FR3046355A1 - Fragments du facteur h pour son utilisation comme agent anti-angiogenique - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un fragment du facteur H du complément pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.

Description

Fragment du facteur H pour son utilisation comme agent antiangiogénique

La présente invention concerne un fragment du facteur H (FH) du complément pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation. L’angiogénèse est un mécanisme physiologique complexe qui joue un rôle majeur dans la genèse de la néovascularisation impliquée dans différentes pathologies incluant la croissance de tumeurs solides, l’athérosclérose, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis et les pathologies néo-vasculaires intraoculaires comme les rétinopathies prolifératives ou la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) exsudative.

Des inhibiteurs du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) sont utilisés dans le traitement de divers cancers et pathologies oculaires. On peut citer comme inhibiteurs du VEGF actuellement disponibles le pegaptanib, le bevacizumab, le ranibizumab, ou encore l'aflibercept. Bien que ces molécules constituent une avancée dans le traitement de la DMLA exsudative, il s’avère que la récupération de la vue obtenue grâce à ces traitements n’est que transitoire, l’œdème rétinien secondaire à la néovascularisation récidive et la dégénérescence rétinienne se poursuit. De plus, 20-30 % des patients répondent faiblement à ces traitements (Rasmussen and Sander, 2014) et présentent des signes exsudatifs résiduels. D’autre part, si l’excès de VEGF a un effet promoteur de la néovascularisation et de l’œdème associé, en contrepartie, une inhibition totale peut avoir un effet néfaste sur la rétine neurale, la choroïde et les cellules de l’épithélium pigmentaire de la rétine (EPR), et notamment ses jonctions serrées, essentielles au maintien de l’intégrité de l’EPR. En effet, le VEGF est considéré comme un facteur trophique pour la survie des cellules de l’EPR (Byeon et al., 2010), le maintien des choriocapillaires (Geniez et al., 2009) et les fonctions visuelles (Saint-Geniez et al., 2008). Ainsi, le traitement par les agents anti- VEGF peut entraîner à long terme, une atrophie progressive de la rétine neurale, de la choroïde et de l’EPR chez les patients atteints de DMLA exsudative. D’ailleurs une augmentation du taux de progression de l’atrophie de l’EPR a été rapportée chez les patients atteints de DMLA exsudative et traités aux anti-VEGF, ce qui souligne l’efficacité insuffisante de ce traitement pour prévenir les conséquences visuelles à long terme de la DMLA (Rosenfeld et al., 2011 ; Lois et al., 2013 ; Kumar et al., 2013 ; Grunwald et al., 2014 ; Young et al., 2014 ; Bhisitkul et al., 2015 ; Channa et al., 2015 ; Schütze et al., 2015).

De plus, il a été montré que des polymorphismes situés sur le gène du FH entraînent une résistance de certains patients traités avec des anticorps anti-VEGF (Kloeckener-Gruissem et al., 2011 ; Brantley et al., 2007)

Il existe donc un besoin de développer de nouvelles thérapies alliant efficacité et acceptabilité pour le traitement des pathologies impliquant une néovascularisation, et notamment des pathologies oculaires.

De manière surprenante, les inventeurs ont identifié, pour la première fois, une nouvelle fonction du FH. Après de longues études, ils ont mis en évidence la capacité de fragments du FH à exercer une activité antiangiogénique. Une telle activité est particulièrement prometteuse pour le traitement de pathologies impliquant une néovascularisation.

Ainsi, dans un premier aspect, l'invention concerne un fragment du FH pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation, ledit fragment du FH comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2.

En effet, les inventeurs ont mis en évidence le fait que les fragments du FH comprenant a minima le domaine SCR7, représenté en SEQ ID N°2, inhibe la néovascularisation, en particulier la néovascularisation choroïdienne. Aussi, les fragments de facteur H apparaissent comme une nouvelle solution pertinente et efficace pour le traitement de pathologies, en particulier les pathologies oculaires, liées à une vascularisation excessive ou une néovascularisation choroïdienne. L'invention propose donc une nouvelle stratégie thérapeutique efficace pour le traitement de patients souffrant de pathologies oculaires impliquant une vascularisation excessive ou une néovascularisation choroïdienne.

Par "Facteur H" ou "FH" on entend une glycoprotéine intervenant dans la régulation de la voie alterne du complément. Plus spécifiquement, le FH joue un rôle dans la régulation de la voie alterne du complément en interagissant principalement avec la molécule C3b. Le FH, codé par le gène FH, est majoritairement synthétisé dans le foie mais peut également, être exprimé localement par différents types cellulaires incluant les cellules de l’EPR, les cellules endothéliales, et autres. Le FH possède des séquences répétitives d’environ 60 acides aminés appelées " domaines SCR" (short consensus repeat). La région du FH impliquée dans la régulation en phase fluide de l’activité complément de la voie alterne est localisée au niveau des domaines SCR1-4. Le FH possède des sites de liaison au C3b (SCR1-4, SCR6-8, SCR12-14 et SCR19-20) et aux glycosaminglycannes (GAGs) (SCR6-8, et SCR19-20). Ainsi, le FH peut interagir avec les matrices extracellulaires. Le domaine SCR19-20 est aussi un site de liaison au C3b et plus précisément au C3d. Le FH possède aussi des sites de liaison à la protéine C réactive ou CRP (SCR6-8 et SCR 16-20), qui est une protéine de phase aiguë synthétisée principalement par le foie mais et qui joue un rôle important dans les réactions inflammatoires, et sert de marqueur biologique à celles-ci. Enfin le FH possède un site de liaison au Zinc (SCR6-8), important pour l’oligomérisation du CFH. Le FH et le Facteur I (FI) régulent la voie alterne du complément par le contrôle de la boucle d’amplification de la voie alterne. Le FH se fixe sur le C3b de façon compétitive avec le facteur B (FB), ce qui entraîne une dissociation accélérée de la C3 (C3bBb) ou de la C5 (C3bBbC3b) convertase alterne, qui perd ainsi son activité. De plus, le FH lié au C3b joue le rôle de co-facteur pour le FI, permettant à celui-ci de cliver C3b en C3bi, molécule incapable de se lier au FB pour former C3bBb. La dérégulation ou l’inactivation de la voie alterne contrôlée par le FH, peut entraîner l’activation incontrôlée de C3, entraînant l’assemblage des composants terminaux du complément en complexe d’attaque membranaire ou MAC. Ce complexe, qui est composé des protéines du complément C5b9, reste lié et forme un pore membranaire, composant cytotoxique du système du complément et qui entraîne la lyse des cellules étrangères. L'art antérieur décrit que le FH peut être utilisé pour traiter certaines dégénérescences rétiniennes du fait de son activité anti-inflammatoire ou antioxydante. En effet, le document W02006/088950 décrit un polymorphisme dans le gène du FH générant le variant Y402H qui est associé à l’augmentation de risque de développement de la DMLA (Edwards et al., 2005; Hageman et al., 2005; Haines et al., 2005; Klein et al., 2005 ; Despriet et al., 2006). De plus, le document WO2011/113641 décrit l’utilisation du FH dans le traitement et/ou la prévention de plusieurs pathologies, dont des pathologies oculaires. Cette demande décrit une activité du FH qui repose sur sa capacité à se lier à la malondialdéhyde endogène, empêchant ainsi la production de substances proinflammatoires. Ainsi, l’activité du FH décrite dans ce document est une activité anti-inflammatoire, l’activité anti-angiogénique du FH n’y est pas décrite. En outre, la stratégie proposée par le document WO2011/113641 vise uniquement à traiter des pathologies comprenant une composante inflammatoire.

Par ailleurs, le document W02013/140104 décrit un rôle antioxydant du FH. Il y est notamment décrit que le FH protège l’EPR soumis à un stress oxydatif, notamment grâce à un effet protecteur sur les jonctions serrées des cellules de l'EPR contre le stress oxydatif, plus précisément contre la déstabilisation et la désorganisation des jonctions serrées des cellules rétiniennes soumises à un stress oxydatif. Là encore, l’activité antiangiogénique du FH n’y est pas décrit.

Dans SJ Kim et al, 2013, il est montré que le FH plasmatique humain a un rôle anti-angiogénique dans un modèle de néo-vascularisation induite par impact laser chez le rat.

La présente invention se démarque de cet enseignement en identifiant pour la première fois des fragments du FH, et non le FH entier, avec une activité anti- angiogénique. L’utilisation de fragments du FH, et non le FH entier, présente plusieurs avantages. Le plus faible poids moléculaire des fragments, comparé à la protéine entière, permet l’injection d’une plus grande concentration molaire de molécules actives dans l’œil. En effet, les volumes d’administration intra-oculaire dans les traitements de la DMLA sont limités (environ 50 pl chez l’Homme). Il est donc avantageux d’utiliser des principes actifs plus petits, afin de pouvoir augmenter leurs nombres, formulés dans un faible volume d’injection. De plus, l’utilisation de fragments permet de limiter les sites de glycosylation, autorisant ainsi une limitation des variations de glycosylation lors de leur production industrielle et donc d’assurer, à grande échelle, une homogénéité de structure. Par ailleurs, les inventeurs ont montré que les fragments du FH selon l’invention diminuent non seulement la surface de néovascularisation (i.e. formation de nouveaux vaisseaux) mais permettent également de renforcer l’intégrité membranaire des néovaisseaux, limitant ainsi la diffusion de liquide ou du sang.

La séquence peptidique du FH humain natif est représentée en SEQ ID N° 1. Cette séquence est connue de l'homme du métier et est disponible sous le numéro d'accession UniProtKB - P086031 dans la base uniProt.

Par "fragment de FH", on entend une partie de la séquence peptidique du Facteur H. Par définition, l'expression "fragment du facteur H" exclut le facteur H entier. Préférentiellement, ce fragment de FH a conservé la même propriété biologique d'intérêt que le FH humain. En d'autres termes, il s'agit d'une partie de la séquence peptidique du FH présentant la propriété antiangiogénique du FH. Par "propriété biologique d'intérêt du FH", on entend la propriété anti-angiogénique dudit FH.

Par "fragment du FH selon l'invention", on entend les fragments du FH comprenant a minima le domaine SCR 7 du FH humain. La séquence de SCR7 du FH humain est représentée à la séquence SEQ ID N°2. Elle est comme suit: C YFP YLEN G YN QN Y GRKF V QGKS ID V ACHPG Y ALPKAQTT VTC MENGWSPTPRC.

Cette séquence est codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°3. Dans un mode de réalisation préféré, le fragment selon l’invention comprend préférentiellement le domaine SCR 7, fusionné avec les domaines N-terminaux ou C-terminaux du FH.

Dans un autre mode de réalisation préféré, lesdits domaines N-terminaux ou C-terminaux du FH sont constitués, respectivement, des domaines SCR 1 à 4 et SCR 19 à 20.

Dans un autre mode de réalisation préféré, le fragment selon l'invention comprend, préférentiellement, une séquence d'acides aminés choisie parmi : la séquence du domaine SCR7 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°2 et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°3; la séquence des domaines SCR 1 à 7 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N° 4, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°5; la séquence des domaines SCR 1 à 18 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°6, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°7; la séquence des domaines SCR 7 à 20 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°8, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°9; la séquence des domaines SCR 7 à 18 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°10, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°ll, la séquence des domaines SCR 6 à 8 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°12, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°13.

Par "polynucléotide selon l'invention", on entend une séquence d'acides nucléiques codant pour un fragment du facteur H selon l'invention. Typiquement, le polynucléotide selon l'invention comprend a minima une séquence codante pour le domaine SCR7 du facteur H tel que représenté en SEQ ID N°3.

Préférentiellement, le polynucléotide de l'invention comprend une séquence d'acides nucléiques choisie dans le groupe constitué de SEQ ID N°5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N°ll, et SEQ ID N°13.

Les inventeurs ont identifié, pour la première fois, une nouvelle fonction de fragments du FH en tant qu'agent anti-angiogénique et l'utilisation d'un tel fragment du FH pour le traitement de pathologies oculaires impliquant une néovascularisation. Dans le cadre de la présente invention, l'expression "les pathologies impliquant une néo vascularisation" englobe toutes les pathologies qui sont caractérisées par une activité angiogénique anormale, i.e. la formation de nouveaux vaisseaux sanguins irrigant une tumeur ou toute autre anomalie tissulaire, notamment oculaire. Dans le cadre de l'invention, les termes néovascularisation et angiogénèse sont synonymes et désignent une vascularisation anormale et/ou excessive et/ou susceptible d'aboutir à une situation pathologique. Une telle néovascularisation se retrouve dans plusieurs pathologies oculaires, parmi lesquelles la DMLA exsudative.

Selon l’invention, on entend par le terme "traitement" ou "traiter", l’action de supprimer, réduire ou inhiber la progression de la maladie à laquelle ce terme s’applique. On entend également par le terme « traitement » ou « traiter », l’action de supprimer, réduire, inhiber la progression de l’apparition d’un ou plusieurs symptômes de la condition ou de la maladie à laquelle ce terme s’applique.

Selon l'invention on entend par le terme "prévention" ou "prévenir" l'action d'éviter, retarder ou limiter l'apparition d'une pathologie ou des symptômes d'une pathologie chez un sujet sain, ou un sujet connu pour avoir une prédisposition à déclencher ladite pathologie.

Dans un mode de réalisation préféré, la pathologie impliquant une néovascularisation est une pathologie oculaire choisie parmi la DMLA, la néovascularisation de l'iris, la néovascularisation intraoculaire, la néovascularisation cornéenne, la néovascularisation rétinienne, la néovascularisation choroïdienne, la rétinopathie ischémique, la rétinopathie radique, le glaucome néovasculaire, la rétinopathie diabétique, la rétinopathie de la prématurité, l’occlusion vasculaire veineuse, les vasculopathies prolifératives non tumorales et le cancer.

Dans un autre mode de réalisation préféré, la pathologie impliquant une néovascularisation est une pathologie oculaire choisie parmi la DMLA, la néovascularisation de l'iris, la néovascularisation intraoculaire, la néovascularisation cornéenne, la néovascularisation rétinienne, la néovascularisation choroïdienne et le cancer.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit cancer est choisi dans le groupe constitué des tumeurs intraoculaires vascularisées et/ ou vasculaires, des vasculopathies prolifératives tumorales, des tumeurs vasculaires d’origine vasculaire ou non telles que les hémangiomes choroidiens, les proliférations angiomateuses intrarétiniennes, les anastomoses choriorétiniennes ou les vasculopathies polypoidales).

Plus préférentiellement, la pathologie impliquant une néovascularisation est une pathologie oculaire choisie parmi la DMLA et la néovascularisation choroïdienne.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la pathologie impliquant une néovascularisation est la DMLA de forme néovasculaire. Π s'agit en effet d'un groupe de patients susceptibles d'être traités grâce à l'activité anti-angiogénique des fragments du facteur H selon l'invention mis en évidence par les inventeurs.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la pathologie impliquant une néovascularisation est la néovascularisation choroïdienne secondaire à la DMLA ou la néovascularisation choroïdienne secondaire à une myopie forte ou à une inflammation intraoculaire ou à une choroïdite. "La dégénérescence maculaire liée à l’âge" ou "DMLA" est une pathologie touchant d’abord le centre de la rétine, la macula, et entraîne de fait une perte de la vision précise. Bien que préservant la vision périphérique, ce qui permet aux personnes atteintes de s’orienter globalement, la DMLA affecte la qualité de vie de façon importante. Elle constitue la première cause de perte de la vision centrale irréversible dans les pays industrialisés. L’âge est le premier facteur de risque de la DMLA. L’EPR dans la partie centrale de la rétine est considéré comme la première cible de la DMLA. Ainsi, les dommages ou la perte de fonction de l’EPR induisent la mort des photorécepteurs. Diverses études ont mis en évidence le fait que la DMLA est une pathologie complexe liée à de nombreux facteurs, notamment environnementaux et génétiques. Π existe deux formes de DMLA: la forme atrophique et la forme humide. La forme atrophique, également appelée atrophie géographique ou DMLA sèche, se traduit par la disparition progressive des cellules de l’EPR, puis à celle des photorécepteurs situés au niveau de la macula. La forme humide, également dénommée néovasculaire ou exsudative, quant à elle, implique un processus d'angiogenèse et se traduit par une prolifération de nouveaux vaisseaux anormaux sous la rétine. Ces vaisseaux fragiles laissent diffuser du sérum, responsable d’un soulèvement de la rétine, et/ou du sang entraînant l’apparition d’hémorragies rétiniennes. "La néovascularisation choroïdienne" correspond à l'apparition de néovaisseaux choroïdiens. Elle correspond à une prolifération de vaisseaux sanguins anormaux sous la rétine, dans la couche choroïdale du globe oculaire. Les vaisseaux anormaux peuvent laisser échapper des liquides et du sang, provoquant des œdèmes et soulèvement la rétine. Elle se traduit le plus souvent par : - des métamorphopsies (c’est-à-dire des troubles de la vision se caractérisant par une déformation des images), un scotome relatif ou absolu (c'est à dire une lacune immobile dans le champ visuel), et une gêne visuelle prédominant en vision de près.

Le diagnostic est souvent confirmé par des examens consistant en un fond de l'œil, une angiographie à la fluorescéine et une tomographie en cohérence optique. La néovascularisation choroïdienne peut être une néovascularisation choroïdienne secondaire à la DMLA ou la néovascularisation choroïdienne secondaire à une myopie forte, à une inflammation intraoculaire ou à une choroïdite infectieuse ou non infectieuse.

Il a été montré que la formation du MAC résultant de l’activation de la voie du complément est responsable du développement de la néovascularisation choroïdienne induite par le laser chez la souris (Andreoli et al. 2009). En effet, le MAC permettrait la libération de facteurs angiogéniques tels que le VEGF, FGF-2 et PDGF, entraînant l’amplification du processus angiogénique (Andreoli et al. 2009). Le MAC a été aussi montré comme contrôlant l’expression du VEGF dans le modèle de CNV chez la souris (Liu et al., 2011).

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°2, SEQ ID N°4, SEQ ID N°6, SEQ ID N°8, SEQ ID N°10 et SEQ ID N°12 pour le traitement d'une pathologie choisie parmi la DMLA, préférentiellement la DMLA de type néovasculaire, la néovascularisation choroïdienne et le cancer. Toutes les caractéristiques techniques définies précédemment s'appliquent ici.

Le fragment du FH selon l'invention peut être utilisé seul, en combinaison et/ou en association avec d'autres agents actifs, tels que d'autres substances utilisées dans le traitement des pathologies oculaires, en particulier des agents anti-VEGF, des glucocorticoïdes, ou encore des agents biologiques tels que un anticorps anti facteur D. Ces différents agents actifs peuvent être utilisés en combinaison thérapeutique, et administrés sous forme séparée, combinée, étalée dans le temps ou concomitante.

Le fragment du FH selon l'invention peut également être utilisé pour préparer une composition pharmaceutique pour le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire impliquant une néovascularisation. Ainsi, l’invention concerne aussi une composition pharmaceutique pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire choisie parmi la DMLA, la néovascularisation de l'iris, la néovascularisation intraoculaire, la néovascularisation cornéenne, la néovascularisation rétinienne, la néovascularisation choroïdienne, la rétinopathie ischémique, la rétinopathie radique, le glaucome néovasculaire, la rétinopathie diabétique, la rétinopathie de la prématurité, l’occlusion vasculaire veineuse, les vasculopathies prolifératives non tumorales et le cancer. Toutes les caractéristiques techniques mentionnées ci-avant sont applicables ici.

Les fragments du FH selon l'invention peuvent être combinés à tout type de véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable, et optionnellement à une matrice à diffusion prolongée, telle qu’un polymère biodégradable, un réservoir biodégradable ou non biodégradable, des systèmes particulaires ou des implants intraoculaires ou péri oculaires pour former une composition pharmaceutique selon l’invention. Le terme "pharmaceutiquement acceptable" se réfère à des entités moléculaires et des compositions qui ne produisent pas de réaction inverse, allergique ou autre réaction non désirée lorsqu’elles sont administrées à un mammifère, particulièrement un humain. Un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable peut être solide, semi-solide ou liquide. La forme des compositions pharmaceutiques, leur voie d’administration, leur dosage et leur posologie dépendent naturellement de la sévérité de la pathologie oculaire et de son stade d’évolution.

La composition pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous toute forme administrable à un patient, et inclut notamment les formes liquides ou solides, typiquement sous forme de collyre, de gel, de solution buvable, mais également les suspensions, poudre lyophilisées, capsules et comprimés. On préfère les compositions formulées de manière à pouvoir être administrée localement, comme par exemple les collyres et les gels, ou par voie orale comme les solutés buvables, les comprimés, les ampoules. La composition pharmaceutique selon l'invention peut également se présenter sous une forme compatible avec une injection, i.e. une injection locale, une administration à travers la muqueuse, une inhalation, une administration orale et plus généralement toute formulation appropriée pour le but visé.

De manière préférée, la composition pharmaceutique selon l'invention se présente sous une forme compatible pour une administration oculaire, intra-oculaire, intra-vitréenne, sous-ténonienne, sous-rétinienne, intra-orbital, sous-conjonctivale, intraveineuse, intra-artérielle, intramusculaire, intrapéritonéale, topique, sous-cutanée, intra-nasale, orale ou parentérale.

La composition pharmaceutique selon l'invention comprend de 10% à 90% en poids d'un fragment du FH par rapport au poids total de la composition. Préférentiellement, la composition pharmaceutique selon l'invention contient de 20 à 60% d'un fragment du FH par rapport au poids total de la composition.

Parmi les modes d’administration d’une protéine thérapeutique à l’intérieur de l’œil, l’injection intra-vitréale est une manière simple de libérer une protéine dans le segment postérieur de l’œil afin de minimiser l’exposition systémique. Cependant, l’injection répétée peut entraîner des complications telles que des hémorragies, des décollements de la rétine ou de la cataracte.

Afin de réduire le nombre d’injection et de maintenir à un niveau constant l’activité de la protéine thérapeutique, d’autres modes d’administration ont été conçus. Notamment, des polymères particulaires ou non et des lipides particulaires (liposomes, micelles, émulsions nanométriques) permettent la libération progressive de la protéine thérapeutique qui est encapsulée, ce qui réduit la toxicité et augmente sa durée de vie. Enfin, la composition pharmaceutique de l'invention comprend en outre un autre agent actif, tels que, par exemple, d'autres substances utilisées dans le traitement des pathologies oculaires. Typiquement, cet autre agent actif peut être présent dans la composition pharmaceutique à raison d’au moins 20% en poids par rapport au poids total de ladite composition.

Le fragment du Facteur H selon l'invention peut être administré sous forme de DNA ou cDNA pour une expression génique en local. Aussi, un autre objet de l'invention est un polynucléotide comprenant la séquence d'acides nucléiques représentée en SEQ ID N°3 pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.

Dans un mode de réalisation préféré, ledit polynucléotide comprend une séquence d'acides nucléiques choisie parmi dans le groupe constitué des séquences représentées en SEQ ID N°5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N°ll, et SEQ ID N°13.

Un autre objet de l'invention est un vecteur d'expression comprenant le polynucléotide codant pour le fragment du facteur H de l'invention, ou une cassette d’expression comprenant ledit polynucléotide pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.

Selon l'invention, les vecteurs d'expression appropriés pour une utilisation selon l'invention peuvent comprendre au moins un élément de contrôle d'expression fonctionnellement lié à la séquence d'acide nucléique. Les éléments de contrôle d'expression sont insérés dans le vecteur et permettent de réguler l'expression de la séquence d'acide nucléique. Des exemples d'éléments de contrôle d'expression incluent notamment des systèmes lac, le promoteur du phage lambda, les promoteurs de levure ou les promoteurs viraux. D’autres éléments opérationnels peuvent être incorporés, comme une séquence de tête, des codons de terminaison, des signaux de polyadénylation et des séquences nécessaires pour la transcription et la traduction ultérieure de la séquence d'acide nucléique dans le système hôte. Il sera compris par l'homme de l'art que la combinaison correcte des éléments de contrôle d'expression dépend du système hôte choisi. Il sera également entendu que le vecteur d'expression doit contenir les éléments supplémentaires nécessaires pour le transfert et la réplication ultérieure du vecteur d'expression contenant la séquence d'acide nucléique dans le système hôte. De tels vecteurs sont facilement construits en utilisant des méthodes conventionnelles ou disponibles dans le commerce. L'expression du polynucléotide de l'invention peut par exemple être réalisée localement par toute méthode de transfert du polynucléotide vectorisé par des méthodes virales ou non virales dans n’importe quelle cellule de l’œil. L'invention concerne donc une composition comprenant un polynucléotide selon l'invention pour son utilisation comme médicament de thérapie génique. Les moyens par lesquels le vecteur portant le polynucléotide peut être introduit dans les cellules comprennent notamment la microinjection, l'électroporation, la transduction ou la transfection à l'aide de DEAE-dextran, la lipofection, le phosphate de calcium ou d'autres procédures connues de l'homme de l'art.

Dans un mode de réalisation préféré, les vecteurs d'expression eucaryotes qui fonctionnent dans les cellules eucaryotes sont utilisés. Des exemples de tels vecteurs comprennent les vecteurs viraux tels que les rétrovirus, adénovirus, virus de l'herpès, virus de la vaccine, virus de la variole, le poliovirus, lentivirus, les vecteurs d'expression bactériens ou des plasmides tels que pcDNA5.

Des vecteurs viraux offrent l’avantage d’une bonne efficacité de transfection mais ne contrôlent pas la quantité de protéines sécrétées. La technologie de cellules encapsulées a été développée afin de pouvoir administrer une protéine thérapeutique de manière contrôlée, continue et à long terme dans le segment postérieur de l’œil. De plus, des techniques d’électroporation pour transfection spécifique du muscle ciliaire oculaire permettent d’utiliser le muscle ciliaire comme un réservoir de plasmides codant pour des protéines thérapeutiques et ainsi d’exprimer et de sécréter le fragment selon l’invention en intraoculaire et pendant une durée prolongée.

Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode thérapeutique pour le traitement d'une pathologie impliquant une néovascularisation, ladite méthode comprenant l'administration d'un fragment du facteur H comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2. Toutes les caractéristiques techniques mentionnées ci-avant sont applicables ici.

Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un fragment du facteur H comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2 pour l'obtention d'un médicament destiné à traiter une pathologie impliquant une néovascularisation. Toutes les caractéristiques techniques mentionnées ci-avant sont applicables ici.

Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif seulement, et ne sauraient limiter la portée de l’invention.

EXEMPLES

Les inventeurs ont ici démontré le potentiel thérapeutique de fragments du FH dans des modèles pertinents de pathologies impliquant la néovascularisation. Pour cela, ils ont produits dans des cellules en culture plusieurs fragments du FH. Ils ont ensuite procédé à la purification de ces fragments. Le dosage de l'activité biologique des fragments a été testé in vitro sur la capacité des fragments du FH (1) à inhiber la lyse des érythrocytes de mouton par le C3b humain (activité liée au complexe C5b9) et (2) à dissocier la C3 convertase formée au préalable dans des plaques ELISA 96 puits (activité anti-C3 convertase). Enfin, les inventeurs ont mesuré l'inhibition de l'angiogenèse par les fragments produits dans le modèle d’induction de la CNV par laser chez le rat. Cette étude a permis de mettre en évidence pour la première fois et de façon inattendue, un rôle anti-angiogénique de fragments du FH.

I. Préparation des fragments du facteur H

Les inventeurs ont développé des fragments du FH comprenant divers domaines. la séquence des domaines SCR 1 à 7 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N° 4, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°5; la séquence des domaines SCR 1 à 18 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°6, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°7; la séquence des domaines SCR 7 à 20 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°8, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°9; la séquence des domaines SCR 7 à 18 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°10, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°ll, la séquence des domaines SCR 6 à 8 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°12, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°13. la séquence des domaines SCR 1 à 4 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°14 et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°15; la séquence des domaines SCR 1 à 6 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°16 et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°17; la séquence des domaines SCR 8 à 20 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°18 et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°19;

Le nom, la nature et la séquence de ces fragments sont résumés dans le tableau ci-après:

IL Production et purification des fragments du facteur H

Les séquences nucléiques des fragments de FH ont été clonées dans un vecteur plasmidique permettant l’expression de ces molécules dans des cellules eucaryotes. La sécrétion de ces molécules dans le surnageant de culture cellulaire est favorisée par Γutilisation en position N-terminale d’un peptide signal choisi judicieusement (MB7). La production des fragments est réalisée par transfection transitoire dans la lignée cellulaire humaine HEK 293F. Après 7 jours de production en mode batch, le surnageant est récolté, clarifié, concentré puis filtré.

La purification des fragments du FH s'effectue par chromatographie d’affinité sur colonne Ni-NTA ou colonne de cobalt par l’intermédiaire du tag hexahistidine ajouté en position C-terminale des fragments de FH. Le fragment FH 1NT18 ne contenant pas de tag en position C-terminale, a été purifié par une ou deux étapes de chromatographie échangeuse d’ions (SP-Sepharose et Q-Sepharose). Les fragments de FH élués ont été soumis à une dialyse contre du tampon PB S puis concentrés si la concentration finale déterminée par absorbance à 280nm était inférieure à 500pg/ml. III. Analyse de l'inhibition de l'angiogenèse

Les inventeurs ont évalué l'activité anti-angiogénique induite par chacun des fragments du FH décrit au point I. Pour ce faire, ils ont utilisé un modèle animal de néovascularisation choroïdienne, des rats Long Evans (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France).

Matériel et Méthodes

Essai quantitatif pour la détermination de la néovascularisation choroïdienne.

Les rats ont été anesthésiés (à l'aide d'un mélange de kétamine/xylazine dans un ratio de ΙΟΟμΙ/lOOmg) et les yeux ont été dilatés avec du mydriaticum et anesthésiés avec de la tétracaïne. Six impacts laser Argon situés à deux papilles du nerf optique ont été réalisés à intervalles réguliers. Ensuite, la cornée de ces rats a été protégée à l’aide d’une application d’un gel « Goniosol ». Puis, 3μ1 d’une solution saline seule ou d’une solution de FH diluée dans une solution saline ont été injectés dans le vitré des yeux de chaque rat. Deux temps d’injection ont été testés : 1- en préventif soit le jour même du laser et 2- en curatif soit 4 jours post-laser. Après sacrifice aux jours 7 ou 14 post-laser, les yeux des rats ont été énucléés puis fixés dans une solution de paraformaldéhyde. Seule la partie postérieure de l’œil (EPR/choroïde/sclère) a été prélevée puis coupée radialement. Après avoir bloqué les sites non spécifiques avec une solution de sérum de chèvre, les complexes EPR/choroïde/sclère ont été marqués avec un marqueur des cellules endothéliales dilué dans une solution saline. Les complexes EPR/choroïde/sclère sont alors montés entre lame et lamelle à l’aide d’un milieu de montage. Les marquages ont été observés à l’aide d’un microscope confocal «Zeiss» et des images de l’ensemble de l’impact laser, appelées Stacks, ont été prises. Ces images ont ensuite été analysées à l’aide du logiciel « ImageJ » ainsi la surface de marquage a été quantifiée pour chaque impact et ce pour chaque œil de rat. Pour chaque expérimentation, au moins 3 groupes de 4 rats ont été expérimentés : 1- rats non injectés (groupe témoin), 2- rats injectés avec une solution saline (groupe test de l’injection) et 3- rats injectés avec une solution de FH. Résultats

Les inventeurs ont mesuré l'inhibition de la néovascularisation choroïdienne conférée par les différents fragments du FH produits.

Ces résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous

Ces résultats mettent clairement en évidence que les fragments selon l'invention, c’est-à-dire les fragments comprenant le domaine SCR7 du FH permettent une inhibition maximale de la néovascularisation choroïdienne. A la connaissance des inventeurs, il s'agit des premiers essais montrant un rôle anti-angiogénique des fragments du FH comprenant le domaine SCR7.

Ces fragments apparaissent alors comme particulièrement pertinents pour le développement de stratégies de traitement de pathologies impliquant la néovascularisation.

Claims (13)

1. Revendications

   1. Fragment du Facteur H pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation, ledit fragment du Facteur H comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2.
2. 2. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon la revendication 1, ledit fragment comprenant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué de SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10 et SEQ ID N° 12.
3. 3. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon la revendication 1, ledit fragment comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2 fusionnée avec les domaines SCR 1 à 4 du facteur H humain et/ou les domaines SCR 19 à 20 du facteur H humain.
4. 4. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite pathologie impliquant une néovascularisation est choisie dans le groupe constitué de la DMLA, la néovascularisation de l'iris, la néovascularisation intraoculaire, la néovascularisation cornéenne, la néovascularisation rétinienne, la néovascularisation choroïdienne, la rétinopathie ischémique, la rétinopathie radique, le glaucome néovasculaire, la rétinopathie diabétique, la rétinopathie de la prématurité, l’occlusion vasculaire veineuse, les vasculopathies prolifératives non tumorales et le cancer.
5. 5. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit cancer est choisi dans le groupe constitué des tumeurs intraoculaires vascularisées et/ ou vasculaires, des vasculopathies prolifératives tumorales, et des tumeurs vasculaires d’origine vasculaire ou non telles que les hémangiomes choroidiens, les proliférations angiomateuses intrarétiniennes, les anastomoses choriorétiniennes ou les vasculopathies polypoidales.
6. 6. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la pathologie impliquant une néovascularisation est une pathologie oculaire choisie dans le groupe constitué de : la DMLA de forme néovasculaire, la néovascularisation choroïdienne, et les tumeurs oculaires d’origine vasculaire ou non.
7. 7. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la pathologie impliquant une néovascularisation est la néovascularisation choroïdienne secondaire à la DMLA ou la néovascularisation choroïdienne secondaire à une myopie forte, à une inflammation intraoculaire ou à une choroïdite infectieuse ou non infectieuse.
8. 8. Composition pharmaceutique comprenant un fragment du Facteur H comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2 pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire choisie parmi la DMLA, la néovascularisation de l'iris, la néovascularisation intraoculaire, la néovascularisation cornéenne, la néovascularisation rétinienne, la néovascularisation choroïdienne, la rétinopathie ischémique, la rétinopathie radique, le glaucome néovasculaire, la rétinopathie diabétique, la rétinopathie de la prématurité, l’occlusion vasculaire veineuse, les vasculopathies prolifératives non tumorales et le cancer.
9. 9. Composition pharmaceutique comprenant un fragment du Facteur H comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2 pour une utilisation selon la revendication 8, dans laquelle ledit cancer est choisi dans le groupe constitué des tumeurs intraoculaires vascularisées et/ ou vasculaires, des vasculopathies prolifératives tumorales, des tumeurs vasculaires d’origine vasculaire ou non telles que les hémangiomes choroidiens, les proliférations angiomateuses intrarétiniennes, les anastomoses choriorétiniennes ou les vasculopathies polypoidales).
10. 10. Polynucléotide comprenant la séquence d'acides nucléiques représentée en SEQ ID N°3 pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.
11. 11. Polynucléotide pour son utilisation selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit polynucléotide comprend une séquence d'acides nucléiques choisie dans le groupe constitué des séquences représentées en SEQ ID N°5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N°ll, et SEQ ID N°13.
12. 12. Vecteur d'expression comprenant le polynucléotide comprenant la séquence d'acides nucléiques représentée en SEQ ID N°3 pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.
13. 13. Composition comprenant un polynucléotide comprenant la séquence nucléotidique représentée en SEQ ID N°3 pour son utilisation comme médicament de thérapie génique.