具有这样的补体抑制活性，其为所述FH蛋白质的补体抑制活性的大约50％、60％、70％、80％、90％或100％中任何一个。

补体抑制可以基于本领域中已知的任何方法进行评定，包括例如体外酵母聚糖试验、红血球溶解试验、免疫复合体激活试验和甘露聚糖激活试验。在一些实施方式中，CR2-FH具有FH的下列性质中一种或多种：(1)与C反应蛋白(CRP)结合、(2)与C3b结合、(3)与肝素结合、(4)与唾液酸结合、(5)与内皮细胞表面结合、(6)与细胞整联蛋白受体结合、(7)与病原体结合、(8)C3b辅助因子活性、(9)C3b加速腐烂活性以及(10)抑制补体旁路。

在一些实施方式中，CR2-FH分子是融合蛋白。本文所用的“融合蛋白”是指可操作地相互连接的两个或多个肽、多肽或蛋白质。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分被直接相互融合。在一些实施方式中，所述CR2部分和所述FH部分是通过氨基酸连接体序列连接的。连接体序列的实例在本领域是已知的，并且包括例如(Gly₄Ser)、(Gly₄Ser)₂、(Gly₄Ser)₃、(Gly₃Ser)₄、(SerGly₄)、(SerGly₄)₂、(SerGly₄)₃和(SerGly₄)₄。连接序列还可包括在补体因子的不同结构域之间发现的“天然”连接序列。例如，可以使用VSVFPLE位于人类CR2的前两个N-末端短同源重复结构域之间的连接序列。在一些实施方式中，使用的是在人类CR2的第四和第五N-末端短同源重复结构域之间的连接序列(EEIF)。融合蛋白中CR2部分和FH部分的次序可以变化。例如，在一些实施方式中，所述CR2部分的C-末端被融合(直接或间接地)于所述分子的FH部分的N-末端。在一些实施方式中，CR2部分的N-末端被融合(直接或间接地)于所述分子的FH部分的C-末端。

在一些实施方式中，CR2-FH分子是具有SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：23中任何一个的氨基酸序列的CR2-FH融合蛋白。在一些实施方式中，CR2-FH分子是具有这样的氨基酸序列的融合蛋白，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23中任何一个的氨基酸序列具有至少大约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，CR2-FH分子包括SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：23中任何一个的至少大约400、450、500、550或更多的连续氨基酸。

在一些实施方式中，CR2-FH分子是具有SEQ ID NOs：5-10中任何一个的氨基酸序列的CR2-FH融合蛋白。在一些实施方式中，CR2-FH分子是具有这样的氨基酸序列的融合蛋白，所述氨基酸序列与SEQ ID NOs：5-10中任何一个的氨基酸序列具有至少大约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方式中，CR2-FH分子包括SEQ ID NOs：5-10中任何一个的至少大约400、450、500、550或更多个连续氨基酸。

在一些实施方式中，CR2-FH分子由具有SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：22和SEQ ID NO：24中任意一个的核酸序列的多核苷酸编码。在一些实施方式中，CR2-FH分子由具有这样的核酸序列的多核苷酸编码，所述核酸序列与SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24中任意一个的核酸序列具有至少大约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在一些实施方式中，CR2-FH分子包括通过化学交联剂连接的CR2部分和FH部分。这两部分的连接可以发生于位于这两部分的反应性基团上。可用交联剂靶向的反应性基团包括伯胺、硫氢基、羰基、糖和羧酸，或者能加成到蛋白质的活性基团。化学连接体的实例在本领域中是熟知的，并且包括但不限于双马来酰亚胺正己烷、顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(maleimidobenzoyl-N-hydroxylsuccinimide ester)、NHS-酯-马来酰亚胺(NHS-Esters-Maleimide)交联剂例如SPDP、碳二亚胺、戊二醛、MBS、硫代-MBS、SMPB、硫代-SMPB、GMBS、硫代-GMBS、EMCS、硫代-EMCS、亚氨酸酯交联剂例如DMA、DMP、DMS、DTBP、EDC和DTME。

在一些实施方式中，CR2部分和FH部分是非共价连接的。例如，这两部分可以通过两个相互作用的桥接蛋白质(例如生物素和链霉抗生物素蛋白)连接在一起，每个被连接到CR2部分或FH部分。

在一些实施方式中，CR2-FH分子包括两个或更多个本文所述的(相同或不同的)CR2部分。在一些实施方式中，CR2-FH分子包括两个或更多个本文所述的(相同或不同的)FH部分。这两个或更多个CR2(或FH)部分可以相互串联连接(例如融合)。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括CR2部分和两个或更多个(例如三个、四个、五个或更多)FH部分。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括FH部分和两个或更多个(例如三个、四个、五个或更多)CR2部分。在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)包括两个或更多个CR2部分和两个或更多个FH部分。

在一些实施方式中，提供的是分离的CR2-FH分子。在一些实施方式中，CR2-FH分子形成二聚体或多聚体。

该分子中CR2部分和FH部分可以来自相同物种(例如人类或小鼠)或者来自不同物种。

CR2部分

本文所述的CR2部分包括CR2或其片段。CR2是主要在成熟B细胞和滤泡树突样细胞(follicular dendritic cells)上表达的跨膜蛋白质。CR2是C3结合蛋白家族的成员。CR2的天然配体包括例如iC3b、C3dg和C3d以及C3b的细胞结合断裂片段，其结合到CR2的两个N-末端SCR结构域。C3的切割最初导致C3b的产生以及该C3b共价附着到激活细胞表面。C3b片段参与酶复合体的产生，所述酶复合体扩增补体级联系统。在细胞表面，C3b被快速转化成失活的iC3b，尤其是当沉积到含有补体激活调节剂的宿主表面(即大部分宿主组织)上时。甚至在膜结合补体调节剂不存在时，形成了基本水平的iC3b。iC3b随后被血清蛋白酶消化为膜结合片段C3dg，然后是C3d，但是该过程是相对慢的。因此，CR2的C3配体一旦它们被产生是相对长寿命的并且将以高浓度存在于补体激活位点处。CR2因此能充当将分子带到补体激活位点的有效靶向载体。

CR2含有具有15个或16个被称为短同源重复序列(SCR结构域)的重复单元的胞外部分。SCR结构域具有高度保守残基的典型框架，所述高度保守残基包括四个半胱氨酸、两个脯氨酸、一个色氨酸以及几个其它部分保守的甘氨酸和疏水性残基。SEQ ID NO：1表示全长的人类CR2蛋白序列。氨基酸1-20构成前导肽，氨基酸23-82构成SCR1，氨基酸91-146构成SCR2，氨基酸154-210构成SCR3，氨基酸215-271构成SCR4。活性位点(C3结合位点)位于SCR1-2(前两个N-末端SCR结构域)。这些SCR结构域被充当间隔区的可变长度的短序列分开。全长小鼠CR2蛋白质序列在本文被表示为SEQ ID NO：15。小鼠CR2蛋白质的SCR1和SCR2结构域位于SEQ ID NO：15的位置14-73(SCR1)和SEQID NO：15的位置82-138(SCR2)的小鼠CR2氨基酸序列中。人类和小鼠CR2在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：15表示的全长氨基酸序列上具有大约66％的同一性，并且在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：15的SCR1-SCR2区域上具有大约61％的同一性。小鼠和人类CR2两者都结合于C3(在C3d区域)。应当理解，物种和品系变异存在于所公开的肽、多肽和蛋白质，并且本文所述的CR2或其片段包括所有物种和品系变异。

本文所公开的CR2部分是指含有CR2蛋白质的一些或全部配体结合位点的多肽，并且包括但不限于全长CR2蛋白质(例如如SEQ ID NO：1所示的人类CR2或者如SEQ ID NO：15所示的小鼠CR2)、可溶CR2蛋白质(例如包括CR2胞外域的CR2片段)、CR2的其它生物活性片段、包括SCR1和SCR2的CR2片段、或者天然发生的CR2或其片段的任何同系物，如下面详细描述。在一些实施方式中，CR2部分具有CR2的下列性质中的一种：(1)与C3d结合、(2)与iC3b结合、(3)与C3dg结合、(4)与C3d结合以及(5)与结合于CR2的两个N-末端SCR结构域的C3b的细胞结合片段(一个或多个)相结合。

在一些实施方式中，CR2部分包括CR2的前两个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，CR2部分包括CR2的前三个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，CR2部分包括CR2的前四个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，CR2部分包括(并且在一些实施方式中由下列组成或基本上由下列组成)CR2的至少前两个N-末端SCR结构域，包括例如CR2的至少前3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16中任一个的SCR结构域。

CR2蛋白质或其片段的同系物包括不同于天然发生的CR2(或CR2片段)的蛋白质，因为至少一个或几个氨基酸已经被剔除(例如截短形式的蛋白质，例如肽或片段)、插入、倒位、置换和/或衍生化(例如通过糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酸化、酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的加入)。在一些实施方式中，CR2同系物具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与天然发生的CR2的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15)具有至少大约70％的同一性，例如与天然发生的CR2的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15)具有至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任意百分比的同一性。CR2同系物或其片段优选地保留与天然发生的CR2配体结合的能力(例如具有CR2-结合能力的C3d或其它C3片段)。例如，CR2同系物(或其片段)可对C3d具有这样的结合亲合性，所述结合亲合性为CR2(或其片段)的结合亲合性的至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

在一些实施方式中，CR2部分包括人类CR2的至少前两个N-末端SCR结构域，例如具有至少含有人类CR2(SEQ ID NO：1)的氨基酸23至146的氨基酸序列的CR2部分。在一些实施方式中，CR2部分包括人类CR2的至少前两个SCR结构域，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类CR2(SEQ IDNO：1)的氨基酸23至146具有至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％中任一百分比的同一性。

在一些实施方式中，CR2部分包括人类CR2的至少前四个N-末端SCR结构域，例如具有至少含有人类CR2(SEQ ID NO：1)的氨基酸23至271的氨基酸序列的CR2部分。在一些实施方式中，CR2部分包括人类CR2的至少前四个SCR结构域，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类CR2(SEQ IDNO：1)的氨基酸23至271具有至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％中任一百分比的同一性。

与参照序列(例如SEQ ID NO：1)具有至少大约例如95％同一性的氨基酸序列意味着，除了该氨基酸序列每100个该参照序列的氨基酸可以包括高达五个点改变外，该氨基酸序列与参照序列具有同一性。这些高达五个点改变可以是缺失、置换、添加，并且可以发生在该序列的任何地方，其被单个地散布于该参照序列的氨基酸中或者以一个或多个连续的组散布于该参照序列内。

在一些实施方式中，CR2部分包括该CR2蛋白质的部分或全部配体结合位点。在一些实施方式中，所述CR2部分进一步包括保持结合位点的三维结构所必需的序列。基于CR2的晶体结构，例如在美国专利申请公布号2004/0005538中所公开的人类和小鼠CR2晶体结构，CR2的配体结合位点可以容易地确定。例如，在一些实施方式中，CR2部分包括CR2的SCR2的B链和B-C环。在一些实施方式中，CR2部分包括位于CR2SCR的链B和B-C环上的位点，其包括相对于SEQ ID NO：1的片段G98-G99-Y100-K101-I102-R103-G104-S105-T106-P107-Y108。在一些实施方式中，CR2部分包括位于CR2SCR2的B链上的位点，其包括相对于SEQ ID NO：1的位置K119。在一些实施方式中，CR2部分包括这样的片段，其包括相对于SEQ ID NO：1的V149-F150-P151-L152。在一些实施方式中，CR2部分包括CR2SCR2的片段，其包括T120-N121-F122。在一些实施方式中，CR2-FH分子具有这些位点的两个或多个。例如，在一些实施方式中，CR2部分包括这样的部分，其包括相对于SEQ  ID  NO：1的G98-G99-Y100-K101-I102-R103-G104-S105-T106-P107-Y108和K119。也预期了这些位点的其它组合。

H因子部分

本文所述的CR2-FH分子的FH部分包括FH或其片段。

补体因子H(FH)是单多肽链血浆糖蛋白。该蛋白质是由以一串20个珠子样连续的方式排列的大约60个氨基酸的20个重复SCR结构域组成的。H因子结合于C3b，加速了旁路途径C3转化酶(C3Bb)的衰变，并且充当C3b蛋白水解失活的辅因子。在H因子的存在下，C3b蛋白水解导致C3b的切割。H因子对于C3b具有至少三个独特的结合结构域，其位于SCR 1-4、SCR 5-8和SCR19-20内。H因子的每个位点结合于C3b蛋白质内的独特区域：N-末端位点结合于天然C3b；位于H因子的中间区域中的第二位点结合于C3c片段；并且位于SCR19和20内的位点结合于C3d区域。此外，H因子还包括肝素的结合位点，其位于H因子的SCR 7、SCR 5-12和SCR20内并且与C3b结合位点重叠。结构和功能分析已经表明，FH的补体抑制活性的结构域位于前四个N-末端SCR结构域内。

SEQ ID NO：2表示全长人类FH蛋白质序列。氨基酸1-18对应于前导肽，氨基酸21-80对应于SCR1，氨基酸85-141对应于SCR2，氨基酸146-205对应于SCR3，氨基酸210-262对应于SCR4，氨基酸267-320对应于SCR5。全长小鼠FH蛋白质序列在本文由SEQ ID NO：16表示。小鼠FH蛋白质的SCR1和SCR2结构域位于SEQ ID NO：16的位置21-27(SCR1)以及SEQ ID NO：16的位置82-138(SCR2)的小鼠FH氨基酸序列内。人类和小鼠FH在由SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：16表示的全长氨基酸序列范围内具有大约61％的同一性。应当理解，物种和品系变异存在于所公开的肽、多肽和蛋白质，并且所述FH或其片段包括所有物种和品系变异。

本文所述的FH部分是指含有FH蛋白质的一些或全部补体抑制活性的FH蛋白质的任意部分，并且包括但不限于全长FH蛋白质、FH蛋白质的生物活性片段、包括SCR1-4的FH片段或者或者天然发生的FH或其片段的任何同系物，如下面详细描述。在一些实施方式中，FH部分具有下列性质中的一种或多种：(1)与C反应蛋白(CRP)结合、(2)与C3b结合、(3)与肝素结合、(4)与唾液酸结合、(5)与内皮细胞表面结合、(6)与细胞整联蛋白受体结合、(7)与病原体结合、(8)C3b辅助因子活性、(9)C3b衰变加速活性以及(10)抑制补体旁路。

在一些实施方式中，FH部分包括FH的前四个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，该构建物包括FH的前五个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，该构建物包括FH的前六个N-末端SCR结构域。在一些实施方式中，所述FH部分包括(并且在一些实施方式中由下列组成或基本上由下列组成)FH的至少前四个N-末端SCR结构域，包括例如FH的至少前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多个中任一个的SCR结构域。

在一些实施方式中，FH是野生型FH。在一些实施方式中，FH是FH的保护性变体。

在一些实施方式中，FH部分缺少肝素结合位点。这可以例如通过FH上肝素结合位点的突变或者通过选择不含有肝素结合位点的FH片段来实现。在一些实施方式中，FH部分包括具有多态性的FH或其片段，其预防年龄相关性黄斑变性。Hageman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(20)：7227。包括这样的序列的CR2-FH分子的一个实例被提供在图4(SEQ ID NO：6)中。

FH蛋白质或其片段的同系物包括不同于天然发生的FH(或FH片段)的蛋白质，因为至少一个或几个但不限于一个或几个氨基酸已经被剔除(例如截短形式的蛋白质，例如肽或片段)、插入、倒位、置换和/或衍生化(例如通过糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酸化、酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的加入)。例如，FH同系物具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与天然发生的FH的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：16)具有至少大约70％的同一性，例如与天然发生的FH的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：16)具有至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任意百分比的同一性。在一些实施方式中，FH(或其片段)的同系物保留FH(或其片段)的全部补体抑制活性。在一些实施方式中，FH(或其片段)的同系物保留FH(或其片段)补体抑制活性的至少50％，例如至少大约60％、70％、80％、90％或95％中任一个。

在一些实施方式中，FH部分包括人类FH的至少前四个N-末端SCR结构域，例如具有至少含有人类FH(SEQ ID NO：2)的氨基酸21至262的氨基酸序列的FH部分。在一些实施方式中，FH部分包括人类FH的至少前四个N-末端SCR结构域，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类FH(SEQ ID NO：2)的氨基酸21至262具有至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％中任一百分比的同一性。

在一些实施方式中，FH部分包括人类FH的至少前五个N-末端SCR结构域，例如具有至少含有人类FH(SEQ ID NO：2)的氨基酸21至320的氨基酸序列的FH部分。在一些实施方式中，FH部分包括人类FH的至少前五个N-末端SCR结构域，其具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与人类FH(SEQ ID NO：2)的氨基酸21至320具有至少大约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％中任一百分比的同一性。

在一些实施方式中，FH部分包括H因子样1分子(FHL-1)——由H因子基因的可选剪接转录物编码的蛋白质——的全长或片段。成熟FHL-1包含431个氨基酸。前427个氨基酸形成七个SCR结构域并且与FH的N-末端SCR结构域具有同一性。C-末端处剩余的四个氨基酸残基Ser-Phe-Thr-Leu(SFTL)对FHL-1具有特异性。FHL-1已经进行功能表征，并且显示具有H因子补体调节活性。术语“FH部分”还包括H因子相关分子的全长或片段，包括但不限于由FHR1、FHR2、FHR3、FHR4、FHR5基因编码的蛋白质。这些H因子相关的蛋白质被公开在例如de Cordoba等，Molecular Immunology 2004，41：355-367中。CR2-FH分子的变体

还包括CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)的变体。本文所述的CR2-FH分子的变体可以是：(i)这样的变体，其中CR2部分和/或FH部分的一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选地保守氨基酸残基)所置换，并且这种置换的氨基酸残基可以是或者可以不是被遗传密码子编码的氨基酸残基；或(ii)这样的变体，其中CR2部分和/或FH部分的一个或多个氨基酸残基包括取代基；或(iii)这样的变体，其中CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)与另一化合物融合，例如增加CR2-FH分子的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)这样的变体，其中另外的氨基酸被融合到CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)，例如前导序列或分泌序列或者用于CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)提纯的序列；或者(v)这样的变体，其中CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)被融合于较大的多肽，即人类清蛋白、抗体或Fc，用于增加效果的持续时间。这样的变体被认为在阅读本教导后在领域的技术人员的范围之内。

在一些实施方式中，CR2-FH分子的变体包含在一个或多个预期的、优选非必需的氨基酸残基上进行的保守氨基酸置换(下面被进一步定义)。“非必需”氨基酸残基是这样的残基，其可以从蛋白质的野生型序列改变而来而没有改变生物活性，相反“必需”氨基酸残基是生物活性所必需的。“保守氨基酸置换”是这样的置换，其中该氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基置换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中被定义。这些家族包括具有下列侧链的氨基酸：碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、未带电的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

在CR2-FH分子的CR2或FH部分中的氨基酸置换可以被引入以提高该分子的功能。例如，氨基酸置换可以被引入到该分子的CR2部分以增加CR2部分对其配体(或多种)的结合亲合性，增加CR2部分对其配体(或多种)的结合特异性，提高CR2-FH分子对期望位点的靶向性，增加CR2-FH分子的二聚作用或多聚作用，以及提高CR2-FH分子的药物代谢动力学。类似地，氨基酸置换可以被引入到分子的FH部分以增加CR2-FH分子的功能并且提高CR2-FH分子的药物代谢动力学。

在一些实施方式中，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)与另一化合物融合，例如增加该多肽的半衰期和/或减少该多肽潜在的免疫原性的化合物(例如聚乙二醇，“PEG”)。PEG能够被用于赋予该融合蛋白水溶解性、大小、缓慢的肾清除速率以及降低的免疫原性。参见例如美国专利号6,214,966。在聚乙二醇化的情况下，CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)与PEG的融合可以通过本领域技术人员任何熟知的手段进行。例如，聚乙二醇化可以如下完成：首先将半胱氨酸突变引入到该CR2-FH融合蛋白中，接着用PEG-马来酰亚胺进行位点特异性衍生作用。半胱氨酸可以被加到该CR2-FH融合蛋白的C-末端。参见例如Tsutsumi等.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(15)：8548-8553。可以对CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)进行的另一修饰涉及生物素化。在某些情况下，使CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)生物素化以便能容易与链酶抗生物素蛋白反应可能是有用的。蛋白质生物素化的方法在本领域中是众所周知的。此外，硫酸软骨素可以与CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)连接。

在一些实施方式中，CR2-FH分子与进一步增加CR2-FH分子靶向效率的另一靶向分子或靶向部分融合。例如，CR2-FH分子可以被融合于具有与血管的内皮细胞结合或另外附着的能力的配体(例如氨基酸序列)(被称为“血管内皮靶向氨基酸配体”)。示例性的血管内皮靶向配体包括但不限于VEGF、FGF、整联蛋白、纤连蛋白、I-CAM、PDGF或者在血管内皮细胞表面上表达的分子的抗体。

在一些实施方式中，CR2-FH分子与胞间粘附分子配体连接(例如融合)。例如，CR2-FH分子可以与结合胞间粘附分子的一个或多个糖部分连接。糖部分有助于CR2-FH分子定位于损伤位点。糖部分可以通过胞外事件例如化学或酶附着而附着于CR2-FH分子，或者可以是通过合适酶的表达而实现的胞内加工事件的结果。在一些实施方式中，糖部分结合特定种类的粘附分子，例如整联蛋白或选择蛋白，其包括E-选择蛋白、L-选择蛋白或P-选择蛋白。在一些实施方式中，糖部分包括N-连接的糖，例如复合体型，其包括岩藻糖基化的和唾液酸化的糖。在一些实施方式中，该糖部分涉及路易斯X抗原，例如唾液酸化的路易斯X抗原。

对于眼病如AMD的治疗来说，CR2-FH可以与识别玻璃疣的新表位的抗体连接(例如融合)。还可以使用其它靶向分子例如小的靶向肽。CR2-FH分子的其它修饰包括例如通过已知的保护基/封闭基等进行的糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化。

CR2-FH分子可以包括免疫学活性结构域例如抗体表位或其它标记的加入，以有助于多肽的靶向或提纯。6xHis和GST(谷胱甘肽S转移酶)作为标记的使用是众所周知的。融合结合处或附近的切割位点的包含将有助于提纯后去除外来多肽。可以包括在CR2-FH分子中的其它氨基酸序列包括功能结构域，例如来自酶如水解酶的活性位点，糖基化结构域和细胞靶向信号。

CR2-FH分子(例如CR2-FH融合蛋白)的变体包括具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列充分类似于CR2-FH分子的氨基酸序列。术语“充分类似”是指相对于第二氨基酸序列含有足量或最小量的相同或等价的氨基酸残基的第一氨基酸序列，因而第一和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，含有具有至少大约45％，优选地大约75％至98％同一性的共同结构域的氨基酸序列在本文中被定义为充分类似。变体包括被这样的多核苷酸编码的融合蛋白的变体，所述多核苷酸在严格条件下与本发明的多核苷酸或其互补多核苷酸杂交。这样的变体一般保留了本发明的融合蛋白的功能活性。多核苷酸片段的文库可被用于产生多样化的片段群，用于筛选或随后的选择。例如，片段文库可通过如下步骤产生：在其中每个分子只发生大约一次切口的条件下用核酸酶处理多核苷酸的双链PCR片段，使双链DNA变性，使该DNA复性以形成可包括来自不同带切口产物的有义/反义对的双链DNA，通过用S1核酸酶处理从重新形成的双链体中去除单链部分，以及将所得的片段文库连接到表达载体中。通过该方法，就能获得编码本发明融合蛋白的不同大小的N-末端和内部片段的表达文库。

变体包括由于诱变的缘故氨基酸序列不同的融合蛋白。此外，CR2-FH分子(例如融合蛋白)的生物等价类似物还可以通过对CR2部分和/或FH部分中的残基或序列进行各种置换而构建。

在一些实施方式中，CR2-FH分子，尤其是CR2-FH融合蛋白，在其N-末端融合于信号肽。这样的信号肽用于CR2-FH分子的分泌。合适的信号肽包括例如CD5蛋白质的信号(诸如人类CD5蛋白的信号肽MPMGSLQPLATLYLLGMLVAS，SEQ ID NO：11)。在一些实施方式中，使用的是CR2蛋白质的信号肽。例如，在一些实施方式中，使用的是人类CR2蛋白质的信号肽(MGAAGLLGVFLALVAPG，SEQ  ID  NO：13，或者MGAAGLLGVFLALVAPGVLG，SEQ ID NO：25)。

CR2-FH分子的制备

本文所述的CR2-FH分子(或者CR2-FH分子的两个部分)可以通过化学合成方法制备，或者通过以下步骤制备：将编码CR2部分的多核苷酸与编码FH部分的多核苷酸连接(带有或没有连接序列)，并且将所得多核苷酸分子引入到载体中用于转染能表达该分子的宿主细胞。化学合成尤其固相合成对于短肽或者含有非天然或不常见的氨基酸例如D-Tyr、鸟氨酸等的那些来说是优选的。重组方法对于较长多肽来说是优选的。CR2-FH分子可以通过蛋白质提纯方法在体外被分离。CR2-FH分子还可以通过将基因治疗系统引入到其然后表达CR2-FH融合蛋白的目标组织中而“原位”提供。

用于制备CR2-FH融合蛋白的重组DNA技术以简化的形式涉及取出编码CR2-FH的多核苷酸，将其插入到合适的载体中，将所述载体插入到合适的宿主细胞中，以及回收或分离由此产生的融合蛋白。

本文提供的是编码CR2-FH分子(即CR2-FH融合蛋白)的多核苷酸。这样的多核苷酸还可被用于CR2-FH的输送和表达。例如，在一些实施方式中，提供的是编码这样的融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包括包含CR2或其片段的CR2部分以及包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，所述多核苷酸还包括编码信号肽的序列，其被可操作地连接在编码CR2-FH融合蛋白的序列的5’端。信号肽的示例性核苷酸序列被提供在图7(SEQ ID NO：12、14和25)中。在一些实施方式中，连接序列用于将CR2部分与FH部分连接。在一些实施方式中，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CR2-FH融合蛋白。在一些实施方式中，所述核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的CR2-FH融合蛋白，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23中任意一个的氨基酸序列具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任一百分比的同一性。在一些实施方式中，所述核苷酸编码这样的CR2-FH分子，所述CR2-FH分子包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：22和SEQ IDNO：24中任意一个的至少大约400、450、500、550或更多连续核苷酸中任意一个。在一些实施方式中，所述多核苷酸包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：22和SEQ IDNO：24中任意一个的序列。在一些实施方式中，所述多核苷酸包括这样的序列，其与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24中任意一个的核酸序列具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％中任意百分比的同一性。在一些实施方式中，所述多核苷酸包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：24中任意一个的至少大约1200、1300、1400、1500、1600或更多连续核苷酸中的任意一个。所述多核苷酸可进一步包括编码分泌信号序列的序列以将融合蛋白分泌到培养基中。编码分泌信号序列的多核苷酸包括例如编码CD5的信号序列的多核苷酸或者编码CR2的信号序列的多核苷酸序列。

还提供的是包括本文所述的多核苷酸的表达载体，用于表达CR2-FH融合蛋白。该表达载体可被用于在体外或体内直接表达CR2-FH融合蛋白。该载体可以包括用于建立载体常规功能的任何元件，例如启动子、终止子、选择标记和复制起点。该启动子可以是组成型的或调节型的，并且选自例如半乳糖激酶(GAL1)、尿苷酰转移酶(GAL7)、差向异构酶(GAL10)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)、醇脱氢酶(ADH)等的基因的启动子。

许多表达载体对本领域技术人员来说是已知的。例如，大肠杆菌可以用pBR322进行转化，pBR322是从大肠杆菌种中得到的质粒(Mandel等，J.Mol.Biol.，53：154(1970))。质粒pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性的基因，并且因此提供用于选择的容易方法。其它载体包括不同的特征例如不同的启动子，其在表达中经常是重要的。例如，质粒pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)、pKK233-2(Clontech，Palo Alto，Calif.，USA)和pGEM1(Promega Biotech，Madisonk Wis.，USA)都是商业上可得到的。可被用于本发明的其它载体包括但不限于pET21a(Studier等，Methods Enzymol.，185：60-89(1990))、pR1T5和pR1T2T(Pharmacia Biotechnology)以及pB0475(Cunningham等，Science，243：1330-1336(1989)；美国专利号5,580,723)。哺乳动物的表达载体可以包含非转录元件例如复制起点、启动子和增强子；5′或3′非翻译序列例如核糖体结合位点、多腺苷化位点、受体位点和剪接供体；以及转录终止序列。用于哺乳动物表达载体的启动子通常是例如病毒启动子诸如多瘤、腺病毒、HTLV、猿猴病毒40(SV 40)和人巨细胞病毒(CMV)。载体还可以采用标准技术通过组合上述载体的相关优点而构建。

还提供的是用于表达CR2-FH融合蛋白的宿主细胞(例如分离的细胞、瞬时细胞系和稳定细胞系)。该宿主细胞可以是原核或真核细胞。示例性的原核生物宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)K12菌株294(ATCC号31446)、大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC号31537)、大肠杆菌W3110(F-、γ-、原养型/ATCC号27325)、杆菌例如枯草杆菌和其它肠杆菌例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)以及假单胞菌的各个种。一个合适的原核宿主细胞是大肠杆菌BL21(Stratagene)，其缺乏OmpT和Lon蛋白酶，其可以干扰完整重组蛋白质的分离，可以与T7启动子驱动的载体例如pET载体一起使用。另一合适的原核生物是大肠杆菌W3110(ATCC号27325)。当被原核生物表达时，该肽通常含有N-末端甲硫氨酸或者甲酰甲硫氨酸并且没有被糖基化。在融合蛋白的情况下，N-末端甲硫氨酸或者甲酰甲硫氨酸位于融合蛋白的氨基末端或者融合蛋白的信号序列上。这些实例当然意图是例证性的而非限制性的。

除了原核生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母是融合蛋白编码载体合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低级真核宿主微生物。其它包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290：140(1981)；EP 139,383，公开日1985年5月2日)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主(美国专利号4,943,529；Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991))诸如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)：737-742(1983))、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC No.16,045)、K.wickeramii(ATCC No.24,178)、瓦尔特克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC No.56,500)、K.drosophilarum(ATCC No.36,906；Van den Berg等，Bio/Technology，8：135(1990))、K.thermotolerans和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等，J.BasicMicrobiol.，28：265-278(1988))；假丝酵母(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：5259-5263(1979))；许旺酵母(Schwanniomyces)诸如Schwanniomyces occidentalis(EP 394,538，公开日1990年10月31日)；和丝状真菌，诸如举例来说脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(WO 91/00357，公开日1991年1月10日)；以及曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112：284-289(1983)；Tilburn等，Gene，26：205-221(1983)；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.，4：475-479(1985))。甲醇酵母(Methylotropic yeasts)在本文中是合适的，并且包括但不限于能在甲醇上生长的酵母，其选自下列属：汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酿酒酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)。代表这类酵母的一系列特定的种可以在C.Anthony，The Biochemistry of Methylotrophs，269(1982)中找到。宿主细胞还包括昆虫细胞诸如果蝇S2(Drosophila S2)和夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)以及植物细胞。

有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于海拉细胞(HeLa)、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)、COS-7、L细胞、C127、3T3、BHK、CHL-1、NSO、HEK293、WI38、BHK、C127或MDCK细胞系。另一示例性哺乳动物细胞系是CHL-1。当使用CHL-1时，潮霉素作为真核生物选择标记被包括在内。CHL-1细胞得自RPMI 7032黑素瘤细胞，一种易得的人类细胞系。适合用于本发明的细胞可从ATCC商业获得。

在一些实施方式中，宿主细胞是非人类宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是CHO细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是293细胞。

CR2-FH分子可通过本领域中已知的各种方法进行分离。在一些实施方式中，当CR2-FH分子是分泌到生长培养基中的融合蛋白时，该分子可直接从该培养基中提纯。如果融合蛋白不是分泌的，它从细胞裂解物分离。细胞破碎可以通过任何常规方法进行，包括冷冻-融循环、声波处理、机械破碎或使用细胞裂解剂。CR2-FH分子能够通过各种方法获得。这些方法包括但不限于免疫亲和层析、反相层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析和HPLC。例如，CR2-FH分子可以使用识别CR2部分的抗体或者识别FH部分的抗体或者两者通过免疫亲和层析进行提纯。在一些实施方式中，识别CR2的前两个N-末端SCR结构域的抗体被用于提纯CR2-FH分子。在一些实施方式中，CR2-FH分子通过离子交换层析进行提纯。

肽当被表达为融合蛋白时，可能或者可能没有被正确折叠。这些因素决定了融合蛋白是否必须被变性和重折叠，以及如果这样的话，在切割之前或之后这些方法是否被应用。当变性和重折叠是需要的时候，典型地肽用离液剂诸如盐酸胍进行处理，然后在合适的比例、pH和温度下用氧化还原缓冲液进行处理，所述氧化还原缓冲液含有例如还原的和氧化的二硫苏糖醇或谷胱甘肽，这样肽被重折叠成其天然结构。

本文所述的CR2-FH分子还可包含提纯用的标记(例如可切割的标记)。该标记可被融合于CR2部分或FH部分的C-末端或N-末端，并且可用于帮助蛋白质提纯。

在一些实施方式中，CR2-FH分子可以采用本领域熟知的化学方法全部或部分从头合成。例如，组成氨基酸序列可以通过固相技术合成，从该树脂中切割，并且通过制备型高效液相层析进行提纯，接着通过化学键合以形成期望的多肽。合成肽的组成可以通过氨基酸分析或测序进行证实。

CR2-FH分子可以采用体外或体内试验测定它们的期望特性。例如，CR2-FH与CR2配体的结合可以通过表面等离子共振法测定。举例来说，CR2-FH与C3dg-生物素的相互作用的动力学分析可以采用在BIAcore 3000仪器(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)上进行的表面等离子共振(SPR)测量方法进行。人C3dg-生物素可以结合到BIAcore链霉抗生物素蛋白传感器芯片的表面上，这是通过将C3dg-生物素注射在该芯片的一个液体池(flow cell)表面上而实现的。结合可以在CR2-FH浓度范围内进行评价。CR2-FH分子与配体的联合可以监视一段时间(例如120秒)，之后让该复合物在缓冲液的存在下解离仅仅另外的一点时间(例如20秒)。CR2融合蛋白片段与C3dg-固定的液体池的结合可以根据与对照液体池的结合进行校正。结合数据可以采用BIA评价版本3.1软件(BIAcore)拟配(fit)成1∶1Langmuir结合模型，并且对最佳拟配进行评价。所获得的动力学解离曲线可用于借助BIA评价版本3.1程序(BIAevaluation Version 3.1program)计算结合和解离速率(on and offrates)(ka和kd)以及亲和常数(KD)。配体结合的其它试验方法在本领域中是已知的并且也可以使用。

体外酵母聚糖补体试验可用于测定CR2-FH分子的补体抑制活性。兔红细胞在Mg-EGTA中被血清裂解是可以使用的另一种活性测量法。已经去除唾液酸的人或羊红细胞在Mg-EGTA中的裂解提供另外的活性测量法。

药物组合物

本文还提供药物组合物，其包括CR2-FH分子和药学上接受的载体。药物组合物可适用于本文所述的各种给药模式，包括例如全身或局部给药。药物组合物可以为滴眼剂、可注射溶液的形式，或者适合于吸入(通过口或鼻)或口服的形式。本文所述的药物组合物可以包装成单位剂量或多剂型。

在一些实施方式中，药物组合物包括CR2-FH分子以及适合于给人施用的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物包括CR2-FH分子以及适合于眼内注射的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物包括CR2-FH分子以及适合于外部施用于眼睛的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物包括CR2-FH分子以及适合于静脉内注射的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物包括CR2-FH分子以及适合于注射到动脉(例如肾动脉)内的药学上可接受的载体。

组合物一般被配制成无菌的、基本等渗的并且完全符合美国食品药品管理局的所有药品生产质量管理规范(Good Manufacturing Practice，GMP)的规定。在一些实施方式中，所述组合物不含病原体。对于注射来说，所述药物组合物可以为液体溶液形式，例如生理相容性缓冲液诸如Hanks溶液(Hank′s solution)或林格溶液(Ringer′s solution)。此外，CR2-FH药物组合物可以为固体形式并且在使用前立刻再溶解或悬浮。还包括冻干的组合物。

对于口服来说，药物组合物可以采取通过常规手段与药学上可接受的赋形剂一起制备的例如药片或胶囊的形式，所述药学上可接受的赋形剂诸如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。用于口服的液体制剂可采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者它们可以表现为干燥产品，在使用前与水或其它合适的载体配制。这类液体制剂可以通过常规手段与药学上可接受的添加剂一起制备，诸如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化可食脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水载体(例如ationd oil、油脂、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或者山梨酸)。该制剂也可包含适当的缓冲盐、矫味剂、着色剂和甜味剂。

在一些实施方式中，本发明提供组合物，其包括CR2-FH分子以及适于给眼睛施用的药学上可接受的载体。这类药物载体可以是无菌液体诸如水和油，其包括石油、动物、植物和合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油等。盐溶液和葡萄糖、聚乙二醇(PEG)和甘油水溶液也可被用作液体载体，尤其对于可注射溶液来说。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、大米、钠状态、单硬脂酸甘油酯、甘油、丙烯、水等。如果期望的话，所述药物组合物也可包含小量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。CR2-FH分子以及该组合物的其它成分可以被装入聚合物或纤维蛋白胶中以提供该分子的控制释放。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、药膏、凝胶、或其它固体或半固体组合物等形式。组合物一般具有范围在4.5至8.0的pH。组合物也必须被配制成具有与眼睛和眼组织的水状液相容的渗透值。该渗透值将一般在约200至约400渗透压毫克分子/千克水(“mOsm/kg”)的范围内，但是将优选地为约300mOsm/kg。

在一些实施方式中，该组合物根据常规程序配制为适合于静脉内、腹腔内或玻璃体内注射的药物组合物。一般地，注射用组合物是在无菌等渗压含水缓冲液中的溶液。必要的地方，组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂例如利诺卡因以减轻注射位置的疼痛。一般地，成分以单位剂型单独地或者混合在一起供应，例如在显示活性剂的量的密封容器诸如安瓿或小袋中的冻干粉末或无水浓缩物。在组合物通过输注给药的情况下，它可以用含有无菌药物级水或盐水的输注瓶进行配制。在组合物通过注射给药的情况下，注射用无菌水或盐水的安瓿可以提供，以便成分可以在给药前混合。

组合物可进一步包括额外成分，例如防腐剂、缓冲剂、张力剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子润湿剂或澄清剂、增粘剂等。

在溶液中使用的适合的防腐剂包括聚季铵盐-1、苯扎氯铵、硫柳汞、氯代丁醇、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、苯乙醇、乙二胺四乙酸二钠、山梨酸、苄索氯铵等。典型地(但不一定)，该防腐剂按重量计以0.001％至1.0％的水平使用。

合适的缓冲剂包括硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾、乙酸钠、磷酸氢钠等，其量足以将pH保持在约pH 6与pH 8之间，并且优选地在约pH 7与pH 7.5之间。

合适的张力剂为葡聚糖40、葡聚糖70、葡萄糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠等，以便眼用溶液的氯化钠当量在0.9±0.2％的范围内。

合适的抗氧化剂和稳定剂包括亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、硫脲等。合适的润湿和澄清剂包括聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆282(poloxamer 282)和泰洛沙伯(Tyloxapol)。合适的增粘剂包括葡聚糖40、葡聚糖70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、矿脂、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等。

使用增粘剂提供粘度比简单水溶液大的外用组合物对于增加活性化合物被靶组织的眼内吸收或者增加在眼中的保留时间来说可能是期望的。这类增粘剂包括例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素或本领域技术人员已知的其它试剂。该试剂一般按重量计以0.01％至2％的水平使用。

在一些实施方式中，提供的是药物组合物，其用于输送编码CR2-FH分子的核苷酸。基因治疗用药物组合物可以在可接受的稀释剂中，或者可包括其中嵌入基因输送载体或化合物的缓慢释放基质。可选地，在完全基因输送系统可从重组细胞例如逆转录病毒载体完整产生的情况下，药物组合物可包括产生该基因输送系统的一种或多种细胞。

在临床环境中，用于基因治疗的基因输送系统可以通过许多方法中任一种导入受治疗者中。举例来说，基因输送系统的药物组合物可以例如通过静脉内注射全身引入，并且蛋白质在靶细胞中的特异转导主要由于以下原因发生：基因输送载体提供的转染特异性，由于控制受体基因表达的转录调节序列而引起的细胞型或组织型表达，或其组合。在其它实施方式中，重组基因的初始输送更多地受到十分局部化的向动物中引入的限制。例如，基因输送载体可以由导管引入，参见美国专利5,328,470，或者通过立体定向注射，Chen等(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 91：3054-3057。编码CR2-FH分子的多核苷酸可以采用Dev等(1994)，Cancer Treat.Rev.20：105-115描述的技术通过电穿孔在基因治疗构建物中输送。

在一些实施方式中，提供的是药物组合物，其用于基因输送到眼睛。用于储存和/或输送表达载体的眼用溶液已经被公开，例如在WO03077796A2中。CR2-FH分子及其组合物的使用

本文所述的CR2-FH分子可起到特异性地抑制补体旁路中的体内补体激活以及伴随它的炎症表现的作用，诸如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、血小板和肥大细胞的募集和激活、水肿、组织损伤以及局部和内源细胞的直接激活。包括这些分子的组合物因此可用于治疗由补体系统过量或未受控制的激活介导的疾病或状况，尤其由补体旁路过量或未受控制的激活介导的疾病或状况。在一些实施方式中，提供的是治疗涉及局部发炎过程的疾病的方法。在一些实施方式中，提供的是治疗与FH缺乏(例如FH水平降低、FH活性降低、或缺乏野生型或保护性FH)相关的疾病的方法，包括例如年龄相关性黄斑变性、膜增生性肾小球肾炎、蛋白尿性病(proteineuric disease)、溶血尿毒综合症、复发性细菌感染、缺血再灌注(例如肾缺血再灌注或肠缺血再灌注)、器官移植排斥和慢性炎症例如类风湿性关节炎。

在一些实施方式中，提供的是治疗个体中涉及补体旁路的疾病(诸如黄斑变性，例如AMD)的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是在具有其中涉及补体旁路的疾病(诸如黄斑变性，例如AMD)的个体中抑制补体激活的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是在具有其中涉及补体旁路的疾病(诸如黄斑变性，例如AMD)的个体中抑制炎症的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。

“治疗(Treating)”或“治疗(to treat)”疾病被定义为施用含有或不含其它治疗剂的一种或多种CR2-FH分子以减轻、改善、稳定、逆转、减缓、延迟、预防、降低或消除疾病或疾病的症状或者以延迟或阻止疾病或疾病症状的进展。“有效量”是足以治疗疾病——如上所定义——的量。

“个体”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类、小鼠和大鼠。在一些实施方式中，所述个体是人。在一些实施方式中，所述个体是除了人之外的个体。在一些实施方式中，所述个体是动物模型，用于研究其中涉及补体旁路的疾病。愿服从治疗的个体包括这样的个体，其目前无症状但是具有后来发展有症状的黄斑变性相关性疾病的危险。例如，人个体包括具有经历这类疾病的亲戚的那些个体，以及通过遗传标志物或生化标志物的分析、通过生化方法或者通过其它试验诸如T细胞增殖试验确定具有危险的那些个体。在一些实施方式中，所述个体是在其FH基因中具有这样的突变或多态性的人，所述突变或多态性暗示发展其中涉及补体旁路的疾病(例如年龄相关性黄斑变性)的增加的易感性。在一些实施方式中，所述个体具有野生型或保护性单体型FH。FH的不同多态性已经公开在美国专利公告号20070020647中，其在本文以其全部被并入。

本文所述的组合物尤其用于治疗黄斑变性，诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)。AMD的临床特征是，由于被称为黄斑的视网膜区域中感光细胞的损伤而发生的中央视觉的进行性丧失。AMD已经大致分成两种临床状态，湿型和干型，其中干型占总病例的高达80-90％。干型的临床特征是存在黄斑玻璃疣，其是位于视网膜色素上皮细胞(RPE)与布鲁赫氏膜(Bruch′s membrane)之间的局部沉积物，以及由RPE细胞死亡和覆盖的光感受器(光受体)萎缩表征的地图状萎缩。湿型AMD，其占严重视觉丧失的约90％，与黄斑区域的新血管形成以及这些新血管的泄漏相关。血液和流体的积累可引起视网膜脱落，接着快速的光感受器变性以及视觉丧失。一般认为AMD的湿型之前是干型并由干型引起。

AMD病人中玻璃疣的内含物分析已经显示有大量的包括淀粉状蛋白质在内的炎性蛋白质、凝血因子以及大量补体途径的蛋白质。补体因子H的基因变异大大增加了年龄相关性黄斑变性(AMD)的危险，这表明未受控制的补体激活成为AMD发病的基础。Edward等，Science 2005，308：421；Haines等，Science2005，308：419；Klein等，Science 308：385-389；Hageman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2005，102：7227。

本发明提供通过施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物治疗AMD(诸如湿型或于型AMD)的方法。在一些实施方式中，本发明提供治疗或预防AMD的一种或多种方面或症状的方法，其包括但不限于眼睛玻璃疣的形成、眼睛或眼组织中的炎症、感光细胞的损失、视觉(包括例如视力或视野)丧失、新血管形成(诸如脉络膜新血管形成或CNV)以及视网膜脱落。还包括其它相关方面，诸如光感受器变性、RPE变性、视网膜变性、脉络膜视网膜变性、视锥变性、视网膜机能障碍、光暴露(如持续光暴露)引起的视网膜损伤、布鲁赫氏膜损伤、RPE机能丧失、正常黄斑的细胞和/或胞外基质的组织构造完整性的丧失、黄斑中细胞机能的丧失、光感受器营养不良、粘多糖症、视杆-视锥营养不良(rod-conedystrophies)、视锥-视杆营养不良、前葡萄膜炎和后葡萄膜炎以及糖尿病型神经病。

在一些实施方式中，提供的是在个体中治疗黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性或AMD)的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，要治疗的疾病是干型AMD。在一些实施方式中，要治疗的疾病是湿型AMD。

在一些实施方式中，提供的是治疗(例如减少、延迟、消除或预防)个体眼睛中玻璃疣形成的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗(例如减少、延迟、消除或预防)个体眼睛中炎症的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗(例如减少、延迟、消除或预防)个体中感光细胞丧失的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗(例如减少、延迟、消除或预防)个体中感光细胞丧失的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗(例如减少、延迟、消除或预防)与AMD相关的新血管形成的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗(例如减少、延迟、消除或预防)与AMD相关的视网膜脱落的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是提高(包括例如减少、延迟或阻止)个体眼睛中视力或视野丢失的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。

除黄斑变性外，通过本发明的方法可治疗的其它眼病包括例如色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变以及涉及局部发炎过程的其它眼病。在一些实施方式中，眼病是糖尿病性视网膜病变。在一些实施方式中，眼病是色素性视网膜炎。

本文所述的方法还可用于治疗某些肾病。在一些实施方式中，提供的是治疗膜增生性肾小球肾炎II型(MPGN II)的方法。MPGN II是罕见的肾病，其导致持续的蛋白尿、血尿及肾炎综合症。MPGN II中FH缺乏及机能障碍已经在几个病例中被报道。例如，FH突变已经在患有MPGN II的病人中发现。NorwegianYorkshire品种的猪具有以隐性方式遗传的FH缺陷。这些动物发生MPGN II并且在肾小球中显示大量补体沉积物并且在早年由于肾衰竭死亡。此外，识别FH的自身抗体已经描述在具有低补体血性MPGN II的患者中。将FH靶向补体激活位点因此将对患有MPGN II的个体具有治疗作用。因此，在一些实施方式中，提供的是治疗个体中MPGN II的方法，其包括给所述个体施用包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗与MPGN II相关的蛋白尿的方法。在一些实施方式中，提供的是治疗与MPGN II相关的血尿的方法。在一些实施方式中，提供的是治疗与MPGN II相关的肾炎综合症的方法。

在一些实施方式中，提供的是治疗溶血尿毒综合症(HUS)的方法。HUS是由微血管病性溶血性贫血、血小板减少症以及急性肾衰竭组成的疾病，其由于外周的连续血小板降解和肾微循环中的血小板凝血酶而引起的。Zipfel，Seminars in Thrombosis Hemostasis，2001，27(3)：191-199。现在有大量证据表明非腹泻型HUS(D-HUS)与FH的改变和突变有关。此外，FH的自身抗体已经在HUS患者中报道。将FH靶向补体激活位点因此将对患有HUS的个体具有治疗作用。因此，在一些实施方式中，提供的是治疗个体中HUS的方法，其包括给所述个体施用有效量的包括CR2-FH分子的组合物，所述CR2-FH分子包括：a)包括CR2或其片段的CR2部分和b)包括FH或其片段的FH部分。在一些实施方式中，提供的是治疗与HUS相关的微血管病性溶血性贫血的方法。在一些实施方式中，提供的是治疗与HUS相关的血小板减少症的方法。在一些实施方式中，提供的是治疗与HUS相关的急性肾衰竭的方法。

在一些实施方式中，要治疗的疾病是系统性红斑狼疮，诸如狼疮肾炎。系统性红斑狼疮(SLE)是导致多器官侵犯的原型自身免疫疾病。这种抗自身应答特征为针对各种核和细胞质细胞成分的自身抗体。这些自身抗体与其各自的抗原结合，形成免疫复合体，其循环并最终沉积在组织中。该免疫复合体沉积物引起慢性炎症以及组织损伤。补体途径(包括补体旁路)涉及SLE的病理学，本文提供的方法因此可用于治疗SLE(例如狼疮肾炎)。

在一些实施方式中，要治疗的疾病是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎是可呈现出各种全身表现的慢性疾病。该疾病具有未知的病因学并且特征上呈现出持久的炎性滑膜炎，其通常涉及全身分布的外周关节。补体介导的炎症——其引起软骨破坏、骨磨损及最终地关节畸形——是该疾病最重要的特征。本文提供的方法因此可用于治疗类风湿性关节炎。

在一些实施方式中，要治疗的疾病是缺血再灌注。缺血再灌注(I/R)损伤涉及低氧组织再灌注后内皮和下面的软组织的炎性损伤。它是造成对各种组织急性和慢性损伤的原因的常规综合症，所述各种组织包括例如心肌、中枢神经系统、后(下)肢和肠。缺血再灌注可导致坏死和不可逆转的细胞损伤。补体途径(包括补体旁路)是I/R损伤的主要介质。本文提供的方法因此可用于治疗发生在任何器官或组织的缺血再灌注，其包括但不限于肠缺血-再灌注损伤、肾缺血-再灌注损伤、心脏缺血-再灌注损伤、其它内部器官诸如肺或肝缺血-再灌注损伤、中枢神经系统缺血-再灌注损伤、肢或趾缺血-再灌注损伤、外伤引起的血容量不足或者任何移植的器官或组织缺血-再灌注损伤。缺血-再灌注损伤也可与各种其它病症一起发生，所述其它病症括但不限于中风、脊髓损伤、外伤引起的低血容量性休克、以及自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎(例如其可能由于滑膜的缺血性损伤而极大恶化)或者各种其它炎性疾病(炎症介导的疾病或者其中炎症是可能导致或涉及缺血事件和再灌注的症状的疾病)。其中发生缺血再灌注损伤的其它病症和疾病将是本领域技术人员所知的。

在一些实施方式中，提供的是治疗玻璃疣相关性疾病的方法。术语“玻璃疣相关性疾病”是指任何这样的疾病，其中玻璃疣或玻璃疣样胞外病斑的形成发生，并且其中玻璃疣或玻璃疣样胞外病斑引起或促成该疾病或者代表了该疾病的征兆。例如，特征为黄斑性玻璃疣的形成的AMD被认为是玻璃疣相关性疾病。非眼玻璃疣相关性疾病包括但不限于淀粉状蛋白病、弹力纤维病(elastosis)、致密物沉积病和/或动脉粥样硬化。术语“玻璃疣相关性疾病”还包括肾小球肾炎(诸如MPGN II)。

其中涉及补体旁路、可以通过本发明的方法治疗的其它疾病包括，例如：(1)由于急性心肌梗塞、动脉瘤、中风、出血性休克、压伤、多器官衰竭、低血容量性休克肠缺血、脊髓损伤和外伤性脑损伤后的缺血再灌注引起的组织损伤；(2)炎性疾病，例如烧伤、内毒素血症和败血症性休克、成人呼吸窘迫综合症、心肺转流(cardiopulmonary bypass)、血液透析、过敏性休克、重症哮喘、血管性水肿、克罗恩病、镰刀状细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎、膜性肾炎和胰腺炎；(3)移植排斥，例如过急性异种移植排斥；(4)妊娠相关性疾病诸如复发性流产和先兆子痫；以及(5)药物不良反应，例如药物过敏、IL-2诱导的血管渗漏综合症和放射造影剂过敏。自身免疫疾病——其包括但不限于重症肌无力、阿尔茨海默病、多发性硬化症、肺气肿、肥胖、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、胰岛素依赖型糖尿病、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森病(Addison′s disease)、抗磷脂抗体综合症、自身免疫性肝炎、克罗恩病、肺出血-肾炎综合症、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合症、桥本病、原发性血小板减少性紫癜、天疱疮、干燥综合症和高安动脉炎——也可采用本发明的抑制剂治疗。

在一些实施方式中，要治疗的疾病是下列中任一种：心肺转流后并发症；心肌梗塞；缺血/再灌注损伤；中风；急性呼吸窘迫综合症(ARDS)；败血症；烧伤；与心肺转流和血液透析相关的炎症；血浆去除术；血小板分离；白细胞分离法；体外膜氧合(ECMO)；肝素诱导的体外LDL沉淀法(HELP)；放射造影剂诱导的过敏反应；移植排斥；其它炎性疾病以及自身免疫病/免疫复合物病诸如多发性硬化、重症肌无力、胰腺炎、类风湿性关节炎、阿尔茨海默病、哮喘、烫伤、过敏性休克、肠炎、风疹、血管性水肿、血管炎、肾小球肾炎和干燥综合症、红斑狼疮和肾小球肾炎。

本文所述的组合物可经过任何途径施用给个体，包括但不限于静脉内(例如通过输注泵)、腹腔内、眼内、动脉内、肺内、口、吸入、囊内、肌肉内、气管内、皮下、眼内、鞘内、经皮、经胸膜、动脉内、外部、吸入(例如作为喷雾)、粘膜(例如经鼻粘膜)、皮下、经皮、胃肠、关节内、脑池内、心室内、直肠(例如经栓剂)、阴道(即经阴道栓剂)、颅内、尿道内、肝内和瘤内。在一些实施方式中，组合物全身给药(例如通过静脉注射)。在一些实施方式中，组合物局部给药(例如通过动脉内或眼内注射)。

在一些实施方式中，组合物直接施用于眼睛或眼组织。在一些实施方式中，组合物外部施用于眼睛，例如以滴眼剂。在一些实施方式中，组合物通过注射到眼睛(眼内注射)或与眼睛相关的组织给药。组合物可以例如通过眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、跨膜注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射(intracameral injection)、结膜下注射、结膜下注射、眼球筋膜下注射(sub-Tenon’s iniection)、球后注射、球周注射或近巩膜后输送(posteriorjuxtascleral delivery)。这些方法在本领域是已知的。例如，对于视网膜药物输送的示例性眼周途径的描述，参见Periocular routes for retinal drug delivery，Raghava等(2004)，Expert Opin.DrugDeliv.1(1)：99-114。组合物可以施用于例如玻璃体、房水、巩膜、结膜、巩膜与结膜之间的区域、视网膜脉络膜组织、黄斑或者个体的眼睛内或附近的其他区域。组合物也可作为植入物施用给个体。优选的植入物是生物相容性和/或生物降解性持续释放制剂，其在一段时间内持续释放该化合物。药物输送的眼睛植入物在本领域中是已知的。参见例如美国专利5,501,856、5,476,511和6,331,313。组合物也可采用离子电渗疗法施用于个体，包括但不限于在美国专利号4,454,151以及美国专利公告号2003/0181531和2004/0058313中描述的离子电渗疗法。

在一些实施方式中，组合物经血管内诸如静脉内(IV)或动脉内给药。在一些实施方式中(例如对于治疗肾病来说)，组合物直接施用到动脉(诸如肾动脉)中。

组合物的最佳有效量可凭经验确定并且将取决于疾病的类型和严重性、给药途径、疾病进展以及个体的健康、质量和身体面积。该确定方法在本领域技术人员的技能内。有效量也可基于体外补体激活试验确定。本文所述方法可用的CR2-FH分子剂量的实例包括但不限于在下列之一的剂量范围内的有效量：约0.01μg/kg至约300mg/kg、或者约0.1μg/kg至约40mg/kg、或者约1μg/kg至约20mg/kg、或者约1μg/kg至约10mg/kg。例如，当眼内给药时，组合物可以在低微克范围内给药，包括例如约0.1μg/kg或以下、约0.05μg/kg或以下或者约0.01μg/kg或以下。在一些实施方式中，CR2-FH施用于个体的量为每剂量约10μg至约500mg，包括例如下列之一：每剂量约10μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约200μg、约200μg至约300μg、约300μg至约500μg、约500μg至约1mg、约1mg至约10mg、约10mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约200mg、约200mg至约300mg、约300mg至约400mg或者约400mg至约500mg。

CR2-FH组合物可以以单一日剂量给药，或者总日剂量可以以每天两次、三次、或四次的分剂量给药。组合物也可以比每天一次更少频率地给药，例如一周六次、一周五次、一周四次、一周三次、一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次、一月一次、每两月一次、每三月一次或每六月一次。组合物也可以以持续释放的制剂给药，诸如植入物，其在一段时间内逐渐释放组合物使用，并且其允许组合物以较少的频率给药，诸如一月一次、每2-6个月一次、每年一次或者甚至一次性给药。持续释放装置(诸如小球、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球等)可以通过注射给予或手术移植在眼睛或与眼睛相关组织中的不同位置，诸如眼内、玻璃体内、视网膜下、眼周、结膜下或眼球筋膜下(sub-Tenons)。

药物组合物可以单独或与其它分子一起给药，所述其它分子已知对视网膜连接或损坏的视网膜组织具有有益作用，其包括能进行组织修复和再生和/或抑制炎症的分子。有用的辅因子的实例包括抗VEGF剂(如抗VEGF的抗体)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、axokine(CNTF的突变蛋白质)、白血病抑制因子(LIF)、向神经素3(NT-3)、向神经素-4(NT-4)、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子II、前列腺素E2、30kD存活因子、牛磺酸和维生素A。其它有用的辅因子包括减轻症状的辅因子，其包括杀菌剂、抗生素、抗病毒和抗真菌剂以及镇痛药和麻醉剂。

基因治疗

CR2-FH分子也可通过CR2-FH融合蛋白体内表达而输送，其经常被称为“基因治疗”。例如，细胞可以在体外用编码该融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)进行工程改造，工程改造的细胞然后提供给用该融合蛋白治疗的个体。这种方法在本领域中是熟知的。例如，细胞可以借助含有编码本发明的融合蛋白的RNA的逆转录病毒颗粒通过本领域已知的方法进行工程改造。

采用基因疗法局部输送本发明的融合蛋白可向靶区域例如眼睛或眼组织提供治疗剂。

基因输送的方法在本领域中是已知的。这些方法包括但不限于直接DNA转移，参见例如Wolff等(1990)Science 247：1465-1468；2)脂质体介导的DNA转移，参见例如Caplen等(1995)Nature Med.3：39-46；Crystal(1995)NatureMed.1：15-17；Gao and Huang(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.179：280-285；3)逆转录病毒介导的DNA转移，参见例如Kay等(1993)Science 262：117-119；Anderson(1992)Science 256：808-813；4)DNA病毒介导的DNA转移。这类DNA病毒包括腺病毒(优选地Ad2或Ad5基载体)、疱疹病毒(优选地单纯疱疹病毒基载体)以及细小病毒(优选地“缺陷型”或非自主性细小病毒基载体，更优选地腺相关性病毒基载体，最优选地AAV-2基载体)。参见，例如Ali等(1994)GeneTherapy 1：367-384；美国专利号4,797,368，其在此被并入作为参考，以及美国专利号5,139,941。

从中可获得上文所提到的逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney Mouse Leukemia Virus)、脾坏死病毒、逆转录病毒诸如劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈维肉瘤病毒(HarveySarcoma Virus)、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓瘤病毒(Myeloproliferative Sarcoma Virus)和乳腺肿瘤病毒。在一种实施方式中，逆转录病毒质粒载体从莫洛尼小鼠白血病病毒中获得。

腺病毒具有这样的优点：它们具有广泛的宿主范围，可以感染休眠或末端分化的细胞诸如神经元或肝细胞，并且实质上呈现非致瘤性。参见，例如Ali等(1994)，同上，p.367。腺病毒似乎没有结合到宿主基因组中。因为它们位于染色体外，所以插入突变的风险被大大降低。Ali等(1994)，同上，p.373。

腺相关病毒呈现出与腺病毒基载体相似的优点。然而，AAVs呈现出对人类染色体19位点特异性整合作用(Ali等(1994)，同上，p.377)。

基因治疗载体包括一个或多个启动子。在一些实施方式中，载体具有在多个细胞类型中启动表达的启动子。在一些实施方式中，载体具有在特定细胞类型(诸如视网膜细胞或肾中的细胞)中启动表达的启动子。可应用的合适启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；和人类巨细胞病毒(CVM)启动子，其被描述在Miller等(1989)Biotechniques 7(9)：980-990中，或者任何其它启动子(例如细胞启动子诸如真核细胞启动子，其包括但不限于组蛋白、聚合酶III(pol III)和β-肌动蛋白启动子)。可应用的其它病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。通过本文所含的教导，合适启动子的选择对于本领域技术人员来说是明显的。

编码CR2-FH融合蛋白的核酸序列处在合适启动子的控制下。可应用的合适启动子包括但不限于腺病毒启动子诸如腺病毒主要晚期启动子；或者异源启动子诸如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子诸如MMT启动子；金属硫蛋白启动子；热休克启动子；清蛋白启动子；载脂蛋白Al(ApoAl)启动子；人类球蛋白启动子；病毒腺苷激酶启动子诸如单纯疱疹腺苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs(包括上文所述的修饰的逆转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；和人生长激素启动子。

逆转录病毒质粒载体可用于转导包装细胞系以形成生产细胞系。可被转染的包装细胞的实例被描述在Miller(1990)Human Gene Therapy 1：5-14中。载体可通过本领域任何已知的手段转导包装细胞。这类手段包括但不限于电穿孔、使用脂质体以及CaPO₄沉淀法。在一种可选方式中，逆转录病毒质粒载体可以被封装到脂质体中或者结合到脂质中，然后施用到宿主中。生产细胞系产生感染的逆转录病毒载体颗粒，其包括编码该多肽的核酸序列(或多种)。这类逆转录病毒载体颗粒然后可用于在体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码该多肽的核酸序列(或多种)。可被转导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。

在一些实施方式中，指导CR2-FH在眼睛中表达的基因输送载体被使用。用于基因输送给眼睛的载体在本领域中是已知的，并且已经公开在例如美国专利号6,943,153和美国专利申请公告号US20020194630、US20030129164、US200600627165中。

在一些实施方式中，补体激活通过在允许CR2-FH分子发挥抑制补体激活作用的条件下离体使体液接触包括CR2-FH分子的组合物而被抑制。合适的体液包括可返回到个体中的那些体液，诸如血液、血浆或淋巴。亲和吸附清除(Affinity adsorption apheresis)被一般性地描述在Nilsson等(1988)Blood58(1)：38-44；Christie等(1993)Transfusion 33：234-242；Richter等(1997)ASAIO J.43(1)：53-59；Suzuki等(1994)Autoimmunity 19：105-112；美国专利号5,733,254；Richter等(1993)Metabol.Clin.Exp.42：888-894和Wallukat等(1996)Int’lJ.Card.54：1910195中。

因此，本发明包括治疗个体中本文所述的一种或多种疾病的方法，其包括在允许CR2-FH分子发挥抑制补体激活作用的条件下在体外(extracoporeally)(即在身体外部或者离体(ex vivo))用包括CR2-FH分子的组合物处理个体的血液，并且将该血液返回到个体中。

单位剂量、制品及试剂盒

还提供的是CR2-FH分子组合物的单位剂型，每剂包含约0.01mg至约50mg的CR2-FH分子，其包括例如下列之一：约0.1mg至约50mg、约1mg至约50mg、约5mg至约40mg、约10mg至约20mg、或者约15mg的CR2-FH分子。在一些实施方式中，CR2-FH分子组合物的单位剂型包括大约下列任一：0.01mg-0.1mg、0.1mg-0.2mg、0.2mg-0.25mg、0.25mg-0.3mg、0.3mg-0.35mg、0.35mg-0.4mg、0.4mg-0.5mg、0.5mg-1.0mg、10mg-20mg、20mg-50mg、50mg-80mg、80mg-100mg、100mg-150mg、150mg-200mg、200mg-250mg、250mg-300mg、300mg-400mg或者400mg-500mg的CR2-FH分子。在一些实施方式中，单位剂型包括大约0.25mg CH2-FH分子。术语“单位剂型”是指对于个体而言适合作为单一剂量的物理上离散的单位，每一单位含有经计算产生期望治疗效果的预定量的活性物质以及合适的药物载体、稀释剂或赋形剂。这些单位剂型可以以单个或多个单位剂量储存在合适的包装中，并且还可进一步进行灭菌和密封。

还提供的是合适包装的、包括本文所述组合物的制品。本文所述组合物(诸如眼用组合物)的合适包装在本领域中是已知的，并且包括例如小瓶(诸如密封的小瓶)、容器、安瓿瓶、瓶子、罐、柔软包装(例如密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。这些制品可进一步进行灭菌和/或密封。

本发明还提供包括本文所述的组合物的试剂盒(或单位剂型和/或制品)并且可进一步包括关于使用该组合物的方法的说明(或多种)，诸如本文所述的使用。本文所述的试剂盒可进一步包括从商业和使用者观点上讲期望的其它物质，其包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器以及包装插件，带有进行本文所述任何方法的说明。实施例实施例1.CR2-FH分子和信号肽的示例性序列

图4-6提供本文所述的CR2-FH分子的示例性氨基酸序列(SEQ IDNOs：5-10)。“nnn”表示任选的连接体。

图7提供本文所述信号肽的示例性氨基酸序列((SEQ ID NOs：11和13)和编码所述信号肽的多核苷酸(SEQ ID NOs：12和14)。

图9提供小鼠CR2-FH融合蛋白(被称为CR2-fH或CR2NLFH)的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)和编码小鼠CR2-FH加上信号肽的多核苷酸(SEQ IDNO：18)。

图10提供CR2NLFHFH——不带连接体序列的含有CR2部分和两个FH部分的小鼠CR2-FH融合蛋白——的DNA序列(SEQ ID NO：19)。

图11提供CR2LFHFH——含有通过连接体序列连接到两个FH部分的CR2部分的小鼠CR2-FH融合蛋白——的DNA序列(SEQ ID NO：20)。

图20提供人类CR2-FH融合蛋白(被称为人类CR2-fH或CR2fH)的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)和编码人类CR2-fH加上信号序列的多核苷酸(SEQID NO：22)。

图21提供含有两个FH部分的人类CR2-FH融合蛋白(被称为人类CR2-FH2或CR2fH2或人类CR2fH2)的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)和编码人类CR2-FH2加上信号肽的多核苷酸(SEQ ID NO：24)。实施例2.通过CR2-FH体外抑制旁路途径

包含CR2的前四个SCR结构域和FH的前五个SCR结构域的小鼠融合蛋白(带有连接体(CR2LFH))或不带有连接体(CR2NLFH或CR2-fH))通过重组DNA克隆和基因表达方法制备。CR2-FH融合蛋白之一的序列被提供在图9中。SEQ ID NO：17是CR2-FH融合蛋白的多肽序列。SED ID NO：18是用于编码融合蛋白以及信号肽N-末端的信号肽的核苷酸。

还制备了含有CR2的前四个SCR结构域和两个串联连接的FH部分(每个包含FH的前五个SCR结构域)的小鼠CR2-FH融合蛋白(被称为CR2LFHFH、CR2-fH2或CR2-fHH)。CR2部分和第一FH部分是通过连接体序列连接的。CR2LFHFH的DNA序列(包括编码该信号肽的DNA)被提供在图11中(SEQ ID NO：20)。

激活旁路途径的体外试验如Quigg等，J.Immunol.1998，160(9)：4553-60中基本描述的进行。H因子(fH)或CR2-Crry在试验中被用作对照。具体而言，在10ml的0.15M NaCl中的50mg酵母聚糖珠通过煮沸60分钟来激活，并且在PBS中洗涤两次。在每个反应混合物中加入：1)10mM EGTA和5MM MgCl₂(最终浓度)；2)1×10⁷珠；3)10mM EDTA(阴性对照1)或HIC血清(阴性对照2)或者增加CR2-FH融合蛋白或对照蛋白之一的浓度；4)10μl血清；和5)将总体积调至100μl的PBS。该混合物在37℃下温育20分钟，并且反应通过加入10mM EDTA(最终浓度)而停止。该珠用冷的PBSB(含有1％BSA的PBS)洗涤两次，并且用FTIC结合的羊抗C3的抗体在冰上温育一小时。样品然后在PBSB中洗涤两次，用1％的低聚甲醛重新悬浮并且在流式细胞仪下进行分析。

图12A提供采用小鼠CR2-FH融合蛋白(CR2-fH)和单独的H因子(fH)在体外酵母聚糖补体实验中获得的数据的图形表示。如该图所示，CR2-fH在抑制补体激活方面显著比FH更有效。图12B提供采用小鼠FH的前五个SCR结构域(FH15)和小鼠CR2的前四个结构域(CR2)在体外酵母聚糖补体实验中获得的数据的图示。小鼠FH的前五个SCR结构域具有250nM的EC50，其近似等于血清中FH的量。具有CR2的前四个结构域的分子根本没有抑制作用。这些数据证明CR2-FH所看到的作用是由于该分子两部分的联合作用，而不是各部分的独立的功能。

图13提供采用小鼠的带有连接体的CR2-FH融合蛋白(CR2LFH)、不带连接体的CR2-FH融合蛋白(CR2NLFH)、带有连接体的CR2-FH-FH(CR2LFHFH)和CR2-Crry在体外酵母聚糖补体实验中获得的数据的图示。如该图所示，CR2-FH在抑制旁路途径的补体激活方面比CR2-Crry更有效。CR2LFH和CR2NLFH在抑制旁路途径的补体激活方面同等有效。CR2LFHFH比CR2LFH和CR2NLFH有效得更多。实施例3.通过CR2-FH治疗肠缺血和再灌注损伤

该试验显示在小鼠模型中治疗肠缺血和再灌注损伤。

肠缺血再灌注损伤。三只8周龄且体重20-25g的成年雄性小鼠通过腹腔注射用10mg/kg氯胺酮和6mg/kg甲苯噻嗪进行麻醉。动物自然呼吸并且整个试验采用加热垫保持体温。进行中间剖腹术(medial laparotomy)并且将肠小心移动以允许接近肠系膜上动脉。肠系膜上动脉用显微手术夹钳(Fine Instruments，USA)夹住。缺血通过小肠的palor证实。假治疗的小鼠经历剖腹术，而没有夹住肠系膜上动脉。30分钟缺血后，去除动脉夹允许肠系膜脉管系统再灌注。动物采用6.0爱惜邦缝合线(ethicon suture)进行缝合并且让其再灌注2小时。再灌注30分钟后经静脉注射施用0.1mg或0.05mg CR2-fH或对照(PBS)，并且在总共2小时的再灌注之后90分钟将动物处死。

组织学。用于组织染色的组织样品取自肠，并且在4℃下固定在10％福尔马林中过夜并且随后处理到石蜡中，或者在液氮中冷冻，进行免疫荧光分析。来自每个动物的肠切片用苏木精和伊红进行染色，并且对粘膜损伤和绒毛重量进行打分，如前所述(46)。简单地说，0分定为正常绒毛；末端畸变的绒毛为1分；缺乏杯状细胞并且含有Gugenheims空间的绒毛为2分；上皮细胞鳞片状碎裂的绒毛为3分；固有层暴露但完整且上皮细胞脱落的绒毛为4分；固有层渗出的绒毛为5分；并且，最后，呈现出血的绒毛或者脱落的绒毛为6分。所有的组织学评价是以盲式的方式进行的。

试验结果显示在图14A中。如该图所示，在施用过量的CR2-fH的情况下，即使对照动物具有正常水平的循环内源H因子(大约0.5mg/ml)，0.1mg和0.05mg的CR2-fH在动物模型中相比对照动物都显示出保护作用。实施例3.1.通过小鼠CR2-FH治疗肠缺血和再灌注损伤

该试验基本上如实施例3中所公开的进行。

简单地说，0.05mg、0.1mg或0.2mg小鼠CR2-fH或小鼠CR2-fH2(CR2-fHH)在再灌注30分钟后静脉内施用，并且在90分钟后将动物杀死进行组织学分析。试验结果显示在图14B中。如图14B所示，小鼠CR2-fH和小鼠CR2-fHH保护肠免于补体介导的缺血再灌注损伤。实施例3.2.通过小鼠CR2-FH治疗肠缺血和再灌注损伤

该试验显示小鼠CR2-fH和CR2-fH2对补体旁路和肠缺血再灌注的作用。试验基本上如上述进行。

体外试验证明小鼠CR2-fH在抑制补体的旁路途径方面比CR2-Crry显著更有效，并且小鼠CR2-fH2比小鼠CR2-fH的有效性大2倍。小鼠CR2-fH的补体抑制活性依赖于CR2-介导的靶向，如抗CR2抗体阻断试验所证实。此外，纯化的小鼠H因子在体外试验中仅具有最低的补体抑制活性。

在肠缺血和再灌注损伤后，小鼠CR2-fH和小鼠CR2-fH2靶向局部和远程(肺)补体激活位点，并且两种蛋白质以低剂量和剂量依赖性方式保护肠粘膜和肺实质组织免于损伤。尽管小鼠CR2-fH2在体外是比小鼠CR2-fH更有效的补体旁路抑制剂，但是这两种蛋白质在体内模型中的保护作用没有差别。与CR2-Crry相比，为了提供对局部损伤同等的保护，需高近似2倍剂量的小鼠CR2-fH。实施例4.通过小鼠CR2-FH治疗肾缺血再灌注

该实施例表明CR2-FH对肾缺血再灌注的作用。

诱导缺血性ARF的方法。体重20-25克的小鼠用腹腔内注射的300μl2，2，2-三溴乙醇(Sigma-Aldrich)进行麻醉。小鼠麻醉后，将它们置于加热垫上以在手术期间保持它们的体温。然后进行剖腹术，并且肾蒂通过钝器解剖进行定位和分离。该蒂用手术夹钳(Miltex Instrument Company，Inc.)夹住，并且血流阻断通过眼睛观察肾进行确认。夹钳在合适的位置停留24分钟然后被松开。选择缺血时间以获得具有最小血管血栓形成的缺血性ARF的可逆模型以及避免动物死亡。观察肾大约1分钟以确保血液回流。再灌注15分钟后，小鼠腹腔内接受0.25mg小鼠CR2-fH(CR2NLFH)。筋膜和皮肤用4-0丝线(United States Surgical)进行缝合。小鼠用0.5ml标准盐水容量复苏，并且被保持在29℃的恒温箱中以维持体温。

24小时再灌注后，小鼠被麻醉，并且通过心脏穿刺采血。进行剖腹术并且获得肾。该研究方法被科罗拉多州立大学健康科学中心动物护理和使用委员会(University of Colorado Health Sciences Center Animal Care and UseCommittee)批准。

血清尿素氮测量。血清尿素氮通过贝克曼自动分析仪(BeckmanAutoanalyzer，Beckman)对每只小鼠进行测定。结果显示在图15A中。如该图所示，血清尿素氮在小鼠CR2-fH治疗的动物中减少，这表明肾机能被保持。

肾形态学。在肾从小鼠中移取后，矢状切面被固定在4％低聚甲醛中。包埋在石蜡中后，4μm切片被切下并且用过碘酸希夫进行染色。切片由肾脏病理学者以盲式的方式进行评价。对皮质和外部髓质的外部条纹的上皮坏死、刷状缘的损失、管扩张以及脱落物形成进行评价。对每个载玻片观察了至少10个视野(400×)，并确定呈现这些发现的小管的百分数。基于受影响的小管的百分数如下对肾切片进行打分：0，没有；1，＜10％；2，11-25％；3，26-45％；4，46-75％；5，＞75％。试验结果显示在图15B中。如该图所示，在动物模型中CR2-fH相比对照动物显示出保护作用。

免疫荧光。对于免疫荧光来说，肾的矢状切面在OCT化合物(SakuraFinetek)中骤冷。4μm切片用低温恒温器切下并且储存在-70℃下。载玻片随后用丙酮固定，并且与小鼠C3的FITC结合抗体(Cappel)温育。与该抗体在室温下杂交一小时后，载玻片用苏木精(Vector Laboratories，Inc.)复染色。试验结果显示在图15C和15D中。如该图所示，相对于小鼠CR2-fH治疗的小鼠(15D)，更多的C3沉积到假治疗的小鼠(15C)的肾上。实施例5.通过CR2-FH治疗年龄相关性黄斑变性

暴露于恒定光的大白鼠用作年龄相关性黄斑变性(干型AMD)的动物模型。从持续光暴露开始前那一天第一次注射起，每隔一天(第-1、1、3、5、7天)在麻醉下用CR2-FH融合蛋白(1μl的4.3mg/ml贮存液)给五至八只动物眼内注射。一只眼睛作为试验，同时另一只眼睛作为PBS注射的对照眼睛。在第8天测试动物的ERG，并且将该动物实施安乐死以进行组织学和PCR分析。注射有CR2-FH的眼睛中光感受器的排数与PBS对照眼睛相比较。

用下列三个参数测量CR2-FH的作用：机能活性(ERG和DC潜能，即光感受器和RPE应答)、组织学和炎症测定(例如通过RT-PCR的基因表达以及通过免疫组织化学的蛋白质表达)。

在第二动物模型(湿型AMD)中，我们测试除去补体激活剂是否减少脉络膜新血管形成(CNV)。使用氦激光器(200mW，50μm，0.05sec)在五至八只鼠中产生CNV，并且在注射荧光素后记录在脉络膜平铺片(choroidalflatmounts)中。

采用下列四个参数测量CR2-FH的作用：机能活性(ERG和DC潜能，即光感受器和RPE应答)、组织学、血管完整性(在注射荧光素后脉络膜平铺片)和炎症测定(例如通过RT-PCR的基因表达以及通过免疫组织化学的蛋白质表达)。实施例6.小鼠CR2-FH导致的CNV容量减少

对于CNV的产生来说，3月大的动物用甲苯噻嗪和氯胺酮(分别为20和80mg/kg)进行麻醉，并且瞳孔用一滴盐酸去氧肾上腺素(2.5％)和硫酸阿托品(1％)扩大。氩激光光凝术(532nm，光斑尺寸50μm，持续时间0.05s，250mW)用于借助手提式盖玻片作为接触镜(contact lens)在每个眼睛中的视神经周围产生四个激光斑点。在激光斑点上形成的泡沫表明布鲁赫氏膜的破裂。Nozaki等，Proc.Natl.Acad.Sci.2006，103(7)：2328-33。

对于CNV损坏的评价，CNV大小在用同工凝集素B(其在内皮细胞的表面上结合于末端β-D-半乳糖残基并且选择性地标记小鼠血管系统)染色的RPE/脉络膜的平铺片制备物中进行测定。采用共聚焦显微术在2μm切片上获取的荧光测量被用于大小测定。简而言之，全部试验采用相同的激光强度设置获得整个CNV损坏的Z堆积图像。对于每个切片，测定总荧光并相对于深度进行绘图。

对于视网膜电描记术，动物用甲苯噻嗪(20mg/kg体重)和氯胺酮(80mg/kg体重)进行麻醉。瞳孔用一滴盐酸去氧肾上腺素(2.5％)和托吡卡胺(1％)进行扩大。体温通过保持在37℃的DC驱动的加热垫进行稳定。所用的ERG设置先前由Rohrer等，J.Neurosci.，1999，19(20)：8919-30描述，并且根据Lyubarsky和Pugh Lyubarsky等，J.Neurosci.，1996，16(2)：563-571构建。刺激光强度采用中性密度过滤器进行控制。刺激范例。让动物暗适应过夜并且将记录ERG。分析视网膜杆(Rods)对增加光强度的单闪光刺激的应答。单闪光应答是平均至少三次闪光，其中刺激间时间间隔(ISI)为15s至2min(分别从最低强度至最高)。不同的ISI保证第一次和最后一次闪光之间给定强度下的ERG振幅是相同的。数据分析。对于所有ERG记录，a-波振幅是从基线至波谷测量；b-波振幅是从a-波波谷或基线至b波的波峰测量；并且内隐时间(implicit times)从刺激开始至a-波波谷或b-波波峰测量。

在一个试验中，小鼠在激光烧伤后30分钟，在激光烧伤后48小时以及在激光烧伤后6小时用静脉小鼠CR2-fH(250μg)进行治疗。激光烧伤后6天，评价视网膜机能，然后将小鼠实施安乐死进行组织学分析。

图16显示在用或没用CR2-fH治疗的小鼠中a-和b-波视网膜应答。如图16所示，相对于PBS治疗，视网膜应答的a-和b-波被CR2-fH治疗行保护。图17A和17B显示激光烧伤后6天损伤的同工凝集素-b染色。图17C显示基于同工凝集素-b染色损伤大小的量化。如图17A-C所示，与用PBS治疗的动物相比，用CR2-fH治疗的小鼠表现出损伤大小的显著降低。

在独立的试验中，在激光烧伤后立刻、烧伤后48小时以及烧伤后96小时，将1μg小鼠CR2-fH眼内给药。在第6天收集眼睛用于组织学分析。通过同工凝集素-b染色目测损伤。结果显示在图18中。图18A和18B显示激光烧伤后6天损伤的同工凝集素-b染色。图18C显示基于同工凝集素-b染色损坏大小的量化。如图18A-C所示，与用PBS治疗的动物相比，直接施用于眼睛的CR2-fH降低了损坏的蔓延。实施例7.通过小鼠CR2-FH延迟在小鼠异位心脏移植模型中抗体介导的排斥的发作

在该试验中，心脏从C3H供体小鼠异位移植到Balb/c受体小鼠中。这种品系(strain)组合促进TH2免疫表型，其促进急性血管排斥，并且特征在于抗移植物抗体产生以及补体激活片段的移植物沉积。

受体小鼠如下治疗：1)静脉注射(i.v.)PBS；2)再灌注之后30分钟，静脉注射单一0.25mg剂量的小鼠CR2-fH；和3)静脉注射多剂量的0.25mg小鼠CR2-fH，从再灌注后30分钟开始，然后每三天一次。

再灌注后24小时收获心脏进行分析。小鼠CR2-fH治疗的动物被保护免于缺血和再灌注损伤，如通过组织学、不存在C3、嗜中性粒细胞浸润的减少以及炎症细胞因子的减少评价。

小鼠CR2-fH对急性血管排斥的作用显示在图21中。如该图所示，相比11.1±1.6天(单剂量组)和10.7±1.3天(多剂量组)，对照心脏移植受者存活7.1±1天。当与对照比较时，用小鼠CR2-fH治疗的小鼠的存活率有显著提高(p＝0.02)。

在收获时任意组之间病理排斥特性或者抗供体的抗体水平方面没有明显差别。令人感兴趣的是，当与单剂量组比较时，与施用多剂量小鼠CR2-fH相关的存活率似乎没有明显提高(p＜0.05)。实施例8.通过人类CR2-FH抑制补体旁路

不包括信号肽的人类CR2-FH(SEQ ID NO：21，也被称为CR2fH)和人类CR2-FH2(SEQ ID NO：23，也被称为CR2fH2)的蛋白质序列分别显示在图20和21中。包括信号肽的核苷酸序列的人类CR2-FH(SEQ ID NO：22)和人类CR2-FH2(SEQ ID NO：24)的核酸序列分别显示在图20和21中。

人类CR2-FH和人类CR2-FH2通过利用HB5-琼脂糖(HB5-separose)的亲和层析从转染的293细胞上清夜中提纯，HB5-琼脂糖包含连接于CNBr-激活的琼脂糖(Amershan Biosciences)的抗人类CR2单克隆抗体HB5(ATCC目录号HB-135)。粗制CR2-FH或CR2-FH2上清液在基质上穿过，用PBS洗涤，并且在0.1M盐酸甘氨酸，pH 3.0中洗脱。洗脱的馏分通过加入1M Tris-Cl，pH 9.0立即中和，接着采用centricon柱(Millipore)交换到PBS中。300ng非还原的、提纯的CR2-FH和CR2-FH2溶解在SDS-PAGE上并且通过考马斯(Commassie)染色进行目测。如通过质谱(Alphalyse，Palo Alto，CA)测定，CR2-FH呈现为64.0和65.3kDa的两个截然不同的蛋白质，其脱糖基化后分辨为单一条带，而CR2-FH2是99.2kDa的单一种类。在非还原状态下，这些分子的固有二级结构比其实际分子量小。

人类CR2-FH和人类CR2-FH2对旁路途径特异性C3b在酵母聚糖颗粒上的沉积的作用显示在图22A中。简单地说，酵母聚糖颗粒在室温下与FITC结合的羊抗-人类C3抗体在含有5mM Mg²⁺、10mM EGTA、10％人类血清和增加浓度的CR2-FH和CR2-FH2的PBS中温育30分钟。酵母聚糖被造粒并且洗涤，接着FACS分析。如图24A所示，CR2-FH和CR2-FH2两者都抑制补体旁路的激活。通过用小鼠血清温育，接着用FITC结合的羊抗-小鼠C3抗体检测，获得类似的结果。值得注目地，在试验系统中存在200-400nM FH。CR2-FH的EC50为8-22nM，其比在该试验中存在的FH的量低20倍，这证明相比内源性FH，靶向的FH具有明显的益处。

人类CR2-FH和人类CR2-FH2对旁路途径介导的红细胞裂解的作用显示在图22B中。简单地说，兔红细胞(1×10⁸)在37℃下在1×GVB++(BostonBioProducts)和17％人类血清中用不同浓度的CR2-FH或CR2-FH2温育30分钟。该反应通过加入十分之一体积的冷PBS而停止，接着将未裂解的红细胞离心沉淀。通过测量OD_415nm量化溶血。如图24B所示，CR2-FH和CR2-FH2两者都显著抑制了补体旁路的激活。值得注目地，在试验中存在340-680nM FH。CR2-FH的EC50为20-30nM，其比在该试验中存在的FH的量低15-20倍，这证明相比内源性FH，靶向的FH具有明显的益处。实施例9.通过小鼠CR2-FH抑制补体旁路

该实施例表明采用缺乏经典途径的小鼠的血清通过小鼠CR2-FH对补体旁路的抑制。

使用的是利用胶原-抗胶原抗体的免疫复合体在板上进行的ELISA试验。C3沉积/激活通过在来自野生型或来自C4-/C4-小鼠的血清存在下采用抗-C3b抗体进行测量。不同量的全长小鼠FH(2μg/10μl)、小鼠CR2的前四个SCR结构域(2μg/10μl)，以及小鼠CR2-FH(2μg/10μl)加入到血清中。体外试验的结果显示在图23中。如该图所示，采用来自野生型小鼠的血清，小鼠CR2-FH对C3b沉积几乎没有影响。通过比较，小鼠CR2-FH几乎完全防止在来自经典途径缺乏的小鼠的血清中C3b沉积。另一方面，小鼠FH或小鼠CR2在两种试验系统中几乎没有影响。该试验证明，尤其当没有涉及经典补体途径时，采用CR2-FH来抑制补体旁路途径具有明显的益处。

为了进一步证实采用CR2-FH所观察到的C3b沉积的抑制是由于补体旁路的抑制所致，我们研究了在不存在经典途径(C4-/C4-小鼠)下CR2-FH对C3b沉积的作用。钙抑制了凝集素补体途径。图24显示了采用来自C4-/C4-基因敲除小鼠的血清，小鼠CR2-FH在钙足量缓冲液中的滴定曲线。如该图所示，在0.5μg/μl浓度下CR2-FH明显抑制C3b沉积。

尽管为了清楚理解的目的，前述发明已经通过说明和实施例的方式被详细地描述，进行某些微小的变化和修饰对本领域技术人员来说是明显的。因此，说明和实施例不应当理解为对本发明范围的限制。

Claims (21)

1.补体受体2(CR2)-因子H(FH)分子，其包括：

a)包含CR2或其片段的CR2部分，和

b)包含FH或其片段的FH部分，所述FH或其片段包括FH的至少前四个N-末端短同源重复序列(SCR)结构域，

其中所述CR2-FH分子的CR2部分能结合CR2配体，

其中所述CR2-FH分子的FH部分能抑制旁路途径的补体激活；并且

其中所述CR2部分包括CR2的至少前两个N-末端SCR结构域。

2.权利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括CR2的至少前四个N-末端SCR结构域。

3.权利要求1的CR2-FH分子，其中所述FH部分包括FH的至少前五个N-末端SCR结构域。

4.权利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2-FH分子包括两个或更多个FH部分，其中所述两个或多个FH部分的每个包括FH或其片段，其包括FH的至少前四个N-末端SCR结构域。

5.权利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括CR2的前四个N-末端SCR结构域，并且所述FH部分包括FH的前五个N-末端SCR结构域。

6.权利要求5的CR2-FH分子，其中所述CR2部分包括SEQ ID NO：1的氨基酸23至271，并且所述FH部分包括SEQ ID NO：2的氨基酸21至320。

7.权利要求1的CR2-FH分子，其中所述CR2-FH分子是融合蛋白。

8.多核苷酸，其编码权利要求7所述的融合蛋白。

9.载体，其编码权利要求8所述的多核苷酸。

10.宿主细胞，其包含权利要求9所述的多核苷酸。

11.药物组合物，其包括权利要求1的CR2-FH分子和药学上可接受的载体。

12.权利要求11的组合物，其中所述组合物适于眼内、静脉内、动脉内、皮下、气管内或吸入给药。

13.权利要求11所述的药物组合物在制备用于治疗在个体中涉及补体旁路的疾病的药物中的应用。

14.权利要求13的应用，其中所述涉及补体旁路的疾病是炎性疾病或自身免疫疾病。

15.权利要求13的应用，其中所述涉及补体旁路的疾病是年龄相关性黄斑变性。

16.权利要求13的应用，其中所述涉及补体旁路的疾病是缺血再灌注。

17.权利要求13的应用，其中所述涉及补体旁路的疾病是器官移植排斥。

18.权利要求11所述的药物组合物在制备用于治疗患有涉及补体旁路的疾病的个体的药物中的应用，其中所述疾病的特征在于包括微血管病性溶血性贫血、血小板减少症以及急性肾衰竭的症状。

19.权利要求13的应用，其中所述涉及补体旁路的疾病选自黄斑变性、缺血再灌注、器官移植排斥、玻璃疣相关疾病、妊娠相关性疾病、药物不良反应、和心肺转流后并发症。

20.权利要求13的应用，其中所述涉及补体旁路的疾病选自年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎、膜增殖性肾小球肾炎II型(MPGN II)、溶血性尿毒综合症(HUS)、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、中风、心肌梗塞、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、败血症、烧伤、与心肺转流和血液透析相关的炎症、血浆去除术、血小板分离、白细胞分离法、体外膜氧合(ECMO)、肝素诱导的体外LDL沉淀法(HELP)和放射造影剂诱导的过敏反应。

21.权利要求20的应用，其中所述HUS是因子H相关的。

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