BRPI0712987A2

BRPI0712987A2 - tratamento de doenças direcionado ao fator h do complemento

Info

Publication number: BRPI0712987A2
Application number: BRPI0712987-4A
Authority: BR
Inventors: Gary Gilkeson; Stephe Tomlinson; V Michael Holers; Baerbel Rohrer
Original assignee: Musc Found For Res Dev
Priority date: 2006-06-21
Filing date: 2007-06-21
Publication date: 2012-04-10
Also published as: AU2007261315B2; CN101563363A; WO2007149567A3; EP2044111B1; CN101563363B; CA2656063C; JP2009540831A; PT2044111E; JP5250548B2; WO2007149567A2; ES2523640T3; US20140073572A1; HK1206368A1; CA2656063A1; EP2826788A1; SI2044111T1; EP2044111A2; US8569225B2; DK2044111T3; PL2044111T3

Abstract

TRATAMENTO DE DOENçAS DIRECIONADO AO FATOR H DO COMPLEMENTO.A invenção fornece uma molécula de CR2-FH que ompreende uma porção CR2 que compreende proteína 0R2 ou um fragmento desta e uma porção FH que compreende uma proteína do fator H ou um fragmento desta, e composições farmacêuticas que compreendem uma molécula de CR2-FH. Também são fornecidos métodos de utilização das composições para o tratamento de doenças nas quais a via alternativa do complemento está implicada como, por exemplo, degeneração macular relacionada à idade, artrite reumatóide e re- perfusão de isquemia.

Description

TRATAMENTO DE DOENÇAS DIRECIONADO AO FATOR H DO COMPLEMENTO PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o beneficio de prioridade para o pedido de patente provisório N0 60/815.748, depositado em 21 de junho de 2006, cujo conteúdo é incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

Este pedido está relacionado às composições e aos métodos de tratamento de doenças nas quais a via alternativa do complemento está implicada. Especificamente, o pedido está relacionado a uma molécula de CR2-FH e aos usos desta para o tratamento de doenças nas quais a via alternativa do complemento está implicada.

DECLARAÇÃO EM RELAÇÃO ÀS PESQUISAS OU AO DESENVOLVIMENTO COM APOIO FEDERAL

Esta invenção foi feita com apoio governamental sob as Subvenções (Contratos) Nos: AI47469, AI31105 e EY13520 concedidas pelo "National Institutes of Health".

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Complemento é o termo coletivo para uma série de proteínas sangüíneas e é um mecanismo efetor importante do sistema imunológico. 0 complemento tem uma participação importante na patologia de muitas doenças autoimunes, inflamatórias e isquêmicas, e também é responsável por muitos estados de doença associados à bioincompatibilidade. A ativação do complemento inadequada e sua deposição nas células hospedeiras podem levar à lise celular mediada pelo complemento de estruturas-alvo, bem como à destruição tecidual por causa da geração de potentes mediadores da inflamação. O complemento pode ser ativado por uma das três vias, as via clássica, de lectina e a via alternativa. A via clássica é ativada por meio da ligação da proteína do sistema complemento Clq aos complexos antígeno-anticorpo, pentraxinas ou células apoptóticas. As pentraxinas incluem proteína C-reativa e o componente P do amilóide sérico. A via da lectina é iniciada por sacarídeos microbianos por meio da lectina de ligação de manose. A via alternativa é ativada nas superfícies de patógenos que possuem características de carga neutra ou positiva e que não expressam ou contêm inibidores do complemento. Isso ocorre em função do processo denominado "tickover" de C3 que ocorre espontaneamente, que envolve a interação de C3 conformacionalmente alterado com fator B, e resulta na fixação de C3b ativo em patógenos ou em outras superfícies. A via alternativa também pode ser iniciada quando certos anticorpos bloqueiam mecanismos reguladores endógenos, por complexos imunes que contêm IgA, ou quando a expressão de proteínas reguladoras de complemento está diminuída. Além disso, a via alternativa é ativada por um mecanismo denominado "círculo de amplificação", quando C3b que está depositado nos alvos por meio da via clássica ou da lectina se liga então ao fator B (Muller-Eberhard, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:321). Por exemplo, Holers e colaboradores demonstraram que a via alternativa é amplificada em locais de lesão local quando células inflamatórias são recrutadas após ativação do complemento inicial (Girardi e cols., J. Clin. Invest. 2003, 112: 1.644). Ocorre então uma amplificação dramática do complemento por meio da via alternativa através de um mecanismo que envolve a geração adicional de células lesadas que fixam complemento, síntese local de componentes da via alternativa ou, mais provavelmente, por causa das células inflamatórias infiltrantes que carregam ativação acentuadamente aumentada de C3 pré-formado e properdina especificamente naquele local.

A ativação da via alternativa é iniciada quando o fator B circulante se liga ao C3 ativado. Esse complexo é então clivado por fator D circulante para gerar um fragmento enzimaticamente ativo, C3bBb. C3bBb cliva C3 gerando C3b, que dirige a inflamação e também amplifica ainda mais o processo de ativação, gerando um círculo de feedback positivo. O Fator H (FH) é um regulador crucial (inibidor) da via alternativa do complemento. Ele funciona por competição com o fator B pela ligação ao C3b. A ligação de C3b ao Fator H também leva à degradação de C3b pelo fator I na forma inativa C3bi (também designado iC3b) exercendo, dessa forma, uma verificação adicional sobre a ativação do complemento. A concentração plasmática real do fator H é de aproximadamente 50 0 μ9/πι1, fornecendo regulação do complemento na fase líquida, mas sua ligação às células é um fenômeno regulado que é aumentado pela presença de uma superfície carregada negativamente, bem como por C3b, C3bi ou C3d fixado (Jozsi e cols. , Histopathol. (2004) 19: 251- 258).

Foi demonstrado que a infra-regulação da ativação do complemento é eficaz no tratamento de várias indicações de doença em modelos animais e em estudos ex vivo, por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico e glomerulonefrite (Y. Wang e cols., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8.563- 8.568), artrite reumatóide (Y. Wang e cols., Proc. Natl. Acad. Sci., 1995; 92: 8.955-8.959), derivação cardiopulmonar (bypass) e hemodiálise (C.S. Rinder, J. Clin. Invest., 1995; 96: 1.564-1.572), rejeição hiperaguda em transplante de órgãos (T.J. Kroshus e cols., Transplantation, 1995; 60: 1.194-1.202), infarto do miocárdio (J.W. Homeister e cols., J. Immunol., 1993; 150: 1.055-1.064; H. F. Weisman e cols., Science, 1990; 249: 146- 151), lesão de re-perfusão (E.A. Amsterdam e cols., Am. J. Physiol., 1995; 268: H448-H457) e sxndrome do sofrimento respiratório do adulto (R. Rabinovici e cols., J. Immunol., 1992; 149: 1.744-1.750). Além disso, outras condições inflamatórias e doenças autoimunes/de complexo imune também estão intimamente associadas à ativação do complemento (B.P. Morgan. Eur. J. Clin. Invest., 1994: 24: 219-228), incluindo lesão térmica, asma grave, choque anafilático, inflamação do intestino, urticária, angioedema, vasculite, esclerose múltipla, miastenia gravis, glomerulonefrite membrano-proliferativa e sxndrome de Sjõgren. Inibidores do complemento e seus usos também são revelados em WO 04/045520 e Patente U.S. N0 6.521.450.

As revelações de todas as publicações, patentes, pedidos de patente e pedidos de patente publicados aqui citados são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção, em um aspecto, fornece uma molécula de CR2-FH que compreende:

a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecida uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste, em que a molécula de CR2-FH é capaz de se ligar a um ligante de CR2 e em que a molécula de CR2-FH é capaz de inibir a ativação do complemento da via alternativa. Em algumas modalidades, é fornecida uma molécula isolada de CR2-FH. Em algumas modalidades, é fornecida uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) que compreende uma molécula de CR2-FH. Em algumas modalidades, a porção CR2 e a porção FH estão fundidas direta ou indiretamente entre elas na forma de uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, a porção CR2 e a porção FH estão ligadas por meio de um reticulante químico. Em algumas modalidades, a porção CR2 e a porção FH estão ligadas não covalentemente.

Em algumas modalidades, é fornecida uma proteína de fusão de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecida uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste, em que a molécula de CR2-FH é capaz de se ligar a um ligante de CR2 e em que a molécula de CR2-FH é capaz de inibir a ativação do complemento da via alternativa. Em algumas modalidades, a porção CR2 e a porção FH estão fundidas diretamente (ou seja, ligadas) entre elas. Em algumas modalidades, a porção CR2 e a porção FH estão ligadas por meio de uma seqüência de aminoácidos vinculadora. Em algumas modalidades, o terminal C da porção CR2 está ligado (direta ou indiretamente) ao terminal N da porção FH. Em algumas modalidades, o terminal N da porção CR2 está ligado (direta ou indiretamente) ao terminal C da porção FH.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH compreende duas ou mais (por exemplo, qualquer um de duas, três, quatro, cinco ou mais) porções CR2. Essas porções CR2 podem ser as mesmas ou diferentes, por exemplo, em termos de seqüências de aminoácidos, estruturas e/ou funções. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende: 1) duas ou mais porções CR2 que compreendem uma CR2 ou um fragmento desta, e 2) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende: 1) duas ou mais porções CR2 que compreendem uma CR2 ou um fragmento desta, e 2) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste, em que a molécula de CR2-FH é capaz de se ligar a um ligante de CR2 e em que a molécula de CR2-FH é capaz de inibir a ativação do complemento da via alternativa.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH compreende duas ou mais (por exemplo, qualquer uma de duas, três, quatro, cinco ou mais) porções FH. Essas porções FH podem ser as mesmas ou diferentes, por exemplo, em termos de seqüências de aminoácidos, estruturas e/ou funções. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende: 1) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e 2) duas ou mais porções FH que compreendem um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende: 1) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e 2) duas ou mais (por exemplo, duas) porções FH que compreendem um FH ou um fragmento deste, em que a molécula de CR2-FH é capaz de se ligar a um ligante de CR2 e em que a molécula de CR2-FH é capaz de inibir a ativação do complemento da via alternativa.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende: 1) duas ou mais porções CR2 que compreendem uma CR2 ou um fragmento desta, e 2) duas ou mais porções FH que compreendem um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende: 1) duas ou mais porções CR2 que compreendem uma CR2 ou um fragmento desta, e 2) duas ou mais (por exemplo, duas) porções FH que compreendem um FH ou um fragmento deste, em que a molécula de CR2-FH é capaz de se ligar a um ligante de CR2 e em que a molécula de CR2-FH é capaz de inibir a ativação do complemento da via alternativa.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende: 1) CR2 de comprimento total; e 2) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende: 1) um fragmento de CR2, e 2) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende: 1) uma porção CR2 que compreende pelo menos os primeiros dois domínios SCR do terminal N de CR2, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende: 1) uma porção CR2 que compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de CR2, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é capaz de se ligar a um ligante de CR2 e de inibir a ativação do complemento da via alternativa. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH compreende duas ou mais porções FH. Em algumas modalidades, a porção FH compreende um FH de comprimento total. Em algumas modalidades, a porção FH compreende um fragmento de FH. Em algumas modalidades, a porção FH compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a porção FH compreende pelo menos os primeiros cinco domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a porção FH é desprovida de um sítio de ligação de heparina. Em algumas modalidades, a porção FH compreende um FH ou um fragmento deste que possui um polimorfismo que é protetor contra degeneração macular relacionada à idade.

Em algumas modalidades, é fornecida uma molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) que compreende: a) uma porção CR2 que compreende um sítio de ligação de ligante que é qualquer um de (e, em algumas modalidades, é selecionado do grupo que consiste em) (1) um sítio na fita Bea alça B-C de SCR de CR2 que compreende o segmento G98-G99-Y100-KlOl-1102-R103-G104-S105-T106-P107- Υ108 com relação ao ID. DE SEQ. N°: 1, (2) um sítio na fita B de SCR2 de CR2 que compreende a posição K119 com relação ao ID. DE SEQ. N°: 1, (3) um segmento que compreende V149- F150-P151-L152 com relação ao ID. DE SEQ. N°: 1, e (4) um segmento de SCR2 de CR2 que compreende T120-N121-F122 com relação ao ID. DE SEQ. N°: 1; e (b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é capaz de se ligar a um ligante de CR2 e de inibir a ativação do complemento da via alternativa. Em algumas modalidades, a porção CR2 ainda compreende seqüências necessárias para manter a estrutura tridimensional do sítio de ligação de ligante. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH compreende duas ou mais porções FH. Em algumas modalidades, a porção FH compreende um FH de comprimento total. Em algumas modalidades, a porção FH compreende um fragmento de FH. Em algumas modalidades, a porção FH compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a porção FH compreende pelo menos os primeiros cinco domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a porção FH é desprovida de um sítio de ligação de heparina. Em algumas modalidades, a porção FH compreende um FH ou um fragmento deste que possui um polimorfismo que é protetor contra degeneração macular relacionada à idade.

Em algumas modalidades, é fornecida uma molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) que compreende: a) uma porção CR2 que compreende pelo menos os primeiros dois domínios SCR do terminal N de CR2, e b) uma porção FH que compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é capaz de se ligar a um ligante de CR2 e de inibir a ativação do complemento da via alternativa. Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende pelo menos os primeiros 3, 4, 5, 6, 7 ou mais domínios SCR do terminal N de CR2. Em algumas modalidades, a porção FH compreende pelo menos os primeiros 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende (e, em algumas modalidades, consiste em ou consiste basicamente em) : a) uma porção CR2 que compreende os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de CR2, e b) uma porção FH que compreende os primeiros cinco domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende (e, em algumas modalidades, consiste em ou consiste basicamente em): a) uma porção CR2 que compreende os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de CR2, e b) duas ou mais (por exemplo, duas) porções FH que compreendem os primeiros cinco domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH compreende (e, em algumas modalidades, consiste em ou consiste basicamente em): a) uma porção CR2 que compreende os aminoácidos 23 a 271 do ID. DE SEQ. N° : 1, e b) uma porção FH que compreende os aminoácidos 21 a 320 do ID. DE SEQ. N°: 2. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH compreende (e, em algumas modalidades, consiste em ou consiste basicamente em): a) uma porção CR2 que compreende os aminoácidos 23 a 271 do ID. DE SEQ. N°: 1, e b) duas ou mais (por exemplo, duas) porções FH que compreendem aminoácidos 21 a 320 do ID. DE SEQ. N°: 2.

Em algumas modalidades, a CR2-FH é uma proteína de fusão que possui uma seqüência de aminoácidos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 3, ID. DE SEQ. N°: 21 e ID. DE SEQ. N°: 23. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é uma proteína de fusão que possui seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àquela de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 3, ID. DE SEQ. N°: 21 e ID. DE SEQ. N°: 23. Em algumas modalidades, a CR2-FH é uma proteína de fusão que compreende pelo menos cerca de 400, 450, 500, 550 ou mais aminoácidos contíguos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 3, ID. DE SEQ. N°: 21 e ID. DE SEQ. N° : 23. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é uma proteína de fusão codificada por um polinucleotídeo que possui uma seqüência de ácidos nucléicos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 22 e ID. DE SEQ. N°: 24. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é uma proteína de fusão codificada por um polinucleotídeo que possui uma seqüência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àquela de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 22 e ID, DE SEQ. N°: 24. Também são aqui englobados polinucleotídeos que codificam uma proteína de fusão de CR2-FH aqui descrita. Por exemplo, em algumas modalidades, é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão que compreende uma porção CR2 que compreende CR2 ou um fragmento desta e uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo também compreende uma seqüência que codifica um peptídeo sinalizador ligado operacionalmente na extremidade 5' da seqüência que codifica a proteína de fusão de CR2-FH. Em algumas modalidades, é utilizada uma seqüência vinculadora para ligação da porção CR2 e da porção FH. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína de fusão de CR2-FH que possui uma seqüência de aminoácidos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 3, ID. DE SEQ. N°: 21 e ID. DE SEQ. N°: 23. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína de fusão de CR2-FH que possui uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de ácidos nucléicos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N° : 3, ID. DE SEQ. N°: 22 e ID. DE SEQ. N°: 24. Também são fornecidos vetores que compreendem um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de CR2-FH, células hospedeiras que compreendem o polinucleotídeo, e métodos de produção de uma proteína de fusão de CR2-FH que compreendem o cultivo das células hospedeiras sob condições adequadas para expressar a proteína de fusão e a recuperação da proteína de fusão da cultura da célula hospedeira.

Em outro aspecto, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado à administração a um ser humano. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado à injeção intra-ocular. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado à aplicação tópica no olho. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende a CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado à injeção intravenosa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado à injeção nas artérias (por exemplo, artérias renais), fígado ou rim.

Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína CR2 de fusão) que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste; e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é capaz de se ligar a um ligante de CR2 e de inibir a ativação do complemento da via alternativa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: uma molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) que compreende: a) uma porção CR2 que compreende pelo menos os primeiros dois domínios SCR do terminal N de CR2, e b) uma porção FH que compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de FH, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) que compreende (e, em algumas modalidades, consiste em ou consiste basicamente em) : a) uma porção CR2 que compreende os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de CR2, e b) uma porção FH que compreende os primeiros cinco domínios SCR do terminal N de FH, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) que compreende (e, em algumas modalidades, consiste em ou consiste basicamente em) : a) uma porção CR2 que compreende os aminoácidos 23 a 271 do ID. DE SEQ. N° : 1, e b) uma porção FH que compreende os aminoácidos 21 a 320 do ID. DE SEQ. N°: 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma proteína de fusão de CR2-FH que possui uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àquela de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N° : 3, ID. DE SEQ. N°: 21 e ID. DE SEQ. N°: 23, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada à liberação ao olho (por exemplo, por injeção intra-ocular ou por liberação tópica ao olho). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada à injeção intravenosa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é adequada à injeção em artérias (por exemplo, artérias renais), fígado ou rim. Em algumas modalidades, a composição é adequada à administração intra- ocular, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intratraqueal ou por inalação.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma doença na qual a via alternativa do complemento está implicada em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) aqui descrita. Em algumas modalidades, o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, o método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste, em que a molécula de CR2-FH é capaz de se ligar a um ligante de CR2 e em que a molécula de CR2-FH é capaz de inibir a ativação do complemento da via alternativa. Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é uma doença que envolve inflamação local. Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é uma doença que está associada a deficiências de FH (incluindo, por exemplo, diminuição no nível de FH, diminuição na atividade de FH ou ausência de FH do tipo selvagem ou protetor). Em algumas modalidades, a doença a ser tratada não é uma doença que está associada a deficiências de FH.

Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é uma doença associada às drusas. Em algumas modalidades, a doença a ser tratada não envolve a via clássica do complemento.

Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de degeneração macular (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade ou DMRI) em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é uma forma seca de DMRI. Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é uma forma úmida de DMRI. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é administrada por administração intravenosa. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é administração por injeção intra-ocular. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é administrada por administração tópica ao olho (por exemplo, na forma de colírios).

Em algumas modalidades, um ou mais aspectos de DMRI são tratados por métodos da presente invenção. Por exemplo, em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento da (por exemplo, redução, retardo, eliminação ou prevenção) formação de drusas no olho de um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento (por exemplo, redução, retardo, eliminação ou prevenção) de inflamação no olho de um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento (por exemplo, redução, retardo, eliminação ou prevenção) de perda de células fotorreceptoras em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecido um método de melhorar (incluindo, por exemplo, diminuição, retardo ou bloqueio da perda de) a acuidade visual ou o campo visual no olho de um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de neovascularização (por exemplo, neovascularização coroidiana ou CNV), que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Também são contemplados tratamentos de outros aspectos da DMRI.

Os métodos aqui descritos também são úteis para o tratamento de certas doenças renais. Por exemplo, em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de glomerulonef rite membrano-prolif erativa do tipo II (MPGN II), que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de síndrome hemolítico-urêmica (HUS), que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de nefrite lúpica, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste.

Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de isquemia por re-perfusão (incluindo, por exemplo, isquemia por re-perfusão renal e isquemia por re- perfusão intestinal) , que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste.

Também são fornecidos métodos de tratamento de rejeição de transplante de órgãos. Por exemplo, em algumas modalidades, é fornecido um método de retardo do surgimento de rejeição vascular aguda (por exemplo, rejeição mediada por anticorpos de transplante cardíaco) em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste.

Em algumas modalidades, é fornecido um método de melhorar sobrevida no transplante de órgão em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecido um método de melhorar sobrevida no transplante de órgão em um indivíduo, que compreende a perfusão do órgão a ser transplantado a um indivíduo com uma composição que compreende a molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecido um método de melhorar sobrevida de um doador do transplante de órgão, que compreende a administração ao doador do transplante de órgão de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste.

Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de artrite reumatóide, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou fragmento deste.

Também são fornecidos formas de dosagem unitária, kits e artigos manufaturados que são úteis para os métodos aqui descritos.

Deve-se entender que uma, algumas ou todas as propriedades das várias modalidades aqui descritas podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 fornece diagramas esquemáticos de um plasmideo de expressão de CR2-FH exemplar e proteínas CR2 - FH. Para o plasmideo de expressão de CR2-FH, k refere-se à seqüência de Kozak, 5 refere-se ao peptídeo sinalizador CD5, 1 refere-se a um vinculador opcional, s refere-se ao códon de parada e sinal poliA. Para as proteínas CR2-FH (com ou sem peptídeo sinalizador) , 5 refere-se ao peptídeo sinalizador CDS, 1 refere-se a um vinculador opcional.

A Figura 2 fornece a seqüência de aminoácidos da CR2 humana (ID. DE SEQ. N°: 1) e a seqüência de aminoácidos do FH humano (ID. DE SEQ. N°: 2).

A Figura 3 fornece a seqüência de aminoácidos de uma proteína de fusão de CR2-FH humana exemplar (ID. DE SEQ. N°: 3) e uma seqüência de polinucleotídeos exemplar que codifica uma proteína de fusão de CR2-FH humana (ID. DE SEQ. N° : 4) .

As Figuras 4-6 fornecem seqüências de aminoácidos exemplares de moléculas de CR2-FH aqui descritas (IDS. DE SEQ. Nos: 5-10). "nnn" representa um vinculador opcional.

A Figura 7 fornece seqüências de aminoácidos exemplares de peptídeos de sinalização aqui descritos (IDS. DE SEQ. Nos: 11, 13 e 25) e seqüências de polinucleotídeos exemplares que codificam os peptídeos de sinalização (IDS. DE SEQ. Nos: 12, 14 e 26).

A Figura 8 fornece uma seqüência de aminoácidos de CR2 de camundongo (ID. DE SEQ. N° : 15) e uma seqüência de aminoácidos de FH de camundongo (ID. DE SEQ. N°: 16).

A Figura 9 fornece uma seqüência de aminoácidos de uma proteína de fusão de CR2-FH de camundongo exemplar (ID. DE SEQ. N°: 17) e uma seqüência de polinucleotídeos exemplar que codifica uma CR2-FH de camundongo mais o peptídeo sinalizador (ID. DE SEQ. N° : 18).

A Figura 10 fornece uma seqüência de DNA exemplar de CR2NLFHFH, uma proteína de fusão de CR2-FH de camundongo que contém uma porção CR2 e duas porções FH, sem uma seqüência vinculadora (ID. DE SEQ. N° : 19).

A Figura 11 fornece uma seqüência de DNA exemplar de CR2LFHFH, uma proteína de fusão de CR2-FH de camundongo que contém uma porção CR2 ligada a duas porções FH por meio de uma seqüência vinculadora (ID. DE SEQ. N°: 20).

A Figura 12A apresenta uma representação gráfica de dados obtidos em um ensaio de complemento de zimosan in vitro com o uso de uma proteína de fusão de CR2-FH de camundongo (CR2-fH) e fator H isoladamente (fH). A Figura 12B apresenta uma representação gráfica de dados obtidos em um ensaio de complemento de zimosan in vitro com o uso dos primeiros cinco domínios SCR de FH (FH 15) e dos primeiros quatro domínios de CR2 (CR2). A Figura 13 apresenta uma representação gráfica de dados obtidos em um ensaio de complemento de zimosan in vitro com o uso de proteína de fusão de CR2-FH de camundongo com vinculador (CR2LFH), proteína de fusão de CR2-FH sem vinculador (CR2NLFH), CR2-FH-FH com vinculador (CR2LFHFH), e CR2-Crry.

As Figuras 14A e 14B fornecem representações gráficas de dados obtidos em um modelo animal de isquemia intestinal e lesão de re-perfusão com o uso de proteína de fusão de CR2-FH de camundongo que possui uma porção FH (CR2-fH) ou duas porções FH (CR2-ÍHH).

A Figura 15A apresenta uma representação gráfica dos efeitos de CR2-fH sobre a função renal medidos por nitrogênio uréico sérico (SUN). A Figura 15B apresenta uma representação gráfica dos efeitos de CR2-fH sobre a morfologia renal. As Figuras 15C e 15D fornecem resultados de coloração por imunof luorescência de cortes de rim de camundongos de controle (15C) e de camundongo tratados com CR2-fH (15D) incubados com anticorpo conjugado a FTIC para C3 de camundongo.

A Figura 16 fornece resultados da resposta retiniana de onda a e b em camundongos tratados com ou sem CR2-fH.

As Figuras 17A e 17B fornecem a coloração com isolectina-b de lesões da retina de camundongo de camundongo de controle (17A) e camundongos tratados com CR2-fH por injeção intravenosa (17B).

A Figura 17C mostra a quantificação dos tamanhos da lesão com base na coloração com isolectina-b das Figuras 17A e 17B.

As Figuras 18A e 18B fornecem coloração com isolectina-b de lesões de retina de camundongo de camundongos de controle (18A) e camundongos tratados com CR2-fH por injeção intra-óptica (18B). A Figura 18C fornece quantificação dos tamanhos da lesão com base na coloração com isolectina-b das Figuras 18A e 18B.

A Figura 19 fornece uma curva de sobrevida de receptor de transplante cardíaco de camundongo tratado com dose única de CR2-fH (CR2-fH), doses múltiplas de CR2-fH (CR2-fH (m) ) e tampão de controle (PBS) .

A Figura 2 0 fornece uma seqüência de aminoácidos de uma proteína de fusão de CR2-FH humana exemplar (designada como CR2-fH humana ou CR2 f H) (ID. DE SEQ. N°: 21) e uma seqüência de polinucleotídeos exemplar que codifica uma CR2-fH humana mais o peptídeo sinalizador (ID. DE SEQ. N°: 22) . A seqüência que codifica o peptídeo sinalizador está sublinhada.

A Figura 21 fornece uma seqüência de aminoácidos exemplar de uma proteína de fusão de CR2-FH humana que contém duas porções FH (designada como CR2-FH2 humana ou CR2fH2 humana) (ID. DE SEQ. N°: 23) e uma seqüência de polinucleotídeos exemplar que codifica uma CR2-FH2 humana mais o peptídeo sinalizador (ID. DE SEQ. N°: 24). A seqüência que codifica o peptídeo sinalizador está sublinhada.

A Figura 22A mostra a inibição de CR2fH e CR2fH2 humanas na deposição de C3b específico da via alternativa sobre partículas de zimosan. A Figura 22B mostra a inibição da via Iise de eritrócitos mediada pela alternativa por CR2fH humana e CR2fH2 humana.

A Figura 23 mostra os efeitos de CR2-FH de camundongo sobre a ativação de C3 induzida por complexos imunes de anticorpos de colágeno-anti-colágeno. O eixo Y mostra os valores médios de OD.

A Figura 24 mostra a titulação de CR2-FH de camundongo em tampão com cálcio suficiente com o uso de soro de camundongo knockout para C4-/C4-. 0 eixo Y mostra os valores médios de OD.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece uma molécula de CR2-FH, composições (por exemplo, composições farmacêuticas) que compreendem uma molécula de CR2-FH, e métodos de tratamento de uma doença na qual a via alternativa do complemento está implicada por administração da composição. A molécula de CR2-FH compreende uma porção CR2 e uma porção FH. A porção CR2 é responsável pela liberação direcionada da molécula aos locais de ativação do complemento, e a porção FH é responsável por inibir especificamente a ativação do complemento da via alternativa. Estudos preliminares demonstraram que uma molécula de CR2-FH, especificamente, uma proteína de fusão de CR2-FH que contém os primeiros quatro domínios SCR do terminal N da proteína CR2 e os primeiros cinco domínios SCR do terminal N da proteína do fator H, possui tanto atividade de direcionamento quanto atividade inibidora do complemento in vitro. Essa molécula é significativamente mais eficaz do que uma molécula de fator H desprovida da porção CR2, o que sugere que o direcionamento do FH aos locais de ativação do complemento será uma ferramenta terapêutica eficaz no tratamento de uma doença na qual a via alternativa do complemento está implicada como, por exemplo, degeneração macular (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade). Essa observação é surpreendente por causa da concentração relativamente elevada de FH no plasma e da crença antiga de que células que estejam em contato direto com o plasma já estão completamente cobertas com FH. Jozsi e cols., Histopathol. (2004) 19: 251-258.

Conseqüentemente, em um aspecto, é fornecida uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecida uma molécula isolada de CR2-FH. Em algumas modalidades, é fornecida uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica) que compreende uma molécula de CR2-FH. Por exemplo, em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado à administração a um indivíduo sistemicamente (por exemplo, injeção intravenosa) ou localmente (por exemplo, injeção intra-ocular ou injeção em artérias, incluindo artérias renais).

Em outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de uma doença na qual a via alternativa do complemento está implicada em um indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Doenças adequadas que podem ser tratadas pelos métodos da presente invenção incluem, por exemplo, degeneração macular (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade), artrite reumatóide, isquemia por re- perfusão, rejeição de transplante de órgão e doenças renais como, por exemplo, MPGN II, HUS e nefrite lúpica.

A referência geral à "composição" ou às "composições" inclui e é aplicável às composições da invenção.

Como aqui usada, a forma no singular "um", "uma", "a" ou "o" inclui referências no plural, a menos que indicado de forma diferente. Por exemplo, "uma" porção FH inclui uma ou mais porções FH.

Referência aqui feita a "cerca de" um valor ou parâmetro inclui (e descreve) modalidades que são dirigidas àquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição em referência a "cerca de X" inclui a descrição de "X".

Entende-se que aspectos e modalidades da invenção aqui descritas incluem "que consistem" e/ou "que consistem essencialmente em" aspectos e modalidades.

Moléculas de CR2-FH e composições que compreendem uma molécula de CR2-FH

São aqui fornecidas moléculas de CR2-FH e composições (por exemplo, composições farmacêuticas) que compreendem uma molécula de CR2-FH.

O termo "molécula de CR2-FH", como aqui usado, refere- se a uma molécula de ocorrência não natural que compreende uma CR2 ou um fragmento desta (a "porção CR2") e um FH ou um fragmento deste (a "porção FH"). A porção CR2 é capaz de se ligar a um ou mais ligantes de CR2 naturais e, dessa forma, é responsável pela liberação direcionada da molécula aos locais de ativação do complemento. A porção FH é responsável por inibir especificamente a ativação do complemento pela via alternativa do complemento. A porção CR2 e a porção FH da molécula de CR2-FH podem estar ligadas juntas por qualquer método conhecido na técnica, desde que as funcionalidades desejadas das duas porções sejam mantidas.

Dessa forma, a molécula de CR2-FH aqui descrita geralmente possui as funções duplas de se ligar a um ligante de CR2 e de inibir a ativação do complemento da via alternativa, "ligante de CR2" refere-se a qualquer molécula que se liga a uma proteína CR2 de ocorrência natural, que inclui, sem limitação, C3d, iC3b, C3dg, C3d, e fragmentos ligados à célula de C3b que se ligam aos dois domínios SCR do terminal N de CR2. A molécula de CR2-FH pode, por exemplo, se ligar a um ligante de CR2 com uma afinidade de ligação que é de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%; 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% da proteína CR2. A afinidade de ligação pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, ressonância por plasmônio de superfície, titulação por calorimetria, ELISA, e citometria de fluxo. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH possui uma ou mais das seguintes propriedades de CR2: (1) ligação a C3d, (2) ligação a iC3b, (3) ligação a C3dg, (4) ligação a C3d, e (5) ligação a fragmentos ligados à célula de C3b que se ligam aos dois domínios SCR do terminal N de CR2.

A molécula de CR2-FH aqui descrita é geralmente capaz de inibir a ativação do complemento da via alternativa. A molécula de CR2-FH pode ser um inibidor mais potente do complemento do que a proteína FH de ocorrência natural. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH possui uma atividade inibidora do complemento que é de cerca de 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40 ou mais vezes aquela da proteína FH. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH possui uma EC50 de menos do que cerca de 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM ou 10 nM. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH possui uma EC50 de cerca de 5-60 nM, incluindo, por exemplo, 8-50 nM, 8-20 nM, 10-40 nM e 20-30 nM. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH possui atividade inibidora do complemento que é cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% aquela da proteína FH.

A inibição do complemento pode ser avaliada com base em qualquer método conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, ensaios de zimosan in vitro, ensaios para a lise de eritrócitos, ensaios de ativação de complexo imune e ensaios de ativação de manana. Em algumas modalidades, a CR2-FH possui uma ou mais das seguintes propriedades de FH: (1) ligação ã proteína C-reativa (CRP), (2) ligação a C3b, (3) ligação à heparina, (4) ligação ao ácido siálico, (5) ligação às superfícies da célula endotelial, (6) ligação ao receptor celular de integrina, (7) ligação a patógenos, (8) atividade de co-fator C3b, (9) atividade de queda- aceleração de C3b, e (10) inibição da via alternativa do complemento.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é uma proteína de fusão. O termo "proteína de fusão", como aqui usado, refere-se a dois ou mais peptídeos, polipeptídeos ou proteínas ligados operacionalmente uns aos outros. Em algumas modalidades, a porção CR2 e a porção FH estão fundidas diretamente entre elas. Em algumas modalidades, a porção CR2 e a porção FH estão ligadas por uma seqüência de aminoácidos vinculadora. Exemplos de seqüências vinculadoras são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, (Gly4Ser), (Gly4Ser)2, (Gly4Ser)3, (Gly3Ser)4, (SerGly4), (SerGly4)2, (SerGly4)3 e (SerGly4)4. Seqüências de ligação também podem compreender seqüências de ligação "naturais" encontradas entre diferentes domínios de fatores do complemento. Por exemplo, pode ser usada VSVFPLE, uma seqüência de ligação entre os dois primeiros domínios de repetição curta de consenso do terminal N de CR2 humana. Em algumas modalidades, é usada a seqüência de ligação entre o quarto e o quinto domínios de repetição curta de consenso do terminal N de CR2 humana (EEIF) . A ordem da porção CR2 da porção FH na proteína de fusão pode variar. Por exemplo, em algumas modalidades, o terminal C da porção CR2 é fundido (direta ou indiretamente) ao terminal N da porção FH da molécula. Em algumas modalidades, o terminal N da porção CR2 é fundido (direta ou indiretamente) ao terminal C da porção FH da molécula.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é uma proteína de fusão de CR2-FH que possui uma seqüência de aminoácidos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N° : 3, ID. DE SEQ. N°: 21 e ID. DE SEQ. N°: 23. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é uma proteína de fusão que possui uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àquela de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 3, ID. DE SEQ. N° : 21 OU ID. DE SEQ. N°: 23. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH compreende pelo menos cerca de 400, 450, 500, 550 ou mais aminoácidos contíguos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 3, ID. DE SEQ. N° : 21 e ID. DE SEQ. N°: 23.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é uma proteína de fusão de CR2-FH que possui uma seqüência de aminoácidos de qualquer um do IDS. DE SEQ. Nos: 5-10. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é uma proteína de fusão que possui uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àquela de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 5-10. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH compreende pelo menos cerca de 400, 450, 500, 550 ou mais aminoácidos contíguos de qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos :5-10.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é codificada por um polinucleotídeo que possui uma seqüência de ácidos nucléicos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 22 e ID. DE SEQ. N°: 24. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é codificada por um polinucleotídeo que possui uma seqüência de ácidos nucléicos que é pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àquela de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 22 e ID. DE SEQ. N°: 24.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH compreende uma porção CR2 e uma porção FH ligadas por meio de um reticulante químico. A ligação das duas porções pode ocorrer em grupos reativos localizados nas duas porções . Grupos reativos que podem ser direcionados com o uso de um reticulante incluem aminas primárias, sulfidrilas, carbonilas, carboidratos e ácidos carboxílicos, ou grupos ativos que possam ser adicionados às proteínas. Exemplos de vinculadores químicos são bem conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, bismaleimidohexano, éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, reticulantes de NHS- ésteres-maleimida como, por exemplo, SPDP, carbodiimida, glutaraldeído, MBS, Sulfo-MBS, SMPB, sulfo-SMPB, GMBS, Sulfo-GMBS, EMCS, Sulfo-EMCS, reticulantes de imidoéster como, por exemplo, DMA, DMP, DMS, DTBP, EDC e DTME.

Em algumas modalidades, a porção CR2 e a porção FH são ligadas de forma não covalente. Por exemplo, as duas porções podem ser juntas por duas proteínas de interação em ponte (por exemplo, biotina e estreptavidina) , cada uma ligada a uma porção CR2 ou a uma porção FH.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH compreende duas ou mais porções CR2 (iguais ou diferentes) aqui descritas. Em algumas modalidades, a molécula de CR2- FH compreende duas ou mais porções FH (iguais ou diferentes) aqui descritas. Essas duas ou mais porções CR2 (ou FH) podem ser ligadas em tandem (por exemplo, fundidas) entre elas. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende uma porção CR2 e duas ou mais (por exemplo, três, quatro, cinco ou mais) porções FH. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende uma porção FH e duas ou mais (por exemplo, três, quatro, cinco ou mais) porções CR2. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, uma proteína de fusão de CR2-FH) compreende duas ou mais porções CR2 e duas ou mais porções FH.

Em algumas modalidades, é fornecida uma molécula isolada de CR2-FH. Em algumas modalidades, as moléculas de CR2-FH formam dímeros ou multímeros.

A porção CR2 e a porção FH na molécula podem ser da mesma espécie (por exemplo, humanas ou de camundongo), ou de espécies diferentes.

Porção CR2

A porção CR2 aqui descrita compreende uma CR2 ou um fragmento desta. CR2 é uma proteína transmembrana expressa predominantemente em células B maduras e células dendríticas foliculares. CR2 é um membro da família das proteínas de ligação de C3. Ligantes naturais para CR2 incluem, por exemplo, iC3b, C3dg e C3d, e fragmentos de degradação ligados à de C3b que se ligam aos dois domínios SCR do terminal N de CR2. A clivagem de C3 resulta inicialmente na geração de C3b e na adesão covalente desse C3b à superfície da célula de ativação. 0 fragmento de C3b está envolvido na geração de complexos enzimáticos que amplificam a cascata do complemento. Na superfície celular, C3b é rapidamente convertido em iC3b inativo, particularmente quando depositado na superfície de um hospedeiro que contém reguladores da ativação do complemento (ou seja, a maioria dos tecidos hospedeiros).

Até mesmo na ausência de reguladores de complemento ligado à membrana, são formados níveis substanciais de iC3b. iC3b é subseqüentemente digerido nos fragmentos ligados à membrana C3dg, e depois em C3d por proteases séricas, mas esse processo é relativamente lento. Dessa forma, os ligantes de C3 para CR2 duram relativamente muito após serem gerados, e estarão presentes em concentrações elevadas nos locais de ativação do complemento. Portanto, CR2 pode servir como um veículo de direcionamento potente para a condução de moléculas até o local de ativação do complemento.

CR2 contém uma porção extracelular que possui 15 ou 16 unidades de repetição conhecidas como as repetições curtas de consenso (domínios SCR) . Os domínios SCR possuem uma estrutura central típica de resíduos altamente conservados que incluem quatro cisteínas, duas prolinas, um triptofano e várias outras glicinas e resíduos hidrofóbicos parcialmente conservados. O ID. DE SEQ. N°: 1 representa a seqüência da proteína CR2 humana de comprimento total. Os aminoácidos 1-20 compreendem o peptídeo líder, os aminoácidos 23-82 compreendem SCRl, os aminoácidos 91-14 6 compreendem SCR2, os aminoácidos 154-210 compreendem SCR3, os aminoácidos 215-271 compreendem SCR4. O sítio ativo (sítio de ligação de C3d) está localizado em SCR1-2 (os primeiros dois domínios SCR do terminal N). Esses domínios SCR são separados por seqüências curtas de comprimento variável que servem como espaçadores. A seqüência da proteína CR2 de camundongo de comprimento total é aqui representada pelo ID. DE SEQ. N°: 15. Os domínios SCRl e SCR2 da proteína CR2 de camundongo estão localizados com a seqüência amino da CR2 de camundongo nas posições 14-73 do ID. DE SEQ. N° : 15 (SCRl) e nas posições 82-138 do ID. DE SEQ. N°: 15 (SCR2) . CR2 humana e de camundongo são aproximadamente 66% idênticas sobre as seqüências de aminoácidos de comprimento total representadas pelos ID. DE SEQ. N°: I e ID. DE SEQ. N° : 15, e aproximadamente 61% idênticas sobre as regiões SCR1-SCR2 do ID. DE SEQ. N° : e do ID. DE SEQ. N° : 15. Tanto a CR2 de camundongo quanto a humana se ligam ao C3 (na região C3d). Sabe-se que existem variações de espécie e cepa para os peptídeos, polipeptídeos e proteínas revelados, e que a CR2 ou um fragmento desta aqui descrito engloba todas as variações de espécie e cepa.

A porção CR2 aqui revelada refere-se a um polipeptídeo que contém alguns ou todos os sítios de ligação de ligante da proteína CR2, e inclui, sem limitação, proteínas CR2 de comprimento total (por exemplo, CR2 humana, como mostrada no ID. DE SEQ. N° : 1, ou CR2 de camundongo, como mostrada no ID. DE SEQ. N°: 15), proteínas CR2 solúveis (por exemplo, um fragmento de CR2 que compreende o domínio extracelular de CR2), outros fragmentos de CR2 biologicamente ativos, um fragmento de CR2 que compreende SCRl e SCR2, ou qualquer homólogo de uma CR2 de ocorrência natural ou fragmento desta, como descrito em detalhe abaixo. Em algumas modalidades, a porção CR2 possui uma das seguintes propriedades de CR2: (1) ligação a C3d, (2) ligação a iC3b, (3) ligação a C3dg, (4) ligação a C3d, e (5) ligação a fragmentos ligados à célula de C3b que se ligam aos dois domínios SCR do terminal N de CR2.

Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende os primeiros dois domínios SCR do terminal N de CR2. Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende os primeiros três domínios SCR do terminal N de CR2. Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de CR2. Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende (e, em algumas modalidades, consiste em ou consiste basicamente em) pelo menos os primeiros dois domínios SCR do terminal N de CR2, incluindo, por exemplo, pelo menos qualquer um dos primeiros 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 domínios SCR de CR2.

Um homólogo de uma proteína CR2 ou um fragmento desta inclui proteínas que diferem de uma CR2 de ocorrência natural (ou fragmento de CR2) pelo fato de que pelo menos um ou poucos aminoácidos foram eliminados (por exemplo, uma versão truncada da proteína como, por exemplo, um peptídeo ou fragmento), inseridos, invertidos, substituídos e/ou derivatizados (por exemplo, por glicosilação, fosforilação, acetilação, miristoilação, prenilação, palmitação, amidação e/ou adição de glicosilfosfatidil inositol). Em algumas modalidades, um homólogo de CR2 possui uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 70% idêntica à seqüência de aminoácidos de uma CR2 de ocorrência natural (por exemplo, ID. DE SEQ. N° : 1 ou ID. DE SEQ. N° : 15), por exemplo, pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de aminoácidos de uma CR2 de ocorrência natural (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 1 ou ID. DE SEQ. N°: 15). Um homólogo de CR2 ou um fragmento deste preferivelmente retém a habilidade para se ligar a um ligante de CR2 de ocorrência natural (por exemplo, C3d ou outros fragmentos de C3 com habilidade de ligação à CR2). Por exemplo, o homólogo de CR2 (ou fragmento deste) pode ter uma afinidade de ligação para C3d que é pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% daquela de CR2 (ou ura fragmento desta).

Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende pelo menos os primeiros dois domínios SCR do terminal N de uma CR2 humana como, por exemplo, uma porção CR2 que possui uma seqüência de aminoácidos que contém pelo menos aminoácidos 23 até 146 da CR2 humana (ID. DE SEQ. N°: 1). Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende pelo menos os primeiros dois domínios SCR de CR2 humana que possuem uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntica aos aminoácidos 23 até 146 da CR2 humana (ID. DE SEQ. N°: 1).

Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de uma CR2 humana como, por exemplo, uma porção CR2 que possui uma seqüência de aminoácidos que contém pelo menos aminoácidos 23 até 271 da CR2 humana (ID. DE SEQ. N° : 1). Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR de CR2 humana que possuem uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntica aos aminoácidos 23 até 271 da CR2 humana (ID. DE SEQ. N0: 1) .

Uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de, por exemplo, 95% idêntica a uma seqüência de referência (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 1) significa que a seqüência de aminoácidos é idêntica à seqüência de referência, exceto que a seqüência de arainoácidos pode incluir até cinco alterações pontuais por cada 100 aminoácidos da seqüência de referência. Essas até cinco alterações pontuais podem ser eliminações, substituições, adições, e podem ocorrer em qualquer lugar na seqüência, espalhadas individualmente entre aminoácidos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contínuos dentro da seqüência de referência.

Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende parte ou todos os sítios de ligação de ligante da proteína CR2. Em algumas modalidades, a porção CR2 ainda compreende seqüências necessárias para manter a estrutura tridimensional do sítio de ligação. Sítios de ligação de ligante de CR2 podem ser facilmente determinados com base nas estruturas cristais de CR2 como, por exemplo, as estruturas cristais de CR2 humana e de camundongo reveladas na Publicação do Pedido de Patente U.S. N0 2004/0005538. Por exemplo, em algumas modalidades, a porção CR2 compreende a fita B e alça B-C de SCR2 de CR2. Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende um sítio na fita Bea alça B-C de SCR de CR2 que compreende o segmento G98-G99- Y100-KlOl-I102-R103-Gl04 - S105-T106-P107-YlO8 com relação ao ID. DE SEQ. N°: 1. Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende um sítio na fita B de SCR2 de CR2 que compreende a posição K119 com relação ao ID. DE SEQ. N° : 1. Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende um segmento que compreende V149-F150-P151-L152, com relação ao ID. DE SEQ. N° : 1. Em algumas modalidades, a porção CR2 compreende um segmento de SCR2 de CR2 que compreende T120-N121-F122. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH possui dois ou mais desses sítios. Por exemplo, em algumas modalidades, a porção CR2 compreende uma porção que compreende G98-G99- YlO0-KlOl-1102-R103-Gl04 -S105-T106-P107-Y108 e K119 com relação ao ID. DE SEQ. N°: 1. Outras combinações desses sítios também são contempladas.

Porção fator H

A porção FH da molécula de CR2-FH aqui descrita compreende um FH ou um fragmento deste.

0 fator do complemento H (FH) é uma glicoproteína plasmática de cadeia polipeptídica simples. A proteína é composta por 20 domínios SCR repetitivos de aproximadamente 60 aminoácidos, dispostos de forma contínua como um cordão de 20 contas. 0 fator H se liga ao C3b, acelera a queda da C3-convertase da via alternativa (C3Bb), e atua como um co- fator para a inativação proteolítica de C3b. Na presença de fator H, a proteólise de C3b resulta na clivagem de C3b. O fator H possui pelo menos três domínios de ligação distintos para C3b, que estão localizados dentro de SCR 1- 4, SCR 5-8 e SCR 19-20. Cada sítio do fator H se liga a uma região distinta dentro da proteína C3b: os sítios do terminal N se ligam ao C3b nativo; o segundo sítio, localizado na região média do fator H, se liga ao fragmento C3c, e o sítio localizado dentro de SCR 19 e 20 se liga à região C3d. Além disso, o fator H também contém sítios de ligação para heparina, que estão localizados dentro de SCR 7, SCR 5-12 e SCR 20 do fator H, e se sobrepõem com aqueles do sítio de ligação de C3b. As análises estruturais e funcionais demonstraram que os domínios para a atividade inibidora do complemento de FH estão localizados dentro dos primeiros quatro domínios SCR do terminal N.

O ID. DE SEQ. N°: 2 representa a seqüência de proteína do FH humano de comprimento total. Os aminoácidos 1-18 correspondem ao peptídeo líder, os aminoácidos 21-80 correspondem ao SCRl, os aminoácidos 85-141 correspondem ao SCR2, os aminoácidos 146-205 correspondem ao SCR3, os aminoácidos 210-262 correspondem ao SCR4, os aminoácidos 267-320 correspondem ao SCR5. A seqüência da proteína do FH de camundongo de comprimento total está aqui representada pelo ID. DE SEQ. N°: 16. Os domínios SCRl e SCR2 da proteína do FH de camundongo estão localizados com a seqüência amino do FH de camundongo nas posições 21-27 do ID. DE SEQ. N°: 16 (SCRl) e posições 82-138 do ID. DE SEQ. N°: 16 (SCR2). O FH humano e o de camundongo são aproximadamente 61% idênticos sobre as seqüências de aminoácidos de comprimento total representadas pelo ID. DE SEQ. N0 : 2 e pelo ID. DE SEQ. N°: 16. Sabe-se que existem variações de espécie e cepa para os peptídeos, polipeptídeos e proteínas revelados, e que o FH ou um fragmento deste engloba todas as variações de espécie e cepa.

A porção FH aqui descrita refere-se a qualquer porção de uma proteína FH que possua um pouco ou toda a atividade inibidora do complemento da proteína FH, e inclui, sem limitação, proteínas FH de comprimento total, fragmentos biologicamente ativos de proteínas FH, um fragmento do FR que compreende SCRl-4, ou qualquer homólogo de um FH de ocorrência natural ou fragmento deste, como descrito em detalhe abaixo. Em algumas modalidades, a porção FR possui uma ou mais das seguintes propriedades: (1) ligação à proteína C-reativa (CRP), (2) ligação a C3b, (3) ligação à heparina, (4) ligação ao ácido siálico, (5) ligação às superfícies da célula endotelial, (6) ligação ao receptor celular de integrina, (7) ligação a patógenos, (8) atividade de co-fator C3b, (9) atividade de queda- aceleração de C3b, e (10) inibição da via alternativa do complemento.

Em algumas modalidades, a porção FH compreende os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a construção compreende os primeiros cinco domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a construção compreende os primeiros seis domínios SCR do terminal N de FH. Em algumas modalidades, a porção FH compreende (e, em algumas modalidades, consiste em, ou consiste essencialmente em) pelo menos os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de FH, incluindo, por exemplo, pelo menos qualquer um dos primeiros 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou mais domínios SCR do terminal N de FH.

Em algumas modalidades, o FH é um FH do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o FH é uma variante protetora de FH.

Em algumas modalidades, a porção FH é desprovida de um sítio de ligação de heparina. Isso pode ser obtido, por exemplo, por mutação do sítio de ligação de heparina em FH, ou por seleção de fragmentos de FH que não contêm um sítio de ligação de heparina. Em algumas modalidades, a porção FH compreende um FH ou um fragmento deste que possui um polimorfismo que é protetor para degeneração macular relacionada à idade (Hageman e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102(20): 7.227). Um exemplo de uma molécula de CR2-FH que compreende uma seqüência desse tipo é fornecido na Figura 4 (ID. DE SEQ. N° : 6).

Um homólogo de uma proteína FH ou de um fragmento deste inclui proteínas que diferem de um FH de ocorrência natural (ou fragmento de FH) pelo fato de que pelo menos um ou poucos, mas não limitado a um ou poucos, aminoácidos foram eliminados (por exemplo, uma versão truncada da proteína como, por exemplo, um peptídeo ou fragmento), inseridos, invertidos, substituídos e/ou derivatizados (por exemplo, por glicosilação, fosforilação, acetilação, miristoilação, prenilação, palmitação, amidação e/ou adição de glicosilfosfatidil inositol). Por exemplo, um homólogo de FH pode ter uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 70% idêntica à seqüência de aminoácidos de um FH de ocorrência natural (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 2 OU ID. DE SEQ. N°: 16), por exemplo, pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de aminoácidos de um FH de ocorrência natural (por exemplo, ID. DE SEQ. N°: 2 ou ID. DE SEQ. N°: 16). Em algumas modalidades, um homólogo de FH (ou um fragmento deste) retém toda a atividade de inibição de complemento de FH (ou um fragmento deste) . Em algumas modalidades, o homólogo de FH (ou um fragmento deste) retém pelo menos cerca de 50%, por exemplo, pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% da atividade de inibição de complemento de FH (ou um fragmento deste).

Em algumas modalidades, a porção FH compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de um FH humano, por exemplo, uma porção FH que possui uma seqüência de aminoácidos que contém pelo menos os aminoácidos 21 até 262 do FH humano (ID. DE SEQ. N°: 2). Em algumas modalidades, a porção FH compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de FH humano que possui uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntica aos aminoácidos 21 até 262 do FH humano (ID. DE SEQ. N° : 2).

Em algumas modalidades, a porção FH compreende pelo menos os primeiros cinco domínios SCR do terminal N de um FH humano, por exemplo, uma porção FH que possui uma seqüência de aminoácidos que contém pelo menos aminoácidos 21 até 320 do FH humano (ID. DE SEQ. N°: 2). Em algumas modalidades, a porção FH compreende pelo menos os primeiros cinco domínios SCR do terminal N de FH humano que possui uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idêntica aos aminoácidos 21 até 320 do FH humano (ID. DE SEQ. N°: 2).

Em algumas modalidades, a porção FH compreende um fator H de comprimento total ou um fragmento de molécula de fator H-Iike 1 (FHL-I) , uma proteína codificada por um transcrito unido alternativamente do gene do fator Η. O FHL-I maduro contém 431 aminoácidos. Os primeiros 427 aminoácidos organizam sete domínios SCR e são idênticos aos domínios SCR do terminal N de FH. Os quatro resíduos de aminoácidos Ser-Phe-Thr-Leu (SFTL) restantes no terminal C são específicos para FHL-I. FHL-I foi caracterizado funcionalmente e demonstrou ter atividade reguladora de complemento do fator Η. O termo "porção FH" também engloba o comprimento total ou fragmentos de moléculas relacionadas ao fator H, incluindo, sem limitação, proteínas codificadas pelos genes de FHRl, FHR2, FHR3, FFIR4, FHR5. Essas proteínas relacionadas ao fator H são reveladas, por exemplo, em de Cordoba e cols., Molecular Immunology 2004, 41: 355-367.

Variantes de moléculas de CR2-FH

Também são englobadas variantes das moléculas de CR2- FH (por exemplo, as proteínas de fusão de CR2-FH) . Uma variante da molécula de CR2-FH aqui descrito pode ser: (i) um no qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos da porção CR2 e/ou da porção FH são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado), e esse resíduo de aminoácido substituído pode ou ser ou não um codificado pelo código genético; ou (ii) um no qual um dos resíduos de aminoácidos na porção CR2 e/ou na porção FH inclui um grupo substituinte, ou (iii) um no qual a molécula de CR2-FH (por exemplo, a proteína de fusão de CR2-FH) está fundida a outro composto, por exemplo, um composto para aumentar a meia-vida da molécula de CR2-FH (por exemplo, polietileno glicol) , ou (iv) um no qual aminoácidos adicionais estão fundidos à molécula de CR2-FH (por exemplo, a proteína de fusão de CR2-FH) como, por exemplo, uma seqüência líder ou secretora ou uma seqüência que seja empregada para a purificação da molécula de CR2-FH (por exemplo, a proteína de fusão de CR2-FH), ou (v) um no qual a molécula de CR2-FH (por exemplo, a proteína de fusão de CR2-FH) está fundida com um polipeptídeo maior, ou seja, albumina humana, um anticorpo ou Fe, para aumento da duração do efeito. Essas variantes são consideradas como estando dentro do escopo daqueles habilitados na técnica a partir dos ensinamentos aqui apresentados.

Em algumas modalidades, a variante da molécula de CR2- FH contém substituições de aminoácidos conservadoras (definidas com mais detalhe abaixo) feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos previstos, preferivelmente não essenciais. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado da seqüência do tipo selvagem de uma proteína, sem alterar a atividade biológica, enquanto um resíduo de aminoácido "essencial" é necessário para a atividade biológica. Uma "substituição de aminoácido conservadora" é aquela na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos que possuem cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais com ramificações beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

Podem ser introduzidas substituições de aminoácidos nas porções CR2 ou FH da molécula de CR2-FH para aumentar a funcionalidade da molécula. Por exemplo, podem ser introduzidas substituições de aminoácidos na porção CR2 da molécula para aumentar a afinidade de ligação da porção CR2 ao(s) seu(s) ligante(s), para aumento da especificidade de ligação da porção CR2 ao(s) seu(s) ligante(s), para aumentar o direcionamento da molécula de CR2-FH aos locais desejados, para aumentar a dimerização ou multimerização de moléculas de CR2-FH, e para aprimorar a farmacocinética da molécula de CR2-FH. Similarmente, podem ser introduzidas substituições de aminoácidos na porção FH da molécula para aumentar a funcionalidade da molécula de CR2-FH e para aprimorar a farmacocinética da molécula de CR2-FH.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH (por exemplo, a proteína de fusão de CR2-FH) é fundida com outro composto, por exemplo, um composto para aumento da meia- vida do polipeptídeo e/ou para redução da imunogenicidade potencial do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol, "PEG"). O PEG pode ser usado para conferir hidrossolubilidade, tamanho, reduzir a taxa de depuração renal e reduzir a imunogenicidade da proteína de fusão. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.214.966. No caso de PEGuilações, a fusão da molécula de CR2-FH (por exemplo, a proteína de fusão de CR2-FH) ao PEG pode ser obtida por meios conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, a PEGuilação pode ser obtida introduzindo-se, inicialmente, uma mutação de cisteína na proteína de fusão de CR2-FH, seguida por derivatização sítio-específica com PEG-maleimida. A cisteína pode ser adicionada ao terminal C da proteína de fusão de CR2-FH. Veja, por exemplo, Tsutsumi e cols. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97(15): 8.548- 8.553. Outra modificação que pode ser feita à molécula de CR2-FH (por exemplo, à proteína de fusão de CR2-FH) envolve biotinilação. Em certos casos, pode ser útil ter a molécula de CR2-FH (por exemplo, a proteína de fusão de CR2-FH) biotinilada de forma que ela possa reagir facilmente com estreptavidina. Métodos para a biotinilação de proteínas são bem conhecidos na técnica. Adicionalmente, sulfato de condroitina pode ser ligado à molécula de CR2-FH (por exemplo, à proteína de fusão de CR2-FH).

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é fundida a outra molécula de direcionamento ou porção de direcionamento, o que aumenta ainda mais a eficiência de direcionamento da molécula de CR2-FH. Por exemplo, a molécula de CR2-FH pode ser fundida a um ligante (por exemplo, uma seqüência de aminoácidos) que tem a capacidade de se ligar ou de algum outro modo aderir em uma célula endotelial de um vaso sangüíneo (denominado "ligante de aminoácido de direcionamento endotelial vascular") . Ligantes de direcionamento endotelial vascular exemplares incluem, sem limitação, VEGF, FGF, integrina, fibronectina, I-CAM, PDGF, ou um anticorpo para uma molécula expressa na superfície de uma célula endotelial vascular.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é conjugada (por exemplo, fundida) a um ligante para moléculas de adesão intercelular. Por exemplo, a molécula de CR2-FH pode ser conjugada a uma ou mais porções de carboidrato que se ligam a uma molécula de adesão intercelular. A porção de carboidrato facilita a localização da molécula de CR2-FH até o local da lesão. A porção de carboidrato pode ser anexada à molécula de CR2-FH por meio de um evento extracelular como, por exemplo, uma adesão química ou enzimática, ou pode ser o resultado de um evento de processamento intracelular obtido pela expressão de enzimas apropriadas. Em algumas modalidades, a porção de carboidrato se liga a uma classe de moléculas de adesão em particular, por exemplo, integrinas ou selectinas, incluindo E-selectina, L-selectina ou P-selectina. Em algumas modalidades, a porção de carboidrato compreende um carboidrato ligado ao N, por exemplo, do tipo complexo, incluindo carboidratos fucosilados e sialilados. Em algumas modalidades, a porção de carboidrato está relacionada ao antígeno X de Lewis, por exemplo, ao antígeno X de Lewis sialilado.

Para o tratamento de doenças oculares como, por exemplo, DMRI, a CR2-FH pode ser conjugada (por exemplo, fundida) a um anticorpo que reconhece um neoepitopo das drusas. Também podem ser usadas outras moléculas de direcionamento como, por exemplo, pequeno peptídeo de direcionamento. Outras modificações da molécula de CR2-FH incluem, por exemplo, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, e semelhantes.

A molécula de CR2-FH pode incluir a adição de um domínio imunologicamente ativo como, por exemplo, um epitopo ou outro tagr de anticorpo, para facilitar o direcionamento ou purificação do polipeptídeo. 0 uso de 6xHis e GST (glutationa S transferase) como t ags é bem conhecido. A inclusão de um sítio de clivagem na junção de fusão ou próximo a ela facilitará a remoção do polipeptídeo estranho após purificação. Outras seqüências de aminoácidos que podem ser incluídas na molécula de CR2-FH incluem domínios funcionais como, por exemplo, sítios ativos de enzimas, por exemplo, uma hidrolase, domínios de glicosilação, e sinais de direcionamento celular.

Variantes da molécula de CR2-FH (por exemplo, a proteína de fusão de CR2-FH) incluem polipeptídeos que possuem uma seqüência de aminoácidos suficientemente similar à seqüência de aminoácidos da molécula de CR2-FH. O termo "suficientemente similar" significa uma primeira seqüência de aminoácidos que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácidos idênticos ou equivalentes, em relação a uma segunda seqüência de aminoácidos, de tal forma que a primeira e a segunda seqüências de aminoácidos possuam um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum. Por exemplo, seqüências de aminoácidos que contêm um domínio estrutural comum que sejam pelo menos cerca de 45%, preferivelmente cerca de 75% até 98% idênticas, são aqui definidas como suficientemente similares. Variantes incluem variantes de proteínas de fusão codificadas por um polinucleotídeo que hibridiza para um polinucleotídeo desta invenção ou para um complemento deste, sob condições de alto rigor. Essas variantes geralmente retêm a atividade funcional das proteínas de fusão desta invenção. Podem ser usadas bibliotecas de fragmentos dos polinucleotídeos para a geração de uma população variada de fragmentos para rastreamento e subseqüente seleção. Por exemplo, uma biblioteca de fragmentos pode ser gerada por tratamento de um fragmento de PCR de fita dupla de um polinucleotídeo com uma nuclease sob condições nas quais o corte (nícking) só ocorra aproximadamente uma vez por molécula, desnaturando o DNA de fita dupla, efetuando-se a renaturação do DNA para formar DNA de fita dupla que pode incluir pares senso/anti- senso de diferentes produtos cortados, removendo porções de fita simples dos duplexos reformados por tratamento com Si nuclease, e ligando a biblioteca de fragmentos resultante em um vetor de expressão. Por esse método, pode-se derivar uma biblioteca de expressão que codifica fragmentos do terminal N e internos de vários tamanhos das proteínas de fusão desta invenção.

Variantes incluem proteínas de fusão que diferem na seqüência de aminoácidos em função de mutagênese. Além disso, também podem ser construídos análogos bioequivalentes da molécula de CR2-FH (por exemplo, proteína de fusão) fazendo-se várias substituições nos resíduos ou seqüências na porção CR2 e/ou na porção FH.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH, particularmente a proteína de fusão de CR2-FH, é fundida em seu peptídeo sinalizador do terminal N. Esses peptídeos sinalizadores são úteis para a secreção da molécula de CR2- FH. Peptídeos sinalizadores adequados incluem, por exemplo, o peptídeo sinalizador da proteína CD5 (por exemplo, peptídeo sinalizador da proteína CD5 humana MPMGSLQPLATLYLLGMLVAS, ID. DE SEQ. N°: 11). Em algumas modalidades, é usado o peptídeo sinalizador da proteína CR2. Por exemplo, em algumas modalidades, é usado o peptídeo sinalizador da proteína CR2 humana (MGAAGLLGVFLALVAPG, ID. DE SEQ. N°: 13 OU MGAAGLLGVFLALVAPGVLG, ID. DE SEQ. N°: 25). Preparação de moléculas de CR2-FH

As moléculas de CR2-FH (ou as duas porções das moléculas de CR2-FH) aqui descritas podem ser feitas por métodos de síntese química, ou por ligação de um polinucleotídeo que codifica a porção CR2 e um polinucleotídeo que codifica a porção FH (com ou sem uma seqüência vinculadora) , e a introdução da molécula de polinucleotídeo resultante em um vetor para a transfecção de células hospedeiras que sejam capazes de expressar a molécula. A síntese química, especialmente a síntese de fase sólida, é preferida para peptídeos curtos ou para aqueles que contêm aminoácidos não naturais ou incomuns como, por exemplo, D-Tyr, ornitina, e semelhantes. Preferem-se procedimentos recombinantes para polipeptídeos mais longos. A molécula de CR2-FH pode ser isolada in vitro por métodos de purificação de proteínas. A molécula de CR2- FH também pode ser fornecida "in si tu" por introdução de um sistema de terapia gênica ao tecido de interesse, que então expressa a fusão de CR2-FH.

Técnicas de DNA recombinante para a produção de uma proteína de fusão de CR2-FH envolvem, de forma simplificada, o uso de um polinucleotídeo que codifica CR2- FH, sua inserção em um vetor apropriado, a inserção do vetor em uma célula hospedeira apropriada, e a recuperação ou o isolamento da proteína de fusão assim produzida.

São aqui fornecidos polinucleotídeos que codificam uma molécula de CR2-FH (ou seja, uma proteína de fusão de CR2- FH) . Esses polinucleotídeo também podem ser usados para a liberação e expressão de CR2-FH. Por exemplo, em algumas modalidades, é fornecido um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão que compreende uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta e uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo também compreende uma seqüência que codifica um peptídeo sinalizador ligado operacionalmente à extremidade 5' da seqüência que codifica a proteína de fusão de CR2-FH. Seqüências de nucleotídeos de peptídeos sinalizadores exemplares são fornecidas na Figura 7 (ID. DE SEQ. N°: 12, 14 e 25). Em algumas modalidades, é utilizada uma seqüência vinculadora para ligação da porção CR2 e da porção FH. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína de fusão de CR2-FH que possui uma seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° : 3. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma proteína de fusão de CR2-FH que possui uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de aminoácidos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 3, ID. DE SEQ. N°: 21 e ID. DE SEQ. N°: 23. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma molécula de CR2-FH que compreende pelo menos cerca de 400, 450, 500, 550 ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 22 e ID. DE SEQ. N°: 24. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma seqüência de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N° : 4, ID. DE SEQ. N°: 22 e ID. DE SEQ. N°: 24. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma seqüência que é pelo menos cerca de 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de ácidos nucléicos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 22 e ID. DE SEQ. N°: 24. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende pelo menos cerca de 1.2 00, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600 ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer um entre o ID. DE SEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 22 e ID. DE SEQ. N°: 24. O polinucleotídeo pode ainda incluir uma seqüência que codifica uma seqüência sinalizadora de secreção para secretar a proteína de fusão em um meio. O polinucleotídeo que codifica uma seqüência sinalizadora de secreção inclui, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica a seqüência sinalizadora de CD 5 ou uma seqüência de polinucleotídeos que codifica a seqüência sinalizadora de CR2.

Também são fornecidos vetores de expressão que compreendem um polinucleotídeo aqui descrito para expressão da proteína de fusão de CR2-FH. 0 vetor de expressão pode ser usado para dirigir a expressão de uma proteína de fusão de CR2-FH in vitro ou in vivo. 0 vetor pode incluir qualquer elemento para estabelecer uma função convencional de um vetor, por exemplo, promotor, finalizador, marcador de seleção e origem de replicação. 0 promotor pode ser constitutivo ou regulador, e é selecionado, por exemplo, de promotores de genes para galactoquinase (GAL1) , uridililtransferase (GAL7), epimerase (GAL10), fosfoglicerato quinase (PGK), gliceraldeídos-3-fosfato desidrogenase (GPD), álcool desidrogenase (ADH), e semelhantes.

Muitos vetores de expressão são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, E. coli pode ser transformada com o uso de pBR322, um plasmideo derivado de uma espécie de E. coli (Mandei e cols. , J. Mol. Biol.,53: 154(1970)). 0 plasmideo pBR322 contém genes para resistência à ampicilina e tetraciclina e, dessa forma, fornece um meio fácil para a seleção. Outros vetores incluem características diferentes como, por exemplo, diferentes promotores, que são freqüentemente importantes na expressão. Por exemplo, os plasmídeos pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia), pKK233-2 (Clontech, Palo Alto, Calif, EUA) e pGEMl (Promega Biotech, Madison, Wis., EUA) são todos disponíveis comercialmente. Outros vetores que podem ser usados na presente invenção incluem, sem limitação, pET21a (Studier e cols., Methods Enzymol., 185: 60-89 (1990)), pRlT5 e pRlT2T (Pharmacia Biotechnology), e pB0475 (Cunningham e cols., Science, 243: 1.330-1.336 (1989); Patente U.S. N0 5.580.723). Vetores de expressão mamíferos podem conter elementos não transcritos como, por exemplo, uma origem de replicação, um promotor e um intensif icador, e seqüências não traduzidas 5 ou 3 1 como, por exemplo, sítios de ligação de ribossomo, um sítio de poliadenilação, um sítio receptor e doador de junção {splice), e seqüências de terminação da transcrição.

Promotores para uso em vetores de expressão mamíferos normalmente são, por exemplo, promotores virais como, por exemplo, de polioma, de adenovírus, HTLV, do vírus símio 4 0 (SV 40) e do citomegalovírus humano (CMV). Também podem ser construídos vetores com o uso de técnicas padronizadas por combinação dos traços relevantes dos vetores descritos acima. Também são fornecidas células hospedeiras (por exemplo, células isoladas, linhagens celulares transitórias e linhagens celulares estáveis) para a expressão de uma proteína de fusão de CR2-FH. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica. Células hospedeiras procarióticas exemplares incluem E. coli K12 cepa 294 (N° ATCC 31446), E. coli Β, E. coli X1776 (N° ATCC 31537), E. coli W3110 (F-, gama-, prototrófica / N0 ATCC 27325), bacilos como, por exemplo, Bacillus subtilis, e outras enterobacteriaceae como, por exemplo, Salmonella typhimurium ou Serratia marcesans, e várias espécies de Pseudomonas. Uma célula hospedeira procariótica adequada é E. coli BL21 (Stratagene) , que é deficiente nas OmpT e Lon proteases, o que pode interferir com o isolamento de proteínas recombinantes intactas, e é útil com vetores dirigidos pelo promotor T7, por exemplo, os vetores pET. Outro procariota adequado é E. coli W3110 (N° ATCC 27325) . Quando expressos por procariotas, os peptídeos tipicamente contêm uma metionina ou uma formil metionina no terminal N, e não são glicosilados. No caso de proteínas de fusão, a metionina ou formil metionina do terminal N reside no terminal amino da proteína de fusão ou na seqüência sinalizadora da proteína de fusão. Evidentemente, esses exemplos são apenas ilustrativos, e não limitantes.

Além de procariotas, micróbios eucarióticos como, por exemplo, fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou de expressão adequados para vetores que codificam proteína de fusão. Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucariótico inferior comumente usado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Naturel 290: 140 (1981); EP 139.383 publicada em 2 de maio de 1985) ; hospedeiros de Kluyveromyces (Patente U.S. N0 4.94 3.52 9; Fleer e cols., Bio/Technology, 9: 968- 975 (1991)) como, por exemplo, K. Iactis (MW98-8C, CBS683, CBS4 574; Louvencourt e cols., J. Bacteriol., 154(2): 737- 742 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (N° ATCC 16.045), K. wickeramii (N° ATCC 24.178), K. waltii (N° ATCC 56.500), K. drosophilarum (N° ATCC 36.906; Van den Berg e cols., Bio,/ Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna e cols., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76: 5.259-5.263 (1979)); Schwarmiomyces como, por exemplo, Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538 publicada em 31 de outubro de 1990); e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada em 10 de janeiro de 1991), e hospedeiros de Aspergillus como, por exemplo, A. nidulans (Ballance e cols., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn e cols., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1.470-1.474 (1984)) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985)). Leveduras metilotróficas são aqui adequadas e incluem, sem limitação, leveduras capazes de crescer em metanol selecionadas dos gêneros que consistem em Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Uma lista de espécies específicas que são exemplares dessa classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, "The Biochemistry of Metilotrophs", 269 (1982). Células hospedeiras também incluem células de inseto como, por exemplo, Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, além de células de plantas.

Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem, sem limitação, linhagens de células HeLa, de ovário de hamster chinês (CHO), COS-7, de células L, C127, 3T3, BHK, CHL-I1 NSO, HEK293, WI38, BHK, C127 ou MDCK. Outra linhagem de células de mamíferos exemplar é CHL-I. Quando for usada CHL-1, será incluída higromicina como um marcador de seleção eucariótica. Células CHL-I são derivadas de células de melanoma RPMI 7032, uma linhagem celular humana facilmente disponível. Células adequadas para uso nesta invenção são disponíveis comercialmente pela ATCC.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula hospedeira não humana. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula CHO. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula 293.

As moléculas de CR2-FH podem ser isoladas por diversos métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, quando a molécula de CR2-FH for uma proteína de fusão secretada nos meios de crescimento, a molécula poderá ser purificada diretamente dos meios. Caso a proteína de fusão não seja secretada, ela será isolada de lisados de células. A ruptura das células pode ser feita por qualquer método convencional, incluindo ciclos de congelamento- descongelamento, sonificação, ruptura mecânica, ou o uso de agentes de Iise celular. As moléculas de CR2-FH podem ser obtidas por vários métodos. Esses incluem, sem limitação, cromatografia por imunoafinidade, cromatografia de fase reversa, cromatografia por troca catiônica, cromatografia por troca aniônica, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia por filtração em gel e HPLC. Por exemplo, a molécula de CR2-FH pode ser purificada por cromatografia por imunoafinidade com a utilização de um anticorpo que reconhece a porção CR2 ou de um anticorpo que reconhece a porção FH, ou ambos. Em algumas modalidades, é usado um anticorpo que reconhece os primeiros dois domínios SCR do terminal N de CR2 para a purificação da molécula de CR2-FH. Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH é purificada por cromatografia por troca iônica.

O peptídeo pode ou não ser dobrado adequadamente quando expresso como uma proteína de fusão. Esses fatores determinam se a proteína de fusão deve ser desnaturada e re-dobrada e, caso deva, se esses procedimentos devem ser empregados antes ou depois da clivagem. Quando a desnaturação e a re-dobragem são necessárias, tipicamente o peptídeo será tratado com um agente caotrópico, por exemplo, HCl de guanidina, e depois será tratado com um tampão redox contendo, por exemplo, ditiotreitol reduzido e oxidado, ou glutationa nas proporções, pH e temperatura apropriados, de tal forma que o peptídeo seja re-dobrado em sua estrutura nativa.

As moléculas de CR2-FH aqui descritas também podem conter um tag (por exemplo, um tag clivável) para purificação. Esse tag pode estar fundido ao terminal C ou ao terminal N da porção CR2 ou da porção FH, e pode ser usado para facilitar a purificação de proteínas.

Em algumas modalidades, a molécula de CR2-FH poderia ser sintetizada de novo no todo ou em parte, com o uso de métodos químicos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as seqüências de aminoácidos componentes podem ser sintetizadas por técnicas de fase sólida, clivadas da resina, e purificadas por cromatografia líquida preparativa de alto rendimento, seguida por ligação química, para formar um polipeptídeo desejado. A composição dos peptídeos sintéticos pode ser confirmada por análise ou seqüenciamento de aminoácidos.

As moléculas de CR2-FH podem ser testadas quanto às suas propriedades desejadas com a utilização de ensaios in vitro ou in vivo. Por exemplo, a ligação de CR2-FH ao ligante de CR2 pode ser determinada pelo método de ressonância por plasmônio de superfície. Como exemplo, a análise cinética da interação da CR2-FH com C3dg-biotina pode ser realizada com a utilização de medidas de ressonância por plasmônio de superfície (SPR) feitas em um instrumento BIAcore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia). C3dg humano-biotina pode ser ligado à superfície de chips sensores de estreptavidina BIAcore por injeção de C3dg- biotina sobre a superfície de uma célula de fluxo do chip. A ligação pode ser avaliada sobre uma gama de concentrações de CR2-FH. A associação da molécula de CR2-FH com o ligante pode ser monitorada por certo período de tempo (por exemplo, 12 0 segundos) , após o qual se permite que o complexo se dissocie na presença apenas de tampão por um período de tempo adicional (por exemplo, 120 segundos). A ligação de fragmentos da proteína CR2 de fusão às células de fluxo com C3dg imobilizado pode ser corrigida para a ligação para o controle das células de fluxo. Os dados da ligação podem ser ajustados a um modelo de ligação de Langmuir 1:1 com o uso do software "BIAevaluation" Versão 3.1 (BIAcore) , e avaliados para o melhor ajuste. Os perfis de dissociação cinética obtidos podem ser usados para calcular as taxas on e off (ka e kd) e as constantes de afinidade (KD) com a utilização do programa "BIAevaluation" Versão 3.1. São conhecidos na técnica outros métodos de ensaio para a ligação de ligante que também podem ser usados.

O ensaio de complemento de zimosan in vitro pode ser usado para determinar a atividade inibidora do complemento de moléculas de CR2-FH. A Iise de eritrócitos de coelho por soro em Mg-EGTA é outra medida de atividade que pode ser utilizada. A Iise em Mg-EGTA de eritrócitos humanos ou de carneiros que foram submetidos ã remoção de ácido siálico permite medidas adicionais da atividade. Composições farmacêuticas

Também são aqui fornecidas composições farmacêuticas que compreendem uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem ser adequadas a diversos modos de administração aqui descritos, incluindo, por exemplo, administração sistêmica ou localizada. As composições farmacêuticas podem estar na forma de colírios, soluções injetáveis, ou em uma forma adequada à inalação (através da boca ou do nariz) ou à administração oral. As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser embaladas em dosagens unitárias únicas ou em formas de multidosagens.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado à administração a seres humanos. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem uma molécula de CR2-FH e um veiculo farmaceuticamente aceitável adequado à injeção intra-ocular. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem uma molécula de CR2-FH e um veiculo farmaceuticamente aceitável adequado à aplicação tópica no olho. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado à injeção intravenosa. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado à injeção nas artérias (por exemplo, artérias renais).

As composições são geralmente formuladas como estéreis, substancialmente isotônicas, e totalmente de acordo com as regulamentações de "Good Manufacturing Practice" (GMP) do F.D.A. americano ("U.S. Food and Drug Administration" - agência governamental americana que regula e fiscaliza a fabricação de comestíveis, drogas e cosméticos). Em algumas modalidades, a composição é livre de patógenos. Para injeção, a composição farmacêutica pode estar na forma de soluções líquidas, por exemplo, em tampões fisiologicamente compatíveis como, por exemplo, solução de Hank ou solução de Ringer. Além disso, a composição farmacêutica de CR2-FH também pode estar em uma forma sólida e ser re-dissolvida ou suspensa imediatamente antes do uso. Também são incluídas composições Iiofilizadas.

Para administração oral, as composições farmacêuticas podem assumir a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparadas por meios convencionais, com excipientes farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, agentes de ligação (por exemplo, amido pré-gelatinizado de milho, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); enchimentos (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou fosfato de cálcio hidrogênio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de sódio amido); ou agentes umidificantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio) . Preparações líquidas para administração oral podem assumir a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou podem ser apresentadas como um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado, antes do uso. Essas preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis) ; agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoas, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados) ; e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações também podem conter sais de tamponamento, agentes flavorizantes, colorantes e adoçantes, como adequado.

A presente invenção, em algumas modalidades, fornece composições que compreendem uma molécula de CR2-FH e um veículo farmaceuticamente aceitável adequado à administração ao olho. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, por exemplo, água e óleo, incluindo aqueles originados do petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, e semelhantes. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose, polietileno glicol (PEG) e glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, glicerol, propileno, água, e semelhantes. A composição farmacêutica, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de agentes umidificantes ou emulsificantes, ou agentes de tamponamento do pH. A molécula de CR2-FH e outros componentes da composição podem ser encapsulados em polímeros ou colas de fibrina para permitir a liberação controlada da molécula. Essas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, pomada, gel ou outras composições sólidas ou semi-sólidas, e semelhantes. As composições tipicamente possuem um pH na faixa de 4,5 a 8,0. As composições também devem ser formuladas para terem valores osmóticos que sejam compatíveis com o humor aquoso do olho e tecidos oftálmicos. Esses valores osmóticos estarão geralmente na faixa de cerca de 200 a cerca de 400 miliosmoles por quilograma de água ("mOsm/kg"), mas serão preferivelmente de cerca de 300 mOsm/kg.

Em algumas modalidades, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada á injeção intravenosa, intraperitoneal ou intravítrea. Tipicamente, as composições para injeção são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente de solubilização e um anestésico local como, por exemplo, lidocaina, para reduzir a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados juntos na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou um concentrado sem água em um recipiente lacrado hermeticamente como, por exemplo, uma ampola ou sachê, indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição for administrada por infusão, ela poderá ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo água ou solução salina estéril de grau farmacêutico. Quando a composição for administrada por injeção, poderá ser fornecida uma ampola de água estéril ou solução salina para injeção, de tal forma que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

As composições podem ainda compreender ingredientes adicionais, por exemplo, conservantes, tampões, agentes de tonicidade, antioxidantes e estabilizantes, agentes umidificantes ou de clarificação não iônicos, agentes que aumentam a viscosidade, e semelhantes.

Conservantes adequados para uso em uma solução incluem poliquaternium-1, cloreto de benzalcônio, timerosal, clorobutanol, metil parabeno, propil parabeno, álcool feniletilico, edetato dissódico, ácido sórbico, cloreto de benzetônio, e semelhantes. Tipicamente (mas não necessariamente), esses conservantes são empregados em um nível de 0,001% a 1,0% por peso. Tampões adequados incluem ácido bórico, bicarbonato de sódio e potássio, boratos de sódio e potássio, carbonato de sódio e potássio, acetato de sódio, bifosfato de sódio, e semelhantes, em quantidades suficientes para manter o pH entre cerca de pH 6 e pH 8 e, preferivelmente, entre cerca de pH 7 e pH 7,5.

Agentes de tonicidade adequados são dextrana 40, dextrana 70, dextrose, glicerina, cloreto de potássio, propileno glicol, cloreto de sódio, e semelhantes, de tal forma que o equivalente de cloreto de sódio da solução oftálmica esteja na faixa de 0,9 mais ou menos 0,2%.

Antioxidantes e estabilizantes adequados incluem bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, tiossulfito de sódio, tiouréia, e semelhantes. Agentes umidificantes e de clarificação adequados incluem polissorbato 80, polissorbato 20, poloxâmero 282 e tiloxapol. Agentes de aumento da viscosidade adequados incluem dextrana 40, dextrana 70, gelatina, glicerina, hidroxietil celulose, hidroximetilpropilcelulose, lanolina, metilcelulose, vaselina, polietileno glicol, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetil celulose, e semelhantes.

O uso de agentes de aumento da viscosidade para a geração de composições tópicas com viscosidades acima da viscosidade de soluções aquosas simples pode ser desejável para aumentar a absorção ocular dos compostos ativos pelos tecidos-alvo ou para aumentar o tempo de retenção no olho. Esses agentes para aumento da viscosidade incluem, por exemplo, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, metil celulose, hidróxi propil metilcelulose, hidroxietil celulose, carboximetil celulose, hidróxi propil celulose ou outros agentes conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Esses agentes são empregados tipicamente em um nível de 0,01% a 2% por peso.

Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica para a liberação de um nucleotídeo que codifica uma molécula de CR2-FH. A composição farmacêutica para terapia gênica pode estar em um diluente aceitável, ou pode compreender uma matriz de liberação lenta na qual o veículo ou composto de liberação gênica é embebido.

Alternativamente, quando o sistema de liberação gênica completo puder ser produzido intacto por células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a composição farmacêutica poderá compreender uma ou mais células que produzem o sistema de liberação gênica.

Na prática clínica, pode ser introduzido um sistema de liberação gênica para uma terapêutica gênica em um indivíduo por qualquer um dentre diversos métodos. Por exemplo, uma composição farmacêutica do sistema de liberação gênica pode ser introduzida sistemicamente, por exemplo, por injeção intravenosa, e a transdução específica da proteína nas células-alvo ocorre predominantemente pela especificidade da transfecção produzida pelo veículo de liberação gênica, da expressão do tipo de célula ou do tipo de tecido em função das seqüências reguladoras da transcrição que controlam a expressão do gene receptor, ou uma combinação destes. Em outras modalidades, a liberação inicial do gene recombinante é mais limitada com a introdução no animal sendo bem localizada. Por exemplo, o veículo de liberação gênica pode ser introduzido por cateter; veja a Patente U.S. 5.328.470, ou por injeção estereotática, Chen e cols. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 3.054-3.057. Um polinucleotídeo que codifica uma molécula de CR2-FH pode ser liberado em uma construção de terapia gênica por eletroporação com a utilização de técnicas descritas por Dev e cols. (1994), Câncer Treat. Ver. 20: 105-115.

Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica para liberação gênica ao olho. Soluções oftálmicas úteis para o armazenamento e/ou liberação de vetores de expressão foram apresentadas, por exemplo, em WO 03 0777 96A2.

Usos de moléculas de CR2-FH e composições destas

As moléculas de CR2-FH aqui descritas podem funcionar para inibir especificamente a ativação in vivo do complemento na via alternativa do complemento e as manifestações inflamatórias que a acompanham, por exemplo, o recrutamento e a ativação de macrófagos, neutrófilos, plaquetas e mastócitos, edema, dano tecidual e ativação direta de células locais e endógenas. As composições que compreendem essas moléculas podem, portanto, ser usadas para o tratamento de doenças ou condições que são mediadas por ativação excessiva ou descontrolada do sistema complemento, particularmente doenças ou condições mediadas por ativação excessiva ou descontrolada da via alternativa do complemento. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de doenças que envolvem processo local de inflamação. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de doenças associadas às deficiências de FH (por exemplo, uma diminuição no nível de FH, diminuição na atividade de FH ou ausência de FH do tipo selvagem ou protetor) , incluindo, por exemplo, degeneração macular relacionada à idade, glomerulonefrite membrano- proliferativa, doença proteinúrica, síndrome hemolítico- urêmica, infecção microbiana recorrente, isquemia por re- perfusão (por exemplo, isquemia por re-perfusão renal ou isquemia por re-perfusão intestinal), rejeição de transplante de órgão e inflamação crônica como, por exemplo, artrite reumatóide.

Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de uma doença na qual a via alternativa do complemento está implicada (por exemplo, degeneração macular, por exemplo, DMRI) em um individuo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecido um método de inibição da ativação do complemento em um indivíduo que possui uma doença na qual a via alternativa do complemento está implicada (por exemplo, degeneração macular, por exemplo, DMRI), que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, é fornecido um método de inibição de inflamação em um indivíduo que possui uma doença na qual a via alternativa está implicada (por exemplo, degeneração macular, por exemplo, DMRI), que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste.

O termo "tratamento" ou "para tratar" uma doença é definido como a administração de uma ou mais moléculas de CR2-FH, com ou sem outros agentes terapêuticos, a fim de atenuar, melhorar, estabilizar, reverter, tornar mais lenta, retardar, evitar, reduzir ou eliminar a doença ou um sintoma da doença, ou para retardar ou interromper a progressão da doença ou de um sintoma da doença. Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para tratar uma doença, como definida acima.

Um "indivíduo" é um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um ser humano. Mamíferos incluem, sem limitação, animais de criação, animais de esporte, animais de estimação, primatas, camundongos e ratos. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano.

Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo que não um ser humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um modelo animal para o estudo de uma doença na qual a via alternativa do complemento está implicada. Indivíduos passíveis de tratamento incluem aqueles que estejam assintomáticos no momento, mas que estejam em risco de desenvolver um distúrbio sintomático relacionado ã degeneração macular em um momento posterior. Por exemplo, indivíduos humanos incluem aqueles que possuem parentes que apresentaram uma doença desse tipo, e aqueles cujo risco seja determinado por análise de marcadores genéticos ou bioquímicos, por métodos bioquímicos, ou por outros ensaios como, por exemplo, ensaio de proliferação de células T. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano que possui uma mutação ou polimorfo em seu gene FH que indica uma suscetibilidade aumentada ao desenvolvimento de uma doença na qual a via alternativa do complemento está implicada (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade). Em algumas modalidades, o indivíduo possui um haplótipo do tipo selvagem ou protetor de FH. Polimorfos diferentes de FH foram revelados na Publicação de Patente U.S. N0 20070020647, que é aqui incorporada em sua totalidade.

As composições aqui descritas são particularmente úteis para o tratamento de degeneração macular, por exemplo, degeneração macular relacionada à idade (DMRI). A DMRI é caracterizada clinicamente por perda progressiva da visão central que ocorre em conseqüência de lesão das células fotorreceptoras em uma área da retina denominada mácula. A DMRI foi classificada de forma ampla em dois estados clínicos: uma forma úmida e uma forma seca, com a forma seca constituindo 80-90% do total dos casos. A forma seca é caracterizada clinicamente pela presença de drusas maculares, que são depósitos localizados entre o epitélio pigmentar da retina (RPE) e a membrana de Bruch, e por atrofia geográfica caracterizada por morte da célula do RPE com atrofia dos fotorreceptores subjacentes. A DMRI úmida, que é responsável por aproximadamente 90% de perda séria da visão, está associada à neovascularização na área da mácula e ao extravasamentos desses novos vasos. 0 acúmulo de sangue e de líquido pode causar descolamento da retina, seguido por degeneração rápida dos fotorreceptores e perda de visão. É geralmente aceito que a forma úmida de DMRI é precedida e surge da forma seca.

A análise do conteúdo das drusas em pacientes com DMRI demonstrou um grande número de proteínas inflamatórias que incluem proteínas amilóides, fatores da coagulação, e um grande número de proteínas da via do complemento. Uma variação genética no fator H do complemento eleva substancialmente o risco de degeneração macular relacionada à idade (DMRI), sugerindo que a ativação descontrolada do complemento está subjacente à patogênese da DMRI (Edward e cols., Science 2005, 308: 421; Haines e cols., Science 2005, 308: 419; Klein e cols., Science 308: 385-389; Hageman e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2005, 102: 7.227) .

A presente invenção fornece métodos de tratamento de DMRI (por exemplo, formas úmidas ou secas de DMRI) por administração de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento ou prevenção de um ou mais aspectos ou sintomas de DMRI, incluindo, sem limitação, a formação de drusas oculares, inflamação no olho ou do tecido ocular, perda de células fotorreceptoras, perda de visão (incluindo, por exemplo, acuidade visual e campo visual), neovascularização (por exemplo, neovascularização coroidiana ou CNV) e descolamento da retina. Também estão incluídos outros aspectos relacionados como, por exemplo, degeneração dos fotorreceptores, degeneração do RPE, degeneração retiniana, degeneração coriorretiniana, degeneração de cones, disfunção retiniana, lesão retiniana em resposta ã exposição à luz (por exemplo, exposição constante à luz) , lesão da membrana de Bruch, perda da função do RPE, perda de integridade da arquitetura histológica das células e/ou da matriz extracelular macular normal, perda de função das células na mácula, distrofia dos fotorreceptores, mucopolissacaridoses, distrofias de bastonetes e cones, distrofias de cones e bastonetes, uveite anterior e posterior, e neuropatia diabética.

Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de degeneração macular (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade ou DMRI) em um indivíduo, que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é uma forma seca de DMRI. Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é uma forma úmida de DMRI.

Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento (por exemplo, redução, retardo, eliminação ou prevenção) da formação de drusas no olho de um indivíduo, que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento (por exemplo, redução, retardo, eliminação ou prevenção) de inflamação no olho de um indivíduo, que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento (por exemplo, redução, retardo, eliminação ou prevenção) de perda de células fotorreceptoras em um indivíduo, que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento (por exemplo, redução, retardo, eliminação ou prevenção) de perda de células fotorreceptoras em um indivíduo, que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou

um fragmento deste. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento (por exemplo, redução, retardo, eliminação ou prevenção) de neovascularização associada à DMRI, que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento (por exemplo, redução, retardo, eliminação ou prevenção) de descolamento da retina associado à DMRI, que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de melhora (incluindo, por exemplo, diminuição, retardo ou bloqueio da perda) da acuidade visual ou do campo visual no olho de um indivíduo, que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste.

Além de degeneração macular, outras doenças oculares que podem ser tratadas pelos métodos da presente invenção incluem, por exemplo, retinite pigmentosa, retinopatia diabética e outras doenças oculares que envolvem um processo inflamatório local. Em algumas modalidades, a doença ocular é retinopatia diabética. Em algumas modalidades, a doença ocular é retinite pigmentosa.

Os métodos aqui descritos também podem ser úteis para o tratamento de certas doenças renais. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de glomerulonefrite membrano-proliferativa do tipo II (MPGN II). MPGN II é uma doença renal rara que leva à proteinúria persistente, hematúria e síndrome nefrítica. A deficiência de FH e a disfunção na MPGN II foram relatadas em vários casos. Por exemplo, foram encontradas mutações no FH em pacientes humanos com MPGN II. Porcos da raça norueguesa Yorkshire possuem defeitos do FH que são herdados em um padrão recessivo. Esses animais desenvolvem MPGN II e apresentam depósitos maciços de complemento nos glomérulos renais, e morrem em um estágio inicial em conseqüência de insuficiência renal. Além disso, foi descrito um auto- anticorpo que reconhece FH em um paciente com MPGN II hipocomplementêmica. Dessa forma, o direcionamento do FH aos locais de ativação do complemento terá efeitos terapêuticos sobre um indivíduo que possui MPGN II. Conseqüentemente, em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de MPGN II em um indivíduo, que compreendem a administração ao indivíduo de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de proteinúria associada â MPGN II. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de hematúria associada à MPGN II. Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de síndrome nefrítica associada à MPGN II.

Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de síndrome hemolítico-urêmica (HUS). A HUS é uma doença que consiste em anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia e insuficiência renal aguda, causadas por degradação plaquetária contínua na periferia e trombina plaquetária na microcirculação do rim (Zipfel, "Seminars in Thrombosis Hemostasis", 2001, 27 (3) : 191-199) . Há agora evidências consideráveis de que a forma não diarréica da HUS (D-HUS) está associada a alternações e mutações de FH. Além disso, foram relatados auto-anticorpos ao FH em pacientes com HUS. Dessa forma, o direcionamento do FH aos locais de ativação do complemento terá efeitos terapêuticos sobre um indivíduo que possui HUS. Conseqüentemente, em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de HUS em um indivíduo, que compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH que compreende: a) uma porção CR2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de anemia hemolítica microangiopática associada ã HUS. Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de trombocitopenia associada à HUS. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de insuficiência renal aguda associada à HUS.

Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é lúpus eritematoso sistêmico, por exemplo, nefrite lúpica. O lúpus eritematoso sistêmico (SLE) é a doença autoimune prototípica que resulta em envolvimento de vários órgãos. Essa anti-auto-resposta é caracterizada por auto-anticorpos dirigidos contra diversos componentes celulares nucleares e citoplasmáticos. Esses auto-anticorpos se ligam aos seus respectivos antígenos, formando complexos imunes que circulam e eventualmente se depositam nos tecidos. Essa deposição de complexo imune causa inflamação crônica e lesão tecidual. As vias do complemento (incluindo a via alternativa do complemento) estão implicadas na patologia do SLE e, portanto, os métodos aqui fornecidos são úteis para o tratamento de SLE (por exemplo, nefrite lúpica). Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é artrite reumatóide. A artrite reumatóide é uma doença crônica que pode exibir diversas manifestações sistêmicas. Essa doença possui uma etiologia desconhecida e caracteristicamente exibe uma sinovite inflamatória persistente que normalmente envolve as articulações periféricas em uma distribuição simétrica. A inflamação mediada pelo complemento que causa destruição da cartilagem, erosões ósseas e, por fim, deformidades articulares é a característica mais importante dessa doença. Portanto, os métodos aqui fornecidos são úteis para o tratamento de artrite reumatóide.

Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é isquemia por re-perfusão. A lesão de isquemia por re- perfusão (I/R) refere-se à lesão inflamatória do endotélio e tecidos parenquimatosos subjacentes após a re-perfusão de tecidos hipóxicos. É uma síndrome geral responsável pela lesão aguda e crônica de vários tecidos, incluindo, por exemplo, miocárdio, sistema nervoso central, membros traseiros e intestino. A lesão da isquemia por re-perfusão pode causar necrose e lesão celular irreversível. A via do complemento (incluindo a via alternativa do complemento) é um mediador importante da lesão por I/R. Portanto, os métodos aqui fornecidos são úteis para o tratamento de isquemia por re-perfusão que ocorre em qualquer órgão ou tecido, incluindo, sem limitação, lesão de isquemia por re- perfusão intestinal, lesão de isquemia por re-perfusão renal, lesão de isquemia por re-perfusão cardíaca, lesão de isquemia por re-perfusão de outros órgãos internos como, por exemplo, do pulmão ou do fígado, lesão de isquemia por re-perfusão do sistema nervoso central, lesão de isquemia por re-perfusão dos membros ou dos dedos, hipovolemia induzida por trauma, ou lesão de isquemia por re-perfusão de qualquer órgão ou tecido transplantado. A lesão de isquemia por re-perfusão também pode ocorrer em conjunto com várias outras condições, incluindo, sem limitação, acidente vascular cerebral, lesão da medula vertebral, choque hipovolêmico induzido por traumas e doenças autoimunes, por exemplo, artrite reumatóide (por exemplo, que pode piorar acentuadamente por lesão isquêmica da sinóvia) ou várias outras doenças inflamatórias (doenças mediadas por inflamação ou nas quais a inflamação é um sintoma que pode causar ou estar associado a eventos isquêmicos e re-perfusão) . Outras condições e doenças nas quais a lesão de isquemia por re-perfusão ocorre serão conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de tratamento de uma doença associada às drusas. O termo "doença associada às drusas" refere-se a qualquer doença na qual ocorre a formação de drusas ou placa de doença extracelular semelhante a drusas, e na qual drusas ou uma placa de doença extracelular semelhante a drusas causa ou contribui para ela ou representa um sinal desta. Por exemplo, DMRI, caracterizada pela formação de drusas maculares, é considerada uma doença associada às drusas. Doenças não oculares relacionadas às drusas incluem, sem limitação, amiloidose, elastose, doença de depósito denso e/ou aterosclerose. O termo "doença relacionada às drusas" também inclui glomerulonefrite (por exemplo, MPGN II) .

Outras doenças nas quais a via alternativa do complemento está implicada que podem ser tratadas pelos métodos da presente invenção incluem, por exemplo: (1) dano tecidual em conseqüência de isquemia por re-perfusão após infarto agudo do miocárdio, aneurisma, acidente vascular cerebral, choque hemorrágico, lesão por esmagamento, insuficiência de múltiplos órgãos, choque hipovolêmico, isquemia intestinal, lesão da medula vertebral e lesão cerebral traumática; (2) distúrbios inflamatórios, por exemplo, queimaduras, endotoxemia e choque séptico, síndrome do sofrimento respiratório do adulto, derivação cardiopulmonar, hemodiálise; choque anafilático, asma grave, angioedema, doença de Crohn, anemia falciforme, glomerulonefrite pós-estreptocócica, nefrite membranosa e pancreatite; (3) rejeição de transplante, por exemplo, rejeição hiperaguda de xenoenxerto; (4) doenças relacionadas à gravidez como, por exemplo, perda fetal recorrente e pré-eclampsia, e (5) reações farmacológicas adversas, por exemplo, alergia a fármacos, síndrome de extravasamento vascular induzido por IL-2 e alergia a meios de contraste radiográficos. Distúrbios autoimunes que incluem, sem limitação, miastenia gravis, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, enfisema, obesidade, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, miastenia gravis, diabetes melito insulino- dependente, encefalomielite aguda disseminada, doença de Addison, síndrome do anticorpo anti-fosfolipídeo, hepatite autoimune, doença de Crohn, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, doença de Hashimoto, púrpura trombocitopênica idiopática, pênfigo, síndrome de Sjógren, e arterite de Takayasu, também podem ser tratados com os inibidores da invenção.

Em algumas modalidades, a doença a ser tratada é qualquer uma das seguintes: complicações pós-derivação cardiopulmonar; infarto do miocárdio; isquemia/lesão de re- perfusão; acidente vascular cerebral; síndrome do sofrimento respiratório agudo (ARDS); sépsis; lesão por queimadura; inflamação associada à derivação cardiopulmonar e hemodiálise; plasmaferese; plaquetoferese; Ieucoferese; extracorpórea; oxigenação por membrana (ECMO); precipitação de LDL extracorpórea induzida por heparina (HELP); resposta alérgica induzida por meios de contraste radiográfico; rejeição de transplantes; e outras condições inflamatórias e doenças autoimunes/de complexo imune como, por exemplo, esclerose múltipla, miastenia gravis, pancreatite, artrite reumatóide, doença de Alzheimer, asma, lesão térmica, choque anafilático, inflamação do intestino, urticária, angioedema, vasculite, glomerulonefrite e síndrome de Sjógren, lúpus eritematoso e nefrite glomerular.

As composições aqui descritas podem ser administradas a um indivíduo por meio de qualquer via, incluindo, sem limitação, a via intravenosa (por exemplo, por bombas de infusão), a via intraperitoneal, intra-ocular, intra- arterial, intrapulmonar, oral, por inalação, intravesicular, intramuscular, intratraqueal, subcutânea, intra-ocular, intratecal, transdérmica, transpleural, intra-arterial, tópica, por inalação (por exemplo, como névoas de sprays), mucosa (por exemplo, por meio da mucosa nasal), subcutânea, transdérmica, gastrintestinal, intra- articular, intracisterna, intraventricular, retal (ou seja, por meio de supositórios) , por via vaginal (ou seja, por meio de pessário), por via intracraniana, intra-uretral, intra-hepática e intratumoral. Em algumas modalidades, as composições são administradas sistemicamente (por exemplo, por injeção intravenosa). Em algumas modalidades, as composições são administradas localmente (por exemplo, por injeção intra-arterial ou intra-ocular).

Em algumas modalidades, as composições são administradas diretamente no olho ou no tecido ocular. Em algumas modalidades, as composições são administradas topicamente no olho, por exemplo, na forma de colírios. Em algumas modalidades, as composições são administradas por injeção no olho (injeção intra-ocular) ou nos tecidos associados ao olho. As composições podem ser administradas, por exemplo, por injeção intra-ocular, por injeção periocular, por injeção sub-retiniana, injeção intravítrea, injeção trans-septal, injeção subescleral, injeção intracoroidiana, injeção intracameral, injeção subconjuntival, por injeção subtenoniana, injeção retrobulbar, por injeção peribulbar ou por liberação justaescleral posterior. Esses métodos são conhecidos na técnica. Por exemplo, para uma descrição de vias perioculares exemplares para liberação retiniana de fármacos, veja "Periocular routes for retinal drug delivery", Raghava e cols. (2004), Expert Opin. Drug Deily. 1(1): 99-114. As composições podem ser administradas, por exemplo, no vítreo, humor aquoso, esclera, conjuntiva, na área entre a esclera e a conjuntiva, nos tecidos da retina e coróide, na mácula ou em outra área no olho ou próxima ao olho de um indivíduo. As composições também podem ser administradas ao indivíduo como um implante. Implantes preferidos são formulações de liberação sustentada biocompativeis e/ou biodegradáveis que liberam gradualmente os compostos ao longo de um período de tempo. Implantes oculares para liberação de fármacos são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. N°s 5.501.856, 5.476.511 e 6.331.313. As composições também podem ser administradas ao indivíduo com a utilização de iontoforese, incluindo, sem limitação, os métodos iontoforéticos descritos na Patente U.S. N0 4.454.151 e nas Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos 2003/0181531 e 2004/0058313.

Em algumas modalidades, as composições são administradas por via intravascular, por exemplo, por via intravenosa (IV) ou intra-arterial. Em algumas modalidades (por exemplo, para o tratamento de doenças renais) , as composições são administradas diretamente nas artérias (por exemplo, artérias renais).

A quantidade eficaz ótima das composições pode ser determinada empiricamente, e dependerá do tipo e da gravidade da doença, da via de administração, da progressão da doença e da saúde, da massa e área corporal do indivíduo. Essas determinações fazem parte da técnica. A quantidade eficaz também pode ser determinada com base em ensaios in vitro de ativação do complemento. Exemplos de dosagens de moléculas de CR2-FH que podem ser usadas para os métodos aqui descritos incluem, sem limitação, uma quantidade eficaz dentro da faixa de dosagem de cerca de 0,01 μg/kg a cerca de 300 mg/kg, ou dentro de uma faixa de cerca de 0,1 μg/kg a cerca de 40 mg/kg, ou com cerca de 1 MS/kg a cerca de 20 mg/kg, ou dentro de cerca de 1 μg/kg a cerca de 10 mg/kg. Por exemplo, quando administrada por via intra-ocular, a composição pode ser administrada em faixas baixas de microgramas, incluindo, por exemplo, cerca de 0,1 Hçj/kg ou menos, cerca de 0,05 ou menos, ou 0,01 ou menos. Em algumas modalidades, a quantidade de CR2-FH administrada a um indivíduo é de cerca de 10 μg a cerca de 500 mg por dose, incluindo, por exemplo, de cerca de 10 μg a cerca de 50 μg, cerca de 50 μg a cerca de 100 μg, cerca de 100 μg a cerca de 200 μg, cerca de 200 μg a cerca de 300 μg, cerca de 300 μg a cerca de 500 μg, cerca de 500 μg a cerca de 1 mg, cerca de 1 mg a cerca de 10 mg, cerca de 10 mg a cerca de 50 mg, cerca de 50 mg a cerca de 100 mg, cerca de 100 mg a cerca de 200 mg, cerca de 200 mg a cerca de 300 mg, cerca de 300 mg a cerca de 400 mg, ou cerca de 400 mg a cerca de 50 0 mg por dose.

As composições de CR2-FH podem ser administradas em uma dose diária única, ou a dose diária total pode ser administrada em dosagens divididas de duas, três ou quatro vezes ao dia. As composições também podem ser administradas menos freqüentemente do que diariamente, por exemplo, seis vezes por semana, cinco vezes por semana, quatro vezes por semana, três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, ou uma vez a cada seis meses. As composições também podem ser administradas em uma formulação de liberação sustentada como, por exemplo, um implante que libera gradualmente a composição para uso ao longo de um período de tempo, e que permite que a composição seja administrada menos freqüentemente, por exemplo, uma vez por mês, uma vez a cada 2-6 meses, uma vez por ano, ou até mesmo uma administração única. Os dispositivos de liberação sustentada (por exemplo, péletes, nanoparticulas, micropartículas , nanoesferas, microesferas, e semelhantes) podem ser administrados por injeção ou implantados cirurgicamente em várias localizações no olho ou no tecido associado ao olho como, por exemplo, por injeção intra-ocular,intravítrea,sub-retiniana, periocular, subconjuntival ou subtenoniana.

As composições farmacêuticas podem ser administradas isoladamente ou em combinação com outras moléculas conhecidas por terem um efeito benéfico sobre a adesão retiniana ou ao tecido retiniano danificado, incluindo moléculas capazes de reparo e regeneração tecidual e/ou inibição da inflamação. Exemplos de co-fatores úteis incluem agentes anti-VEGF (por exemplo, um anticorpo contra VEGF), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), fator neurotrófico ciliar (CNTF), axoquina (uma muteina de CNTF) , fator inibidor de leucemia (LIF) , neutrotrofina-3 (NT-3), neutrotrofina-4 (NT-4), fator de crescimento de nervos (NGF), fator de crescimento insulina-Iike II, prostaglandina E2, fator de sobrevida de 3 0 kD, taurina e vitamina A. Outros co-fatores úteis incluem co-fatores que aliviam os sintomas, incluindo anti-sépticos, antibióticos, agentes antivirais e antifúngicos, e analgésicos e anestésicos.

Terapia gênica

As moléculas de CR2-FH também podem ser liberadas por expressão da proteína de fusão de CR2-FH in vivo, o que é freqüentemente denominado "terapia gênica". Por exemplo, as células podem ser projetadas com um polinucleotídeo (DNA ou RNA) que codifica a proteína de fusão ex vivo; as células projetadas são então fornecidas a um indivíduo a ser tratado com a proteína de fusão. Esses métodos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser projetadas por procedimentos conhecidos na técnica com o uso de uma partícula retroviral que contém RNA que codifica a proteína de fusão da presente invenção.

A liberação local das proteínas de fusão da presente invenção com a utilização de terapia gênica pode fornecer o agente terapêutico à área-alvo, por exemplo, ao olho ou ao tecido ocular.

Métodos de liberação gênica são conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, sem limitação: 1) transferência direta de DNA; veja, por exemplo, Wolff e cols. (1990) Science 247: 1.465-1.468; 2) transferência de DNA mediada por lipossomo; veja, por exemplo, Caplen e cols. (1995) Nature Med. 3: 39-46; Crystal (1995) Nature Med. 1: 15-17; Gao e Huang (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 280- 285; 3) transferência de DNA mediada por retrovírus; veja, por exemplo, Kay e cols. (1993) Science 262: 117-119; Anderson (1992) Science 256: 808-813; 4) transferência de DNA mediada por vírus de DNA. Esses vírus de DNA incluem adenovírus (preferivelmente vetores baseados em Ad2 ou Ad5), herpes vírus (preferivelmente vetores baseados no vírus do herpes simples), e parvovírus (preferivelmente vetores baseados em parvovírus "defeituosos" ou não autônomos, mais preferivelmente vetores baseados em vírus adeno-associados, principalmente vetores baseados em AAV- 2). Veja, por exemplo, Ali e cols. (1994) Gene Therapy 1: 367-384; Patente U.S. N0 4.797.368, aqui incorporada por referência, e Patente U.S. N0 5.139.941.

Retrovírus dos quais os vetores de plasmídeo retroviral aqui mencionado anteriormente podem ser derivados incluem, sem limitação, o vírus da leucemia do camundongo de Moloney, vírus da necrose esplênica, retrovírus como, por exemplo, o vírus do sarcoma de Rous, o vírus do sarcoma de Harvey, o vírus da leucose aviária, vírus da leucemia do macaco gibão, vírus da imunodeficiência humana, adenovírus, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus do tumor mamário. Em uma modalidade, o vetor de plasmídeo retroviral é derivado do vírus da leucemia do camundongo de Moloney.

Os adenovírus possuem a vantagem de ter uma ampla gama de hospedeiros, de poder infectar células em repouso ou terminalmente diferenciadas, por exemplo, neurônios ou hepatócitos, e parecem ser essencialmente não oncogênicos. Veja, por exemplo, Ali e cols. (1994), supra, p. 367. Os adenovírus parecem não se integrar no genoma do hospedeiro. Na medida em que eles existem de forma extracromossômica, o risco de mutagênese por inserção é grandemente reduzido (Ali e cols. (1994), supra, p. 373).

Os vírus adeno-associados exibem vantagens similares em relação aos vetores baseados em adenovírus. No entanto, AAVs exibem integração sítio-específica no cromossomo humano 19 (Ali e cols. (1994), supra, p. 377).

Os vetores de terapia gênica incluem um ou mais promotores. Em algumas modalidades, o vetor possui um promotor que dirige a expressão em vários tipos de células. Em algumas modalidades, o vetor possui um promotor que dirige a expressão em tipos de células específicos (por exemplo, células da retina ou células no rim) . Promotores adequados que podem ser empregados incluem, sem limitação, a LTR retroviral; o promotor de SV4 0; e o promotor de citomegalovírus humano (CVM) descrito em Miller e cols.

(1989) Biotechniques 7(9): 980-990, ou qualquer outro promotor (por exemplo, promotores celulares como, por exemplo, promotores de células eucarióticas que incluem, sem limitação, os promotores de histona, pol III e de beta- actina). Outros promotores virais que podem ser empregados incluem, sem limitação, promotores de adenovirus, promotores de timidina quinase (TK) e promotores de parvovirus B19. A seleção de um promotor adequado ficará evidente para aqueles habilitados na técnica a partir dos ensinamentos aqui contidos.

A seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína de fusão de CR2-FH está sob o controle de um promotor adequado. Promotores adequados que podem ser empregados incluem, sem limitação, promotores adenovirais, por exemplo, o promotor adenoviral principal tardio; ou promotores heterólogos, por exemplo, o promotor de citomegalovírus (CMV); o promotor do vírus sincicial respiratório (RSV); promotores indutíveis, por exemplo, o promotor de MMT, o promotor de metalotioneína; promotores de choque térmico; o promotor de albumina; o promotor de

ApoAl; promotores de globina humana; promotores virais de timidina quinase, por exemplo, o promotor de timidina quinase do herpes simples; LIRs retrovirais (incluindo as LTR retrovirais modificadas aqui descritas anteriormente); o promotor de β-actina; e promotor de hormônio de crescimento humano. Podem ser usados vetores de plasmídeo retroviral para a transdução de linhagens celulares de empacotamento para a formação de linhagens celulares produtoras. Exemplos de células de empacotamento que podem ser transfectadas são descritos em Miller (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14. Os vetores podem efetuar a transdução das células de empacotamento por qualquer meio conhecido na técnica. Esses meios incluem, sem limitação, eletroporação, o uso de lipossomos, e precipitação de CaPO.sub.4. Em uma alternativa, o vetor de plasmídeo retroviral pode ser encapsulado em um lipossomo, ou acoplado a um lipídeo, e depois administrado a um hospedeiro. A linhagem celular produtora gera partículas infecciosas do vetor retroviral que incluem a(s) seqüência(s) de ácidos nucléicos que codifica os polipeptídeos. Essas partículas do vetor retroviral podem então ser empregadas para a transdução de células eucarióticas, in vitro ou in vivo. As células eucarióticas transduzidas expressarão a(s) seqüência(s) de ácidos nucléicos que codifica o polipeptídeo. As células eucarióticas que podem ser transduzidas incluem, sem limitação, células-tronco embrionárias, células embrionárias de carcinoma, além de células - tronco hematopoiéticas, hepatócitos, fibroblastos, mioblastos, ceratinócitos, células endoteliais e células epiteliais brônquicas.

Em algumas modalidades, são usados vetores de liberação gênica que dirigem a expressão de CR2-FH no olho. Vetores para a liberação gênica ao olho são conhecidos na técnica, e foram revelados, por exemplo, na Patente U.S. N° 6.943.153 e nas Publicações de Pedido de Patente U.S. N°s US20 02019463 0, US20030129164 , US200600627165.

Em algumas modalidades, a ativação do complemento é inibida por contato de um líquido corporal com uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH ex vivo sob condições que permitem que a molécula de CR2-FH funcione para inibir a ativação do complemento. Líquidos corporais adequados incluem aqueles que podem ser retornados ao indivíduo como, por exemplo, sangue, plasma ou Iinfa. A aférese por adsorção de afinidade é descrita de forma geral em Nilsson e cols. (1988) Blood 58(1): 38-44; Christie e cols. (1993) Transfusion 33: 234- 242; Richter e cols. (1997) ASAIO J. 43(1): 53-59; Suzuki e cols. (1994) Autoimmunity 19: 105-112; Patente U.S. N0 5.733.254; Richter e cols. (1993) Metabol. Clin. Exp. 42: 888-894; e Wallukat e cols. (1996) Int. J. Cará. 54: 1910195.

Conseqüentemente, a invenção inclui métodos de tratamento de uma ou mais doenças aqui descritas em um indivíduo que compreendem o tratamento do sangue do indivíduo de forma extracorpórea (ou seja, fora do corpo ou ex vivo) com uma composição que compreende uma molécula de CR2-FH sob condições que permitem que a molécula funcione para inibir a ativação do complemento, e o retorno do sangue ao indivíduo.

Dosagens unitárias, artigos manufaturados e kits

Também são fornecidas formas de dosagem unitária de composições de moléculas de CR2-FH, cada dosagem contendo de cerca de 0,01 mg a cerca de 50 mg, incluindo, por exemplo, de cerca de 0,1 mg a cerca de 5 0 mg, cerca de 1 mg a cerca de 5 0 mg, cerca de 5 mg a cerca de 4 0 mg, cerca de 10mg a cerca de 20 mg ou cerca de 15 mg da molécula de CR2-FH. Em algumas modalidades, as formas de dosagem unitária da composição de molécula de CR2-FH compreendem cerca de 0,01 mg-0,1 mg, 0,1 mg-0,2 mg, 0,2 mg-0,25 mg, 0,25 mg-0,3 mg, 0,3 mg-0,35 mg, 0,35 mg-0,4 mg, 0,4 mg-0,5 mg, 0,5 mg-1,0 mg, 10 mg-2 0 mg, 2 0 mg -50 mg, 5 0 mg-8 0 mg, 80 mg-100 mg, 100 mg-150 mg, 150 mg-200 mg, 200 mg-250 mg, 250 mg-300 mg, 300 mg-400 mg ou 400 mg-500 mg da molécula de CR2-FH. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária compreende cerca de 0,25 mg de molécula de CH2-FH.

O termo "forma de dosagem unitária" refere-se a uma unidade fisicamente distinta adequada como dosagens unitárias para um indivíduo, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para a produção do efeito terapêutico desejado, em associação com um veículo farmacêutico diluente ou excipiente adequado. Essas formas de dosagem unitária podem ser armazenadas em uma embalagem adequada em dosagens unitárias únicas ou múltiplas, e também podem ainda ser esterilizadas e lacradas.

Também são fornecidos artigos manufaturados que compreendem as composições aqui descritas em embalagens adequadas. Embalagens adequadas para as composições (por exemplo, composições oftálmicas) aqui descritas são conhecidas na técnica, e incluem, por exemplo, frascos (por exemplo, frascos lacrados), vasos, ampolas, garrafas, jarros, embalagens flexíveis (por exemplo, bolsas de Mylar ou bolsas plásticas lacradas), e semelhantes. Esses artigos manufaturados podem ainda ser esterilizados e/ou lacrados.

A presente invenção também fornece kits que compreendem as composições (ou formas de dosagens unitárias e/ou artigos manufaturados) aqui descritas e podem ainda compreender instruções sobre os métodos de utilização da composição, por exemplo, os usos aqui descritos. Os kits aqui descritos podem ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para a realização de qualquer um dos métodos aqui descritos.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Seqüências exemplares de moléculas de CR2-FH e peptídeos sinalizadores

A Figura 7 fornece seqüências de aminoácidos exemplares de peptídeos de sinalização aqui descritos (IDS. DE SEQ. Nos: 11 e 13) e polinucleotídeos que codificam os peptídeos de sinalização (IDS. DE SEQ. Nos: 12 e 14).

A Figura 9 fornece uma seqüência de aminoácidos de uma proteína de fusão de CR2-FH de camundongo (designada como CR2 - f H ou CR2NLFH) (ID. DE SEQ. N°: 17) e um polinucleotídeo que codifica uma CR2-FH de camundongo mais o peptídeo sinalizador (ID. DE SEQ. N°: 18).

A Figura 10 fornece a seqüência de DNA de CR2NLFHFH, uma proteína de fusão de CR2-FH de camundongo que contém

uma porção CR2 e duas porções FH sem uma seqüência vinculadora (ID. DE SEQ. N° : 19).

A Figura 11 fornece a seqüência de DNA de CR2LFHFH, uma proteína de fusão de CR2-FH de camundongo que contém uma porção CR2 ligada a duas porções FH por meio de uma seqüência vinculadora (ID. DE SEQ. N°: 20).

A Figura 2 0 fornece uma seqüência de aminoácidos de uma proteína de fusão de CR2-FH humana (designada como CR2- fH humana ou CR2f H) (ID. DE SEQ. N° : 21) e um polinucleotídeo que codifica uma CR2-fH humana mais o peptídeo sinalizador (ID. DE SEQ. N° : 22).

A Figura 21 fornece uma seqüência de aminoácidos de uma proteína de fusão de CR2-FH humana que contém duas porções FH (designada como CR2-FH2 humana ou CR2fH2 ou CR2fH2 humana) (ID. DE SEQ. N° : 23) e um polinucleotídeo que codifica uma CR2-FH2 humana mais o peptídeo sinalizador (ID. DE SEQ. N0: 24).

Exemplo 2. Inibição in vitro da via alternativa por CR2-FH

Foram feitas proteínas de fusão de camundongo que contêm os primeiros quatro domínios SCR de CR2 e os primeiros cinco domínios SCR de FH (com vinculador (CR2LFH) ou sem vinculador (CR2NLFH ou CR2-fH)) pelo método de clonagem de DNA recombinante e expressão gênica. A seqüência para uma das proteínas de fusão de CR2-FH é fornecida na Figura 9. 0 ID. DE SEQ. N°: 17 é a seqüência de polipeptídeos da proteína de fusão de CR2-FH. 0 ID. DE SEQ. N°: 18 é o nucleotídeo usado para codificar a proteína de fusão, além de um peptídeo sinalizador no terminal N do peptídeo sinalizador.

Também foi feita uma proteína de fusão de CR2-FH de camundongo (designada como CR2LFHFH, CR2-ÍH2 ou CR2-fHH) que contém os primeiros quatro domínios SCR de CR2 e duas porções FH ligadas em tandem (cada uma contendo os primeiros cinco domínios SCR de FH) . A porção CR2 e a primeira porção FH foram ligadas por uma seqüência vinculadora. A seqüência de DNA (que inclui o DNA que codifica o peptídeo sinalizador) de CR2LFHFH é fornecida na Figura 11 (ID. DE SEQ. N°: 20).

Foram realizados ensaios in vitro para ativação da via alternativa, basicamente como descrito em Quigg e cols., J. Iiumun. 1998, 160(9): 4.553-60. Fator H (fH) ou CR2-Crry foram usados como controles no experimento. Especificamente, 50 mg de glóbulos de zimosan em 10 ml de NaCl 0,15 M foram ativados por fervura por 60 minutos, e lavados duas vezes em PBS. Em cada mistura de reação, adicionar: 1) EGTA 10 mM e MgCl2 5 MM (concentração final) ; 2) 1 χ IO7 glóbulos; 3) EDTA 10 mM (controle negativo 1) ou soro HIC (controle negativo 2) ou concentração crescente de uma das proteínas de fusão de CR2-FH ou de proteínas de controle; 4) 10 μΐ de soro; e 5) PBS até levar o volume total até 100 μΐ. As misturas foram incubadas a 37°C por 20 minutos, e as reações foram interrompidas por adição de EDTA 10 mM (concentração final). Os glóbulos foram lavados duas vezes com PBSB gelado (PBS com BSA 1%) , e incubados com anticorpo anti-C3 de cabra conjugado a FTIC por uma hora no gelo. As amostras foram então lavadas duas vezes em PBSB, re-suspensas com paraformaldeído 1% e analisadas sob citometria de fluxo.

A Figura 12A apresenta uma representação gráfica de dados obtidos em um ensaio de complemento de zimosan in vitro com o uso de proteínas de fusão de CR2-FH de camundongo (CR2-fH) e fator H isoladamente (fH). Como mostrado na figura, CR2-fH foi significativamente mais eficaz do que FH na inibição da ativação do complemento. A Figura 12B apresenta uma representação gráfica de dados obtidos em um ensaio de complemento de zimosan in vitro com o uso dos primeiros cinco domínios SCR de FH de camundongo (FH 15) e os primeiros quatro domínios de CR2 de camundongo (CR2) . Os primeiros cinco domínios SCR de FH de camundongo tiveram uma EC5 0 de 2 50 nM, o que era aproximadamente igual à quantidade de FH no soro. A molécula que possui os primeiros quatro domínios de CR2 não possui nenhum efeito inibidor. Esses dados demonstram que o efeito observado com CR2-FH é causado pelos efeitos combinados das duas porções da molécula, e não pela função independente de cada porção.

A Figura 13 apresenta uma representação gráfica de dados obtidos em um ensaio de complemento de zimosan in vitro com o uso de proteína de fusão de CR2-FH de camundongo com vinculador (CR2LFH), de proteína de fusão de CR2-FH sem vinculador (CR2NLFH) , de CR2- FH-FH com vinculador (CR2LFHFH) e de CR2-Crry. Como mostrado na figura, CR2-FH foi mais eficaz do que CR2-Crry na inibição da ativação do complemento da via alternativa. CR2LFH e CR2NLFH foram igualmente eficazes na inibição da ativação do complemento da via alternativa. CR2LFHFH é bem mais eficaz do que CR2LFH e CR2NLFH.

Exemplo 3. Tratamento de isquemia intestinal e lesão de re- perfusão por CR2-FH

Este experimento mostra o tratamento de isquemia intestinal e lesão de re-perfusão em um modelo de camundongo.

Isquemia intestinal e lesão de re-perfusão. Três machos adultos de camundongos com idade de 8 semanas e pesando 20-25 g foram anestesiados com 10 mg/kg de quetamina e 6 mg/kg de xilazina por injeção i.p. Os animais estavam respirando espontaneamente e a temperatura corporal foi mantida com a utilização de um cobertor aquecido por todo o experimento. Foi feita uma laparotomia mediai, e os intestinos foram cuidadosamente movidos para permitir acesso à artéria mesentérica superior. A artéria mesentérica superior foi pinçada com o uso de uma pinça microcirúrgica (Fine Instruments, EUA) . A isquemia foi confirmada por palidez do intestino delgado. Camundongos com cirurgia simulada foram submetidos a laparotomia, sem pinçamento da artéria mesentérica superior. Após 3 0 minutos, a pinça da isquemia arterial foi removida, permitindo a re-perfusão da vasculatura mesentérica. Os animais foram suturados usando sutura ethicon 6.0, e deixou-se que a re-perfusão ocorresse por 2 horas. Foi administrado por via i.v. 0,1 mg ou 0,05 mg de CR2-fH ou de controle (PBS) 30 minutos após a re-perfusão, e os animais foram sacrificados 90 minutos mais tarde, após um total de 2 horas de re-perfusão.

Histologia. Foram coletadas amostras de tecido para coloração histológica do intestino, e elas foram fixadas em formalina 10% a 4°C de um dia para o outro e subseqüentemente processadas em parafina, ou foram congeladas em nitrogênio liquido para análise por imunofluorescência. Os cortes do intestino de cada animal foram corados com hematoxilina e eosina, e classificados quanto ao dano mucoso e altura das vilosidades, como descrito previamente (46) . Resumidamente, uma classificação de 0 foi atribuída a uma vilosidade normal; vilosidades com distorção da ponta foram classificadas como 1; as vilosidades desprovidas de células caliciformes e que contêm espaços de Gugenheims foram classificadas como 2; as vilosidades com ruptura desigual das células epiteliais foram classificadas como 3; as vilosidades expostas, mas com lâmina própria intacta e descamação de células epiteliais receberam a classificação 4; as vilosidades nas quais a lâmina própria apresentava exsudação foram classificadas como 5; e, finalmente, as vilosidades que apresentavam hemorragia ou vilosidades desnudas foram classificadas como 6. Todas as avaliações histológicas foram feitas de forma cega.

Os resultados do experimento são mostrados na Figura 14A. Como mostrado na figura, tanto 0,1 mg quanto 0,05 mg de CR2-fH mostraram efeito protetor no modelo animal, comparado com os animais de controle, embora os animais de controle tenham tido níveis normais de fator H endógeno circulante (cerca de 0,5 mg/ml) além das quantidades de CR2-fH administradas.

Exemplo 3.1. Tratamento de isquemia intestinal e lesão de re-perfusão por CR2-FH de camundongo experimento foi realizado basicamente como apresentado no Exemplo 3 .

Resumidamente, 0,05 mg, 0, 1 mg ou 0, 2 mg de CR2-fH de camundongo ou CR2-fH2 de camundongo (CR2-fHH) foram administrados i.v. 3 0 minutos após a re-perfusão, e os animais foram sacrificados 90 minutos mais tarde para análise histológica. Os resultados do experimento são mostrados na Figura 14B. Como mostrado na Figura 14B, tanto CR2-fH de camundongo quanto CR2-fHH de camundongo protegeram o intestino da isquemia mediada por complemento por lesão de re-perfusão. Exemplo 3.2. Tratamento de isquemia intestinal e lesão de re-perfusão por CR2-FH de camundongo

Esse experimento mostra os efeitos de CR2-fH e CR2-fH2 de camundongo sobre a via alternativa do complemento e isquemia por re-perfusão intestinal. Os experimentos foram realizados basicamente como descrito acima.

Ensaios in vitro demonstraram que CR2-fH de camundongo foi significativamente mais eficaz na inibição da via alternativa do complemento do que CR2-Crry, e que CR2-fH2 de camundongo foi cerca de 2 vezes mais eficaz do que CR2- fH de camundongo. A atividade inibidora do complemento de CR2-fH de camundongo era dependente do direcionamento mediado por CR2, como demonstrado por experimentos de bloqueio do anticorpo anti-CR2. Além disso, o fator H purificado de camundongo teve atividades inibidoras do complemento apenas mínimas nos ensaios in vitro.

CR2-fH de camundongo e CR2-fH2 de camundongo foram direcionadas aos locais de ativação do complemento local e remota (pulmão) após isquemia intestinal e lesão de re- perfusão, e ambas as proteínas protegeram a mucosa intestinal e o parênquima pulmonar contra lesão em uma dose baixa e de forma dose-dependente. Embora a CR2-fH2 de camundongo tenha sido um inibidor mais potente da via alternativa do complemento do que a CR2-fH de camundongo in vitro, não houve diferenças no efeito protetor das duas proteínas no modelo in vivo. Comparado com CR2-Crry, foi necessária uma dose aproximadamente 2 vezes maior de CR2-fH de camundongo para gerar uma proteção equivalente contra lesão local.

Exemplo 4. Tratamento de isquemia por re-perfusão renal por CR2-FH de camundongo

Este exemplo mostra o efeito de CR2-FH sobre a isquemia por re-perfusão renal.

Protocolo para indução de ARF isquêmica. Camundongos pesando 20-25 gramas foram anestesiados com 300 μΐ de 2,2,2 -tribromoetanol (Sigma-Aldrich) injetados por via intraperitoneal. Após os camundongos terem sido anestesiados, eles foram colocados em um colchão de aquecimento para manter sua temperatura corporal durante a cirurgia. Foram então feitas laparotomias, e os pediculos renais foram localizados e isolados por dissecção romba. Os pediculos foram pingados com pinças cirúrgicas (Miltex Instrument Company, Inc.), e a oclusão do fluxo sangüíneo foi confirmada por inspeção visual dos rins. As pinças foram deixadas por 24 minutos, e depois liberadas. Foi escolhido o tempo de isquemia para obter um modelo reversível de ARF isquêmica com um mínimo de trombose vascular, e para evitar a morte do animal. Os rins foram observados por aproximadamente um minuto para assegurar o retorno do fluxo sangüíneo. Após 15 minutos de re-perfusão, os camundongos receberam 0,2 5 mg da CR2-fH de camundongo (CR2NLFH) por via intraperitoneal. A fáscia e a pele foram suturadas com seda 4-0 (United States Surgical). Os camundongos foram ressuscitados por volume com 0,5 ml de solução salina normal e mantidos em uma incubadora a 29°C para manter a temperatura corporal.

Após 24 horas de re-perfusão, os camundongos foram anestesiados, e foi obtido sangue por punção cardíaca. Foi feita uma laparotomia, e os rins foram removidos. O estudo foi aprovado pelo "University of Colorado Health Sciences Center Animal Care and Use Committee".

Medidas do nitrogênio uréico sérico. 0 nitrogênio uréico sérico foi determinado para cada camundongo com a utilização de um "Beckman Autoanalyzer" (Beckman). O resultado é mostrado na Figura 15A. Como mostrado na figura, o nitrogênio uréico sérico foi reduzido nos animais tratados com CR2-fH de camundongo, indicando preservação da função renal.

Morfologia renal. Após os rins serem removidos dos camundongos, cortes sagitais foram fixados em paraformaldeído 4%. Após serem embebidos em parafina, cortes de 4 μπι foram secionados e corados com ácido periódico de Schiff. Os cortes foram avaliados por um patologista renal de forma cega. 0 córtex e a faixa externa da medula externa foram avaliados quanto à presença de necrose epitelial, perda da borda em escova, dilatação tubular e formação de moldes. Pelo menos dez campos (400 x) foram revisados para cada lâmina, e foi determinada a percentagem de túbulos que exibem esses achados. Os cortes do rim foram classificados da seguinte forma, com base na percentagem de túbulos afetados: 0, nenhum; 1, <10%, 2, 11- 25%, 3, 26-45%, 4, 46-75%, 5, >75%. 0 resultado do experimento é mostrado na Figura 15B. Como mostrado na figura, CR2-fH mostrou efeito protetor no modelo animal, comparado com o animal de controle.

Imunofluorescência: para imunofluorescência, cortes sagitais dos rins foram congelados em composto OCT (Sakura Finetek) . Cortes de 4 μπι foram seccionados com um cryostat e armazenados a -70°C. Mais tarde, as lâminas foram fixadas com acetona e incubadas com o anticorpo conjugado a FITC para C3 de camundongo (Cappel) . Após hibridização com o anticorpo por uma hora em temperatura ambiente, as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina (Vector Laboratories, Inc. ) . Os resultados do experimento são mostrados nas Figuras 15C e 15D. Como mostrado na figura, mais C3 estava depositado nos rins de camundongos com cirurgia simulada (15C) em relação aos camundongos tratados com CR2-fH de camundongo (15D).

Exemplo 5. Tratamento de degeneração macular relacionada à idade por CR2-FH

Ratos albinos expostos à luz constante são usados como modelos animais para degeneração macular relacionada à idade (DMRI seca). Cinco a oito animais são injetados por via intra-ocular sob anestesia em dias alternados com uma proteína de fusão de CR2-FH (1 μΐ de 4,3 mg/ml de solução de estoque), começando com a primeira injeção no dia anterior ao surgimento da exposição contínua à luz (dias - 1, 1, 3, 5, 7). Um olho serve como o do experimento, enquanto o outro olho serve como o olho de controle injetado com PBS. Os animais são testados com ERG no 8° dia, e depois sacrificados para análise histológica e análise por PCR. O número de fileiras de fotorreceptores nos olhos injetados com CR2-FH é comparado com o dos olhos de controle com PBS.

Os efeitos de CR2-FH são medidos com o uso de três parâmetros: atividade funcional (potenciais ERG e DC, ou seja, respostas de fotorreceptores e RPE) , histologia e medidas da inflamação (por exemplo, expressão gênica por RT-PCR e expressão de proteínas por imunoistoquímica).

Em um segundo modelo animal (DMRI úmida), testamos se a eliminação de ativadores do complemento reduz a neovascularização coroidiana (CNV). A CNV é produzida em cinco a oito ratos com um laser de criptônio (200 mW, 50 μm, 0,05 seg) e documentada em montagens coroidianas após injeções de fluoresceina.

Os efeitos de CR2-FH foram medidos com o uso de quatro parâmetros: atividade funcional (potenciais de ERG e DC, ou seja, respostas de fotorreceptores e RPE) , histologia, integridade vascular (montagens coroidianas após injeções de fluoresceina) e medidas de inflamação (por exemplo, expressão gênica por RT-PCR e expressão de proteína por imunoistoquímica).

Exemplo 6. Redução do volume de CNV por CR2-FH de camundongo

Para a geração de CNV, animais com 3 meses de idade foram anestesiados com a utilização de xilazina e quetamina (20 e 80 mg/kg, respectivamente) e as pupilas dilatadas com uma gota de HCl de fenilefrina (2,5%) e sulfato de atropina (1%). Foi usada fotocoagulação com laser de argônio (532 nm, tamanho do spot de 50 μπι, 0,05 s de duração, 250 mW) para a geração de quatro spots de laser em cada olho, circundando o nervo óptico, usando uma laminula manual como uma lente de contato. Uma bolha formada em um spot de laser indicava a ruptura da membrana de Bruch (Nozaki e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. 2006, 103(7): 2.328-33).

Par avaliação das lesões de CNV, o tamanho da CNV foi determinado em preparações planas de RPE/coróide coradas com isolectina B (que se liga aos resíduos terminais de β- D-galactose na superfície de células endoteliais e marca 3 0 seletivamente a vasculatura do camundongo). Medidas da fluorescência feitas em cortes de 2 μπι com o uso de microscopia confocal foram usadas para determinação do tamanho. Resumidamente, foi obtido um Z-stack de imagens na lesão de CNV, usando o mesmo ajuste de intensidade de laser para todos os experimentos. Para cada lâmina, a fluorescência global foi determinada e tabulada contra a profundidade.

Para eletrorretinografia, os animais foram anestesiados usando xilazina (20 mg/kg de peso corporal) e quetamina (80 mg/kg de peso corporal) . As pupilas foram dilatadas com uma gota de HCl de fenilefrina (2,5%) e tropicamida (1%) . A temperatura corporal foi estabilizada por meio de um colchão de aquecimento elétrico mantido a 37°C. O ajuste do ERG usado foi descrito previamente por Rohrer e cols., J. Neurosci., 1999, 19(20): 89 19-30 e foi construído de acordo com Lyubarsky e Pugh Lyubarsky e cols., J. Neurosci., 1996, 16(2): 563-571. A intensidade dos estímulos luminosos foi controlada com o uso de filtros de densidade neutra. Paradigmas do estímulo. Os animais foram adaptados ao escuro de um dia para o outro e ERGs registrados. Os bastonetes foram analisados em resposta a estímulos de flash único de intensidade luminosa crescente. As respostas de flash único tiveram uma média de pelo menos 3 flashes, com um intervalo entre estímulos (ISI) de 15 s a 2 min (da menor para a maior intensidade, respectivamente). Os diferentes ISIs asseguraram que as amplitudes de ERG em certa intensidade eram idênticas entre o primeiro e o último flash. Análise de dados. Para todos os registros de ERG, a amplitude da onda a foi medida a partir da linha de base e durante o experimento; a amplitude da onda b foi medida a partir da onda a até o pico da onda b, e os tempos implícitos foram medidos a partir do surgimento do estímulo até a onda a até o pico da onda b.

Em um experimento, os camundongos foram tratados com CR2 - f H de camundongo por via intravenosa (250 μg) 3 0 minutos após a queimadura com laser, 4 8 horas após a queimadura com laser e 6 horas após a queimadura com laser. Seis dias após a queimadura, função retiniana foi avaliada, e a seguir os camundongos foram sacrificados para exame histológico.

A Figura 16 mostra respostas retinianas de onda a e b em camundongos tratados com ou sem CR2-fH. Como mostrado na Figura 16, tantos as ondas a quanto as ondas b da resposta retiniana foram protegidas pelo tratamento com CR2-fH em relação ao tratamento com PBS. As Figuras 17A e 17B mostram a coloração com isolectina-b de lesões 6 dias após a queimadura com laser. A Figura 17C mostra a quantificação dos tamanhos da lesão com base na coloração com isolectina- b. Como mostrado nas Figuras 17A-C, os camundongos tratados com CR2-fH apresentam uma redução significativa do tamanho da lesão, comparados com os animais tratados com PBS.

Em um experimento separado, 1 μg de CR2-fH de camundongo foi administrado por via intra-óptica imediatamente após a queimadura por laser, 48 horas após a queimadura e 96 horas após a queimadura. Os olhos foram coletados no 6° dia para exame histológico. As lesões foram visualizadas por coloração com isolectina-b. Os resultados são mostrados na Figura 18. As Figura 18A e 18B mostram a coloração com isolectina-b de lesões 6 dias após a queimadura com laser. A Figura 18C mostra a quantificação do tamanho da lesão com base na coloração com isolectina-b. Como mostrado nas Figuras 18A-C, CR2-fH liberada diretamente ao olho reduz a disseminação da lesão. Exemplo 7. Retardo do surgimento de rejeição mediada por anticorpos em um modelo de camundongo de transplante cardíaco heterotrópico por CR2-FH de camundongo

Neste experimento, corações foram transplantados de forma heterotrópica de camundongos doadores de C3H em camundongos Balb/c receptores. Essa combinação de cepas promove um fenótipo imune TH2 que promove a rejeição vascular aguda, e é caracterizado por produção de anticorpo antienxerto e deposição no enxerto de fragmentos de ativação do complemento.

Os camundongos receptores foram tratados com: 1) PBS, i.v., 2) uma dose única de 0,2 5 mg de CR2-fH de camundongo, i.v. 30 minutos após a re-perfusão, e 3) doses múltiplas de 0,25 mg de CR2-fH de camundongo i.v., começando 3 0 minutos após a re-perfusão, e posteriormente a cada três dias.

Os corações foram coletados 24 horas após a re- perfusão para análise. Os animais tratados com CR2-fH de camundongo foram protegidos da isquemia e de lesão de re- perfusão, como avaliado por exame histológico, pela ausência de C3, por uma redução na infiltração de neutrófilos e por uma redução das citocinas inflamatórias.

Os efeitos da CR2-fH de camundongo sobre a rejeição vascular aguda são mostrados na Figura 21. Como mostrado na figura, receptores de transplante cardíaco de controle sobreviveram 7,1 ± 1 dias, comparados com 11,1 ± 1,6 dias (grupo de dose única) e 10,7 ± 1,3 dias (grupo de doses múltiplas). Há uma melhora significativa da sobrevida em camundongos tratados com CR2-fH de caraundongo, quando comparados com os controles (p = 0,02).

No tempo da coleta, não havia diferenças óbvias nos perfis de rejeição patológica ou nos níveis de anticorpos antidoador entre qualquer um dos grupos. Curiosamente, parece não haver melhora significativa na sobrevida associada à administração de doses múltiplas de CR2-fH de camundongo, quando comparadas com o grupo de dose única (p <0,05) .

Exemplo 8. Inibição da via alternativa do complemento por CR2-FH humana

As seqüências de proteínas de CR2-FH humana (ID. DE SEQ. N°: 21, também designada CR2fH) e CR2-FH2 humana (ID. DE SEQ. N°: 23, também designada CR2ÍH2), que não incluem peptídeos sinalizadores, são mostradas nas Figuras 20 e 21, respectivamente. As seqüências de ácidos nucléicos de CR2- FH humana (ID. DE SEQ. N°: 22) e CR2-FH2 humana (ID. DE SEQ. N°: 24), que incluem seqüências de nucleotídeos para os peptídeos sinalizadores, são mostradas nas Figuras 2 0 e 21, respectivamente.

CR2-FH humana e CR2-FH2 humana foram purificadas de sobrenadantes de células 293 transfectadas por cromatografia por afinidade com o uso de HB5-sefarose, que contém anticorpo monoclonal HB5 anti-CR2 humana (catálogo ATCC # HB-135) ligado à sefarose ativada por CNBr (Amershan Biosciences). Os sobrenadantes brutos de CR2-FH ou CR2-FH2 foram passados sobre a matriz, lavados com PBS e eluídos em glicina-HCl 0,1 M, pH 3,0. A fração eluída foi imediatamente neutralizada pela adição de Tris-Cl 1 M, pH 9,0, seguida por troca em PBS com o uso de colunas centricon (Millipore). Trezentos ng de CR2-FH e CR2-FH2 purificadas, não reduzidas, foram resolvidos em SDS-PAGE e visualizados por coloração Commassie. CR2-FH estava presente como duas proteínas distintas, como determinado por espectrometria de massa (Alphalyse, Palo Alto, CA) de 64,0 e 65,3 kDa, que se resolveram em uma banda única após desglicosilação, enquanto CR2-FH2 era uma espécie única de 99,2 kDa. A estrutura secundária inerente dessas moléculas faz com que elas sejam menores do que seu verdadeiro peso sob condições não redutoras.

Os efeitos de CR2-FH humana e CR2-FH2 humana sobre a deposição de C3b específico da via alternativa sobre partículas de zimosan são mostrados na Figura 22A. Resumidamente, partículas de zimosan foram incubadas em PBS contendo Mg2+ 5 mM, EGTA 10 mM, soro humano 10%, e concentrações crescentes de CR2-FH e CR2-FH2 por 30 minutos em temperatura ambiente com anticorpo anti-C3 humano de cabra conjugado a FITC. 0 zimosan foi peletizado e lavado, seguido por análise FACS. Como mostrado na Figura 24A, tanto CR2-FH quanto CR2-FH2 inibiram a ativação da via alternativa do complemento. Resultados similares foram obtidos por incubação com soro de camundongo, seguida por detecção com anticorpo anti-C3 de camundongo de cabra conjugado a FITC. Significativamente, havia 200-400 nM de FH presente no sistema de ensaio. A CR2-FH tinha uma EC5 0 de 8-22 nM, que era 20 vezes menor do que a quantidade de FH presente no ensaio, demonstrando um benefício nítido de FH direcionado em relação ao FH endógeno.

Os efeitos de CR2-FH humana e de CR2-FH2 humana sobre a Iise de eritrócitos mediada pela via alternativa são mostrados na Figura 22B. Resumidamente, eritrócitos de coelho (1 χ IO8) foram incubados com concentrações variáveis de CR2-FH ou CR2-FH2 em 1 χ GVB++ (Boston BioProducts) e soro humano 17% por 30 minutos a 37 °C. A reação foi interrompida com a adição de um volume de um décimo de PBS gelado, seguido por centrifugação para peletizar eritrócitos não lisados. A hemólise foi quantificada por medida da OD4I5nm- Como mostrado na Figura 24B, tanto CR2-FH quanto CR2-F112 inibiram significativamente a ativação da via alternativa do complemento. Significativamente, havia 340-680 nM de FH presente no ensaio. A CR2-FH teve uma EC5 0 de 20-3 0 nM, que era 15-20 vezes menor do que a quantidade de FH presente no ensaio, demonstrando um beneficio nítido do FH direcionado em relação ao FH endógeno.

Exemplo 9. Inibição da via alternativa do complemento por CR2-FH de camundongo

Este exemplo mostra a inibição da via alternativa do complemento por CR2-FH de camundongo com o uso de soro para camundongos deficientes na via clássica.

Foi usado o ensaio ELISA com complexos imunes de anticorpos colágeno-anti-colágeno nas placas. A deposição/ativação de C3 foi medida pela utilização de anticorpo anti-C3b na presença de soro de camundongos do tipo selvagem ou de camundongos C4-/C4-. Quantidades diferentes de FH de camundongo de comprimento total (2 μg/10 μl) , dos primeiros quatro domínios SCR de CR2 de camundongo (2 μg/10 μl) e de CR2-FH de camundongo (2 μ9/10 μl) foram adicionadas ao soro. 0 resultado do estudo in vitro é mostrado na Figura 23. Como mostrado na figura, CR2-FH de camundongo teve pouco efeito sobre a deposição de C3b com o uso de soro de camundongos do tipo selvagem. Em contraste, CR2-FH de camundongo evitou quase completamente a deposição de C3b no soro de camundongos deficientes da via clássica. FH de camundongo ou CR2 de camundongo, por outro lado, teve poucos efeitos em ambos os sistemas de ensaio. Este experimento demonstra uma vantagem nítida da utilização de CR2-FH para inibir a via alternativa do complemento, particularmente quando a via clássica do complemento não está envolvida.

Para demonstrar ainda mais que a inibição da deposição de C3b observada com CR2-FH era causada pela inibição da via alternativa, estudamos os efeitos de CR2-FH sobre a deposição de C3b na ausência da via clássica (camundongos C4-/C4-). O cálcio inibe a via de lectina do complemento. A Figura 24 mostra uma curva de titulação de CR2-FH de camundongo em tampão com cálcio suficiente com a utilização de soro de camundongos knockout C4-/C4-. Como mostrado na figura, CR2-FH inibe significativamente a deposição de C3b na concentração de 0,5 μg/μl.

Embora a invenção tenha sido descrita com algum detalhe como forma de ilustração e exemplo com o objetivo de facilitar sua compreensão, fica evidente para aqueles habilitados na técnica que certas mudanças e modificações menores serão praticadas. Portanto, a descrição e os exemplos não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.

Claims

1. Molécula de CR2-FH, caracterizada por compreender: a) jUma porção CR 2 que compreende uma CR2 ou um fragmento desta, e b) uma porção FH que compreende um FH ou um fragmento deste, em que a molécula de CR2-FH é capas de se ligar a um ligante de ÇR2, e em que a molécula de CR2-FH é capas de inibir a ativação de complemento da via alternativa.

2. Molécula de CR2-FH, de acordo com a reivindicação -1, caracterizada pelo fato de que a porção CR2 compreende pelo menos os primeiros dois domínios SCR do terminal N de CR2 .

3. Molécula de CR2-FH, de acordo com a reivindicação -1,caracterizada pelo fato de que a porção CR2 compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de CR2.

4. Molécula de CR2-FH, de acordo com a reivindicação -1, caracterizada pelo fato de que a porção FH compreende pelo menos os primeiros quatro domínios SCR de FH.

5. Molécula de CR2-FH, de acordo com a reivindicação li caracterizada pelo fato de que a porção FH compreende pelo menos os primeiros cinco domínios SCR de FH.

6. Molécula de CR2-FH, de acordo com a reivindicação caracterizada pelo fato de que a molécula de CR2-FH compreende duas ou mais porções FH.

7. Molécula de CR2-FH, de acordo com a reivindicação -1, caracterizada pelo fato de que a porção CRΞ compreende os primeiros quatro domínios SCR do terminal N de CR2, e a porção FH compreende os primeiros cinco domínios SCR de FH1

8. Molécula de CR2-FH, de acordo com a reivindicação -7, caracterizada pelo fato de que a porção CRZ compreende os aminoácidos 33 a 271 do ID. DE SEQ. N°: 1, e a porção FH compreende os aminoácidoa 21 a 320 do ID. DE SEQ. N°: 2.

9. Molécula de CR2-FH, de acordo com a reivindicação -1, caracterizada pelo fato de que a molécula de CR2-FH é uma proteína de fusão,

10. EsOlinucleotideo caracterizado por codificar a proteína de fusão da reivindicação 9.

11. Vetor caracterizado por codificar o polinucleotldeo da reivindicação 10.

12. Célula hospedeira caracterizada por compreender o polinucleotídeo da reivindicação 11.

13. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma molécula de CR2-FH da reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que uma composição é adequada à administração intra-ocular, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, íntratragueal ou por inalação.

15. Método de tratamento de uma doença onde a via alternativa do complemento está implicada em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da reivindicação 13.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença na qual a via alternativa do complemento está implicada é qualquer utma de degeneração macular, artrite reumatôide, re-perfusão de isguemia, refeição de transplante de órgão, MPGN IIr HDS e nefrite lúpica.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a doença na qual a via alternativa do complemento está implicada é degsneração tnacular relacionada â idade.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracter izado pelo fato de que a doença na qual a via alternativa do complemento está implicada é re-perfusão de isquemía.

19 . Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a doença na qual a via alternativa do complemento está implicada é rejeição de transplante de órgão,