JP2003128575A

JP2003128575A - 脳腫瘍治療剤

Info

Publication number: JP2003128575A
Application number: JP2001327319A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Tabuchi; 和雄田渕; Tetsuya Shiraishi; 哲也白石
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-10-25
Filing date: 2001-10-25
Publication date: 2003-05-08

Abstract

(57)【要約】【課題】蛋白質としてのＦａｓリガンドを有効成分と
し、脳脊髄液内に投与することにより、より安全に、Ｆ
ａｓ／Ｆａｓリガンド系を介するアポトーシスを誘導す
る脳腫瘍治療剤の提供。【解決手段】アポトーシス誘導活性を有する、Ｆａｓリ
ガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチ
ドを含んだ蛋白質を有効成分とすることを特徴とする脳
腫瘍治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はＦａｓリガンドまた
はそのアミノ酸配列の一部を含み、アポトーシス誘導活
性を有する蛋白質を有効成分とすることを特徴とする脳
腫瘍治療剤に関する。本発明はまた、このような蛋白質
を有効成分とする医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｆａｓリガンドは、細胞表面抗原Ｆａｓ
を発現する細胞に対してアポトーシスを誘導する生体内
分子として、長田らにより報告されたポリペプチドであ
り（Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６：１５６７，１
９９４）、ＴＮＦファミリーに属する分子量約４０ｋＤ
のII型糖蛋白質で、ＴＮＦと同様に、生体内で３量体を
形成すると考えられている（Ｔａｎａｋａｅｔａ
ｌ．ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１４：１１２９，１９９
５）。また、ヒトＦａｓリガンドはラットＦａｓリガン
ド（Ｓｕｄａｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ，７５：１１６９，
１９９３）やマウスＦａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ７６：９６９，１９９４）
と細胞外領域において高いホモロジーを有しており、ヒ
トＦａｓリガンドはヒトＦａｓのみでなくラットＦａ
ｓ、マウスＦａｓをも認識し、アポトーシスを誘導する
ことができる。また、近年、アポトーシス、特にＦａｓ
を介するアポトーシスと種々の疾患及び生理現象との関
連が示唆されている。たとえば、ウイルス性劇症肝炎に
おける肝細胞死及びある種の自己免疫疾患等において、
Ｆａｓを介するアポトーシスの異常が関与する可能性が
示唆されている。また、癌細胞の増殖は、生体の細胞増
殖制御機構の過程であるアポトーシスを逸脱した無秩序
な増殖であり、放射線治療や抗癌剤を用いる化学療法も
癌細胞にアポトーシスを誘導させる方法の一つである。
例えば、ブレオマイシンもＦａｓ／Ｆａｓリガンドを介
したアポトーシスを誘導することが報告されている（Ｍ
ｉｚｕｔａｎｉｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒ７９：１
１８０，１９９７）。この様に抗癌剤とアポトーシスの
関係が研究されているが、これら現在知られている抗癌
剤は、腫瘍細胞に対する選択性に乏しく、副作用は免れ
得ないアポトーシス誘導法である。特に脳腫瘍について
みると、現在行われている脳腫瘍（グリオーマ）の治療
は腫瘍全体を完全に摘除することが基本であるが、悪性
の脳腫瘍においては境界が明確でないため、完全には摘
出できないことが多く、放射線治療、化学療法や免疫療
法を併用している。しかし、その予後は充分満足のいく
ものではない。例えば、マイトマイシンの血小板減少、
ニトロソウレア系の造血障害及び腎毒性、シクロフォス
ファミドの消化器毒性、シスプラチンの腎毒性及びブレ
オマイシンの副作用等がよく知られているように、抗癌
剤は癌細胞に対する効果が強いほど、正常細胞または生
体に対する副作用が強いために充分な効果が上げられて
いない。また、放射線療法においても脱毛及び呼吸器障
害等の副作用が知られている。さらに、発生場所によっ
ては外科手術も適応できないなど解決すべき問題は多
い。

【０００３】一方ヒト悪性脳腫瘍ではＦａｓリガンドの
受容体である、Ｆａｓの発現が高く、周りの正常組織で
は発現が低いこと（Ｓｈｉｎｏｕｒａｅｔａｌ．Ｊ
ｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．９１：１０４４，２
０００）、悪性度が高いほどＦａｓ発現率が高くなるこ
と（Ｔａｃｈｉｂａｎａｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲ
ｅｓ．５５：５５２８，１９９５）、また、予後のいい
低グレードの脳腫瘍ではＦａｓリガンドの発現レベルが
高いこと（Ｅｈｒｍａｎｎｅｔａｌ．Ｎｅｏｐｌａ
ｓｍａ４７：１５１，２０００）が報告されている。

【０００４】Ｆａｓリガンドの脳腫瘍治療の分野におけ
る臨床応用につながる例としてはアデノウイルスを用い
たＦａｓリガンドｃＤＮＡの株化グリオーマ細胞Ｕ−３
７３ＭＧへの導入（Ｓｈｉｎｏｕｒａｅｔａｌ．Ｊ
ｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．９１：１０４４，２
０００）、Ｆａｓリガンド遺伝子を導入した細胞の局所
投与による癌治療法（国際公開番号ＷＯ９８／４６２４
２）、Ｆａｓリガンドを発現させた細胞の培養膠芽腫細
胞への添加（Ｋａｗａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．Ｎｅｕ
ｒｏｓｕｒｇｅｒｙ４６：４３１，２０００）、Ｆａ
ｓまたはＦａｓリガンド上のアミノ酸配列から導かれる
アミノ酸配列を有し、Ｆａｓ発現細胞に選択的にアポト
ーシスを誘導することができるペプチドを有効成分とす
る抗癌剤（特開２００１−１８７７９９号公報）等の報
告がある。しかし、蛋白質としてのＦａｓリガンドその
もの、若しくはその誘導体、またはＦａｓリガンドの生
物学的活性を有する融合蛋白質等を用いた例はない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ウイ
ルス、細胞等を介せず、蛋白質としてのＦａｓリガンド
そのもの、若しくはその誘導体、またはＦａｓリガンド
の生物学的活性を有する融合蛋白質を有効成分とし、脳
脊髄液内に投与することにより、より安全に、Ｆａｓ／
Ｆａｓリガンド系を介するアポトーシスを誘導する脳腫
瘍治療剤を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、脳腫瘍患
者を救うべく、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系の機能及びＦ
ａｓ／Ｆａｓリガンド系を介するアポトーシスを脳腫瘍
治療に応用することを鋭意研究してきたが、脳腫瘍モデ
ルにおいてＦａｓリガンドの生物学的活性を有する融合
蛋白質がその病態を改善することを見出し、本発明を完
成した。すなわち、本発明は、下記の脳腫瘍治療剤およ
び医薬組成物に関するものである。（１）アポトーシス誘導活性を有する、Ｆａｓリガンド
のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドを含
む蛋白質を有効成分とすることを特徴とする脳腫瘍治療
剤。（２）前記蛋白質がＦａｓリガンド融合蛋白質であるこ
とを特徴とする（１）に記載の脳腫瘍治療剤。（３）前記融合蛋白質がオリゴマー形成能を有するペプ
チドを含むことを特徴とする（１）または（２）に記載
の脳腫瘍治療剤。（４）前記アミノ酸配列が配列番号１に記載の配列であ
る（１）ないし（３）に記載の脳腫瘍治療剤。（５）前記蛋白質がＦＬＡＧ様ペプチド、ロイシンジッ
パーおよびＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも
一部を有するペプチドを含む融合蛋白質である（１）な
いし（４）に記載の脳腫瘍治療剤。（６）前記融合蛋白質は、Ｎ末端側からＦＬＡＧ様ペプ
チド、ロイシンジッパー、Ｆａｓリガンドのアミノ酸配
列の少なくとも一部を有するペプチドの順で連結されて
いることを特徴とする請求項５に記載の脳腫瘍治療剤。（７）前記ロイシンジッパーが配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列であり、前記ＦＬＡＧ様ペプチドが配列番号３
に記載のアミノ酸配列である（５）または（６）に記載
の脳腫瘍治療剤。（８）前記融合蛋白質が配列番号４に記載の配列である
（２）ないし（６）に記載の脳腫瘍治療剤。（９）脳腫瘍がグリオーマであることを特徴とする
（１）ないし（８）に記載の脳腫瘍治療剤。（１０）局所投与剤であることを特徴とする（１）ない
し（９）に記載の脳腫瘍治療剤。（１１）脳脊髄腔内への投与剤であることを特徴とする
（１０）に記載の脳腫瘍治療剤。（１２）配列番号３に記載するＦＬＡＧ様ペプチドと、
配列番号２に記載するロイシンジッパーと、配列番号１
に記載するＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも
一部を有するペプチドとが、この順でＮ末端側から連結
されている融合蛋白質を有効成分とする医薬組成物。（１３）配列番号４に記載する融合蛋白質を有効成分と
する医薬組成物。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の脳腫瘍治療剤により治療
対象とされる脳腫瘍は、頭蓋内に発生するすべての腫瘍
をいう。このような脳腫瘍の中でも、発生頻度の高い代
表的なものが神経膠腫（グリオーマ）であり、これはさ
らに、星細胞腫（アストロサイトーマ）、神経膠芽腫
（グリオブラストーマ）等を含む。脳腫瘍には、この
他、下垂体腺腫、神経鞘腫などがある。ただし、本発明
が治療対象とする脳腫瘍は、これらに限定されるもので
はなく、Ｆａｓを発現し、頭蓋内に発生する、もしくは
血液、肺や胃など他の臓器由来の腫瘍であっても、転移
により頭蓋内で増殖する腫瘍であれば含まれる。

【０００８】次に、本発明においてＦａｓリガンドと
は、少なくともその生物学的活性として、Ｆａｓに結合
し、Ｆａｓを発現する細胞にアポトーシスを誘導する活
性を有する物質である。Ｆａｓリガンドによるアポトー
シスの誘導は、Ｆａｓリガンドが細胞表面のＦａｓに結
合し、Ｆａｓを介して、アポトーシスのシグナルが細胞
に伝達されるためと考えられている。ここでいうＦａｓ
あるいはＦａｓリガンドは例えば、ヒト、マウス、ラッ
ト、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、ウマ、サル、ネコ、イヌ、マーモット等のいかなる
動物種由来のものであってもよいが、好ましくはヒト由
来のものである。

【０００９】本発明において、脳腫瘍治療剤の有効成分
であるＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部
を有するペプチドとは、好ましくは配列表の配列番号１
に記載のアミノ酸配列の全体を有するペプチド、およ
び、そのアミノ酸配列の任意の長さからなる任意の一部
分を有するペプチドであり、Ｆａｓリガンドとしての生
物学的活性を有するものを意味する。もちろん、そのア
ミノ酸配列の任意の一部に加え、そのＮ末端、Ｃ末端の
いずれか一方、もしくはその両方に、例えばＭｅｔ等の
任意の１つ以上のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列
で規定されるペプチド、あるいはアミノ酸配列中の任意
の位置に１つ以上のアミノ酸の変異、付加、欠失、置換
が生じたものであってもＦａｓリガンドとしての生物学
的活性を有する限りにおいては、これに含まれる。例え
ばラットやマウスのＦａｓリガンドのアミノ酸配列はヒ
トのＦａｓリガンドのアミノ酸配列に複数の置換、欠失
が生じているものと位置づけることができるが、いずれ
もＦａｓリガンドとしての生物学的活性を有することが
知られている。同様に、アカゲザル（Ｗａｎｇｅｔａ
ｌ．ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５９：５９
９，１９９８）やモルモット、ニワトリ、ウサギ、ブ
タ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ネコ、イヌ、マーモッ
ト等の他の動物種由来のＦａｓリガンドであっても、Ｆ
ａｓリガンドとしての生物学的活性を有する限りにおい
ては、本発明において使用するＦａｓリガンドのアミノ
酸配列の少なくとも一部を有するペプチドに含まれる。
Ｆａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有す
るペプチドの最も好適な一例は、Ｆａｓリガンドの細胞
外ドメインである。Ｆａｓリガンドの細胞外ドメイン
は、配列表の配列番号１に記載のヒトのＦａｓリガンド
では１０３〜２８１アミノ酸部分に相当する。しかし、
本発明において使用する、融合蛋白質はアポトーシスを
誘導する活性を有するものであり、ヒトのＦａｓリガン
ドにおいてはＮ末端から１４５〜２８１アミノ酸部分が
アポトーシス誘導活性に必要であることが知られてい
る。したがって、本発明において使用する融合蛋白質は
Ｆａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部とし
て、ヒトのＦａｓリガンドの１４５〜２８１アミノ酸部
分を含有するものである。しかし、アポトーシス誘導活
性がより強いものとしては、さらにヒトのＦａｓリガン
ドの１４４アミノ酸部分を含有することが好ましい。

【００１０】オリゴマー形成能を有するペプチドとは、
二量体、三量体、或いはそれより高度のオリゴマーへと
自己会合する能力があるペプチドのことであり、多くの
場合、α−ヘリックスやβ−シートのような２次構造を
とりうる。ロイシンジッパーが好適な１例として提供さ
れる。

【００１１】ロイシンジッパーとは、数々の蛋白質にお
ける保存ドメインとして存在する、（ａｂｃｄｅｆｇ）
_n（ｎは４あるいは５）と表示される反復性７残基モチ
ーフを意味するのに用いられる用語である。式中、ａお
よびｄは一般的にロイシンあるいはイソロイシンのよう
な疎水性残基であり、これらはヘリックスの同一面に並
んでいる（ＭｃＬａｃｈｌａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：２９３，１９７５）。位置ｄに
存在するロイシン残基は大きな疎水性安定化エネルギー
の一因となっており、そしてこれは二量体形成にとって
重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．
Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＲｅｓ．３８：２２９，１９９
１）。また、ロイシンジッパーの上記式ａおよびｄ残基
に対応するアミノ酸置換がロイシンジッパーのオリゴマ
ー形成特性を変化させることが見いだされた（Ｈａｒｂ
ｕｒｙｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１４
０１，１９９３）。位置ａの全ての残基がイソロイシン
に代わる場合には、ロイシンジッパーは依然として平行
二量体を形成する。この変化に加え、位置ｄのロイシン
残基が全てイソロイシンに代わる場合には、得られるペ
プチドは溶液中において自発的に三量体平行らせん状コ
イルを形成する。位置ｄの全てのアミノ酸をイソロイシ
ンで、そして位置ａの全てのアミノ酸をロイシンで置換
すると四量体を形成する。オリゴマー形成のメカニズム
が同一であるかぎり、これらの置換を含むペプチドは依
然としてロイシンジッパーとして引用される。ロイシン
ジッパーの好適な例は、前記位置ａおよびｄ残基がすべ
てイソロイシンに代えられた、いわゆるイソロイシンジ
ッパーであり、もっとも好適な１例は、配列番号２に記
載される配列を有するものであるがオリゴマー形成能を
有するかぎりにおいてはこれに限定されるものではな
い。オリゴマー形成能を有するペプチドの他の例として
は、ｐ５３の四量体化に関与する配列、血小板因子４、
ヒストンＨ３およびＨ４蛋白質の一部の配列などが知ら
れている（これらは、特表平１１−５０８１２６号公報
に詳細に記載され、本明細書はこれを引用として明細書
の内容とする。）。ここで、アミノ酸配列中の任意の位
置に１つ以上のアミノ酸の変異、付加、欠失、置換が生
じたものであってもロイシンジッパーとしての生物学的
活性を有する限りにおいては、これに含まれる。

【００１２】ＦＬＡＧペプチドとは、本来、生物活性を
変化させず、特異的モノクローナル抗体により認識され
るエピトープを提供し、発現される融合蛋白質の迅速な
検出および容易な精製を可能にするためのものである
が、組換え蛋白質の産生量を増加させる効果を有してい
る。本発明において使用するＦＬＡＧ様ペプチドとは、
ＦＬＡＧペプチドと同様の組換え蛋白質の産生量を増加
させる効果を有するペプチドを意味する。ＦＬＡＧペプ
チドの好適態様は、配列番号３に記載する配列である
が、この効果を有する限りにおいては、そのアミノ酸配
列の任意の一部に加え、そのＮ末端、Ｃ末端のいずれか
一方、もしくはその両方に、例えばＭｅｔ等の任意の１
つ以上のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列で規定さ
れるペプチド、あるいはアミノ酸配列中の任意の位置に
１つ以上のアミノ酸の変異、付加、欠失、置換が生じた
ものであっても、これに含まれる。例えば、Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓというアミノ酸配列からなるペプチドも、配列番号３
に記載の配列と同等の機能を有するものとして含まれ
る。

【００１３】本発明において使用する融合蛋白質は、Ｆ
ａｓリガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有する
ペプチド、オリゴマー形成能を有するペプチドおよびＦ
ＬＡＧ様ペプチドのいずれをも含み、Ｆａｓリガンドの
生物学的活性を有する、すなわち、少なくともＦａｓと
結合し、Ｆａｓを発現している細胞にアポトーシスを誘
導する活性を保持している。融合蛋白質は、Ｆａｓリガ
ンドの生物学的活性を有している限り、その構成に関し
て、３種のペプチドはいかなる順序で連結されてもよい
し、任意のリンカー配列やシグナル配列を含むこともで
きる。リンカー配列は、当技術分野において周知であ
る。シグナル配列の例としては、マウスＴリンパ球抗原
ＣＤ８シグナル配列、バキュロウイルスｇｐ６７蛋白シ
グナル配列、Ｇ−ＣＳＦシグナル配列、ヒトＦａｓシグ
ナル配列のような蛋白質の分泌を促すシグナル配列が挙
げられる。

【００１４】該融合蛋白質の好適な１例は、Ｎ末端側か
らＦＬＡＧ様ペプチド、ロイシンジッパー、ヒトＦａｓ
リガンドの細胞外ドメインの順に連結された融合蛋白質
である。最も好適な１例は配列表の配列番号４に示され
るアミノ酸配列を有するものであり、Ｎ末端側からＦＬ
ＡＧペプチド、ロイシンジッパー、ヒトＦａｓリガンド
の細胞外ドメインの順に連結された融合蛋白質である
が、ヒトＦａｓシグナル配列の一部を含んでいてもかま
わない。

【００１５】本発明の脳腫瘍治療剤は、Ｆａｓリガンド
のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドを含
んだ比較的分子量の大きい蛋白質（単一ポリペプチドと
して２６ｋＤａ超）を有効成分とする。これにより、本
発明の脳腫瘍治療剤は、有効成分の流動性が低く、投与
した際に所望の部位、すなわち腫瘍の存在する組織に保
持され、他の組織に副作用を及ぼすことなく、脳腫瘍に
効率良く作用する。また、このような比較的分子量の大
きい蛋白質を有効成分とするため、治療剤の生物学的半
減期が長く、より長期にわたって脳腫瘍に作用すること
ができる。これにより、脳腫瘍の治療する上で必要とな
る薬剤の投与回数をより少なくすることができる。さら
に、合成物ではなく、もともと生体内に存在するＦａｓ
リガンドを有効成分とするため、免疫原性が少ない。

【００１６】本発明の脳腫瘍治療剤の投与方法は特に限
定されないが、脳腫瘍に効率よく作用し、さらに他組織
への副作用等を排除できることから、局所投与が好まし
い。より好ましくは脳脊髄内投与であり、とりわけ脊髄
内投与、大曹内投与等が好ましいが、外科的な摘出手術
時において、より完璧にするために、あるいは外科的な
摘出が困難な場合などに、腫瘍組織あるいは摘出組織周
辺に直接接触させる方法、除放性になるよう工夫された
カプセル等を埋め込む方法も含まれる。

【００１７】本発明の医薬組成物は、上記したアポトー
シス誘導活性を有する、Ｆａｓリガンドのアミノ酸配列
の一部を有するペプチドを含む蛋白質を有効成分とし、
医薬上許容される担体または溶媒の類を、本発明で使用
する融合蛋白質と適宜組み合わせて種々の剤形としたも
のである。より詳細には、防腐剤、等張化剤、安定化剤
（例えば糖、糖アルコール、ヒト血清アルブミン、ヒト
免疫グロブリン、α２マクログロブリン、アミノ酸な
ど）、分散剤（例えばイオン性界面活性剤、非イオン性
界面活性剤など）、酸化防止剤（例えばアスコルビン
酸、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、没食子酸
プロピル、ｄｌ−α−トコフェロールなど）、緩衝剤、
保存剤（例えばパラベン、ベンジルアルコール、塩化ベ
ンザルコニウムなど）、更には必要に応じて滅菌水、植
物油、無害性有機溶媒あるいは無害性溶解補助剤（例え
ばグリセリン、プロピレングリコールなど）、乳化剤、
懸濁化剤（例えばツイーン８０、アラビアゴム溶液な
ど）などと適宜選択して組み合わせて適当な医薬用製剤
に調製することができる。

【００１８】この剤形としては、例えば水性もしくは非
水性の注射剤、乳濁性もしくは懸濁性の注射剤、あるい
は用時溶解、乳濁または懸濁して用いる固形注射剤等が
挙げられる。これらは例えばメンブランフィルターによ
る濾過、殺菌剤の配合または紫外線照射などによって無
菌化される。これらはまた無菌の個体組成物を製造し、
用時溶解、乳濁、または懸濁して用いる注射剤とするこ
ともできる。

【００１９】本発明の脳腫瘍治療剤の投与量は、症状に
より異なるが、通常、成人に対して一日あたり、全身投
与（静脈内投与等の非経口投与）の場合、約１〜１００
０mgの範囲以内で、好ましくは約１０〜１００mgの範囲
で投与されるが、患者の容態等に応じて適宜増減される
ものであり、これに限定されるものではない。また、全
量を単回あるいは２〜６回に分割して投与することや、
点滴静注等も可能である。局所投与の場合も、症状によ
り異なるが、脊髄内投与などの方法により適量投与する
ことができる。また、治療剤の剤形、投与方法、１日当
たりの投与回数、症状の程度、体重、年齢等によって適
宜増減することが好ましい。なお、本発明の化合物は従
来の治療薬と併用することも可能である。

【００２０】

【実施例】以下に、実施例をもって本発明を一層具体的
に説明するが、これらは一例として示すものであり、本
発明はこれらにより何等限定されるものではない。ま
た、以下の記載において用いる略号は、該分野における
慣用略号に基づくものである。

【００２１】（実施例１）ヒトＦａｓリガンド融合蛋白
質発現ベクターの作製（１）ロイシンジッパーとヒトＦａｓリガンド細胞外ド
メインの融合蛋白質を発現するプラスミドｐＭ１８０７
を以下に示す方法で作製した。センスプライマー１（Ａ
ＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴ
ＡＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＴＡＣＧＴＣＴＧＴＴＧＣ
Ｔ）、アンチセンスプライマー１（ＡＴＴＴＣＴＴＣＧ
ＡＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＡＴＴＣ
ＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＧＴＡＡＧＡＡＣＣＡＧ）、セ
ンスプライマー２（ＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＣＧＡＡＧ
ＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＧＡＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＣＡＴ
ＣＧＡＡＡＡＴＧＡＧ）、アンチセンスプライマー２
（ＧＣＧＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴＡＡＴＴＴＣＴＴＧＡＴ
ＴＣＴＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡＴＴＴＴＣＧＡＴＧＴＧＡ
ＴＡＧＡ）、センスプライマー３（ＴＧＣＧＡＡＴＴＣ
ＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧ）、アンチセン
スプライマー３（ＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧ
ＣＧＴＴＣＧＣＣＧＡＴＴＡＡＴＴＴＣ）、センスプラ
イマー４（ＧＧＣＧＡＡＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴ
ＣＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧ）およびアンチセンスプラ
イマー４（ＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＡＴＴ
ＡＧＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＡ）を化学合成機にて合成し
た。このセンスプライマー１はヒトＦａｓシグナル配列
をコードする配列を含んでいる。アンチセンスプライマ
ー１はヒトＦａｓシグナル配列をコードする配列の３'
末端領域とロイシンジッパーをコードする配列の５' 末
端領域を含んでいる。センスプライマー２はロイシンジ
ッパーをコードする配列の中間領域を含んでいる。アン
チセンスプライマー２はロイシンジッパーをコードする
配列の３' 末端領域を含んでいる。センスプライマー３
はヒトＦａｓシグナル配列をコードする配列の５' 末端
領域とＥｃｏＲＩサイト（ＧＡＡＴＴＣ）を含んでい
る。アンチセンスプライマー３はロイシンジッパーをコ
ードする配列の３' 末端領域、ＰｓｔＩサイト（ＣＴＧ
ＣＡＧ）およびヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインのＮ
末端側をコードする塩基配列を含んでいる。センスプラ
イマー４はロイシンジッパーをコードする配列、３' 末
端領域のＰｓｔＩサイト（ＣＴＧＣＡＧ）およびヒトＦ
ａｓリガンド細胞外ドメインのＮ末端側をコードする塩
基配列を含んでいる。アンチセンスプライマー４はヒト
ＦａｓリガンドのＣ末端側をコードする配列、ＴＡＡ終
止コドンおよびＫｐｎＩサイト（ＧＧＴＡＣＣ）を含ん
でいる。

【００２２】得られたセンスプライマー１およびアンチ
センスプライマー１と、センスプライマー２およびアン
チセンスプライマー２とをそれぞれ５０ｐｍｏｌ、ｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ１０ｎ
ｍｏｌ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン
社）を１．２５ユニットおよび添付の１０×Ｐｆｕバッ
ファー５μＬを含む５０μＬの溶液を調製した。ＤＮＡ
サーマルサイクラー（ＰＣＲシステム９６００、アプラ
イドバイオシステムズ社）を使用して；９４℃で３０
秒；５５℃で３０秒；７２℃で１分を１サイクルとする
ＰＣＲを３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をそ
れぞれ０．５μＬ、センスプライマー３およびアンチセ
ンスプライマー３をそれぞれ５０ｐｍｏｌを含む５０μ
ＬのＰＣＲ反応液を調製し、上記と同様にＰＣＲを行っ
た。

【００２３】一方、センスプライマー４およびアンチセ
ンスプライマー４をそれぞれ５０ｐｍｏｌ、鋳型として
ヒトＦａｓリガンドをコードする配列を含むプラスミド
ｐＢＸ−ｈＦＬ１（国際公開番号ＷＯ９５／１３２９
３）を１ｎｇ含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、同
様にＰＣＲを行った。さらに、センスプライマー３およ
びアンチセンスプライマー３を用いて得られたＰＣＲ産
物とセンスプライマー４およびアンチセンスプライマー
４を用いて得られたＰＣＲ産物をそれぞれ０．５μＬ、
センスプライマー３およびアンチセンスプライマー４を
それぞれ５０ｐｍｏｌを含む５０μＬのＰＣＲ反応液を
調製し、同様にＰＣＲを行った。

【００２４】得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＫ
ｐｎＩで二重消化した。一方、ＥＦプロモーター下にヒ
トＦａｓリガンド細胞外ドメインをコードする配列を持
ちＤＨＦＲ遺伝子を含む発現プラスミドｐＭ１０７０
（国際公開番号ＷＯ９５／１３２９３）をＥｃｏＲＩお
よびＫｐｎＩで二重消化し、アガロース電気泳動に供し
た後、約７ｋｂｐの断片を回収し精製した。このベクタ
ー側断片に上述のＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化した
ＰＣＲ産物の断片を組み込み、得られたプラスミドをｐ
Ｍ１８０７と命名した。

【００２５】（２）ＦＬＡＧペプチドとヒトＦａｓリガ
ンド細胞外ドメインの融合蛋白質を発現するプラスミド
ｐＭ１８０９を以下に示す方法で作製した。アンチセン
スプライマー５（ＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴ
ＴＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＣＧＴＡＡＧＡＡＣ
Ｃ）、センスプライマー５（ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴ
ＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣ
ＴＡＣＡＧ）を化学合成機にて合成した。このアンチセ
ンスプライマー５はヒトＦａｓシグナル配列をコードす
る配列の３' 末端領域とＦＬＡＧペプチドをコードする
配列を含んでいる。センスプライマー５はＦＬＡＧペプ
チドをコードする配列とヒトＦａｓリガンド細胞外ドメ
インのＮ末端側をコードする塩基配列を含んでいる。

【００２６】得られたアンチセンスプライマー５と実施
例１（１）で作製したセンスプライマー３をそれぞれ５
０ｐｍｏｌ、鋳型としてセンスプライマー１を０．０５
ｐｍｏｌ含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、実施例
１（１）と同様にＰＣＲを行った。一方、センスプライ
マー５および実施例１（１）で作製したアンチセンスプ
ライマー４をそれぞれ５０ｐｍｏｌ、鋳型として実施例
１（１）で使用したｐＢＸ−ｈＦＬ１を１ｎｇ含む５０
μＬのＰＣＲ反応液を調製し、同様にＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物をそれぞれ０．５μＬ、センスプラ
イマー３およびアンチセンスプライマー４をそれぞれ５
０ｐｍｏｌを含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、同
様にＰＣＲを行った。

【００２７】こうして得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ
およびＫｐｎＩで二重消化し、実施例１（１）と同様に
ｐＭ１０７０のＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化し
たベクター側断片に組み込み、得られたプラスミドをｐ
Ｍ１８０９と命名した。

【００２８】（３）プラスミドｐＵＣ−ＩＺＦＬを以下
に示す方法で作製した。ｐＵＣ１１８（宝酒造製）をＰ
ｓｔＩで消化し、ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔ
（宝酒造製）を用いて末端を平滑化した後ライゲーショ
ンを行うことで、ＰｓｔＩサイトをつぶしたｐＵＣ１１
８を得た。このプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ
で二重消化し、実施例１（１）で作製したロイシンジッ
パーおよびヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインを含むＰ
ＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化した断
片を組み込み、得られたプラスミドをｐＵＣ−ＩＺＦＬ
と命名した。

【００２９】（４）ＦＬＡＧペプチドとロイシンジッパ
ーとヒトＦａｓリガンド細胞外ドメインの融合蛋白質
（以下ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬと略記）
を発現するプラスミドｐＭ１８１５を以下に示す方法で
作製した。アンチセンスプライマー６（ＧＴＴＴＣＡＴ
ＴＣＴＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴ
Ａ）、センスプライマー６（ＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＧ
ＡＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＣ）を化学合成
機にて合成した。このアンチセンスプライマー６はＦＬ
ＡＧペプチドをコードする配列とロイシンジッパーをコ
ードする配列の５' 末端領域を含んでいる。センスプラ
イマー６はＦＬＡＧペプチドをコードする配列の３' 末
端領域とロイシンジッパーをコードする配列の５' 末端
領域を含んでいる。

【００３０】得られたアンチセンスプライマー６と実施
例１（１）で作製したセンスプライマー３をそれぞれ５
０ｐｍｏｌ、鋳型として実施例１（２）で作製したｐＭ
１８０９を１ｎｇ含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製
し、実施例１（１）と同様にＰＣＲを行った。一方、セ
ンスプライマー６および実施例１（１）で作製したアン
チセンスプライマー３をそれぞれ５０ｐｍｏｌ、鋳型と
して実施例１（１）で作製したｐＭ１８０７を１ｎｇ含
む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、同様にＰＣＲを行
った。得られたＰＣＲ産物をそれぞれ０．５μＬ、セン
スプライマー３およびアンチセンスプライマー３をそれ
ぞれ５０ｐｍｏｌを含む５０μＬのＰＣＲ反応液を調製
し、同様にＰＣＲを行った。

【００３１】こうして得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ
およびＰｓｔＩで二重消化した。一方、実施例１（３）
で作製したｐＵＣ−ＩＺＦＬをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ
Ｉで二重消化し、アガロース電気泳動に供した後、約
３．７ｋｂｐの断片を回収し精製した。このベクター側
断片に上述のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したＰＣ
Ｒ産物の断片を組み込み、プラスミドを得た。このプラ
スミドを更にＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで二重消化し、
実施例１（１）と同様にｐＭ１８０７のＥｃｏＲＩおよ
びＫｐｎＩで二重消化したベクター側断片に組み込み、
得られたプラスミドをｐＭ１８１５と命名した。プラス
ミドｐＭ１８１５は、平成１２年５月１２日付で日本国
茨城県つくば市東一丁目一番一号中央第六の独立行政法
人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し
（受託番号ＦＥＲＭＰ−１７８５３）、さらに平成１
３年５月８日付で原寄託から国際寄託に移管した（寄託
番号ＦＥＲＭＢＰ−７５７５）。

【００３２】（実施例２）ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓ
ｈＦａｓＬの発現（１）ＣＯＳ−１細胞を用いたＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ
−ｓｈＦａｓＬの発現を以下に示す方法で行った。実施
例１で作成したｐＭ１８１５をＣＯＳ−１細胞へ導入し
その上清中に該蛋白質を発現、分泌させた。すなわち、
１μｇのプラスミドを２μＬの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶
液に溶解した。これらに、それぞれ０．２ｍｇ／ｍＬ
ＤＥＡＥ−デキストランおよび５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．４）を含有するＤ−ＭＥＭ（日水製薬
製）０．７ｍＬを添加し、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラ
ン混合液を作製した。６ウエルプレート内でセミコンフ
ルエントまで単層培養したＣＯＳ−１細胞にＤＮＡ−Ｄ
ＥＡＥデキストラン混合液を滴下し、ＣＯ₂インキュベ
ータ中で、３７℃にて培養した。４時間後、ＤＮＡ−Ｄ
ＥＡＥデキストラン混合液を除去し、１０％ＦＢＳ（ギ
ブコ社製）を含有するＤ−ＭＥＭに交換し、さらに９６
時間培養した。プラスミドを導入したＣＯＳ−１細胞の
培養上清を回収し、以下の（２）および実施例３〜６に
使用した。

【００３３】（２）ＣＯＳ−１細胞培養上清中のＦＬＡ
Ｇ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬの定量を以下に示す方
法で行った。培養上清中のＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓ
ｈＦａｓＬの定量は、Ｆａｓリガンド特異的な抗体（固
相化抗体としてＦ９１８−２０−２、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識抗体としてＦ９１９−９−１８、各抗体
の詳細は国際公開番号ＷＯ９７／０２２９０に記載され
ている）を用いたＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ）にて実施した。

【００３４】（実施例３）ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓ
ｈＦａｓＬのＦａｓ発現腫瘍細胞株に対する細胞傷害活
性を、以下の方法で該融合蛋白質を添加して培養し、細
胞の死滅の割合を検討した。（１）ラットＦａｓ遺伝子のクローニングラットグリオーマ細胞由来株化培養細胞Ｃ６細胞をト
リプシン処理により培養フラスコよりはがし、1 ×１０
⁶個を遠心により回収し、「ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉ
ｋｉｔ」( ＱＩＡＧＥＮ社製) を用いてＲＮＡを回収し
た。回収したＲＮＡを吸光度により定量し、「Ｓｕｐｅ
ｒｓｃｒｉｐｔＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙ
ｓｔｅｍｆｏｒＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ」キット( ギブコＢＲＬ社製) を用い
てｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてセンスプライマ
ー７（ＴＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＧＣＴＧＴＧＧＡ
ＴＣＡＴＧ）とアンチセンスプライマー７（ＣＧＣＧＧ
ＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＣ
Ｃ）を用いてＰＣＲを実施した。このセンスプライマー
７はラットＦａｓシグナルペプチドをコードする配列の
５’末端領域、Ｋｏｚａｋ配列及び翻訳開始コドン（Ｇ
ＡＴＡＴＧ）、ＥｃｏＲＩサイト( ＧＡＡＴＴＣ) を含
み、アンチセンスプライマー７はラットＦａｓのＣ末端
側をコードする配列、終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡ
Ａ）、ＢａｍＨ１サイト( ＧＧＡＴＣＣ) を含んでい
る。このセンスプライマー７およびアンチセンスプライ
マー７をそれぞれ２０ｐｍｏｌ、ｃＤＮＡを１μＬ、ｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ１０
ｎｍｏｌ、ＥＸＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造
社製）を０．５ユニットおよび添付の１０×ＥＸＴａ
ｑバッファー２μＬを含む２０μＬの溶液を調製し、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（ＰＣＲシステム９６００、ア
プライドバイオシステムズ社製）を使用し、９４℃で３
０秒、６０℃で３０秒、７２℃で1 分を1 サイクルとす
るＰＣＲを３０サイクル行い、得られたＰＣＲ産物をＥ
Ｆプロモーター下にＰＣＲ産物をクローニングする配列
を持ちＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性遺伝子を含む発現プ
ラスミドｐＥＦ６／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビト
ロジェン社製）に組み込み、プラスミドｐＭ１８１８を
得た。

【００３５】（２）Ｆａｓ発現腫瘍細胞株の樹立Ｃ６細胞1 ×１０⁶個を直径１０ｃｍの培養用ディッシ
ュに１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地１０ｍＬに懸濁
して植え込み、翌日、その細胞に前項で調製したラット
Ｆａｓ遺伝子の発現プラスミドｐＭ１８１８を遺伝子導
入試薬ＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ・ダイアグノスティッ
ク社製）を用いてトランスフェクションし、その翌日、
ディッシュからトリプシン処理により細胞をはがして、
1 枚のディッシュから得られた細胞を３倍から１０倍に
希釈して新しいディッシュに植え込んだ。一昼夜培養の
後、培地に最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように抗生物
質Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（科研製薬製）を添加して約
２週間培養後、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性となった細
胞を９６ウェルプレートに単離した。この薬剤耐性細胞
の中から次項に示す方法を用い、ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉ
ｐ−ｓｈＦａｓＬ刺激感受性を指標としてＦａｓ高発現
細胞、Ｃ６−ｒＦａｓ細胞を選別した。

【００３６】（３）細胞傷害活性の検討Ｃ６細胞並びに前項で得られたＦａｓ刺激感受性を高め
たＣ６−ｒＦａｓ細胞を２×１０⁵細胞／ｍＬとなるよ
うに１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、それ
を９６ウエルプレートに５０μＬ／ウエル（１×１０⁴
個／ウエル）ずつ植え込んだ。翌日、１０％ＦＢＳを含
むＤ−ＭＥＭ培地にてＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦ
ａｓＬを検定する濃度（終濃度０．３、１、３、１０、
３０、１００および３００ｎｇ／ｍＬ）に希釈した。こ
の溶液を５０μＬ／ウエルとなるように先の細胞を植え
込んだウエルに添加し３７℃のＣＯ₂インキュベータ中
で約２０時間培養後、細胞傷害活性を測定した。活性測
定は、ミトコンドリアの酵素活性を指標に生存細胞数を
検定するＷＳＴ−１試薬（ＰｒｅｍｉｘＷＳＴ−１Ｃ
ｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙＳ
ｙｓｔｅｍ，宝酒造製）を１０μＬ／ウエル添加し３
７℃のＣＯ₂インキュベータ中で２ないし３時間培養
後、吸光度（４５０ｎｍ−６２０ｎｍ）を測定すること
で実施した。細胞傷害活性は、バックグランドとして細
胞を植え込んでいないウエルの値を差し引いた後、ＦＬ
ＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬを全く含まない培地
で同様に測定したウエルの値を１００％として細胞生存
率として算出した。細胞生存率（％）＝（検定するウエルの吸光度−細胞非
添加ウエルの吸光度）／（ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓ
ｈＦａｓＬ非添加ウエルの吸光度−細胞非添加ウエルの
吸光度）×１００図１に示すように、Ｃ６−ｒＦａｓ細胞に対し、ＦＬＡ
Ｇ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬは用量依存的に細胞傷
害活性を示した。

【００３７】（実施例４）ラット脳腫瘍モデルに対する
効果の検討９−１０週齢の雄性ＳＤ系ラットを塩酸メデトミジン
０．１ｍＬおよびケタミン０．５ｍＬ筋注にて麻酔し、
頚部を前屈させ頭部固定器に頭部を固定して後頭から後
頚部までを正中切開し、筋肉を鈍的に剥離し、後頭骨お
よび第一頚椎を露出させた。さらに後頭骨と第一頚椎間
の硬膜を露出させ、２９ゲージ針を後頭骨と第一頚椎間
から大槽内へ刺入し脳脊髄液約１００μＬを吸引採取し
た後、実施例３で得たＦａｓ高発現Ｃ６細胞株Ｃ６−ｒ
Ｆａｓ細胞1 ×１０⁶個を１００μＬの人工髄液で懸濁
し、２９ゲージ針を使って大槽内に移植した。１日後、
同様の方法で麻酔をかけ、頭部を固定し、硬膜を露出
し、人工髄液１５０μＬ（コントロール群）、ＦＬＡＧ
−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬ５０μＬ（Ａ群）、Ｆ
ＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬ１００μＬ（Ｂ
群）、ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬ１５０
μＬ（Ｃ群）をそれぞれ大槽内に注入し、さらに１日
後、麻酔下で１０％緩衝化ホルマリンで経心的に灌流し
て脳を摘出し、同液に数日間浸し、固定した。

【００３８】＜人工髄液の調製＞以下のＡ液１０ｍＬお
よびＢ液２０ｍＬを生理食塩水５００ｍＬに溶解して調
製した。Ａ液：塩化カリウム７７．４ｍｇ、塩化マグネシウム・
６水和物１２７．４ｍｇ、塩化カルシウム・２水和物９
２．４ｍｇ、補正用乳酸ナトリウム液（大塚製薬製）
０．８９６ｍＬ、１５％糖液（菱山製薬製）７．６４ｍ
Ｌを蒸留水に溶解し、１０ｍＬに調製した。Ｂ液：リン酸二水素カリウム８１．６ｍｇ、メイロン８
４（大塚製薬製）３．７９４ｍＬ) を蒸留水に溶解し、
２０ｍＬに調製した。

【００３９】＜病理検査＞摘出した脳のｃｏｒｏｎａｌ
ｓｅｃｔｉｏｎを作製してＨ−Ｅ染色し、全視野の中
でクモ膜下腔に腫瘍細胞が最も多く認められる部位を２
００倍で２ヵ所写真をとり、クモ膜下に存在する腫瘍細
胞数をカウントした。Ｈ−Ｅ染色による評価は、クモ膜
下腔に腫瘍細胞が認められないものを０、１から２層の
腫瘍細胞が認められるもの１、３から５層の腫瘍細胞が
認められるものを２、６層以上の腫瘍細胞が認められる
ものを３とし、その値を平均して表した。またＴＵＮＥ
Ｌ染色してアポトーシスを起こしている細胞を観察し、
ａｐｏｐｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ（ＴＵＮＥＬ染色陽性
率で表される）を求めた。その結果、表１に示すよう
に、ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬを投与する
ことにより生着腫瘍細胞数は減少し、１１２．５μg ／
ｂｏｄｙでは腫瘍細胞の生着は完全に抑制された。ま
た、生着した腫瘍も投与量に依存して、アポトーシスの
指標であるａｐｏｐｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘの増加が認
められ、アポトーシスを起こしていることが確認され
た。

【００４０】表１ラット脳腫瘍モデルに対する効果の検討 ──────────────────────────────── Ｆａｓ投与量ＨＦ染色評価生着細胞数 Apoptotic Index μｇ／body cells/area ％ ──────────────────────────────── ０．０２．０３２１０．６３７．５０．７７５１２．４７５．０１．０１１４１９．２１１２．５０．００ − ──────────────────────────────── ＦａｓＬ＝ＦＬＡＧ・ＩｌｅＺｉｐ・ｓｈＦａｓＬ

【００４１】（実施例５）安全性試験 ― ラット静脈
内投与６週齢の雌性ウィスターハノーバー系ラットを５群に
わけ、コントロールまたはＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓ
ｈＦａｓＬの０．１％ヒト血清アルブミン−ＰＢＳ
（−）溶液を０．１、０．２、０．３ｍｇ／ｋｇの用量
で尾静脈内投与し、２４時間後、頚静脈より、採血し、
ＧＯＴ、ＧＰＴを全血マルチロータＶ−ＤＰＰ( 第一化
学薬品製) を用いてベストスキャン全血自動分析装置Ｐ
Ｃ−２００１（米国Ａｂａｘｉｓ社製）で測定した。そ
の結果、表２に示すように、ＧＯＴおよびＧＰＴは薬物
非投与群に比べて変化は認められず、死亡例もなかっ
た。

【００４２】表２安全性試験ラット静脈内投与 ───────────────────────────── ＦａｓＬ投与量ＧＯＴＧＰＴ（ｍｇ／ｋｇｉ. ｖ. ）（ＩＵ／ｄＬ）（ＩＵ／ｄＬ） ───────────────────────────── ０．０６３２２０．１６２２５０．２５７２２０．３６８２７ ───────────────────────────── ＦａｓＬ＝ＦＬＡＧ・ＩｌｅＺｉｐ・ｓｈＦａｓＬ

【００４３】（実施例６）安全試験 ― ラット大槽内
投与９週齢の雌性ウィスターハノーバー系ラットを1 群３
匹にわけ、ＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−ｓｈＦａｓＬの人
工髄液溶液を１５μｇ／２０μＬ／ｂｏｄｙの用量
（０．１ｍｇ／ｋｇ相当）で大槽内投与し、２４時間後
観察したが、コントロール群との差は認められなかっ
た。

【００４４】

【発明の効果】本発明の脳腫瘍治療剤は、Ｆａｓ結合活
性およびアポトーシス発現活性といったＦａｓリガンド
のＦａｓリガンドとしての生物学的活性の強いＦａｓリ
ガンド融合蛋白質を有効成分とする。このため、大槽内
投与により、髄腔内に浸潤したＦａｓを発現するグリオ
ーマ細胞に低用量でアポトーシスを誘導することができ
る。また、治療効果が認められた用量のＦａｓリガンド
を大槽内投与しても副作用は認められず、脳腫瘍の治療
剤として有用である。

【００４５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mochida Pharmaceutical Co.,LTD. <120> Brain tumor remedy <130> MD0605 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 281 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val 5 10 15 Asp Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu 20 25 30 Pro Cys Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly 65 70 75 Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val 80 85 90 Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe 95 100 105 His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln 110 115 120 Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly His Pro Ser 125 130 135 Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr 140 145 150 Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr 155 160 165 Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly 170 175 180 Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val 185 190 195 Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys 200 205 210 Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met 215 220 225 Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala 230 235 240 Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp 245 250 255 His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu 260 265 270 Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280 281

【００４６】 <210> 2 <211> 33 <212> PRT <223> artificial <400> 2 Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys 5 10 15 Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile 20 25 30 Gly Glu Arg 33

【００４７】 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> artificial <400> 3 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

【００４８】 <210> 4 <211> 714 <212> DNA <213> artificial <400> 4 atg ctg ggc atc tgg acc ctc cta cct ctg gtt ctt acg tct gtt gct Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala 1 5 10 15 gac tac aag gat gac gat gac aag aga atg aaa caa atc gaa gac aag Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys 20 25 30 atc gaa gaa att ctt tcg aaa atc tat cac atc gaa aat gag att gcc Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala 35 40 45 aga atc aag aaa tta atc ggc gaa cgc ctg ctg cag ctc ttc cac cta Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu Phe His Leu 50 55 60 cag aag gag ctg gca gaa ctc cga gag tct acc agc cag atg cac aca Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr 65 70 75 80 gca tca tct ttg gag aag caa ata ggc cac ccc agt cca ccc cct gaa Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu 85 90 95 aaa aag gag ctg agg aaa gtg gcc cat tta aca ggc aag tcc aac tca Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser 100 105 110 agg tcc atg cct ctg gaa tgg gaa gac acc tat gga att gtc ctg ctt Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu 115 120 125 tct gga gtg aag tat aag aag ggt ggc ctt gtg atc aat gaa act ggg Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly 130 135 140 ctg tac ttt gta tat tcc aaa gta tac ttc cgg ggt caa tct tgc aac Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn 145 150 155 160 aac ctg ccc ctg agc cac aag gtc tac atg agg aac tct aag tat ccc Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro 165 170 175 cag gat ctg gtg atg atg gag ggg aag atg atg agc tac tgc act act Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr 180 185 190 ggg cag atg tgg gcc cgc agc agc tac ctg ggg gca gtg ttc aat ctt Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu 195 200 205 acc agt gct gat cat tta tat gtc aac gta tct gag ctc tct ctg gtc Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val 210 215 220 aat ttt gag gaa tct cag acg ttt ttc ggc tta tat aag ctc Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 225 230 235

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｆａｓ遺伝子を導入したＣ６−ｒＦａｓ細胞
および親株Ｃ６細胞に対するＦＬＡＧ−ＩｌｅＺｉｐ−
ｓｈＦａｓＬによる細胞傷害活性を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アポトーシス誘導活性を有する、Ｆａｓリ
ガンドのアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチ
ドを含む蛋白質を有効成分とすることを特徴とする脳腫
瘍治療剤。
【請求項２】前記蛋白質がＦａｓリガンド融合蛋白質で
あることを特徴とする請求項１に記載の脳腫瘍治療剤。
【請求項３】前記融合蛋白質がオリゴマー形成能を有す
るペプチドを含むことを特徴とする請求項１または２に
記載の脳腫瘍治療剤。
【請求項４】前記Ｆａｓリガンドのアミノ酸配列が、配
列番号１に記載するアミノ酸配列である請求項１ないし
３のいずれかに記載の脳腫瘍治療剤。
【請求項５】前記蛋白質がＦＬＡＧ様ペプチド、ロイシ
ンジッパー、およびＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少
なくとも一部を有するペプチドを含む融合蛋白質である
請求項１ないし４のいずれかに記載の脳腫瘍治療剤。
【請求項６】前記融合蛋白質は、Ｎ末端側からＦＬＡＧ
様ペプチド、ロイシンジッパー、Ｆａｓリガンドのアミ
ノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドの順で連結
されていることを特徴とする請求項５に記載の脳腫瘍治
療剤。
【請求項７】前記ロイシンジッパーが配列番号２に記載
のアミノ酸配列であり、前記ＦＬＡＧ様ペプチドが配列
番号３に記載のアミノ酸配列である請求項５または６に
記載の脳腫瘍治療剤。
【請求項８】前記融合蛋白質が配列番号４に記載の配列
である請求項２ないし６に記載の脳腫瘍治療剤。
【請求項９】脳腫瘍がグリオーマであることを特徴とす
る請求項１ないし８のいずれかに記載の脳腫瘍治療剤。
【請求項１０】局所投与剤であることを特徴とする請求
項１ないし９のいずれかに記載の脳腫瘍治療剤。
【請求項１１】脳脊髄腔内への投与剤であることを特徴
とする請求項１０に記載の脳腫瘍治療剤。
【請求項１２】配列番号３に記載するＦＬＡＧ様ペプチ
ドと、配列番号２に記載するロイシンジッパーと、配列
番号１に記載するＦａｓリガンドのアミノ酸配列の少な
くとも一部を有するペプチドとが、この順でＮ末端側か
ら連結されている融合蛋白質を有効成分とする医薬組成
物。
【請求項１３】配列番号４に記載する融合蛋白質を有効
成分とする医薬組成物。