CN1387568A

CN1387568A - 修饰的睫状神经营养因子及其制备方法和使用方法

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Publication number: CN1387568A
Application number: CN00814294A
Authority: CN
Inventors: S·J·维甘德; M·W·斯莱曼; P·D·拉姆伯特
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-08-13
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2002-12-25
Also published as: JP2003507393A; IL148033A0; EP1200589A1; HUP0203057A3; HUP0203057A2; AU6382200A; BR0013204A; PL364931A1; CA2379940A1; WO2001012810A1

Abstract

在制备用于治疗糖尿病,尤其是用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病mellitus或妊娠性糖尿病的药剂中使用了修饰的睫状神经营养因子Ax－15。

Description

修饰的睫状神经营养因子及其制备方法和使用方法

本专利申请是1999年8月13日提交的、美国专利序号为NO.09/373,834的专利的部分继续，后者是1999年2月26日提交的、PCT申请号为NO.PCT/US 99/04430的专利部分继续，而1999年2月的申请又是1998年2月27日提交的、美国专利号为NO.09/031,693的专利申请的部分继续。在这些延续的申请中，引用了多种专利和出版物来作为参考文献。因此，那些专利和出版物在本发明中是全文引用以作为参考。发明背景

本发明涉及到与治疗用CNTF相关的多肽，这些多肽在治疗神经性的或其他疾病或病症方面是有效的。

睫状神经营养因子(CNTF)是体外鸡胚胎睫状神经节神经元存活所必须的一种蛋白(Manthorpe et al.，1980，J.Neurochem.34：69-75)。睫状神经节在解剖学上位于眼腔之中，在外直肌和视神经鞘之间。它容纳又支配着睫状肌和瞳孔括约肌的动眼神经的副交感神经纤维。

在过去的十年里，在CNTF支持睫状神经节神经元存活的功能之外又发现了CNTF的多种生物效应。人们认为CNTF诱导了围产期鼠视神经和大脑中双潜能神经胶质远祖细胞的分化(Hughes et al.，1988，Nature 335：70-73)。此外，还观察到其促进了鸡胚胎脊神经节传感神经元的存活(Skaper and Varon，1986，Brain Res.389：39-46)。此外，CNTF支持了运动神经元、海马回神经元、presumpathetic脊髓神经元的存活和分化[Sendtner，et al.，1990，Nature 345：440-441；Ip，et al.1991，J.Neurosci.11：3124-3134；Blottner，et al.1989，Neurosci.Lett.108：316-320]。

很久前我们就已得知，骨骼肌神经支配在维持肌肉结构和功能上起着关键的作用。最近的研究的表明骨骼肌是阳性CNTF作用的靶。特别的，CNTF预防了除神经支配诱导的骨骼肌萎缩(体重降低和肌纤维交叉区减少)和除神经支配的骨骼肌的颤搐和手足搐搦(Helgren et al.，1994 Cell 76：493-504)。在这个模型中，人CNTF也产生了一种不利效应，明显的延缓了体重的增加。这个不利效应也在利用rHCHTF治疗ALS的临床实验上观察到。因此，对利用rHCNTF或其他化合物进行治疗来讲，在去神经支配后对肌肉重量和动物体重进行检测可分别作为治疗效率和不利反应的检测手段。将从这些测量值获得的潜能值比率定义为治疗指数(T.I)，此处用TD₂₅/ED₅₀表示，因此T.I.值越高治疗剂量的化合物越安全。

已经在细菌表达体系中克隆和表达了CNTF，Masiakowski，etal.，在1991的J.Neurosci.

57：1003-1012的文章中和在1991年4月4日出版的国际出版号为NO.91/04316的出版物中对此有描述，这两篇文献在此全文引用以做参考。

已经对CNTF受体(叫做“CNTF_α)进行了克隆、排序和表达[seeDavis，et al.，1991 Science 253：59-63]。已知CNTF和造血因子是白血病抑制因子(LIF)，他们通过一个共有的信号途径来作用于神经元细胞，这个共有的信号途径涉及IL-6信号转换元件gp130和第二种β-元件(称作LIFRβ)。相应的，CNTF/CNTF受体复合体可在携带有gp130和LIFRβ元件的LIF效应细胞和其他细胞中启动信号转导[lp，et al.，1992，Cell 69：1121-1132].

在人CNTF之外，已经克隆了相应的鼠(StOckli et al.，1989，Nature 342：920-923)和兔(Lin et al.，1989，J.Biol.Chem.265：8942-8947)CNTF基因，发现他们编码一种含有200个氨基酸的蛋白，这些基因与人CNTF基因有大约80％同一性。人和鼠重组蛋白可在非常高的水平上表达(可达总蛋白的70％)，并纯化至近乎均一。

尽管他们在结构和功能上有很多相似之处，重组人和鼠CNTF在许多方面不同。在支持培养物中的鸡胚胎睫状神经元的存活和轴突生长方面，重组鼠CNTF的生物活性是重组人CNTF生物活性的4倍[Masiakowski et al.，1991，J.Neurochem.57：1003-1012]。此外，鼠CNTF较人CNTF对人CNTF受体有较高的亲和性。

相同大小的人和鼠CNTF在物理特性上有让人惊讶的区别：他们在SDS凝胶中具有不同的迁移率。这种行为差异表明在两个分子中的一个分子中含有奇异的结构特征，即使在变性状态下这种特征也是存在的(Masiakowski et al.，1991，J.Neurochem.57：1003-1012)。

已经广泛使用通过基因工程方法进行的诱变来阐明重组蛋白功能域的结构组成。在有关于进行缺失和替代诱变的文献中描述了几种不同的方法。最成功的是丙氨酸扫描诱变[Cunningham and Wells 1989，Science 244：1081-I085]和同族体扫描诱变[Cunningham et al.，

1989，Science 243：1330-1336]。这些方法帮助鉴定了生长激素的受体结合域，并且产生了对同源受体具有修饰的结合特性的杂交蛋白。

为了更好的理解rHCNTF的物理、生物化学和药物学特性，在他们相应的重组蛋白的不同生物学和物理特性之上，申请者对人和鼠CNTF基因做了合理的诱变(见Masiakowski，P.，et al.，1991，J.Neurochem.，57：1003-1012)。申请者发现，63位的氨基酸能很大程度的提高人CNTF对sCNTF_α的亲和性和其在体外的生物学潜能(Panayotatos，N.，et al.，J.Biol.Chem.，1993，268：19000-19003；Panayotatos，N.，et al.，Biochemistw，1994，33：5813-5818)。

正如共同共决的在1990年8月20日提交的、美国专利申请序列号为NO.07/570,651、题目为睫状神经营养因子的专利中，以及在1991年4月4日出版的国际出版号为WO 91/04316的出版物中描述的，申请者考虑的CNTF的一个应用就是来治疗Huntington疾病(Huntington舞蹈病)，而这两篇文献在此处都是全文引用作为参考。Huntington疾病是中枢神经系统的一种可遗传的变性性病症。HD的病理学是基底节累进的、无情的退化，而基底节是在大脑深处负责随意运动和认知行为的整合作用的结构。HD症状的出现一般是在成年期，在20到40岁之间。这种疾病特征的临床表现是舞蹈症和其他无意识的运动、痴呆和精神症状。舞蹈运动包括短暂的、无意识的、不固定的运动，主要影响远端四肢。患者经常趋向于将这些运动与随意活动相混合来掩盖这些运动，然而，HD病人也表现出多种其他的神经不正常，包括张力失常(持续的、不正常的姿势)、抽搐(习惯性痉挛)、共济失调(动作失调)以及发音困难(急促不清的发音)。HD患者的痴呆特征为原型的皮层下痴呆。HD患者的临床症状包括精神状态缓慢和难于集中精力和对多种任务排序。HD病人的行为障碍是多种多样的，包括人格改变如冷漠和退缩；激动，冲动，偏执狂，抑郁症，攻击行为，妄想，精神病等。无情的运动(relentless)、认知和行为退化造成了社会性的和功能性的无能力，最终导致死亡。

HD是常染色体显性遗传。估计它在美国的流行程度可达每100,000人中有5-10人，在美国总共有25,000位患者。然而，由于症状出现的晚，还有大量的处于危险状态但又无症状的个体存在。携带有HD基因的处于危险状态但又无症状的病人的流行程度或许是有症状病人的两倍(W.Koroshetz and N.Wexler，personalcommunication)。因此，适于接受新治疗的HD患者群体大约为75,000人。

现在认为，负责HD发病机制的基因位于4号染色体短臂的端粒末端。这些基因编码一个结构新颖但功能未知的蛋白，现在对基因产物与HD发病机制间的关系并不清楚。

HD造成的主要结构损伤包括丧失尾状核和壳中(在啮齿类动物中总称为纹状体)所谓的“中等多刺(medium spiny)”神经元。这些神经元包括投射系统，凭借这些投射系统，尾状核/壳就可投射到位于大脑基底核中的输出核上。虽然许多中等多刺神经元利用的神经介质也含有神经肽如脑啡肽和P物质，但介质多刺神经元所利用的主要神经介质是γ-氨基丁酸(GABA)。然而，非常清楚的是中间神经元中含有的乙酰胆碱或神经肽生长激素释放抑制激素或神经肽Y对HD来讲是相对无害的，而HD的中间神经元是不利用GABA作为其神经介质的。

与HD中可见的病理和神经化学变化相似的变化可通过在纹状体中输注谷氨酸能激动剂来获得。在适当的条件下输注喹啉酸可选择性的缺失中等大小的内部纹状体神经元，并且不影响大的胆碱能中间神经元，而内部纹状体神经元是利用γ-氨基丁酸(GABA)作为他们的神经介质的。

在HD中，没有在其症状或神经保护处理方面的成功临床实验。然而，现有有用的、经过证实的等级评定仪器以及神经成像技术可对病程和患者功能进行监测。

CNTF受体复合体含有三种蛋白：一个可直接结合到CNTF上的特异性确定性α元件，以及2个信号传导β元件(LIFRβ和gp130)，虽然他们自己本身不能结合到CNTF上，但是他们在对CNTF进行响应时是启动信号所必需的。CNTFR复合体的β元件比α元件在体内具有更广泛的分布。正常情况下，CNTFR的3个元件在细胞表面是不结合的；通过首先结合到CNTFRα，然后与gp130结合，最后引入LIFRβ，CNTF诱导了一个完整受体复合体的逐级组装。当受体复合体组装的最后一步(β元件的异源二聚作用)完成时，通过活化与β元件相关的非受体酪氨酸激酶(JAK激酶)而启动了细胞内信号。JAK激酶和位于受体细胞质区域的酪氨酸残基通过相互磷酸化来进行响应，为STAT蛋白的Src同源区2结构域产生了磷酸酪氨酸停泊位点。在他们的磷酸化作用完成之后，结合的STAT蛋白与受体分离，二聚化，并且转移到核区，在那里他们结合到DNA上并且活化转录(reviews：Frank，D.andGreenberg，M.(1996)Perspectives on developmentalneurobiology 4：3-18；Stahl，N.and Yancopoulos，G.(1997)Growth factors and eytokines in health and disease 2B，777-809)。Axokine是具有改进的物理和化学特性的CNTF变异分子，它保留有与CNTF受体相互作用和活化CNTF受体的能力(Panayotatos，N.，et al.(1993)J.Biol.Chem.268：1 9000-1 9003)。

Ob基因的产物Leptin是脂肪细胞分泌的，它的功能是作为大脑的外周信号来调节进食和能量代谢(Zhang，Y.，et at.(1994)Nature372：425-431)。有趣的是，leptin受体(OB-R)是一个含有与gp130相当的相似序列的跨膜受体(Tartaglia，L.，et al.(1995)Cell83：1263-1271)，并且与CNTF相似，leptin通过JAK/STAT途径发送信号(Baumann，H.，et al.(1996)Proc.Natl.Aced.Sci.USA93：8374-8378；Ghilardi，N.，et al.(1996)Proc.Natl.Aced.Sci.USA 93：6231-6235)。对CNTF和leptin的系统给药可在下丘脑饱中枢诱导产生tis-11(Gloaguen，I.，et al.(1997)Proc.Natl.Aced.Sci.USA 94：6456-6461)和STAT3(Vaisse，C.，et al.(1996)Nature Gen.14：95-97)，这表明了他们在调节体重和进食行为中的作用。实际上，对人给药CNTF减少了食物的摄取，从而造成体重下降(Group，A.C.T.S.(1996)Neurology 46：1244-1249.)。

发明简述

本发明的一个目标是为治疗包括，但并不局限于糖尿病和肥胖症在内的疾病或病症提供新颖的、与CNTF相关的神经营养因子。在一个优选的实施方案中，将CNTF和相关的分子用于治疗非胰岛素依赖性糖尿病。

本发明进一步的目标是提供一种鉴定与CNTF相关的因子的方法，除了此处特别描述的，这些因子都具有改进的治疗特性。

按照本发明，这些目标以及其他的目标都实现了，人CNTF蛋白的氨基酸替代也提高了提高了其治疗特性。在一个实施方案中，在电泳迁移率上的改变可用于开始筛选潜在有用的修饰的CNTF蛋白。

在一个优选实施方案中，用精氨酸(即63Q→R)替代或其他的氨基酸代替了CNTF第63位的谷氨酰胺，这样就产生了具有改进的生物活性的修饰的CNTF分子。在进一步的实施方案中，与63Q→R突变相结合的rHCNTF变体具有另外三个新颖的特性：

1)缺失最后的13个氨基酸残基(称为ΔC13)来给予rHCNTF更大的溶解性，并且不损害其活性；

2)替代17位的单一的半胱氨酸残基，这样使得在生理缓冲条件下，在生理pH和温度条件下rHCNTF能稳定存在，并且不影响rHCNTF的活性；或

3)替代氨基酸残基64W，这样可改变rHCNTF在体外的生物活性，并且使其在体内的治疗指数提高了7倍。

在另一个优选的实施方案中，RG297分子(rHCNTF，17CA63QRΔC13)将63Q→R替代(这给予了更大的分子潜能)与末端13个氨基酸残基缺失(这在生理条件下给予了更大的溶解性)和17CA替代(这给予了稳定性，尤其是在37℃的生理条件下)结合使用，这样的分子显示了动物模型中的rHCNTF 2-3倍的治疗指数。

在另外一个优选的实施方案中，描述了一个携带有双重63QR64WA替代的RG242分子，这样的替代使得分子具有不同的生物潜能谱，并且将治疗指数提高了7倍。

在另外一个优选实施方案中，描述了携带有双重63QRΔC13替代的RG29分子，这样就在生理条件下给予了更大的溶解性。

图表简述

图1-CNTF蛋白序列的对比。A.人、大鼠、兔、鼠和小鸡的CNTF蛋白序列(Leung，et al.，1992，Neuron 8：1045-1053]。黑点代表在人序列中发现的残基。B.利用修饰的CNTF分子来展示人CNTF氨基酸残基(点)和大鼠CNTF(展示的残基)。在左面标明了相应于每个序列的纯化的重组蛋白的名称。

图2-人、大鼠和其他几种修饰的CNTF分子在15％的还原性SDS-PAGE凝胶上的迁移率。纯化的重组蛋白如标记所示。分子量标记物在M泳道上。

图3-两种修饰的CNTF分子的生物活性。A.人CNTF(填充的菱形)，大鼠CNTF(开放的正方形)，以及RPN219(填充的正方形)。B.人CNTF(填充的菱形)，大鼠CNTF(开放的正方形)，以及RPN228(填充的正方形)。在指定的蛋白浓度下生存时，游离的E8睫状神经元的剂量响应是以在2ng/ml的大鼠CNTF条件下存活的神经元数目的百分数来表示的。每个实验点表示三次测定的平均值。

图4-对A)SCG神经元和B)MG87/huCNTFR成纤维细胞的竞争性配体结合。垂直条表示三次测定值的平均值的标准偏差。

图5-人CNTF和几种修饰的CNTF分子在15％SDS-PAGE凝胶上的迁移率。重组人CNTF(指定的HCNTF)和几种修饰的CNTF蛋白的上清液(A)和沉淀物(B)制剂的泳道如图所示。修饰的蛋白表示的是ΔC13(也叫做RG160)；17CA；ΔC13(RG162)；ΔC13，63QR RG290)和17CA，ΔC13，63QR(RG297)。分子量标记物在M泳道上。在37℃的生理缓冲液中培育0、2、7和14天的蛋白分别如1-4泳道所示。

图6-在相应于多种CNTF变体增加的浓度条件下，主要的游离E8鸡睫状神经元的存活。大鼠CNTF和rHCNTF的对照浓度响应曲线是利用标准的、未处理的贮存液来获得的，四种rHCNTF变体RG297、RG290、RG160和RG162的响应曲线也是在相同的条件下获得的。

图7-在相应于多种CNTF变体增加的浓度条件下，主要的游离E8鸡睫状神经元的存活。大鼠CNTF和rHCNTF的对照浓度响应曲线是利用标准的、未处理的贮存液来获得的，rHCNTF变体RG228(也叫做RPN118，并且含有63QR突变)的响应曲线也是在相同的条件下获得的。

图8-在相应于多种CNTF变体增加的浓度条件下，主要的游离E8鸡睫状神经元的存活。大鼠CNTF和rHCNTF的对照浓度响应曲线是利用标准的、未处理的贮存液来获得的，rHCNTF变体RG242(含有突变63QR，64WA)的响应曲线也是在相同的条件下获得的。

图9-在对三种浓度规格化为100μg/kg的化合物rHCNTF，RG228和RG242静脉内(IV)给药后，大鼠中平均血浆浓度时间曲线。

图10-在对三种浓度规格化为200μg/kg的化合物rHCNTF，RG228和RG242皮下(SC)给药后，大鼠中平均血浆浓度时间曲线。

图11-大鼠肌肉湿重的剂量依赖型营救的对比，(A)hCNTF对RG228；(B)hCNTF对RG297以及(C)hCNTF对RG242。

图12-hCNTF、RG228、RG242和RG297的体内毒性对比。

图13-接受神经营养因子处理和羟喹酸注射的大脑的典型Nissl染色区(冠状平面)。左上方：对完整的caudate-putamen(CPu)的观察。相邻部分：对比观察经过NGF、BDNF或NT-3处理或羟喹酸注射的大脑区域。在神经营养因子处理的大脑区域中，限定的区域(开放箭头所指)实际上没有中等大小的神经元。CPu中的两条痕迹是插管输液(c)和羟喹酸注射针(箭头顶端)留下的。ec，外囊；LV，侧室；比例尺＝0.5mm。

图14-经过CNTF或PBS处理和羟喹酸注射的大脑的典型Nissl染色区(冠状平面)。左上方：对完整的caudate-putamen(CPu)的观察。右上方：对侧面caudate-putamen(CPu)进行的更高放大倍数的观察表明其中有许多中等大小的神经元，其中很多是用箭头标明。中部和左下部：经过CNTF或PBS处理和羟喹酸注射的大脑的左面caudate-putamen(Cpu)。CPu中的两条痕迹是PBS或CNTF插管输液(c)和羟喹酸注射针(箭头顶端)留下的。开放的箭头表示损伤的中间分界线。中间和右下方：对插管侧面250um区域在高放大倍数进行观察，表明在PBS处理的大脑(神经元损失分数＝4)中实际上是完全缺乏中等大小的纹状体神经元，在CNTF处理的大脑中存在大量的正常出现的神经元(许多存活的神经元是用箭头标明的；神经元损失分数＝2)。ec，外囊；LV，侧室；比例尺＝0.5mm；right比例尺＝30um。

图15-神经营养因子处理对纹状体内注射喹啉酸(QA)诱导的中等大小纹状体神经元损失的影响。A、B、C、D、E指接受神经营养因子或PBS处理以及喹啉酸注射的组的平均神经元损失分数(±SEM)。每组中接受营养因子处理的大鼠的数目如下：NGF＝5；BDNF＝12；NT-3＝10；Ax1＝7；在每个实验的PBS处理对照组中选用了相等数目的大鼠。统计比较是利用不成对的t-检验来进行的。相对于PBS处理对照组，NT-3处理显著增加(+)了平均神经元损失分数：t(17)＝2.75，p＝0.01。相对于PBS处理对照组，CNTF或Ax1处理显著降低了(-)平均神经元损失分数：分别为t(5)＝2.7，p＝0.04和t(13)＝4.2，p＝0.001。

图16-Ax1处理对纹状体内注射喹啉酸(QA)诱导的中等大小纹状体神经元损失的影响。在每个图的上面都有一个时间线段来指示实验方案。A.在实验范例中接受Ax1(n＝6)或PBS(n＝5)处理的组的平均神经元损失分数，除了渗透泵植入时间仅仅为4天，并且在取出泵后注射喹啉酸为期3天，这个实验范例与图1的图例相似。B.在喹啉酸注射3天前和1天后，接受Ax1(n＝6)或PBS(n＝6)每日注射的组的平均神经元损失分数(±SEM)。^*unpaired t-检验，A：t(9)＝2.5，p＝0.03；B：t(10)＝2.3，p＝0.04。

图17-Axokine-15在正常鼠体内的效用。正常的C57BL/6J鼠接受为期6天的每日皮下注射浓度为0.1mg/kg、0.3mg/kg或1.0mg/kg的载体或Ax-15。图示了Ax-15处理组的体重对载体处理对照组的变化百分数。

图18-Ax-15在ob/ob鼠体内的效用。正常的C57BL/6J ob/ob鼠接受为期7天的每日皮下注射浓度为0.1mg/kg、0.3mg/kg或1.0mg/kg的载体、leptin(1.0mg/kg)或Ax-15。对经过限食处理和成对饲养的鼠注射0.3mg/kg Ax-15来研究食物摄取减少对体重损失的影响。图示了Ax-15处理组和leptin处理组的体重对载体处理对照组的变化百分数。

图19-Ax-15对患有食物诱导的肥胖症的鼠的影响。将AKR/J鼠置于高脂肪饮食环境中为期7周，然后接受载体，leptin(1.0mg/kg)或浓度为0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg或1.0mg/kg的Ax-15处理。对经过限食处理和成对饲养的鼠注射0.3mg/kg Ax-15来研究食物摄取减少对体重损失的影响。图示了Ax-15处理组和leptin处理组的体重对载体处理对照组的变化百分数。

图20A和20B-在患有饮食诱导肥胖症的AKR/J鼠中，Ax-15和饮食限制对血清胰岛素和皮质酮水平的影响。图20A-在利用载体、饮食限制和Ax-15(0.01mg/kg)或仅仅Ax-15(0.1mg/kg)对饮食诱导的ARK/J肥胖鼠进行处理后测定其血清胰岛素水平，从而来确定饮食和/或Ax-15处理对与肥胖症相关的胰岛素分泌过多症的影响。图20-B-在利用载体、饮食限制和Ax-15(0.01mg/kg)或仅仅Ax-15(0.1mg/kg)对饮食诱导的ARK/J肥胖鼠进行处理后测定其皮质酮水平，从而来确定饮食和/或Ax-15处理对与肥胖症相关的胰岛素分泌过多症的影响。

图21-在患有饮食诱导的肥胖症的鼠中，在引起体重损失方面，1-20-PEG Ax-15(单-20-PEG Ax-15)与未PEG化的Ax-15相比具有4倍的有效性。DIO鼠每周接受皮下注射(*)PBS、Ax-15(0.7mg/kg)或1-20-PEG Ax-15(0.23和0.7mg/kg)，为期13天。每天对动物进行称重，平均体重变化以基线+/-SEM(n＝6/组)的百分数变化来表示。

图22-在患有饮食诱导的肥胖症的鼠中，1-20-PEG Ax-15比未PEG化的Ax-15更有效的降低其食物摄取。DIO鼠每天接受皮下注射(*)PBS、未PEG化的Ax-15(0.7mg/kg)或1-20-PEG Ax-15(0.23和0.7mg/kg)，为期13天。每天对动物进行食物摄取记录，结果以消费的沉淀的平均克体重+/-SEM(n＝6/组)来表示。

图23A-23D-图23A-每天接受Ax-15处理的db/db实验动物比进行热量限制的动物显著增加了体重损失。每天对db/db鼠或他们的heterozygous litter mates(db/？)皮下注射(s.c.)Ax-15(0.1或0.3mg/kg)或载体，为期10天。将一组接受载体处理的实验动物(成对饲养)的食物摄取限制为与接受最高浓度Ax-15处理的组中的鼠摄取的食物量相同的量。每天记录平均组体重+/-SEM(n＝12)。图23B-在db/db鼠中进行为期10天的Ax-15处理对葡萄糖耐受的影响。对接受载体处理(开放的正方形)、pairfed-载体处理(填充的菱形)和Ax-15处理(0.1mg/kg/天，开放三角形；0.3mg/kg/天，填充的三角形)的db/db雄性鼠和年龄匹配的杂合体(age-matchedheterozygous)db/？鼠(填充的圆形)进行了口服葡萄糖耐受实验。每个点表示至少12只实验动物+/-SEM的平均值。图23C-每天低剂量Ax-15处理的db/db鼠显著引起了显著的体重损失。db/db鼠每天接受为期10天Ax-15(0.0125，0.025或0.05mg/kg)或载体的皮下注射。每天记录平均组体重+/-SEM(n＝6)。图23D-db/db实验动物接受为期10天的低剂量Ax-15处理对葡萄糖耐受的影响。对接受载体处理(开放正方形)和Ax-15处理(0.0125，0.025或0.05mg/kg)的雄性db/db鼠进行口服葡萄糖耐受实验。每个点每个点表示至少6只实验动物+/-SEM的平均值。

图24-相对于载体处理(开放的正方形)、pairfed载体处理(填充的菱形)，Ax-15处理(0.3mg/kg/天；填充的三角形)对db/db雄性鼠非禁食血清血葡萄糖影响的反应过程。每个点代表最后一次注射14小时后至少6只实验动物+/-SEM的平均值。

图25A-25C-对db/db实验送物进行为期10天的Ax-15处理的生理血结果。图25A：与对照组的载体处理(开放的条状)、pairfed载体处理(阴影线条状)和age-matched heterozugous db/？(带点条状)鼠相比较，确定了接受为期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，阴影线条状)处理的雄性db/db鼠血清中禁食血糖浓度。每个条状代表至少8只实验动物的+/-SEM的平均值。图25B：与对照组的载体处理(开放的条状)、pairfed载体处理(阴影线条状)和age-matched heterozugous db/？(带点条状)鼠相比较，确定了接受为期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，阴影线条状)处理的雄性db/db鼠血清中禁食胰岛素浓度。每个条状代表至少8只实验动物的平均值+/-SEM。图25C：与对照组的载体处理(开放的条状)、pairfed载体处理(阴影线条状)和age-matchedheterozugous db/？(带点条状)鼠相比较，确定了接受为期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，阴影线条状)处理的雄性db/db鼠血清中禁食游离脂肪酸水平。每个条状代表至少8只实验动物的+/-SEM的平均值。胰岛素耐受检测数据表明严重损害的载体处理对照db/db实验动物具有提高的胰岛素灵敏度。

图26A-26H-Ax-15处理对db/db鼠弓形神经核的胰岛素刺激的磷酸酪氨酸免疫反应性的影响。与载体注射对照组水平(图26A)相比，在30分钟的胰岛素大丸剂注射(通过颈静脉，1IU)，Heterozygous(db/？)鼠的免疫染色表明弓形神经核达到磷酸酪氨酸免疫反应染色神经元数目有提高(图25B)。对胰岛素抵抗的/患有糖尿病的鼠(接受过为期10天的载体处理)的胰岛素分析揭示了一个基本的高酪氨酸免疫反应染色模式(图26C)，这个模式在进行胰岛素处理(图26D)之后没有可检测到的变化。对db/db鼠为期10天的Ax-15处理减弱了高基底磷酸酪氨酸免疫反应性(图26E和26G)，并且恢复了胰岛素磷酸酪氨酸响应性(图26F和图26H)。

图27A-27B Ax-15处理对db/db鼠肝部胰岛素刺激的信号发送的影响。雄性db/db鼠接受为期10天的载体处理(7和8泳道)、pairfed到药物处理水平的载体处理(泳道1和2)或Ax-15(0.1mg/kg/天，泳道5和6；0.3mg/kg/天；泳道4和5)处理。在接受处理的第11天时，经由门静脉注射盐水(-)或1 IU的普通胰岛素(+)使其麻醉。将肝脏取出，蛋白提取物利用抗磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫沉淀，然后利用PI-3-激酶的P85调节亚单位的抗血清进行标准的Western印记分析(图27A)，利用IRS-1特异性抗血清对蛋白提取物进行免疫沉淀，然后利用一种抗磷酸酪氨酸特异性抗体进行Western印记分析(图27B，上图)，以及利用IRS-1-特异性抗血清进行蛋白提取物沉淀和Western印记分析(图27B，下图)。将非免疫对照免疫沉淀(NI)、非裂解物对照(NL)和p85(C)的3T3-L1裂解物对照作为免疫沉淀和印记对照。

发明详述

本发明涉及到治疗人或动物神经性和内分泌疾病和病症的方法。它部分基于最开始发现重组大鼠CNTF比重组人CNTF能更有效的结合到人CNTF受体上，并且随后发现能使人CNTF与大鼠CNTF更加相似的氨基酸替代作用可提高修饰的CNTF与人CNTF受体的结合，并且伴随着生物活性的提高。

在一个优选的实施方案中，人CNTF蛋白的单个氨基酸改变可显著提高蛋白促进睫神经节和其他神经元的存活与生长的能力。

重组人和大鼠CNTF具有相同数目的氨基酸(199)和相似的分子量(在去除N-末端蛋氨酸后的分子量分别为MW22,798和22,721)。不过，在还原性SDS-PAGE凝胶上，重组人CNTF与分子量为27,500的蛋白的迁移相同，而大鼠CNTF具有预期的迁移率。此外，对于鸡睫神经节(CG)神经元来讲，人CNTF的活性要比大鼠CNTF活性低4倍，并且大鼠CNTF蛋白比人CNTF蛋白更有效的竞争结合到细胞表面的人或大鼠受体上。

上述的观察结果使得我们付出努力来检测CNTF分子上与这些差别相关的区域。这种方法包括利用基因工程方法用相应的大鼠CNTF序列替换人CNTF序列反之亦然。为了达到这样的目的，我们选取了两种CNTF共有的并在他们相应的表达载体上是唯一的限制性位点。在必要的时候，在编码相同蛋白序列的区中的两个基因中的一个或另一个基因中对这些位点进行基因工程操作。通过这种方法，获得了每个修饰的蛋白的表达载体，如图1所示。在将单独蛋白纯化到至少60％的纯度时，就在与人或大鼠中这些蛋白进行比较的情况下确定他们的特性。

由于人和大鼠CNTF的电泳迁移率差异显著，最开始每个氨基酸替代的影响是通过确定这些变化对蛋白迁移率造成的影响来监测的。正如此处所描述的，电泳迁移率数据表明所有迁移到与大鼠CNTF相同位置的修饰的人CNTF都具有单个氨基酸替代Gln63→Arg(Q63→R)。

随后，对表现出与大鼠CNTF分子相似迁移率的修饰的人CNTF蛋白进行了生物活性和受体结合检验。

CNTF的特征在于其具有支持E8鸡胚胎的游离(dissociated)睫状神经元存活的能力。按照这一标准，纯化的重组大鼠CNTF与大鼠天然蛋白具有相同的活性，但其活性却比重组人CNTF高4倍[Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.57：1003-1012 and inInternational Publication No.WO 91/04316，published on April4，1991]。将相同的检测法用于确定利用上述方法制备的修饰的分子的生物活性。正如此处所描述的，与母体人CNTF蛋白相比较，所有具有Q63→R替代的修饰的CNTGF分子表现出在支持睫神经节神经元存活方面的能力的提高。这些结果表明在电泳迁移率改变和提高的生物学特性之间有着很强的联系。

在测定CNTF修饰作用的生物学影响之外，通过确定每个修饰对CNTF分子与CNTF受体结合能力的影响也可获得每个CNTF分子潜在生物学活性的指征。

在一个实施方案中，测定了修饰的人CNTF蛋白与大鼠CNTF竞争结合到大鼠superior颈神经节神经元(SCGs)的能力。正如此处所描述的，与未标记的大鼠CNTF相比，人CNTF置换与这些细胞结合的¹²⁵I-标记的大鼠CNTF的能力低90倍。然而，此处描述的几种修饰的人CNTF在置换大鼠CNTF蛋白方面要比人CNTF更强。此处描述的所有具有提高的竞争性结合能力的分子都表现出了改变的电泳迁移率，在这方面分子迁移方式与大鼠CNTF迁移方式相似。

在另一个优选实施方案中，对细胞，如MG87成纤维细胞，进行了基因工程操作来表达人CNTF受体α-元件，并且将这些细胞用于检测修饰的蛋白与人CNTF受体的结合能力。在与¹²⁵I-标记的大鼠CNTF竞争性结合到人CNTF受体方面，大鼠CNTF要比人CNTF强12倍。此处描述的几种修饰的人CNTF分子，包括所有具有与大鼠CNTF而不是人CNTF相似的电泳迁移率的分子，在与¹²⁵I-大鼠CNTF竞争结合到表达人CNTF受体的细胞方面比人CNTF要强的多。

在另一个实施方案中，一种动物模型可用于评估本发明中修饰的CNTF分子的治疗特性，已经证明，这个动物模型在为某些生长因子和其他因子在预防视网膜光感受器变性能力提供指征方面是有用的。如实施例4中所描述的，在一个光诱导的视网膜变性损伤模型中，hCNTF(Gln63→Arg)在预防光感受器变性方面的能力比重组人CNTF高10倍。

因此，按照本发明，在人CNTF蛋白中的特定氨基酸替代可使得修饰的CNTF蛋白与人CNTF受体结合增强，因此，我们预期它们也具有增强的治疗特性。

通过在原核和真核表达体系中克隆和表达来制备有利于重复本发明的修饰的CNTF分子，这已经有描述，例如在1991年J.Neurosci第57期1003-1012页上Masiakowski等。的文章和1991年4月4日出版的、国际出版号为No.WO 91/04316的公开文件中都有描述。可利用多种方法对重组神经营养因子基因进行表达和纯化。可将编码神经营养因子的基因亚克隆到细菌表达载体，例如但并不局限于pCP110中。

重组神经营养因子可通过多种技术进行纯化，但这些技术必须能在纯化后产生稳定的、具有生物活性的蛋白。例如，但并不局限于，神经营养因子可以可溶性蛋白或包含体的形式从细胞中进行回收，可利用8M盐酸胍和透析法从这些包含体中定量的提取出蛋白。要想进一步纯化这些神经营养因子，就可使用传统的离子交换层析、疏水相互作用层析、反相层析或凝胶过滤法。

按照本发明，此处描述的修饰的CNTF或其杂种或其变体可用于促进细胞在体内或体外的分化、增殖或存活，而这些细胞可对CNTF进行响应，这些细胞包括CNTF/IL-6/LIF受体家族的表达受体细胞或可表达适当信号传导元件的细胞，这些信号传导元件已经有描述，例如在1992年Davis等在Cell第69期的1121-1132页发表的文章中。突变体或杂种都可拮抗细胞分化和存活。

本发明可用于治疗可对CNTF或CNTF/CNTF受体复合体敏感细胞病症。在本发明的一个优选实施方案中，按照这些方法就可对可表达CNTF/IL-6/LIF受体家族成员的细胞的病症进行治疗。这些病症的实施例包括但并不局限于涉及下列细胞的病症：白血病细胞、造血干细胞、巨核细胞及其祖细胞、DAI细胞、破骨细胞、成骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、肾上皮细胞、胚胎干细胞、肾小球膜(renal mesangial)细胞、T细胞、B细胞等。

相应的，本发明提供了一些方法，这些方法包括对遭受与CNTF相关的神经性或分化病症或疾病或神经损伤的患者给药以有效剂量的修饰的CNTF或其杂种或突变体进行治疗。修饰的CNTF分子可用于治疗Masiakowski等编写的、1991年4月4日出版的国际出版号为No.WO91/19009的出版物中有关CNTF的疾病和病症，也可用于治疗1991年12月12日出版的、Davis等编写的、国际出版号为No.WO91/1900的出版物中涉及的CNTF/CNTFR复合体疾病和病症。这两本书在此处全文引用作为参考。

这些疾病和病症包括变性性疾病如视网膜变性，涉及脊髓、胆碱能神经元、海马回神经元的疾病或病症，或涉及运动神经元的疾病或病症如肌萎缩性侧索硬化，或涉及那些面部神经的疾病或病症如贝尔氏麻痹。可以本发明的方法进行治疗的其他疾病或病症包括外周神经障碍、Alzheimer氏病、Parkinson氏病、Huntington舞蹈症(Huntington疾病或HD)、或由如除神经支配法、慢性废用、代谢应激和营养不足等引起的肌肉萎缩，或由肌肉营养不良综合症、先天性肌病、肌肉炎症疾病、中毒性肌病、神经外伤、周围神经病、药物或毒素诱导的损伤等情况下的肌肉萎缩，或运动神经病、或肥胖症、糖尿病型肥胖症或包括但并不局限于非胰岛素依赖型糖尿病。

在一个实施方案中，此处描述的CNTF或CNTF相关分子用于治疗Huntington病。据推测谷氨酸受体介导的兴奋毒性在包括Huntington病在内的多种神经变性性疾病和损伤中起作用。Huntington病主要的神经病理特征是中等大小的、GABA能、纹状体输出神经元的大量变形，但是纹状体中间神经元基本上没有损失(Acheson， A.&R.Lindsay.，1994，Seminars Neurosci.6：333-3410)。正如下面的实施例7中所描述的，申请者利用此处描述的CNTF和其突变体在动物模型上进行了研究，在这个模型中，在Huntington病中观察到的纹状体output神经元优先损失和运动障碍在啮齿类动物和灵长目动物模型中可重复进行，而这些啮齿类动物和灵长目动物模型是在纹状体中注射了NMDA谷氨酸受体促进剂、喹啉酸的(DiFigiia，M.Trends Neurosci.，1990，13：286-289)。在这些研究中，CNTF和其突变体为暴露于喹啉酸提供了保护。喹啉酸损伤的纹状体的外观与死于HD的疾病的外观很相似，这表明与HD不懈而又相对缓慢的病程相比，喹啉酸虽然造成了急性而严重的损伤，但它却构成了一个适当的动物模型来研究破坏性神经病症。

到目前为止，利用重组人CNTF(rHCNTF)进行的人类临床实验仅仅局限于一些研究，在这些研究中，皮下给药蛋白来检验其在减缓肌萎缩性侧索硬化症(ALS)病程中的效能。这样的rHCNTF给药总是伴随着系统副作用，包括咳嗽、厌食症和体重损失，并且，在至少一个研究中，接受rHCNTF的病人中超过80％产生了中和抗体，但这些中和抗体的重要性并不清楚。然而，不管抗体形成和副作用等问题产生，在ALS早期有一个患者亚群从rHCNTF给药中受益，因为相对于具有相似病情的并受安慰剂处理的患者来讲，这些患者表现出肺功能损失减少。

通过对CSF或ALS患者进行间歇的、区室化的rHCNTF给药。申请者的初步实验表明没有证据证明系统副作用产生或抗体形成。这些研究包括使用了Medtronic制造且具有CSF采样侧端口的输液泵(SynchroMed Model 8615/Series DAA)，这个输液泵是通过标准技术(Penn，et al.，1985，2：125-127)在全身麻醉的情况下植入的。这个输液泵是系到蛛网膜下的导管上，在荧光屏检查条件下这个导管的端口是置于L1水平的。每周对4个ALS患者每小时给药浓度为1-8μgrHCNTF，为期48小时，这样持续1年的时间。这些患者没有患有在rHCNTF系统给药时观察到的那些副作用。患者组中的副作用包括两名患者坐骨疼痛和1名患者头疼。在CSF患者中观察到蛋白和白血球升高。在这项研究中，rHCNTF表现了与输注到鞘内(intrathecal space)的小分子药物如氯苯胺丁酸(baclofen)和吗啡相似的分布和药物动力学特征。非常不幸，对持续的CNS输注治疗或局部长效制剂给药来讲，rHCNTF太不稳定了，因为它易于通过其完整的半胱氨酸残基来形成共价二聚体，导致聚集物形成并沉淀。相应的，我们需要稳定的CNTF制剂存在来用于中枢神经系统的直接输注。

在与Aebischer等合作下，申请人在10位ALS患者体内植入了胶囊包被的BHK细胞，这些细胞可将hCNTF释放到患者的蛛网膜下隙。这样在稳定状态下获得了6ng/ml的CSF浓度。虽然所有患者主诉虚弱和疲劳，但却没有观察到体重损失、厌食症和急性响应蛋白活化等症状。没有观察到CSF脑脊液细胞增多，也没有观察到白细胞数量增多。在患者的外周血中检测不到CNTF。到目前为止，效能检测的结果还太少，不能对有关效能作出结论。相对于那些通过泵输注rHCNTF情况，在接受通过植入的、胶囊包被的细胞产生的rHCNTF的患者中没有观察到炎症反应，这表明rHCNTF的泵传递后观察到的变化可能与围绕这个特定蛋白的剂型和稳定性相关。

相应的，基于动物模型数据，而这些数据可证明CNTF及其变体作为本领域内公认的Huntington病模型中的纹状体神经元的兴奋毒性损伤保护药物的效能，结合申请者的通过将CNTF或其变体直接传递到CNS就可避免在CNTF系统注射时观察到的副作用和抗体形成的发现，申请者发现了一个有用的方法来治疗Huntington病。相应的，申请者的发明考虑通过植入细胞或类似细胞的小囊泡，如可释放CNTF的脂质体，来将CNTF或其变体直接传递到CNS。此外，此处描述的CNTF变体与CNTF相比已经具有了提高的稳定性和溶解性，它们为通过如渗透泵将CNTF传送到上述的CNS提供了优选的剂型。因为在体温下溶液中的rHCNTF的不稳定性妨碍了它通过intrathecal或intraventricular输注进行持续给药的能力，此处描述的rHCNTF变体优选的用于这种方式给药，因为它具有提高的稳定性、溶解性和减少的抗原性。

相应的，本发明还考虑到具有提高的溶解性的CNTFG变体可进行治疗性应用，在这些应用中时通过利用如渗透泵来传递药物的。重组人CNTF(rHCNTF)在生理缓冲液如pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中的溶解度是有限的。此外，pH在4.5-8.0之间时的溶解度对培育温度和时间具有很强的依赖。在5℃时，rHCNTF在PBS中的溶解度是1mg/ml，并且溶液在数小时内是稳定的，但是在37℃持续2小时后的溶解度仅仅为0.1mg/ml，持续48小时后的溶解度为0.05mg/ml。这种有限的溶解度和热稳定性妨碍了在生理缓冲条件下制备rHCNTF的稳定剂型。在对CNS持续给药的条件下尤其需要这样的剂型。

我们发现缺少羧基末端最后13个氨基酸残基的rHCNTF(rHCNTF，Δ13也叫做RPN160或RG160)保留有完全的生物活性，并且在低温(5-10℃)下的溶解度至少可达12mg/ml。然而，尽管其又这么高的溶解度，在37℃的PBS溶液中培育几个小时后仍然有rCNTF，ΔC13析出，即使在0.1mg/ml这样低的浓度下。

已经确定，rHCNTF和rCNTF，Δ13的热不稳定性是通过分子间二硫键形成启动的聚集作用的结果，这种热不稳定性对蛋白浓度和温度有很强烈的依赖。将人CNTF第17位的半胱氨酸残基用丙氨酸残基取代，这样得到的蛋白在37℃的PBS中培育至少7天后还表现出很高的稳定性并且维持着它们的生物活性。在rHCNTF，63QR突变体中也维持有这样的特性，这个变体由于精胺酸替代了63位的谷氨酰胺而具有更高的潜能。在一个特定实施例中，rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13(也叫做RG297)比rHCNTF表现出了由于63QR替代而产生的更高生物学活性，也表现出了由于ΔC13缺失而产生的更高溶解度和表现出了由于17CA替代而产生的更高稳定性。

本发明考虑了使用治疗上有效剂量的、此处描述的CNTF或CNTF变体来治疗HD患者。CNTF的有效剂量是指可减缓疾病进程或减少与疾病相关的副作用的剂量。在与没有进行治疗处理的对照组进行比较的条件下，通过比较治疗的效果来确定治疗的效能。在现场研究(Young et aL，1996，Ann NeuroL 20：296-303；Penney and Young，1990，Movement Disorders 5：93-99)、临床评定仪器发展(Shoulson and Fahn，1979，Neurology 29：1-3；Shoulsonal，1989，Quantification of Neurologic Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284.；Feigin et al.，1995，MovementDisorders 10：211-214)、和利用计算机X-射线断层摄影对疾病病程进行的与放射摄影相关的研究(Terrenoe et al.，1977，Neuroradiology 13：173475；Bart et al.，1978，Neurology28：1198-1200；Neophytides et al.，1979，23：188-191；Stober etal.，1984，Neuroradiology 26：25-28)以及磁共振成像(Graftonet.al.，1992，Arch.Neurol.49：1161-1167)和正电子发射X射线断层摄影技术(Harris，et al.，1996，Arch.Neuroh 53：316-324)中对HD的临床病程和自然史进行了广泛的特性研究。

对Huntington病的临床评定是通过Shoulson和Fahn发明的HDFunctional Capacity Scale(HDFC)(1979，Neurology 29：1-3)来进行的。在这个标准中，功能完全的患者为13分，0分表示完全无能(Shoulson et al.，1989，Quantification of NeurologicDeficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284)。利用这个标准确定的患者的平均病程进度是大约0.65单位/年(Shoulson et al.，1989，Quantification of Neurologic Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284；Feigin et al.，1995，Movement Disorders10：211-214)。如果这个标准是完全线性的(一个没有检验的假说)，那么这个病程进度将会与患者有症状的HD平均20年的病期很好的对应。HDFC分数可粗略的分为5个临床阶段(Shoulson et al.，1989，Quantification of Neurologic Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284)。

神经成像研究的重点在于神经元损失的总体病理结果和随后的基底神经节结构萎缩。随着HD的发展，尾状神经核收缩，使得侧室具有了‘box-car’特征外观。可以利用″bicaudate指数″对尾状核萎缩程度进行定量。

磁共振成像与CT可产生相似的指数。然而，一个相对较新的技术，体内NMR分光镜检查具有在活体大脑内评估代谢进程的能力。一个初步研究(Jenkins，et al.，1993，Neurology 43：2689-2695)发现乳酸含量升高，这可能反映了HD患者的大脑中神经元细胞损失或中间代谢缺陷。

利用正电子发射X射线断层摄影技术(PET)可在活体患者体内进行功能成像。可以利用2-脱氧葡糖(反映突触活性)或标志选定的神经元群的选择型放射配体来评定代谢阶段的变化。为了确定HD患者的尾状体大小和葡萄糖代谢变化速率，Grafton等(1992，Arch Neurol.49：1161-1167)对18位HD患者进行了两项葡萄糖代谢的正电子发射X-射线断层成像研究和两项磁共振成像扫描研究，两项研究之间时间间隔为42(+/-9)月。在整个研究结束之后，通过基因检测确定其中7位患者为Huntington病基因阴性，其余患者为Huntington病基因阳性或为舞蹈症发病。相对于基因阴性组，基因阳性组患者表现出尾状核每年的葡萄糖代谢率有3.1％的显著损失(95％confidenceinterval[CI]，-4.64，-1.48)。磁共振成像bicaudate比率每年有3.6％的增加，而磁共振成像bicaudate比率是对尾状核萎缩的线性测定标准。然而，尾状核大小的变化率和尾状核代谢的变化率之间没有联系，这表明代谢损失和萎缩是独立进行的。因此，一系列的正电子发射X射线断层摄影或磁共振成像产生的损失速率与在临床评定标准中得到的结果(大约5％/年，vide supra)没有很达的差别，因此它们是对在症状发生前的HD患者中进行实验性药理学介入时进行监测的有用手段，在临床实验中应该将这些这些症状发生前的HD患者群体吸收在内。

在葡萄糖代谢摄影之外，其他的放射配体可用于监测HD中的纹状体完整性。例如，在HD中损失的内部纹状体神经元都含有多巴胺受体，所以可将多巴胺受体的配体用于监测HD病程发展。这些研究表明HD患者体内的纹状体D1D2受体确实是平行减少(Turjanski et al.，1995，Brain 118：689-696)。

在对纹状体进行喹啉酸注射治疗的灵长目动物进行的PET研究中获得了相似的代谢和神经化学发现。Brownell等(1994，Exp.Neurol.125：41-51)报道，在3个非人灵长目动物的纹状体喹啉酸损伤之后，可通过多巴胺促进剂处理诱导产生与Huntington病相似的症状。通过进行[19F]氟-2-脱氧*D-葡萄糖正电子发射X-射线断层成像(PET)研究，所有实验动物的尾状体在葡糖利用上都表现出了40-50％的长期减少。D1受体的Caudate-putamen摄取速率常数反映出有平均40-48％的神经元损失和减少。利用PET进行的多巴胺重新摄取位点和纤维表明神经元轻微损失区暂时减少，而严重破坏的纹状体区长期减少。这些结果与尸体解剖检验所观察到的行为变化和神经病理学相一致，也与对Huntington病患者进行的临床研究观察相似，这些结果可用于附加证明喹啉酸模型，也表明这些测定方法可用于人临床实验中。

HD临床实验很大程度上限于对精神病和不随意运动进行的姑息症状治疗的评定(Shoulson et al.，1981，，Neurology 29：1-3)。然而，我们要检验一个潜在的神经保护药物。这个实验涉及使用氯苯胺丁酸，它是一种GABA-B受体拮抗剂，理论上来讲，这种药物会减少纹状体中皮质纹状体末端谷胺酸的释放，从而阻碍HD的病情发展(Shoulson et aL，1989，Quantification of Neurologie Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284)。这个实验的结果是负面的，因为在实验进行的30个月中，氯苯胺丁酸处理的患者组的进食情况并不比对照组好。然而，这个实验为HDFC的使用和合理化提供了支持证据。这个研究的一个重要发现是研究对象内在的病情进展速率仅仅是研究者最初估计的一半。现在这些信息可用于通过评定仪器设计将来的临床实验。

目前，我们没有正在进行的、主要的HD临床实验。然而，已经成立了一个临床实验组织，Huntington病研究组，其下层基础部门来替代做HD的临床实验。这个研究组正在进行的多个临床研究选项包括1)利用辅酶Q来增强中间代谢和2)谷胺酸拮抗剂和/或谷胺酸释放阻滞剂的使用(W.Koroshetz，personal communication)。在欧洲成立了一个类似的研究组，这个研究组通过PET方法来检验胎儿纹状体植入物的效能，也检验异种生物瓣膜移植物的使用。

具有有效的临床评定仪器，并且有相关的放射成像检测方法来评定HD的疾病病程，结合现有的两个大的、有组织的multicenter，临床实验consortia将会很容易的完成HD临床实验。

此处，申请者描述了一种修饰的CNTF分子，称作Ax-13或Ax-1(命名为rHCNTF，17CA63QRΔC13)，在这个分子中将63Q→R替代(这给予了更大的生物学潜能)与末端13个氨基酸残基缺失(这在生理条件下给予了更大的溶解性)和17CA替代(给予了稳定性，尤其是在37℃的生理状态下)进行了结合，这使得它在动物模型上的治疗指数比rHCNTF要高2-3倍。然而，当在大肠杆菌中进行表达时，产生的表达蛋白的一部分在C-末端标记有十肽菌素。由于这种情况，Ax-13的纯化很困难，并且造成了纯化的、未标记的产物的产量较低。当在哺乳动物表达体系中表达时可能不产生十肽菌素标记。此外，十肽菌素标记可能会有助于提高分子的免疫原性，并且也可能引起稳定性问题。

然而，从成本和效率的观点来看，大肠杆菌表达体系的应用还是优选的。因此，申请者研究发明了一种缩短的CNTF分子，这种分子不仅保留了Ax-13提高的潜能、溶解性和稳定性特征，而且在大肠杆菌中表达时避免了十肽菌素标记问题。正如此处所描述的，申请者已经成功的生产出了一种叫做Ax-15的分子(命名为rHCNTF，17CA63QRΔC15)，它不仅保留有Ax-13改进的特性，还具有在大肠杆菌中表达时具有减少的氨基酸标记附加的优点。因此，这种新分子Ax-15不仅具有更高的产量，而且更易于纯化的优点。此外，由于具有显著减少的细菌氨基酸标记，Ax-15不存在产生那些Ax-13产生的与分子免疫原性和稳定性相关的问题。

因此，本发明的一个目标就是提供改进的、修饰的睫状神经营养因子分子。明确的讲，本发明的一个实施方案是具有Cys17→Ala、GIn63→Arg修饰和末端15个氨基撒残基缺失的修饰的人睫状神经营养因子。本发明也提供了编码本发明的睫状神经营养因子的单独的核酸分子。本发明也考虑了一个编码本发明中的人睫状神经营养因子的重组DNA分子，可将这个重组DNA分子可操作的连接到一个表达控制序列上和利用重组DNA分子转化过的宿主细胞中。宿主细胞可以是真核或原核细胞，因此宿主细胞可以是如细菌如大肠杆菌、酵母细胞如Pichia pastoris、昆虫细胞如Spodoptera fruqiperda或哺乳动物细胞如COS或CHO细胞。这些宿主细胞可用于生产修饰的睫状神经营养因子的生产方法中，这些生产方法包括：(a)生长本发明中的重组DNA分子转化的宿主细胞，这样宿主细胞表达DNA分子，产生本发明中的修饰的睫状神经营养因子，和(b)分离已经表达的，修饰的睫状神经营养因子。

本发明的主题进一步包括一种包含修饰的睫状神经营养因子(Ax-15)和载体在内的组合物。

本发明的另一个目标就是提供治疗神经系统疾病和病症的方法，这些方法包括对此处描述的修饰的睫状神经营养因子Ax-15给药。需要接受治疗的疾病和病症包括变形性疾病和/或涉及脊髓、运动神经元、胆碱能神经元或海马细胞的疾病或病症。此外，疾病治疗方法可以是治疗包括神经系统损伤在内的神经系统病症或疾病，这些神经系统损伤起因是由创伤、外科手术、梗塞、感染、恶性肿瘤和暴露于有毒药物组成的组中的情况之一。本发明还考虑了涉及肌肉萎缩的疾病和病症的治疗方法。

本发明的另一个目标是提供保护纹状体神经元免于变形的方法，包括对该纹状体神经元给药以有效剂量的、此处描述的修饰的睫状神经营养因子如Ax-15。

本发明的另一个目标是提供诱导哺乳动物体重损失的方法，包括对哺乳动物给药以此处描述的修饰的睫状神经营养因子如Ax-15。本发明的一个明确的实施方案涉及诱导人的体重损失。

对Ax-15给药的方法可用于治疗病态肥胖症或具有遗传学确定的起源的肥胖症。此处描述的Ax-15也可用于预防和/或治疗人妊娠期或成年期发病的糖尿病的方法中。

上述的涉及对Ax-15给药的方法可通过选自下组中的任一种Ax-15给药途径进行，这个组中的给药途径包括静脉内、肌肉内、皮下、鞘内(intrathecal)、intracerebroventricular和实质内(intraparenchymal)。

此外，可通过能释放修饰的睫状神经营养因子的细胞植入物来对Ax-15给药。

本发明也考虑了神经系统损伤造成的疾病和病症，其中这些损伤可能是由创伤、外科手术、梗塞、感染、恶性肿瘤和暴露于有毒药物等造成的。

本发明也提供了药物组合物，这些药物组合物包括修饰的CNTF分子或其杂种和变体，正如此处描述的，如包含在含有CNTF受体复合体中的治疗性药物和包含在适当的药物学载体中的治疗性药物。

包括此处描述的CNTF和修饰的CNTF分子在内的活性成分应该制备到适当的药物学载体中，通过适当的给药途径来进行体内给药，这些适当的给药途径包括，但并不局限于实质内给药、intraventricular或intracerebroventricular给药、或通过包括细胞或组织植入物在内的持续释放植入物给药，持续释放植入物给药在如1996年2月1日出版的、出版号为WO 96/02646的出版物、1995年10月26日出版的、出版号为WO 95/28166的出版物或1995年2月23日出版的、出版号为WO 95/505452的出版物中有描述。

依赖于不同的给药方式，可将活性成分制备到液体载体如盐水中，可将其掺入到脂质体、微囊体、多聚体或wax-based并可控制释放的制剂中。在优选的实施方案中，修饰的CNTF制剂是稳定的，或是以制备成片剂、丸剂或胶囊的形式存在。

药剂中使用的活性成分的浓度依赖于所需的有效剂量和使用的给药方式。使用的剂量应该是足以实现活性成分在血浆中进行有效循环血浆浓度。可利用从体外或动物模型检测体系制得的响应曲线中推测出有效剂量。预期的有效剂量在大约0.001-1mg/天。

实施例实施例1：修饰的人CNTF分子的电泳迁移率材料和方法

制备修饰的CNTF分子

细菌菌株和质粒

大肠杆菌K-12 RFJ26是一株能超量生产乳糖操纵子阻遏物的菌株。

携带有CNTF基因的表达载体pRPN33和携带有大鼠CNTF基因的载体pRPN110几乎是完全相同的(Masiakowski，et al.，1991，J.Neuresci.57：1003-1012 and in International Publication No.WO 91/04316，published on April 4，1991.)。

质粒pRPN219的构建中首先是消化含有限制性酶Nhe1和Hind3的pRPN33，并在凝胶上纯化得到4081bp的片段。第二步，随后用167bp Nhe1-Hind3片段来替代编码部分CNTF基因的更小的片段，167bpNhe1-Hind3片段是利用引物RAT-III-dniH：5′ACGGTAAGCTTGGAGGTTCTC3′；和RAT-Nhe-I-M：5′TCTATCTGGCTAGCAAGGAA

GATTCGTTCA GACCTGACTG CTCTT ACG 3′、通过对大鼠基因的PCR扩增来获得的。

质粒pRPN228的构建方式与质粒pRPN219的构建方式相同，除了167bp替代片段的扩增是利用DNA引物Rat-III-dniH-L-R：5′AAGGTA CGA TAA GCT TGG AGG TTC TCT TGG AGT CGC TCT GCC TCA GTCAGC TCACTC CAA CGA TCA GTG 3′和Rat-Nhe-h 5′TCT ATC TGG CTAGCA AGG AAG 3′.来获得的。

质粒pRPN186、pRPNt87、pRPN188、pRPN189、pRPN192、pRPN218和pRPN222是通过类似的方法或利用图1中所示的独特的限制性位点直接交换DNA片段来制备的。

所有质粒的同一性是通过限制性分析和DNA排序来确定的。蛋白质纯化

正如对大鼠和人CNTF描述(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosc[.57：1003-1012 and in International Publication No.WO 91/04316，published on April 4，1991)的那样，对进行蛋白诱导合成、选择性提取、溶解和从包含体中纯化，只是除了在离子交换层析之外偶尔使用凝胶过滤或偶尔使用凝胶过滤代替离子交换层析。此外，利用链霉素和过硫酸铵分级分离从细胞裂解物上清液中纯化蛋白，随后进行柱层析，这些都与对其他蛋白进行纯化相同(Panayotatos et al.，1989，J，Biol.Chem.264：15066-15069)。对所有蛋白进行分离，直至纯度至少为60％。对本研究中的酶反应、DNA电泳和其他技术条件进行了详细描述(Panayotatos，N.1987，Engineering an Efficient Expression System inPlasmids：A practical Approach(Hardy，K.G.ed.)pp 163-176，IRLPress，Oxford，U.K.).结果

图2图示了人、大鼠和几种嵌合CNTF分子在还原性SDS-PAGE凝胶上的迁移率。嵌合分子RPN186、RPN189、RPN218和RPN228表现出与大鼠CNTF相当的迁移率，而RPN187、RPN188、RPN192和RPN222表现出与人CNTF相当的迁移率。图1中这些结果与图1中这些蛋白排序的交叉参考显示了所有在第63位(R63)携带有精氨酸残基的蛋白都表现出了大鼠CNTF的迁移率。对RPN228来讲，单个氨基酸替代(Q63→R)足以给予人CNTF正常的大鼠迁移率。

图2也提供了对不同重组蛋白的纯度的检测。通过目视检查判断，纯度在60％的RPN189到大于90％的RPN228之间。实施例2：测定修饰的CNTF的结合活性材料和方法¹²⁵I-CNTF的制备

将溶解在37ul 0.2M、pH8.5的硼酸钠缓冲液中的大鼠CNTF(28μg)转移到装有4mCi，(2,000Ci/mmole；NEN)的¹²⁵I和试剂(Bolton and Hunter，1973，Biochem J.133：529-539)的小瓶中，这些试剂已经在缓慢的氮流中干燥过。在0℃下培育反应45分钟，随后在室温下反应15分钟，然后加入30ml 0.2M的甘氨酸溶液终止反应。15分钟之后，将含有0.08％明胶的0.2ml PBS添加到其中，并将这些混合物过Superdex-75柱(Pharmacia)以从二聚或其他多聚衍生物中分离单体CNTF。如利用薄层层析确定的那样，吸附量一般为20％，比活一般在1,000Ci/mmole左右。在4℃下贮存单体¹²⁵I-CNTF，并且从制备结束起可使用一星期。为了检验结构和构造的同一性，我们将¹²⁵I-CNTF(大约10,000cpm)与5μg未标记的CNTF混合，并且利用天然凝胶电泳进行分析。通过考马斯亮蓝染色或放射自显影都可见到一条主要的泳道。¹²⁵I-CNTF在支持培养物中的E8鸡睫状神经元存活上显示了与天然CNTF相当的活力。组织培养技术

用胰蛋白酶处理得自新生大鼠的颈上神经节(SCG)，使用机械法使其分离，并将其放置在多聚鸟氨酸(30μg/ml)基底上。生长培养基含有含有10％热灭活的胎牛血清(Hyclone)的Ham营养混合物F12、神经生长因子(NGF)(100ng/ml)、青霉素(50U/ml)和链霉素(50μg/ml)。培养条件维持在37℃、湿度95％、空气中CO₂含量为5％。通过在培养的第1和第3天进行araC(10um)处理消除神经节的非神经元细胞。每周喂养培养物3次，并且培养物在两个周之内常规的用于结合检验。

MG87/CNTFR是利用人CNTFα受体基因转染过的成纤维细胞系(Squinto，et al.，1990，Neuron 5：757-766；Davis et al.，1991，Science 253：59-63)。结合检验

直接在细胞单层上进行结合。用含有磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)、0.1mM杆菌肽、1mM PMSF、1μg/ml白胃素(leupeplin)和1mg/mlBSA的检测缓冲液冲洗一次培养孔中的细胞。在室温与¹²⁵I-CNTF培育2小时后，用检测缓冲液快速的冲洗细胞两次，用含有1％SDS的PBS将细胞溶解，并在Packard Gamma Counter上计数。在多于1,000倍的未标记的CNTF存在下对非特异性结合进行确定。与MG87/CNTFR的特异性结合是80-90％。利用GRAPHPAD程序对数据进行分析(ISI，Philadelphia，PA)。结果

图4a图示了纯化的重组人、大鼠和CNTF RPN219与¹²⁵I-大鼠CNTF在大鼠SCG神经元上的结合的竞争性曲线。大鼠和人CNTF都与¹²⁵I-大鼠CNTF竞争结合到SCG神经元上，但人CNTF(IC50＝25nM)取代¹²⁵I-大鼠CNTF的结合的能力要比未标记的大鼠CNTF弱90倍。相反，RPN219与大鼠CNTF的结合能力几乎相同，当很显然要比人CNTF(IC50＝0.3Nm)的结合能力要强的多。

在对鼠成纤维细胞进行的竞争实验中获得了相似的结果，而实验用鼠成纤维细胞是经过指导人CNTF受体表达的质粒转染过的(图4b)。大鼠CNTF、人CNTF和RPN228都与¹²⁵I-大鼠CNTF竞争结合到MG87/CNTFR细胞上。人CNTF(IC50＝30nM)的能力要比大鼠(IC50＝2.8nM)弱12倍，而RPN228的能力显然要比人蛋白(IC50＝5.6nM)的能力要强的多。

图1中图示的利用其他修饰的CNTF蛋白进行的竞争结合实验也表明具有R63的蛋白显示了大鼠CNTF的生物活性，而具有Q63的蛋白表现了人CNTF的结合特性(数据未给出)。这些结果表明单个氨基酸替代(Q63-7R)足以给予人CNTF特征的大鼠CNTF受体结合特性。实施例3：修饰的CNTF分子的生物活性测定材料与方法

除了对存活的细胞进行MTT染色之外(Mosmann，T.1983；J.Immunol.Methods 65：55-63)，其余都象已有的描述那样(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.57：1003-1012 and inInternational Publication No.WO 91/04316，published on April4，1991)，在解离过的鸡睫状神经节(CG)神经元培养物上对重组CNTF进行检测。结果

图3图示了解离的、富含神经元的E8鸡胚胎睫状神经节培养物对纯化的重组人、大鼠和修饰的CNTF蛋白RPN219和RPN228的剂量响应曲线。通过这种检测方法得知，嵌合蛋白的生物活性与纯化的重组大鼠CNTF没有显著的不同，但却明显的高于重组人CNTF的生物活性。对比图3中的剂量响应曲线也发现利用RPN219、RPN228和大鼠CNTF获得的存活神经元的最高水平要高于利用大鼠获得的存活神经元的最高水平。这些结果表明对大量的神经元来讲，象大鼠CNTF一样，RPN219和RPN228要比人CNTF的活性高。在平行实验中，对图1图示的其他修饰的CNTF蛋白的生物活性进行了检测。在所有情况下，携带有Q63→R替代的修饰的CNTF蛋白表现出了大鼠CNTF的生物活性，而携带有Q63的蛋白表现出人CNTF的生物活性(数据未给出)。

总的来讲，这些结果表明单个氨基酸替代(Q63→R)足以给予人CNTF大鼠的生物活性。实施例4：应用修饰的CNTF来预防光诱导的光感受器损伤

选用2-5个月大小的F 344或Sprague-Dawley系的Albino大鼠。在将其暴露于持续的光中之前，将大鼠维持在循环光环境中(12小时开：12小时关的笼内，照明度小于25ft-c)。将这些大鼠置于115-200 ft-c(绝大多数大鼠接受的照明度为125-170ft-c)照明度水平的持续光中，为期1或2周，这样的光是由两个40瓦的GeneralElectric ″cool-white″荧光灯泡提供的，同时在在距笼子底面60厘米高的地方悬挂有一个白色的反光镜。在暴露于光的这段时间内，将大鼠置于具有不锈钢丝条盖子的透明聚碳酸酯笼子中。

在将大鼠置于光中的前两天，将大鼠用氯胺酮-赛拉榛(ketamine-xylazine)麻醉，然后intravitreally注射溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中、浓度为0.1-500ng/ul的大鼠CNTF、人CNTF或修饰的CNTF[hCNTF(Q63→R)]。这些注射是通过在大约位于锯状缘和眼睛中纬线之间巩膜、脉络膜和视网膜插入32号注射针头完成的。在这些情况下是对眼睛的上半球进行的注射。

在持续的光照之后，立即将大鼠用过度剂量的二氧化碳杀死，随后立即对醛混合物进行血管灌注。将眼睛包埋在环氧树脂中来切成1μm厚的片状，从而提供沿眼睛垂直经线的整个视网膜切片。通过对光感受器营救的程度进行评估，对光诱导的视网膜变形程度进行了定量，对营救程度的评定是按照0-4+病理学者的营救等级来进行的，其中4+是最高程度的营救，几乎是正常视网膜的完整性。在与同一只大鼠的对照眼进行的对比基础上，按照四个等级标准给每个切片的光感受器营救程度打分。这种方法的优点在于不仅考虑了ONL的厚度，而且考虑了光感受器内部和外部部分细微的变形性变化，也考虑了眼内的空间变形性梯度。每个时间点检查三只眼，用这些数据来制作剂量响应曲线。结果

对人、大鼠和hCNTF(Q63→R)的营救程度进行了检测。数据表明，在营救光损伤模型中的光感受器方面，大鼠和hCNTF(Q63→R)的能力要比重组人CNTF的能力高10倍。

应该这样理解，虽然本发明在上文中结合优选的特定实施方案进行了描述，这些描述和实施例是为了说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围是由附加的权利要求所界定的。实施例5材料于方法

如前面所描述的，对重组人CNTF突变体进行基因工程操作、在大肠杆菌中表达并且在纯度高于90％的情况下进行回收(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.57：1003-1012 and in InternationalPublication No.WO 91/04316，published on April 4，1991；Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.268：19000-19003)。

5℃下，在PBS中新鲜制备下面的的贮存液：rHCNTF.............................................0.5mg/mlRG160(rHCNTF，ΔC13)..........0.5mg/mlRG162(rHCNTF，17CA，ΔC13.........0.5mg/mRG290(rHCNTF，63QR，ΔC13)....................1.2mg/mlRG297(rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13).........0.4mg/ml

为了确定在37℃、生理缓冲溶液中的rHCNTF和几种衍生物的稳定性，所以在5℃的PBS中对贮存液进行完全透析，然后用PBS将其稀释到0.1mg/ml并进行过滤消毒。将这些等份(0.2ml)转移到0.5ml的聚丙烯离心管中。将这些离心管放置在37℃的培养箱中，并且在指定的时间取出单个管，在室温下15,000rpm离心3分钟以从不溶的沉淀中分离可溶的蛋白。将上清液吸入含有等体积2倍蛋白凝胶样品缓冲液的干净管中，85℃水浴2分钟，混合，在-20℃下贮存直到通过15％的SDS-PAGE进行分析。将沉淀物重新溶解在1/10原始体积的水中，与等体积的2倍蛋白凝胶样品缓冲液混合，然后按照上述步骤进行处理。

在E8鸡睫状神经元上进行的生物活性分析方法和蛋白凝胶电泳方法已经有描述(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.57：1003-1012 and in International Publication No.WO 91/04316，published on April 4，1991；Panayotatos et al.，1993，J.BioI.Chem.268：19000-19003)。蛋白凝胶样品缓冲溶液(2倍)组成为12.5ml pH6.8的TrisHCI-20ml甘油-40ml 10％SDS和5mg溴酚蓝/100ml缓冲液。结果

在中性pH的生理缓冲溶液中，rHCNTF的溶解度是有限的。此外，在宽领域pH范围(4.5-8.0)内的溶解度强烈的依赖于培育温度和培育时间。在5℃时，rHCNTF的溶解度是1.4mg/ml，并且在溶液中蛋白的溶解状态保持几个小时。与rHCNTF的有限的溶解度形成鲜明对比，突变体rHCNTF，ΔC13在5℃下至少能浓缩到12mg/ml。然而，尽管具有高溶解度，但在生理状态的缓冲溶液中、在生理pH和温度下，rHCNTF，ΔC13具有很强的不稳定性。在37℃下进行培育时，rHCNTF，ΔC13立即就以依赖于其起始浓度的速度从溶液中沉降出来。

为了确定不稳定性的原因，我们以几种突变体作平行实验分析了rHCNTF的同一性。图5图示说明rHCNTF在37℃的生理缓冲溶液中为期0、2、7和14天的培育(分别为泳道1-4)导致了上清液中的蛋白的逐渐消失，同时沉淀中的蛋白逐渐出现。此外，沉淀中有相当一部分的rHCNTF是48KD的，并且它们的大小与二聚体rHCNTF的大小相对应(图5，双箭头)。在更长的培育时间内，也出现了一小部分更高聚合物。然而，在有二硫键还原试剂存在的条件下，将同样的样品在同样的凝胶上进行分析时却发现48KD蛋白却转化为单体rHCNTF，这证明48KD蛋白代表了通过二硫键共价连接的rHCNTF二聚体。这些二聚体估计是通过rHCNTF残基特有的半胱氨酸残基来形成的。因此，这些结果表明rHCNTF在37℃下的不稳定性是由通过分子间二硫键形成启动的聚合作用引起的。

在对两个rHCNTF突变体rHCNTF，ΔC13和rHCNTF，63QR，ΔC13进行的实验中得到了相似的结果，只是rHCNTF，ΔC13在沉淀中出现不溶性聚合物的速度有点慢(图5)。假定ΔC13缺失给予rHCNTF在生理缓冲溶液中的更高的溶解性，那么rHCNTF，ΔC13提高的稳定性最有可能是其高溶解性的直接结果。

为了进一步检验rHCNTF在37℃下的不稳定性是由通过分子间二硫键形成启动的聚合作用引起的可能性，我们利用现有的基因工程方法将17位的特有半胱氨酸残基用丙氨酸替代。利用这种方法产生的两个rHCNTF变体rHCNTF，17CA，ΔC13和rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13接受15％的非还原性SDS-PAGE分析。图5表明，即使在37℃下培育14天，也没有这两种蛋白二聚化的迹象和聚合物形成，它们仍然是以溶解状态存在。即使在沉淀中发现了一小部分蛋白，但这在很大程度上代表了在吸出上清液后仍然存留在离心管中的少量可溶性蛋白，有很少量的证据证明有二聚化作用发生。这些结果确定了rHCNTF在37℃下的不稳定性是由通过分子间二硫键形成启动的聚合作用引起的结论，并且证明在其他rHCNTF突变体入RG297中消除自由的-SH功能基团也可产生更大的稳定性。

为了检验存留在溶液中的蛋白在37℃培育之后是否仍有生物活性，我们对样品进行了神经元存活活性分析。图6图示了利用标准的、未处理的贮存液制得的大鼠CNTF和rHCNTF以及四种rHCNTF突变体的对照浓度响应曲线，而这些CNTF和其突变体都是在37℃下进行了为期7天的培育的。这些突变体都是经过17CA突变的，RG297和RG162是在他们的正常浓度下进行检测的，而RG290和RG160是在以对溶液中的蛋白的量进行浓度矫正之后的浓度检测的。图6表明，这些化合物展示的浓度响应曲线正是这些蛋白的完全活性形式展示的浓度响应曲线：在实验误差范围之内，RG160和RG162表现了与rHCNTF相同的活性，而正如前面所观察到的(Panayotatos，N.，et al.，1993，J.Biol.Chem.268：19000-19003)和图7中所示的，携带有63QR替代的RG290和RG297则显示了比rHCNTF高4-5倍的活性。因此，在37℃下对rHCNTF和其衍生物进行为期7天的培育没有造成其生物活性损失，仅仅是由于沉淀后的二聚化作用造成了蛋白损失。实施例6材料与方法

蛋白工程和纯化-下列rHCNTF突变体是与rHCNTF进行比较的：

RG228(rHCNTF，63QR)；

RG297(rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13)

RG242(rHCNTF，63QR64WA)

如前面所描述适用于rHCNTF的方法，对这些蛋白进行基因工程操作、在大肠杆菌中表达并且在纯度高于90％的情况下进行回收(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.57：1003-1012 and inInternational Publication No.WO 91/04316，published on April4，1991；Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.268：19000-19003)。

生物活性检验-在E8鸡睫状神经元上进行生物活性检测的方法已经有描述(Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.268：19000-19003)。

药物动力学测定-对大鼠进行静脉注射(i.v.)100μg/kg的rHCNTF(n＝1)和RG242(n＝2)以及200μg/kg的RG228(n＝1)。也对大鼠皮下注射(s.c.)200μg/kg的rHCNTF(n＝2)、RG242(n＝2)和RG228(n＝1)。在给药前收集血液标本，并在给药后的不同时间收集血液标本，将这些标本进行加工来获得血浆。利用对啮齿类动物血浆进行的rHCNTF ELISA法对这些血浆进行分析(D.B.Lakings，et al.DSER 93/DMAP/006，″Dose Proportionality and AbsoluteBioavailability of rHCNTF in the Rat Following SubcutaneousAdministration at Eight

Dose Levels″(Phoenix International Project No.920847)10 November 1993)。

利用non compartment技术来测定血浆浓度。在每个检测板上都要包括每种化合物的标准曲线，这些标准曲线用于计算在平板上分析的样品中所含的化合物的量。检测灵敏度因化合物不同而有小于两倍的差别。

体内的的毒性和效率测定-在进行外科手术之前，先将体重大约为220g的雄性的Sprague-Dawley大鼠麻醉。在膝盖部位将右坐骨神经横切断，取大小为5mm的片段。在每只实验动物的左侧坐骨神经实施假外科手术。在外科手术后实施第一个部分，对大鼠进行称重，并且给药载体(PBS或pH4.5的乳酸盐/磷酸盐/D-甘露醇)或待测的rHCNTF化合物，这些化合物都溶解在相同的载体中，并且剂量为0.01-1.0mg/kg，给药方式为s.c。每天对大鼠称重和注射，持续1周，然后将它们杀死，并且对它们的比目鱼肌进行解剖和称重。计算每只实验动物的右(变性的)与左(假的)比目鱼肌湿重的比率，以此来评定变性引起的萎缩的程度和每种化合物处理对其预防的程度。为了对毒性进行评定，体重是以载体处理的大鼠体重增加的百分数来计算的。这些载体溶液在肌肉萎缩和体重增加上产生了相似的结果。结果

体内的生物活性-为了对rHCNTFZ在体内的生物活性进行特征确定，我们检测了它在介导主要的解离的E8鸡睫状神经元存活上产生的影响。图6、7和8中图示了对浓度逐渐增加的多种CNTF突变体作出响应的神经元存活。携带有63QR替代的突变体RG228(图7)和RG297(他8)显示了比rHCNTF高4-5倍的活力，而尽管携带有63QR替代，突变体RG242仍显示了比rHCNTF低10倍的活力。因此，在CNTF序列的不同部位引入不同的氨基酸侧链对体内主要神经元的存活会产生差别很大的影响，相对于rHCNTF，这些影响在活力损失巨大和剧烈增强之间变动。

药物动力学-对在一系列化合物的体外生物活性和它们的体内药物学效率之间建立联系作出努力之前，确定它们在相同动物模型中的绝对生物利用度是有用的。在下面描述的实验中，与rHCNTF的病因动力学和绝对生物利用度相比较，我们确定了在对RG228和RG242进行i.v给药后的病因动力学和s.c给药后的绝对生物利用度。

图9图示大鼠中对rHCNTF、RG228和RG242IV给药后的平均血浆浓度的时间变化曲线，将这三种化合物的浓度都调至标准的100g/kg。在表1中总结了所有的平均药物动力学参数。

在对大鼠i.v给药后，RG242的分布相α多少要大于rHCNTF和RG228的分布相α。RG242和RG228的分布相β多少要大于rHCNTF的分布相β。因此RG242分布到体内并从系统循环中清除的速度要快于rHCNTF，而RG228与HCNTF在体内的分布速度相同，而从系统循环中清除时RG228要快些。在RG242浓度时间变化曲线上的区域(AUC)与rHCNTF的相当，这表明这两种化合物的全身清除率(Cl_T)大体相同。然而，RG228和RG242的表观分布体积(Varea)要比rHCNTF小大约两倍，而表观分布体积是β和AUC的应变量，这表明这些突变体的分布范围要窄一些。由于这些实验中所用的动物数量限制，我们没有确定这些值的数量差别。然而，这些结果清晰的表明在i.v给药后，RG228和RG242与rHCNTF在分布动力学和病因动力学上没有显著的不同。

在s.c给药后，相对于rHCNTF，RG228和RG242具有长出2-3倍的吸收相(Ka)(图10和表2)。RG242的病因相也有点长。相对于i.v.给药来讲，s.c.给药后RG242较长的表观末端病因相可能是由于i.v.注射后末端相的不完全特性引起的。总的来讲，RG228(13.7％)和RG242(10.9％)的绝对生物利用度与rHCNTF(6.0％)的相当，这是由于在前面的两个独立的研究中rHCNTF的绝对生物利用度是14.2％(n＝18)和7.5％(n＝8)(D.B.Lakings，et aL，DSER 93/DMAP/006，″Dose Proportional and Absolute Bioavailability of rHCNTF inthe Rat Following

Subcutaneous Administration at Eight Dose Levels″(Phoenix International Project No.920847)10 November 1993；D.B.Lakings；et al.，Dose Proportionality and AbsoluteBioavailability of rHCNTF Administered Subcutaneously to Rats.AAPS Ninth Annual Meeting，San Diego，CA，November，1994)。因此，在实验误差之内，rHCNTF、RG228和RG242的绝对生物利用度没有显著的差别。

体内的毒性和效率-在对照实验中，比目鱼肌变性在7天内造成了肌肉湿重40％损失。这个值是非常准确，并且是可重复的，因为它在多个独立实验中的变化仅仅为3％。rHCNTF每日给药可造成肌肉湿重的剂量依赖性营救，其ED₅₀＝0.12mg/kg，最大影响剂量为0.3mg/kg(Figure 11)。同时，虽然实验动物在这些实验过程中继续增加体重，但它们显然不能与它们的载体处理对照组实验动物达到相同的增加程度(p＜0.01；图12)，尤其是在最大有效剂量时。

在与rHCNTF平行进行的几个实验过程中，经确定得知，63QR替代使其体内生物活性有2倍的增加(图11)，但同时其毒性也有2倍的增加(图12)。相反，携带有额外C17A和ΔC13修饰的RG297表现了2.6倍的生物活性增加，而其毒性与rHCNTF相同。最后，相对于rHCNTF，RG242提高了2.8倍的生物活性，并且毒性有2.4倍的降低了。这些结果在表3中有总结。

将这些化合物的TD₂₅和ED₅₀的比值作为这些化合物的相对治疗指数(T.I.)，而在计算时这些化合物TD₂₅和ED₅₀必须标准化为rHCNTF的TD₂₅和ED₅₀。虽然RG228的T.I与rHCNTF相同，但RG297和RG242的T.I.分别比rHCNTF的高2.5和6.8倍。

因此，RG297和RG242具有优于rHCNTF的药物学特性。在对人进行rHCNTF处理时观察到体重下降，此时的临床条件与rHCNTF的药物学特性有很大的关系。

本领域中的熟练技术人员将会认识到，CNTF氨基酸序列的其他改变也能产生生物学活性分子，这些分子可能具有增强得特性。例如，申请者已经制备了一个用丝氨酸残基取代17位的半胱氨酸残基的17CS突变体，这个突变体是生物活性的。申请者还制备了一个生物活性的4倍突变体17CA，ΔC13，63QR，64WA。另外的所有保留有生物活性的CNTF突变体都在表4中列出。

表1.对大鼠静脉内给药100μg/kg的rHCNTF、RG228和RG242后的平均药物动力学参数。

药物动力学化合物

参数 rHCNTF RG242 RG228^*

n 1 2 1

C₀(ng/ml) 726 2,175NC

AUC_0-∞(ng·min/ml) 20,230 22,890 55,800

α(min^-1) 0.0492 0.0856 0.041

t_1/2α(min) 14 8 17

β(min^-1) 0.0106 0.0200 0.0176

t_1/2β(min) 65 35 39

V_area(ml/kg) 470 220 204

Cl_T(ml/min/kg) 4.9 4.4 3.6

*将RG228的值标准化为100μg/kgi.v.剂量，以使其与其他两种以100μg/kg.剂量给药的化合物具有比较性

C₀：通过将前两个血浆浓度外推到零时间使的估计值

NC；未计算

表2.对大鼠皮下给药200μg/kg的rHCNTF、RG228和RG242后的平均药物动力学参数。

药物动力学化合物

参数 rHCNTF RG242 RG228

n 2 2 1

C_max(ng/ml) 18 32 50

T_max(min) 30-45 30-45 60

AUC_0-∞(ng·min/ml) 2,425 4,980 7,620

绝对生物

利用度 6.0 10.9 13.7

k_e(min^-1) 0.0133 0.0083 NC

t_1/2ke(min) 52 82 NC

k_a(min^-1) 0.0401 0.0180 0.0102

t_1/2ka(min) 17 39 68

NC；未计算表3.RHCNTF和其衍生物的效率、毒性和治疗指数治疗 ED₅₀ TD₂₅ 治疗指数相对指数化合物

(mg/kg) (mg/kg) (TD₂₅/ED₅₀) IndexrHCNTF 0.12 0.087 0.72 1.0RG228 0.065 0.047 0.72 1.0RG297 0.045 0.080 1.78 2.5RG242 0.043 0.21 4.88 6.8

表4.RHCNTF对E8鸡睫状神经元的生物活性。给出了相对于rHCNTF的潜能单位(1/EC50)，而rHCNTF的潜能单位规定值为100。一个潜能单位定义为表现出相当于1ng/ml rHCNTF的生物活力的交互配体的浓度。

CNTF 潜能

鼠 500.0

人 100.0

17CS 100.0

63QA 87.0

63QN 100.0

63QH 2.5

63QE ＜1

63QK 1.1

63QR 400.0

64WA 2.0

63QR64WA 9.0

63QR64WF 250.0

63QR64WH 25.0

63QR64WQ 10.0实施例7：CNTF及其突变体在Huntington病动物模型中的效率背景

据猜测，谷氨酸盐受体介导的兴奋毒性在多种神经变性性疾病中发挥了作用，这些疾病包括Huntington病和运动神经元疾病(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13：286-289；Rothstein，et al.，1995，J.Neurochem. 65：643-651)。Huntington病主要的神经病理特征是中等大小的、GABAergic、纹状体output神经元的大量变形，但是纹状体中间神经元基本上没有损失(Albin，et al.，1989，Trends Neurosci.12：366-375；Harrington，et al.，1991，J.Neuropathol.Exp.Neurol.

50：309)。在Huntington病中观察到的纹状体output神经元优先损失和运动障碍在啮齿类动物和灵长目动物模型中可重复进行，而这些啮齿类动物和灵长目动物模型是在纹状体中注射了NMDA谷氨酸受体促进剂喹啉酸(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13：286-289)。

在缺少用于HD的遗传动物模型的情况下，神经科学家继续依赖急性损伤模型来研究HD的表现型。经典的HD动物模型涉及大鼠纹状体兴奋毒性损伤的产生，而这个损伤是利用NMDA受体的谷氨酸盐促进剂完成的。在这样的损伤范例中，直接向纹状体中注射神经毒素可造成中等大小的内部纹状体神经元损失，这些中等大小的内部纹状体神经元可利用γ-氨基丁酸(GABA)来作为它们的神经递质，只有两种相对保守的纹状体中间神经元利用乙酰胆碱和生长激素释放抑制激素和神经肽Y作为它们的神经递质。最近的研究已经依赖于向纹状体内注射喹啉酸。看来这种方法最能如实的重现HD纹状体的外观。

Figueredo-Cardenas等。(1994，Exp.Neurol 129：37-56)向成年大鼠的纹状体中注射喹啉酸(QA)，2-4个月后，损伤呈现出多种不同类型的纹状体投射神经元和中间神经元以及不同纹状体投射区的纹状体输出纤维存活的相对模式。所有类型的投射神经元(etriatopallidal，striatonigral和striato-entopeduncuLar)的核周质都较胆碱能中间神经元的核周质脆弱的多。在投射神经元核周质中有关于有差别的易损性的证据，其中striatonigral神经元看来是最脆弱的。对纹状体靶区域的免疫标记的纹状体纤维进行的检验表明striato-entopeduneular纤维比striatopaltidal或striatonigral纤维能更好的在纹状体内QA环境下生存。在对投射神经元和/或它们的输出纤维丛进行的研究中观察到的易损性表观程度，以及在对胆碱能中间神经元进行的研究中观察到的易损性都与在HD中观察到的相似。

在例外一个动物模型中，对3-硝基丙酸(3-NP)系统给药引起了与Huntington病(HD)中观察到的那些病理学变化类似的病理学变化。虽然在这些动物中观察到的行为活动减退与在HD的大多数兴奋毒性模型中观察到的活动减退有区别，但许多人认为3-NP提供了一个更好的幼年发病和超前HD模型。3-NP的神经病理学效果包括内部纹状体胆碱能神经元损失，但许多缺乏大的AchE阳性神经元、含有NADPH-黄递酶的神经元的最小损伤以及神经胶质浸润Borlongan et al.，1995，Brain Res.Bull.365：49-56)。在3-NP作为HD神经毒性模型方面的研究较少。其可靠性和实用性还有待研究。

最近的研究已经开始探讨兴奋毒性和Huntington在纹状体中的作用之间的联系。对鼠纹状体注射喹啉酸诱导Huntingtin在许多剩余的神经元，而不是神经胶质细胞中的免疫反应性提高。在兴奋毒性攻击6小时后，这种提高在白质的细胞突和神经元胞体中很明显。因此，Huntington可能与这些神经元中的兴奋毒性紧张有关(Tatter，etal.，1995，Neuroreport 6：1125-1129)。在免疫反应性提高开始后的1-6小时间，1T15 mRNA水平以与一组神经元特异基因相似的方式减少。在24小时后，减少的神经元水平表明神经变性活神经胶质增生没有激活神经胶质转录。1小时和24小时时的mRNA水平强有力的表明1T15转录优选的定位于变性的神经元。Carlock et al.，1995，Neuroreport 6：1121-1124。

纹状体的兴奋毒性损伤也与在HD大脑中观察到的某些细胞死亡特征类似(Beal et al.，1986，Nature 321：168-171)。在HD患者的新生纹状体中，TUNEL-阳性神经元和神经胶质的分布模式使人联想到在神经系统正常发育期内的凋亡细胞死亡中观察到的分布模式；在相同区域内可偶尔检测到非随机DNA断裂。在大鼠纹状体兴奋毒性损伤之后，早期能观察到核小体间DNA断裂(编程性细胞死亡的证据)，并且在后期能观察到随机DNA断裂(细胞坏死的证据)。此外，通过EM检测到损伤大鼠的中等刺状神经元的坏死轮廓。因此，在HD和兴奋毒性动物模型中都有编程性细胞死亡发生。此外，神经元死亡的编程性死亡机制和坏死性死亡机制可同时在兴奋毒性损伤大脑的单个濒死细胞中出现(Portera et al.，1995，J.Neuroscience 15：3775-3787)。

已经在对多种病况(例如神经胶质瘤、外伤性大脑损伤、Parkinson病、Parkinson′s-Alzheimer′s complex、multisystem萎缩、stiatonigral变性)下的人大脑的初步研究中对Tdt-介导的dUTP-生物素缺刻末端标记(TUNEL)技术进行了研究。利用这种方法，只有Huntington病表现出明显并持续的标记。Thomas et ah，1995，Experimental Neurology 133：265-272)。在喹啉酸注射后c-fos表达迅速增加，并在大鼠大脑中蔓延，但注射后24小时这种情况就消失。然而，DNA断裂仅仅局限于在纹状体中，并且在注射后24小时达到最高。这些结果证明了原位切口移位法检测局部神经病理的灵敏度，这些结果了也说明了c-fos表达与兴奋毒性神经元死亡之间的时间和空间关系(Dure et al.，1995，Exp.Neurol.133：207-214)。

兴奋毒性损伤也用于探讨可能的HD治疗方法。喹啉酸诱导的兴奋毒性纹状体损伤，一种Huntington病模型，已经用于检验成年大鼠中的纹状体胆碱能神经元和纹状体GABAergic神经元上的神经生长因子(NGF)的神经保护反应，而这些成年大鼠是已经接受了喹啉酸(150nmol)损伤的。持续一周的每日纹状体间NGF给药在对照组水平之上使胆碱乙酰转移酶信使RNA水平增加了三倍，并且将Trk A信使RNA表达的水平保持在对照组水平。与对胆碱能细胞的保护效应相反，NGF处理没有能够缓和喹啉酸诱导的谷氨酸盐脱羧酶信使RNA水平降低。因此，在Huntington病中变性的纹状体谷氨酸盐脱羧酶信使RNA表达的GABAergic神经元对NGF没有响应。

Frim等(1993，J.Neurosurg.78：267-273)将分泌NGF的成纤维细胞植入到喹啉酸损伤的大鼠纹状体中。他们发现，相对于非NGF分泌成纤维细胞移植，胼胝体内对NGF分泌成纤维细胞的预先移植使得同侧纹状体中随后的兴奋毒性损伤最大十字区面积减少了80％，与没有进行移植的动物的兴奋损伤相比则减少了82％的面积(p＜0.003)。材料与方法

营养因子。在大肠杆菌中制备重组人BDNF、神经生长因子(NGF)和NT-3，以及重组大鼠CNTF，并且按照已有的描述对它们进行定性(Maisonpierre，et al.，1990，Science 247：1446-1451；Masiakowski，et a(.，1991，J.Neurochern.57：1003-1012)。Axokinel(Ax1)指定用于重组人CNTF，进行了下列修饰：用丙氨酸替代17位的半胱氨酸，用精氨酸替代63位的谷氨酰胺，以及C-末端13个氨基酸缺失。这些CNTF类似物具有增强的溶解性，在37℃的生理缓冲液中至少可以稳定存在一周，并且与原始人CNTF相比，在体内的活性增强了4-5倍(Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.268：19000-19003)。

实验动物的处理。所有的实验动物的使用程序严格的与动物保护与使用委员会(IACUC)通过的协议相一致。

利用渗透泵进行营养因子传递。利用水合氯醛(170mg/kg)和戊巴比妥(35mg/kg)将体重为250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠麻醉，然后将一个30号渗透泵输注插管和一个22号导管(分别位5.0和2.2mm长)并排着长期植入大鼠的大脑左半球(相对于前囟点的stereotaxic坐标为AP0.7，ML3.2；在interaural line下incisorbar 3.3mm)。30天后，将这些大鼠再次麻醉，利用塑料管将含有0.1M磷酸缓冲盐溶液(PBS)(pH 7.4)或重组人NGF(0.9 mg/ml)、人BDNF(1 mg/ml)、人NT-3(1 mg/ml)、大鼠CNTF(0.78 mg/ml)或Ax1(0.4mg/ml)PBS溶液的Alzet微型渗透真空泵2002(2周的工作时限，传递速率为0.5ul/hr)连接到输注插管上，并且进行皮下移植(Anderson，et al.，1995，J.Comp.Neurol. 357：296-317)。由于输注插管和塑料管有死体积，营养因子向大脑的传递在泵移植1天后开始。正如通过生物测定确定的那样，神经营养因子在37℃渗透泵中保持12天的完全稳定状态，并且通过对适当因子的切片进行免疫组织化学染色来保证神经营养因子在纹状体内的有效传递(Anderson，et al.，1995，J.Comp.Neurol.35__Z.7：296-317)。渗透泵植入3或4天后，利用配有28号钝头针头的10ul注射器、通过导管对已进行了麻醉的大鼠注射喹啉酸(溶解在1ul pH 7.2的磷酸缓冲液中，浓度为50nmol，用时10分钟)。

通过每日注射来进行营养因子传递如上文所述，将一根22号导管(长2.2mm)长期植入已经麻醉的大鼠的左脑半球中(stereotaxic坐标为AP 0.5，ML 3.0)。1周后，利用Hamilton注射器、通过导管向麻醉的大鼠每日注射Ax1(质量0.4μg，体积1ul，用时10分钟)或载体。在喹啉酸注射前连续3天和喹啉酸注射后1天注射Ax1，喹啉酸的注射如上文所描述的那样进行。

组织学方法和分析在喹啉酸注射后第8或9天开始收集在4％多聚甲醛中灌注固定的大脑，并且在冠状平面上切下一块40微米厚的、用硫堇染过色的切片。在每个实验中，由一个不清楚处理条件的研究者来评估一系列Nissl染色切片的1/12，并按照下列标准对中等的纹状体神经元的相对损失进行等级鉴定：0(没有神经元损失)，1(有但却微小的神经元损失)。2(中等程度的神经元损失)，3(严重但不是完全的神经元损失)，4(在喹啉酸处理的区域内的中等大小的神经元完全损失)。当遇到神经元损失在两个等级中间的情况时，可给出两个最近相邻分数的平均值。在利用BDNF和NT-3进行的实验中，两个独立观察者对42只大鼠中的40只给出的神经元损失分数在0-0.5点(相关系数＝0.8；p＝0.0001)。

在利用CNTF进行的实验中，也通过对切片中的神经元计数来评估神经元损失，而这些切片是通过将0.5mm的突出部分压进输注导管而制得的。对每个切片来讲，是通过在处理过的纹状体内选择7个区，每个区的体积为0.4×0.4mm，然后将每个区沿垂直线横切成10×10个样品小格，这样来对神经元进行计数。第一个区在纹状体的中心稍微侧偏一点，在典型的喹啉酸诱导损伤的中心(也即在输注插管的紧头部)。其余的6个区是从第一个区处进行对角线选取的，两个区在dorsomedial方向，两个区在ventromedial方向，并且在dorsolateral和ventrolateral方向各有一个区。为了控制切片厚度可能的变化，在纹状体的两面对7个区的等效部位取样(每7个区大约有600个神经元)。并且神经元的存活是以处理过的面上的神经元数量与未处理面上的神经元数量的百分比来表示的。实际神经元计数结果(CNTF处理和PBS处理组的神经元损失分别为31％和61％)表明，它与对神经元损失评价体系的数据进行回归分析(Spearman等级相关系数＝0.82，p＜0.05)得到的结果紧密吻合(平均神经元损失分数分别为1.67和3.25)。

利用unpaired t-检验对实验组和它们的对照组间的差别进行评定。结果

在一系列的实验中，利用渗透泵(额定传送速率：人NGF，10.8μg/天；人BDNF或NT-3，12.0μg/天；大鼠CNTF，9.4μg/天)向纹状体内输注神经营养因子3或4天后，向成年大鼠左纹状体中注射喹啉酸(50nmol)。这种剂量的喹啉酸对在所有纹状体神经元中占90％以上的中等大小纹状体output神经元来说是有毒的，但胆碱能中间神经元和微白蛋白/GABAergic中间神经元的纹状体群在很大程度上没有受到影响(Qin，et al.，1992，Experimental Neurology 115：200-211；Figueredo-Cardeeas，et al.，1994，Exp.Neuro[.129：37-56)。对在喹啉酸注射后8-9天收集的大脑Nissl染色切片进行显微镜分析，结果表明在BDNF-、NGF或NT-3处理的大脑中没有明显的中等大小纹状体神经元贫乏(图13)。在另外一组实验中，BDNF或NGF输注后7天进行喹啉酸注射时没有观察到明显的神经元贫乏。

形成鲜明对比的是，CNTF处理的大鼠组的神经元存活相对于单用载体处理的大鼠组有显著提高(图14)，这与通过神经元计数得到的平均存活百分数(±SEM)分别为69±17％和29±11％(unpaired t-检验，t(5)＝2.12，p＝0.04)或通过半定量神经元损失分数评定得到的结果(图15)一样。CNTF处理过的大脑中存活的神经元完全散布于受到喹啉酸注射影响的纹状体区域。

假定CNTF产生了正面影响，利用一种多肽CNTF受体促进剂Axokine 1(Ax-1)(24)进行了类似的实验。正如在CNTF给药后观察到的那样，Ax-1(4.8μg/天)输注造成了暴露于喹啉酸的中等大小纹状体神经元显著贫乏(图15)。这样的结果支持了CNTF受体介导机制可有效的保护纹状体神经元免遭NMDA受体介导的兴奋毒性这个结论。

在没有对行为或健康，象已经指出的，例如体重产生明显的负面影响的情况下就可实现CNTF或Ax-1的神经保护作用。CNTF或Ax-1处理没有显著影响实验结束时测定的体重(unpaired t-检验)。在CNTF实验中，营养因子处理组和载体处理组的平均体重分别为369±20g和331±15g，(p＝0.21)；在Ax-1实验中它们分别为431±26g和453±14g，(p＝0.44)。

另外进行了两个实验来确定是否在神经营养因子给药结束后CNTF受体配体的神经保护作用仍然存在，也通过其来确定在间歇传送低剂量的营养因子时这些处理方法是否是有效的。在第一个实验中，对大鼠持续3天纹状体内注射Ax-1(4.8μg/day)或载体，然后取出渗透泵结束传送。然后将喹啉酸注射到纹状体中，持续3天(图16A)。在第二个实验中，在纹状体内注射喹啉酸前3天内和注射后1天对大鼠进行每日Ax-1(0.4μg/天)或载体注射(图16B)；因此这些大鼠仅仅接受了总共1.6μg Ax-1。在这两个实验中，Nissl染色切片的显微镜分析表明，Ax-1处理的大脑中中等大小纹状体神经元的显著贫乏与在CNTF或Ax-1持续输注一段时间的实验中观察到的神经元贫乏程度(图16)相当。讨论

由于纹状体中90％以上的神经元是中等大小的投射神经元、胆碱能投射神经元、GABAergic投射神经元、striatonigral投射神经元和striatopallidal投射神经元(Graybiel，A.M.，1990，TINS13：244-254)，所以现有的结果表明CNTF或CNTF受体促进剂处理保护了纹状体output神经元免遭兴奋毒性损伤。因此，CNTF是首批纯化的、能保护纹状体output神经元的营养因子之一，而这些营养因子是在Huntington病的成年动物模型上进行了药理学应用的。在其他进行了特性研究的因子中，有报道说，只有利用碱性成纤维细胞生长因子进行的处理能减小对成年大鼠和新生大鼠进行N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和丙二酸注射诱导的纹状体损伤的面积(Nozaki，et al.，1993，J.Cereb.Blood Flow Metab.13：221-228；Kirschner，et al.，1995，J.Cereb.Blood Flow Metab.15：619-623)。虽然在纹状体附近植入的NGF分泌成纤维细胞表现出能保护大鼠的中等大小纹状体神经元免遭喹啉酸损伤(Frim，et al.，1993，NeuroReport 4：367-370；Emerich，et al.，1994，Exp.Neurol. 130：141-150)，但是我们利用纯化的NGF处理这些神经元没有收到任何存活促进效果，这与早期的几项研究相一致(Davies，et al.，1992，Neurosci.Lett. 140：161-164；Venero，et al.，1994，Neuroscience61：257-268；Kordower，et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：9077-9080).这个发现表明NGF不是NGF分泌成纤维细胞提供的神经保护的唯一介体。然而，象以前的报道所说的那样，我们确实观察到大的、暗黑的染色，估计在NGF处理过的大脑中胆碱能神经元更显著

(Davies，et al.，1992，Neurosci.Lett. 140：161-164；Kordower，et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9077-9080；Perez-Navarro，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.6：706-711).高亲和性NGF受体TrkA在纹状体的表达仅仅局限于胆碱能中间神经元(Steininger，et al.，1993，Brain Res.612.：330-335)，这与NGF在这些神经元上的选择性反应中的发现相一致，而BDNF和NT-3的高亲和性受体(TrkB和TrkC)是通过多种中等大小的纹状体神经元来表达的(Altar，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.6：1389-1405)。BDNF和NT-3(与NGF不同)促进了体内胚胎output神经元、GABAergic output神经元和纹状体output神经元的存活和显型分化

(Mizuno，et al.，1994 Dev.Biol.165：243-256；Ventimiglia，et al.，1995，Eur.J.Neurosci).此外，这些神经营养因子能保护体内特定的神经元群免遭谷氨酸毒性

(Lindholm，et al.，1993，Eur.J.Neurosci.5：1455-1464；Shimohama，et al.，1993，Neurosci.Lett. 164：55-58；Cheng，et al.，1994，Brain Res. 640：56-67).然而，BDNF或NT-3输注没有表现出能保护体内的纹状体output神经元免遭NMDA受体介导的兴奋毒性，虽然脑内输注相当剂量的BDNF或NT-3在纹状体和大脑的其他部位引发了明确的生物学效应(Lindsay，et al.，1994，TINS 17：182-190)。可利用体内神经元类型(纹状体神经元对海马回神经元，皮质神经元对小脑神经元)、神经元发育阶段的差异(成年期对胚胎期)或glutamatergic突出input的存在体内和体外研究结果间的差异。

可通过对中等大小的纹状体神经元的直接作用来产生CNTF受体配体表现的神经保护效应，因为纹状体的CNTF受体元件(CNTFRα，CNTFRβ，CNTFRγ)有足够的mRNA表达

(Ip，et al.，1993，Neuron 10：89-102；Rudge，et al.，1994，Eur.J.Neurosci. 6：693-705).潜在的机制可能包括谷氨酸受体功能和表达的修饰，从而使得神经元具有针对glutamatergic刺激的修饰的灵敏度，或使得神经元具有提高的能力来调节胞液钙离子浓度，而钙离子浓度增加被认为是启动神经保护过程的一个重要步骤(Choi，D.W.，1988，Neuron 1：623-634)。CNTF作为谷氨酸受体拮抗剂来阻断喹啉酸的毒性是不可能的，因为CNTF不组阻断体内谷氨酸的毒性效应(Mattson，et al.，1995，J.Neurochem.65：1740-1751)。

在另一方面，CNTF受体可间接通过纹状体的其他组分来进行潜在的作用。例如，在暴露于喹啉酸之前消除纹状体中的黑质和皮质输入就可显著减少纹状体神经元的损失

(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci. 13：286-289；Buisson，et al.，1991，Neurosci.Lett. 131：257-259)在表明在诱导细胞死亡时要求外源毒素和内源神经递质共同作用。因此，glutamatergic或dopaminergic突触的突触传递减少可能保护纹状体神经元免遭喹啉酸注射造成的损伤。虽然星形胶质细胞不能在体内正常表达可检测到的CNTFRα(Ip，et al.，1993，Neuron 10：89-102)，但是星形胶质细在经过大脑损伤活化后或在体外细胞种就能表达所有的CNTF受体元件(Rudge，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.6：693-705)。此外，在暴露于星形胶质细胞中10-48小时后，CNTF传递就能活化星形胶质细胞，这可由神经胶质原纤维酸性蛋白和其mRNA量增多表明

(Levison，et al.，1995，Soc.Neurosci.Abst.21：497；Winter，et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：5865-5869).不管CNTF是进行直接还是间接活化，星形胶质细胞就可通过增强的兴奋性氨基酸扣押或通过释放保护神经元的物质来提高神经元的存活。

在本研究中，通过CNTF受体介导的作用来免遭兴奋毒性损伤的纹状体神经元群与在Huntington病中选择性消失的神经元类型相同(Albin，et al.，1989，Trends Neurosci.1-2：366-375)。有人提出，在兴奋毒性刺激和Huntington病基因增强的表达之间具有潜在的联系(Carlock，et al.，1995，NeuroReport 6：1121-1124；Tatter，et al.，1995，NeuroReport 6：1125-1129)。虽然有大量的、旨在确定Huntington病致病机理研究正在进行，但现有的证据已明确的表明了NMDA受体介导的兴奋毒性在其中的作用(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13：286-289)。实施例8：Axokine蛋白的PEG化

我们已经知道蛋白的PEG化可通过提高稳定性和生物利用度、降低免疫原性来提高它们在体内的前能。已经知道特定蛋白的特性是可以通过聚乙二醇(PEG)多聚物附着来进行调整，聚乙二醇多聚物可增加蛋白的流体动力学体积，因而就可通过肾过滤来减低其清除率(见如Clark，R.，et al.，1996，J.Biol.Chem.271：21969-21977)。我们已经通过Ax-13和聚乙二醇(PEG)的共价交联制得了PEGylatedAxokine。我们也发明了一种方法以便将不同形式PEGylatedAxokine与未进行修饰的分子分离。在生理pH下，PEGylated Ax-13具有比unPEGylated Ax-13好的溶解性和稳定性。已经证明Pegylation可大大提高药物动力学特性，我们也期望它能类似的提高其他Axokine分子的特性。

这些研究中选用的是在大肠杆菌中表达并进行纯化后的Ax-13。从Shearwater Polymers购得20kD mPEG-SPA，从Sigma购得Bicine，并从Novex，CA购得Tris-甘氨酸预制凝胶。进行了一个小型的反应研究来确定反应条件。最终浓度为0.6mg/ml的20kD mPEG-SPA在pH8.1的4℃无胺缓冲液中与Ax-13反应。选用了不同的PEG与蛋白的摩尔比和两个反应时间。通过添加大量过量的主胺来停止反应。反应产物利用还原性SDS-PAGE进行分析。主要的修饰蛋白分子量大约为60KD。也可观察到更高程度修饰的更高分子量泳道。在这些研究基础之上，我们选择了PEG与蛋白的比率为4的过夜反应。

4℃下，0.6mg/ml Ax-13与20kD mPEG-SPA在pH8.1的Bicine缓冲液种进行反应。通过添加大量过量的主胺来停止反应。反应产物在低盐缓冲液中稀释并过离子交换柱。柱子用低盐缓冲液冲洗，然后进行氯化钠梯度洗脱。更高交联程度形式的分子(利用SDS-PAGE获得的表观分子量为＞66KD)与未经修饰的Ax-13在离子交换柱上有很好的分离，而这些更高交联程度形式的分子是分子量大约为60KD的独特的修饰蛋白。对与60KD泳道相对应的片段进行了生物测定。我们注意到在与60KD带相对应的片段中有一条很微弱的未经修饰的Ax-13泳道。为了确定生物测定结果没有受到这种物质的显著影响，我们利用分子大小排阻层析(SEC)来进行进一步的纯化，这种方法对60KD带和Ax-13进行了基线分离。对纯化的Ax-13进行生物测定，生物测定结果与利用没有进行SEC之前物质进行的生物测定结果没有区别。实施例9：构建Ax-15表达质粒pRG643

质粒pRG632是一个高拷贝质粒，它能编码氨苄青霉素抗性以及编码在3′到终止密码子间含有特有的Eag I限制性酶识别序列的CNTF-C17A，Q63R，ΔC13(此处也指Ax1或Ax-13)。对包含在ΔC15内的187 bp BseR I-Eagl DNA片段进行PCR扩增，利用质粒pRG632构建了CNTF突变体C17A，Q63R，ΔC15(命名为Ax-15)。编码BseR I位点的5′-引物{ΔC15-5′(5′-CCAGATAGAGGAGTTAATGATACTCCT-3′)}和编码Ax-15基因C-末端的3′引物ΔC15-3′{(5′-GCGTCGGCCGCGGACCACG CTCATTACCCAGTCTGTGA GAAGAAATG-3′)}在Gly185处终止，随后是两个终止密码子和一个Eagl限制性酶识别序列。将这个DNA片段用BseR I和Eag I消化，并且结合到pRG632中的相同位点。最终的质粒pRG639可编码Ax-15(人CNTF C17A，Q63R，ΔC15)。然后将ΔC15突变体作为一个339 bp Hind III-Eag I DNA传递到pRG421中的相同位点，而pRG421是一个编码卡那霉素抗性和人CNTFC17A，Q63R，ΔC13的高拷贝表达质粒。最终形成的质粒pRG643可在lacUV5启动子的转录控制下编码Ax-15基因，并且赋予卡那霉素抗性。通过序列分析对Ax-15基因的DNA序列进行确定。实施例10：Ax-15蛋白的小规模表达和纯化

含有质粒pRG639大肠杆菌菌株RFJ141在LB培养基上生长，通过添加1％的乳糖(w/v0就可诱导Ax-15蛋白的表达。通过离心对诱导生成的细胞进行收集，将收集到的细胞重新悬浮在pH 8.3的20mMTris-HCI、pH8.35mM EDTA和1mM DTT中，并将他们在10,000psi下通过French pressure cell来裂解。将细胞裂解物进行离心，然后将沉淀重新悬浮在8M盐酸胍、50mM pH 8.3的Tris-HCI、0.05mMEDTA中，然后利用5倍体积的50mM pH 8.3的Tris-HCI和0.05mMEDTA(Buffer A)进行稀释，随后利用Buffer A.对其进行透析。将透析物过Buffer A平衡过的Q-琼脂糖柱。利用含在10倍柱体积的缓冲液中的0-1M氯化钠对Ax-15蛋白进行线性梯度洗脱。收集含有Ax-15蛋白的片段，并在通过添加氢氧化钠保持pH8.3的情况下向其中缓慢添加固体(NH₄)₂SO₄使(NH₄)₂SO₄浓度达到1M。利用含有0.5M(NH₄)₂SO₄的缓冲液A冲洗柱子，并利用逐渐降低的(NH₄)₂SO₄浓度线性梯度洗脱Ax-15蛋白。收集含有Ax-15蛋白的洗脱液，利用pH 8.3的5mM NaPO₄进行透析，然后通过超滤进行浓缩。浓缩液在利用。pH8.3的5mM NaPO₄平衡过的Sephacryl S-100柱上进行分级分离。

实施例11：Ax-15蛋白的大规模表达和纯化

在含有20μg/ml卡那霉素的微量盐葡萄糖培养基中培养可在lac启动子调控(pRG643)下表达Ax-15蛋白的、卡那霉素抗性重组大肠杆菌菌株RFJ141，使其浓度达到30-35 AU550(550nM下的光吸收)的中等浓度。通过添加IPTG(硫代半乳糖苷)至1.0mM的浓度来诱导Ax-15蛋白的表达，并且此后发酵持续8小时。在IPTG诱导后Ax-15蛋白是以不溶包含体形式表达的。在诱导后，收集细胞，对细胞糊进行浓缩，并且通过AGT 500,000molecular weight cut off(mwco)中空纤维渗滤(ACG Technologies，inc.)将缓冲液换为20mM Tris、1.0mMDTT、5.0mM EDTA、pH 8.5。将冷冻(0-10℃)的细胞糊悬浮液重复通过连续流动的、高压(＞8,000psi)Nifo Soavi匀浆器来使细胞破裂，包含体从收获的细胞中释放出来。利用冷冻的(4-8℃)、连续转动的高速(＞17,000xG)Sharpies离心机(source)对匀浆物进行离心来回收包含体。在含有1.0mM DTT的8.0M盐酸胍中提取包含体。将Ax-15蛋白/盐酸胍溶液稀释到含有50mM Tris-HCI、1.0mM DTT、0.05mM EDTA、pH8.0-8.3的缓冲液中，通过AGT 5,000mwco hollowfiber filters(ACG Technologies，Inc.)对稀释缓冲液进行渗滤。在进行层析法纯化之前，将含有重新折叠的Ax-15蛋白的最终溶液通过Microgon 0.22um空心纤维滤器(ACG Technologies，Inc.)进行过滤。实施例12：重折叠的Ax-15的柱层析纯化

将上述过滤后的Ax-15蛋白溶液加到16.4 L DEAE Sepharose(Pharmacia)浓度为10.9mg/ml的柱上，并且用50L含有50mMTris、1.0mM DTT和0.05mM EDTA、pH 8.0-8.3的缓冲液进行冲洗。在相同的缓冲液中，Ax-15蛋白是在120mM NaCI浓度梯度处从层析柱上洗脱下来。收集那些在峰的上升部分超过以前确定的最大280nM吸收标准40％和那些在峰的下降部分超过20％的洗脱液，将他们冷冻保存(-30℃)或用于下一步的纯化。通过逐步添加固体硫酸铵来将收集的Ax-15蛋白洗脱液中的硫酸铵浓度调节到1.0M，维持pH8.0-8.3。将此溶液滤过0.22um Sartorious capsule filter，然后加到12.5L苯基琼脂糖HP(Pharmacia)浓度为8.24mg/ml的柱上，并且用55L溶解在含有0.05mM EDTA、pH 8.0-8.3的50mM Tris缓冲液中的.1.0M硫酸铵冲洗。在利用体积为12L、含在相同缓冲液中的250mM硫酸铵冲洗之后，Ax-15蛋白在125mM硫酸铵、Tris缓冲液洗脱梯度中洗脱下来。收集那些在峰的上升部分超过以前确定的最大280nM吸收标准100％和那些在峰的下降部分超过20％的洗脱液。同时将洗脱液按1∶4的比例稀释到不含盐的50mM Tris、pH 8.0-8.3缓冲液中，以此来降低他们的传导性。稀释液进行冷冻保存(-30℃)或用于下一步的纯化。将收集的疏水相互作用层析(HIC)物质浓缩到25L，并且利用5,000 mwco AGT hollow fiber filter(ACG Technologies，Inc.)对pH 8.0-8.3的5.0mM磷酸钠缓冲液进行渗滤。在sulfylpropyl fast flow(SP FP)琼脂糖层析前，立即通过逐步添加浓缩的磷酸(85％)将其pH调整到7.0-7.2。将pH调节过的收集物加到7.7L SP FF琼脂糖(Pharmacia)浓度为9.0mg/m层析柱上，并且最少用25L pH 7.0的5.0mM磷酸钠缓冲液冲洗。Ax-15蛋白在体积为77.0L的5.0mM磷酸钠、130mM NaCI、pH 7.0-7.2梯度中洗脱下来。同时将洗脱液按1∶5的比例稀释到不含盐的10.0mM磷酸钠、pH 9.0-9.2缓冲液中，以此来降低他们的传导性并提高其pH。收集那些在峰的上升部分超过以前确定的最大280nM吸收标准20％和那些在峰的下降部分超过20％的洗脱液。收集液进行冷冻保存(-30℃)或用于下面的步骤。将收集的SP FF琼脂糖Ax-15蛋白进行浓缩，并且通过5,000mwco AGT hollow fiber filter(ACG Technologies，Inc.)对pH8.0-8.3的5.0mM磷酸钠缓冲液进行渗滤。将收集物(24.66g)浓缩到≤5.0L。将浓缩过、渗滤过的Ax-15蛋白加到50LS-100Sephacryl(Pharmacia)sizing column上，用250L pH 8.0-8.3的5.0mM磷酸钠缓冲液洗脱。收集那些在峰的上升部分超过以前确定的最大280nM吸收标准40％和那些在峰的下降部分超过40％的峰物质。将收集的Ax-15蛋白滤过0.22um的Millipak滤膜，并在配制和进行药物制剂前将滤液在-80℃下保存。Ax-15的氨基酸序列如下所示。另外，一种大肠杆菌可产生在起始丙氨酸之前含有蛋氨酸的Ax-15氨基酸序列。

9 19 29 39 49 59* * * * * * * * * * * *AFTEHSPLT PHRRDLASRS IWLARKIRSD LTALTESYVK HQGLNKNINL DSADGMPVAS

69 79 89 99 109 119

* * * * * * * * * * * *TDRWSELTEA ERLQENLQAY RTFHVLLARL LEDQQVHFTP TEGDFHQAIH TLLLQVAAFA

129 139 149 159 169 179

* * * * * * * * * * * *YQIEELMILL EYKIPRNEAD GMPINVGDGG LFEKKLWGLK VLQELSQWTV RSIHDLRFIS

*SHQTG蛋氨酸+

10 20 30 40 50 60

* * * * * * * * * * * *MAFTEHSPLT PHRRDLASRS IWLARKIRSD LTALTESYVK HQGLNKNINL DSADGMPVAS

70 80 90 100 110 120

130 140 150 160 170 180

*SHQTG实施例13：利用Ax-15治疗肥胖症动物模型

正常鼠

正常的(8周)C57BL/6J鼠是得自Taconic。对鼠进行每天的皮下注射载体或Ax-15。这些鼠的体重每天都在增加，并且在第3天和第4天间确定24小时内的食物摄取量。

ob/ob鼠

作为在6号染色体上单基因突变的结果，ob/ob鼠产生了一种截短的、非功能性的基因产物(Leptin)。这些鼠饮食过量、胰导功能亢进并显著的肥胖。

C57BL/6J ob/ob鼠得自Jackson实验室，并且在12-14周大小时进行实验。这些鼠每天接受载体、Ax-15和Leptin的皮下注射。Pair-fed组也给予接受Ax-15(0.3mg/ml)处理的动物的平均食物消费量(g)。这些鼠的体重每天都增加，并且在第3天和第4天间确定24小时内的食物摄取量。在第8天，将实验鼠杀死，并且进行尸体分析。

患有饮食诱导的肥胖症(DIO)的鼠

已经证明，AKR/J鼠易于患有通过增加身体脂肪含量方式进行的饮食诱导的肥胖症。对于这种饮食性肥胖症，如人肥胖症来讲，虽然对基因环境(饮食)相互作用没有完全的了解，但是基因型是多基因的。

AKR/J鼠得自Jackson实验室，并且在10-12周龄的时候接受高脂肪饮食(45％脂肪；研究用饮食)。在这样的饮食进行7周后开始所有的实验。这些鼠每天接受载体、Ax-15和Leptin的皮下注射。Pair-fed组也给予接受Ax-15(0.1mg/ml)处理的动物的平均食物消费量(g)。这些鼠的体重每天都增加，并且在第3天和第4天间确定24小时内的食物摄取量。在第8天，将实验鼠杀死，收集血清用于胰岛素和皮质酮检验。试剂

在上述实验开始就制备了重组人Ax-15，并从R & D Systems购得Leptin。结果

正常鼠

在正常鼠中，Ax-15以一种剂量依赖的方式减轻了正常鼠的体重。在6天里，接受0.1mg/kg、0.3rng/kg和1mg/kg剂量处理动物分别损失了大约4％、11％和16％的体重(Figure 17).。

ob/ob鼠

在对ob/ob鼠进行Ax-15处理后，他们的体重产生了与剂量(0.1mg/kg-3mg/kg)相关的减少(图18)。在0.1mg/kg-3mg/kg的剂量范围内，体重有8-25％的降低。接受特定的Ax-15剂量(0.3mg/kg)的pair-fed鼠表现了与接受前述Ax-15剂量的鼠相同的体重损失，这表明食物摄取是体重降低的主要原因。

Leptin也可有效降低ob/ob鼠的体重。在1mg/kg剂量时，在7天内leptin使体重降低了6％，其过程与给药0.1mg/kg Ax-15(figure 18)几乎相同。

尸体分析表明，与pair-fed对照组一样，Ax-15和leptin处理显著减少了总的身体脂肪(表5)。相对于载体给药组，这些组中都有很少但不显著的瘦体重损失。仅仅接受限食处理的鼠(pair-fed)与载体对照组在脂肪/瘦体重比率上没有区别。这表明他们损失的脂肪和瘦体重相同。然而，Ax-15和leptin处理的鼠表现出优选的身体脂肪损失，这可通过脂肪/瘦体重比率的降低反映出来(表5)。

DIO鼠

Ax-15以剂量依赖方式降低了DIO鼠的体重。在一周之内，接受0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg剂量处理动物分别损失了大约14％、26％和33％的体重(Figure 19)。相对于Ax-15处理的效果和pair-fed对照组鼠，在这两组中有小但显著的区别，这表明在Ax-15处理组中降低的食物摄取可能是，虽然不是唯一的体重损失原因。实际上，Ax-15处理显著减轻了DIO鼠中与胰岛素功能亢进相关的肥胖症，然而仅仅减少食物摄取却没有收到这样的效果(图20A)。此外，Ax-15处理没有提高皮质酮的水平，而皮质酮升高是限食的普遍结果(图20B)

值得注意的是对Ax-15以相同的剂量范围(0.1-1mg/kg)给药时，DIO鼠相对于正常鼠损失了超过两倍的体重(见图17)饮食诱导的肥胖症动物对Ax-15的高敏感性表明肥胖症可以调节Ax-15的效率，从而使得肥胖症在正常化之后Ax-15并不引起体重的持续损失。

DIO鼠是leptin抗性的，在每天注射leptin的动物中没有观察到体重损失(1mg/kg；图19)。

我们的结论如下：

1.Ax-15以剂量依赖方式引起正常鼠的体重损失。

2.Ax-15以剂量依赖方式引起ob/ob鼠的体重损失。对ob/ob鼠来讲，Ax-15(0.1mg/kg)在引起体重损失方面与Leptin(1mg/kg)是等效的。Ax-15和Leptin处理，而不是pair-fed，优选的减少总脂肪，而不是瘦体重。

3.Ax-15在饮食诱导的鼠中以剂量依赖方式引起体重损失，而Leptin是无效的。Ax-15处理减轻了DIO鼠与胰导功能亢进相关的肥胖症；但在pair-fed鼠中没有观察到其效用。此外，Ax-15鼠在DIO鼠中比在正常鼠或ob/ob鼠中更有效的诱导体重的损失。总起来讲，我们的结果表明了Ax-15在治疗Leptin抗性肥胖症，如II型糖尿病相关的肥胖症方面的一个特定应用。

4.在Leptin抗性鼠模型中，Ax-15在减少体重上的有效性表明Ax-15也可有效减少那些Leptin抗性或对Leptin不敏感的肥胖症患者的体重。

表5：ob/ob鼠的尸体分析结果

脂肪g Lean mass g Fat：Lean mass

载体平均 34.77 4.79 7.26

sem 1.41 0.24Pair-fed to Ax-15 0.3mg/kg 29.36 4.03 7.28

0.93 0.07Ax-15 0.1mg/kg 30.22 4.38 6.9

0.59 0.13Ax-15 0.3mg/kg 26.77 4.03 6.64

0.66 0.08Ax-15 1mg/kg 23.29 3.35 6.95

0.87 0.12Ax-15 3mg/kg 23 3.5 6.57

0.53 0.12Leptin 1mg/kg 28.89 4.73 6.11

0.89 0.1实施例14：PEG化Ax-15

申请者已经通过将不同长度和类型的聚乙烯醇链与Ax-15多肽分子共价交联制得了几种不同的PEG化Ax-15分子。申请者也发明了多种纯化方法来将PEG化形式的Ax-15与未修饰的Ax-15分子分离开来。材料与方法

利用大肠杆菌(上文)制得的、纯化的Ax-15用于这些研究。从Shearwater Polymers，AL购得了利用胺特异末端基团功能化的不同分子量的PEG链，从Sigma，MO购得了Bicine，以及从Novex，CA购得了Bis-Tris预制凝胶。进行小规模的反应研究来检验不同的反应条件。选用了不同的反应条件，下面的条件是可变的：

1.Ax-15蛋白浓度：0.6mg/ml-6.0mg/ml。

2.PEG/Ax-15蛋白摩尔比直至30∶1

3.温度：4℃至室温

此外，在应用了醛化学的例子中，选用了不同浓度的还原性试剂(如购自Aldrich Chemicals，Milwaukee，WI的sodiumcyanoborohydride)来还原Schiff碱。通过添加远远超过1M贮液的pH 7.5的Tris-HCI来终止反应，而贮液室购自Life Technologies，Gaithersburg，MD.。一般来讲，用于调节蛋白浓度的pH 7.5、50 mMTris-HCI是在μM范围之内的。

对于纯化来讲，反应产物一般是用低盐缓冲液来稀释，并且进行离子交换柱层析。柱子用低盐缓冲液冲洗，用溶解在15mM Bicine缓冲液中的0-300mM NaCI梯度洗脱，而洗脱液要流过装有购自Pharmacia，Piscataway，NJ的Q-HP阴离子交换树脂柱。我们观察到在未修饰的Ax-15和与结合有不同数量的PEG链相对应的pegylated形式之间有很好的分离。对离子交层析柱的不同收集液进行浓缩，并通过标准预备的分子大小排组层析来进一步纯化。在许多情况下，将两种相近形式的PEG Ax-15蛋白收集到一起，并且当作一个样品来处理(例如，标明为PEG 5K(3，4)-2⁰胺-Ax 15的样品主要包含通过2⁰胺连接结合有3或4链分子量大约为5KD PEG分子的样品)。

通过下列方法中的任一种或所有方法对反应产物和纯化样品进行分析：

1.在还原性和非还原性条件下的SDS-PAGE：

2.分析用离子交换层析法

3.分析用分子大小排阻层析

一开始，在SDS-PAGE凝胶上的泳道的模式基础之上，指出了样品中结合到Ax-15分子上的链的数量。在已公开的技术(Karr，L.J.et.al.，Methods in Enzymology 228：377-390(1994))之上，通过游离氨基检测法或通过偶联到MALLS(多角度激光散射)体系上的、依次配备有UV、RI(屈光指数)和MALLS检测器的分析用分子大小排组层析柱来检测主要的氨基以便对其数量进行确认。光散射是大分子质量和浓度的一个函数。为了确定分子量。将蛋白样品注射到凝胶过滤柱中，流出物依次利用即时光散射检测器和屈光指数和/或UV检测器来进行检测。光散射检测器是购自Wyatt Technology Corporation(Santa Barbara，CA)MiniDawn激光散射检测器。这种仪器可从三个不同角度检测静态光。即时光散射检测器或UV检测器用于测定蛋白浓度。在蛋白的dn/dc(dn＝屈光指数变化；dc＝浓度)或消光系数基础之上，利用Astra 4.7软件(Wyatt Technology Corporation，Santa Barbara，CA)来计算蛋白浓度。SEC-MALLS体系液用于检测PEGAx-15制剂的纯度和分子量。

在下列的体内实验中检测了多种PEG Ax-15分子。实施例15：利用PEG Ax-15来治疗肥胖症的体内实验

已经证明，AKR/J鼠易于患有通过增加身体脂肪含量方式进行的饮食诱导的肥胖症。对于这种饮食性肥胖症，如人肥胖症来讲，虽然对基因环境(饮食)相互作用没有完全的了解，但是基因型是多基因的。下面进行的实验是为了检验PEG Ax-15在患有饮食诱导的肥胖症的实验动物模型中对体重和食物摄取的影响。在本实验中描述的特定分子叫做1-20-PEG Ax-15，这仅仅是通过上述方法制备得到的并在体内实验中进行检测的许多PEG化Ax-15分子中的一个。这个分子是20KDPEG通过2⁰胺连接的单PEG化分子。表6展示了多种Pegylated Ax-15制剂体内活性的对比。实验步骤

从10周龄开始对雄性AKR/J鼠(The Jackson Laboratory，BarHarbor，Mb.)进行高脂肪饮食饲养(含有45％脂肪能量)。到17周龄时，这些鼠比饲养以正常饮食的同窝鼠重30％，这些鼠叫做饮食诱导的肥胖症(DIO)鼠。每组包括6只DIO鼠的四组鼠接受每周皮下注射载体(PBS)、非PEG化Ax-15(0.7mg/kg)或1-20-PEG Ax-15(0.23或0.7mg/kg)。在治疗期间，每天记录和24小时饮食的检测数据，持续13天。结果

1-20-PEG Ax-15处理以剂量依赖方式减轻了DIO鼠的体重(图21)。在0.7mg/kg剂量条件下，1-20-PEG Ax-15引起了接近32％的体重损失，而相同剂量的非PEG化Ax-15仅仅减轻了8％的体重。此外，体重损失与食物摄取的减少紧密相连，在高剂量处理(0.7mg/kg 1-20-PEG Ax-15)组中观察到食欲的最大损失(图22)。在这个处理组中食欲抑制时间也最长(图22)。这些发现说明PEG化将Ax-15在DIO鼠体重损失方面效率提高了4倍(图22)。因此，Ax-15 PEG化可允许低剂量和低频率给药。实施例16：利用Ax-15来治疗非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)背景

非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM或II型糖尿病)影响了大约5％的人口，它的特征在于提高了血糖的浓度，这种提高主要是由于在外周组织中对胰岛素作用的抗性产生的。NIDDM是最普遍的代谢疾病中的一种，是由环境因素和基因因素共同决定的。为揭开特定NIDDM易患基因的分子同一性所做的努力导致了对几种异常的鉴定，这有助于个体小亚群中的疾病的治疗。然而，NIDDM最普遍的、最新出现的形式涉及的基因的分子同一性仍然没有得到鉴定。

C57BL/KsJ db/db(db/db)鼠是NIDDM的动物模型中研究的最好的一个。这些鼠是胰岛素抗性的，并且也表现出多种代谢和激素异常，如大规模的肥胖、饮食过度和低能量消耗(Kodama，H.，et al.，1994Diabetotogia 37：739-744)。与在患有NIDDM的人中一样，在db/ab鼠中也是由减少的葡萄糖代谢的内环境调控，高血浆葡萄糖水平和延迟的葡萄糖消失突出说明了这一点，这是通过口服葡萄糖耐受性检验(OGTT)得出的评价结果。已知系统给药睫状神经营养因子(CNTF)可减少缺乏功能性leptin(ob/ob鼠)或leptin受体(db/db鼠)的鼠的肥胖症(Gloaguen，I.et el.，1997，Proc Natl Acad Sci94：6456-6461)。我们利用这种模型进行的研究表明Ax-15处理对食物摄取和体重调节(下文有详述)上有戏剧性的效果，并且在葡萄糖耐受上也有戏剧性的效果，而后者是不能单单归因于体重损失的。与pair-fed糖尿病鼠和载体处理的糖尿病鼠相比，对实验动物进行为期10天的Ax-15处理以一种剂量相关的方式显著提高了口服葡糖耐受性(下文有详述)。这说明实验动物在以一种胰岛素依赖方式或非胰岛素依赖方式处理葡萄糖大丸剂注射上的能力有了提高。重要的是，在Ax-15处理过的鼠中，空腹血浆葡萄糖水平和胰岛素水平(下文有详述)显著降低到接近正常的、非糖尿病水平。由于在NIDDM中空腹血清胰岛素水平和胰岛素抗性之间有很强的联系，所以这些结果说明Ax-15处理在实验模型中显著降低了胰岛素抗性。相对于载体处理对照db/db鼠，Ax-15处理过的鼠中游离脂肪酸水平有显著的降低(下文有详述)。

这些结合数据表明Ax-15处理提高了对葡萄糖的处理和对胰岛素的敏感性，这些不能归因于减少的食物摄取和随后的体重损失。在生物化学水平上，已知胰岛素信号包括由胰岛素结合到其细胞表面受体上引发的级联反应，随后是自磷酸化作用和受体酪氨酸激酶活化，这使得胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化作用(IRSs)(Avruch，J.，1998，Molecular Cell Biochem 182：31-48)。虽然胰岛素在神经末梢区域的绝大多数作用被认为是通过其受体介导的，但弓状核中的神经元表达胰岛素受体和已知IRSs也是已知的(Baskin，D.G.，et al.，1993，Reg Peptides 48：257-266；Schwartz，M.W.，et al.，1992，Endocr Rev 13：387-414)。在与杂和体同窝鼠(db/？)进行对比的情况下，我们对db/db实验动物弓状核中p(tyr)(pTyr)染色蛋白的评定意外的揭示了蛋白，或许是IRSs的组成性活化作用。在这些实验中，检测用Ax-15都减轻了这种畸变，这表明在这些区域修复了对胰岛素信号途径的正常信号传导。

胰岛素另外一个已有详细说明的作用是IRSs与磷酸肌醇(PI)3-激酶调节亚基的结合，已经证明磷酸肌醇(PI)3-激酶调节亚基对多种胰岛素作用是必需的(葡萄糖运输、蛋白质合成以及糖原合成)(Shepard，P.R.，et al.，1996，J.Mci Endocr 17：175-184.)。目前已知的经由胰岛素刺激的PI3激酶是I型异源二聚体p85/p110催化性PI3激酶。p85亚单位作为一个衔接子连接着p110催化亚单位和适当的信号复合体。所有形式的衔接子亚单位都包含有结合到IRS-1、IRS-2和生长因子受体上的酪氨酸磷酸化基序上的SH2结构域(见Shepard，ibid.)。在对Ax-15处理过的db/db鼠肝脏细胞进行的分析中发现，胰岛素在提高p85相关的p(Tyr)蛋白对胰岛素作出响应方面的能力有所恢复。这些结合结果表明Ax-15处理能(1)提高db/db鼠处理葡萄糖的能力以及(2)对个体组织的评定表明了对胰岛素的敏感性的提高。

本发明的目的是对一种修饰的CNTF，Ax-15对NIDDM模型中db/db鼠的糖尿病病情产生的影响进行定性。实验步骤(1)实验动物

在一个屋子中饲养6-8周龄的雄性db/db C57BL/KsJ鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)温度维持在69-75℃，每天光照12小时。所有的实验动物的使用程序严格的与动物保护与使用委员会(IACUC)通过的协议相一致。从第10周开始，对鼠进行个体饲养，接受标准的鼠食(Purina Mills，Richmond，tN)ad libitum，并可以自由饮水。对Pair-fed实验鼠每天提供所有报道中的最高剂量Ax-15处理组中的鼠消费的食物的平均量。每天大约在相同时间每日注射Ax-15(0.1和0.3rog/kg，s.c.)和载体(10mM磷酸钠，0.05％Tween 80，3％PEG 3350，pH 7.5的20％蔗糖)。每天记录实验鼠体重，并且每天收集从尾静脉流入毛细管中的血样。为了进行口服葡萄糖耐受性检验(OGTT)，所有实验鼠必需禁食18-20小时，并且大约在10：00左右开始对尾部放血以进行基线测定。尾部放血后，通过喂食针头(VWR，Plainfield，NJ)对实验动物给药89mg溶解在0.2ml蒸馏水(-2.2g/kg体重)中的D-葡萄糖(Sigma，St.Louis，MO)。在葡萄糖给药后20、60和210分钟从尾部抽取血液。在按照前面叙述的对血糖、胰岛素、游离脂肪酸和甘油三酯(Linco ResearchImmunoassay，St Charles，MO)进行检验之前将血清在-20℃下贮存(Tonra，J.R.，et al.，1999，Diabetes 48：588-594)。(2)组织取样、匀浆和免疫沉淀

在实验的不同组中，对鼠进行研究来检查Ax-15处理对受体信号元件的效用。在上述的对Ax-15进行的给药次数和剂量之后(参看上文)，分离肝脏组织并速冻以进行随后的分析。组织样品(100mg)在置于冰上的缓冲液A(1％NP-40，50mM Hepes pH 7.4，150mM NaCI，1mMEDTA，30mM磷酸钠，50mM氟化钠，0.5mM原钒酸钠，5μg/ml抑肽酶，5μg/ml白胃素，1mm PMSF)中，在14,000g下离心10分钟。在4℃下，利用5ul抗p(tyr)抗体(4G10)或偶联到蛋白A琼脂糖(Upstate Biotechnology，NY)上的抗IRS-1抗体来免疫沉淀裂解物蛋白(2mg)，过夜。利用缓冲液A冲洗免疫沉淀物3次，并且在65℃下加热大约5分钟。在6％或8％预制凝胶上对蛋白样品进行SDS-PAGE分析，并通过Trans Blot系统(Hoeffer

Transblotter，Pharmacia，NJ)转移到氮纤维素薄膜(Novex，CA)上。在室温下，利用5％BSA(对于4G10印记)或3％BIotto/0.5％BSA对氮纤维素薄膜进行阻断，为时至少1小时，然后在4℃下与主要抗体培育过夜。使用的抗体包括抗p(tyr)4G10(1∶5000；UpstateBiotechnology Inc)、抗IRS-1和p85(New England Biolabs，BeverLey，MA)。(3)免疫组织化学

有待进行免疫组织化学评定的实验动物要进行4％多聚甲醛的经心灌注，并将大脑取出，冷冻直至处理前。在弓状核水平区域切下40μm的一个切片，用KPBS(钾缓冲盐溶液，pH7.2)，并在室温下阻断20分钟(溶解在KPBS中的4％正常血清/0.4％Triton X100/1％牛血清白蛋白，Fraction V，Sigma)。在4℃下，自由漂动的切片与做1∶1000稀释的鼠抗p(tyr)抗体(4G10)培育过夜以检测p(tyr)蛋白，冲洗，然后与在缓冲液(KPBS/0.02％Triton X-100/1.0％ BSA)中做1∶1500稀释的生物素化的马抗鼠抗体共培育，随后与抗生物素蛋白过氧化物酶(在PBS中做1∶500稀释；Vector Elite Kit，VectorLaboratories，Burlington，CA)共培育，这两次培育都是在室温下，为时60分钟。在每个步骤中间，切片要用PBS完全冲洗，通过二氨基联苯胺(Sigma St Louis，MO)反应将与组织相连的过氧化物酶固定在明胶包被的载波片上，脱水并加盖玻片使之可进行观察。结果

(1)对db/db实验动物进行每日Ax-15处理比能量限制显著引起了体重损失。对db/db鼠或他们的杂合同窝鼠每天进行Ax-15(0.1或0.3mg/kg)或载体注射(s.c.)，为期10天。对以组载体治疗动物(pair-fed)的饮食限制为最高剂量Ax-15处理组的鼠的饮食量。图23展示了实验结果。每天报道平均组体重+/-SEM(n＝12)。Ax-15(0.1 & 0.3

m/kg/天，为期10天)外周给药显著减少了食物摄取并以剂量依赖的方式减轻了体重(BW)。对最高剂量的检测来讲，对BW的效用要大于能量限制引起的效用(c.f pairfed vehicle db/db；PF)，并且它与附睾脂肪量(25％)和肝脏质量(35％)有关，但对肌肉质量没有产生影响。

(2)对db/db实验动物为期10天的Ax-15出对葡萄糖耐受产生的影响。对接受载体处理(开放正方形)、pair-fed载体处理(填充菱形)和Ax-15处理(0.1mg/kg/天，开放三角形；0.3mg/kg/天，填充三角形)的db/db雄性鼠和年龄相当的杂合db/？鼠(填充圆形)进行了口服葡萄糖耐受性检验(OGTT)。图24展示了这个实验的结果。每个点代表至少十二只实验动物+/-SEM。相对于载体处理组的水平，他们的空腹血浆葡萄糖(65％)、胰岛素(53％)和NEFA(23％)水平都有下降。口服葡萄糖耐受性检验表明在葡萄糖耐受性方面有一种剂量依赖性的提高，曲线内的区域与PF和载体对照组有显著的不同。

(3)对db/db实验动物进行低剂量Ax-15处理引起实验动物体重的显著损失。对实验动物每天注射(s.c.)Ax-15(0.0125，0.025或0.05mg/kg)或载体，为期10天。每天报道平均组体重+/-SEM(n＝6)。正如图23C中所示，实验动物体重以一种剂量依赖方式减轻。

(4)db/db实验动物的低剂量Ax-15处理对实验动物葡萄糖耐受性的影响体。对接受载体(开放正方形)和Ax-15处理(0.0125，0.025或0.05mg/kg)的db/db雄性鼠进行口服葡萄糖耐受性检验(OGTT)。每个点代表至少6只实验动物+/-SEM.的平均值。正如图23D所示，血浆葡萄糖浓度以剂量依赖性方式降低，0.05m/kg剂量时限食了血浆葡萄糖浓度的最大降低。

(5)Ax-15处理的效用的时间变化。相对于载体处理(开放正方形)、pair-fed载体处理(填充菱形)，Ax-15处理(0.3mg/kg/天；填充三角形)对db/db雄性鼠非禁食血清血糖的影响的时间变化。每个点代表在最后注射14小时后至少6只实验动物+/-SEM。正如图24总所示，相对于载体处理或pair-fed载体处理鼠，第3天的Ax-15显著降低了非禁食血清血糖。

(6)对db/db实验动物进行为期10天的Ax-15处理产生的生理后果。图25A-25C展示了实验结果，这个实验时设计来对db/db实验动物进行为期10天Ax-15处理产生的生理后果进行评价的。图25A：相对于对照组、载体处理组(开放条状)、pair-fed载体处理(阴影线条状)组鼠以及年龄相似的杂合db/？鼠(点状)相比，对进行了为期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，阴影形条状)处理的db/db雄性鼠血清的空腹血糖浓度进行了确定。每个条代表了至少8只实验动物的平均值+/-SEM。图25B：相对于对照组、载体处理组(开放条状)、pair-fed载体处理(阴影线条状)组鼠以及年龄相似的杂合db/？鼠(点状)相比，对进行了为期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，阴影形条状)处理的db/db雄性鼠血清的空腹胰岛素浓度进行了确定。每个条代表了至少8只实验动物的平均值+/-SEM。图25C：相对于对照组、载体处理组(开放条状)、pair-fed载体处理(阴影线条状)组鼠以及年龄相似的杂合db/？鼠(点状)相比，对进行了为期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，阴影形条状)处理的db/db雄性鼠血清的空腹脂肪酸水平进行了确定。每个条代表了至少8只实验动物的平均值+/-SEM。

(7)Ax-15处理对db/db鼠弓状核中胰岛素刺激的p(tyr)免疫反应性的影响。对杂合(db/？)鼠进行的免疫染色表明，相对于载体注射组的水平(图26A)，在为时30分钟的胰岛素大丸剂给药(1IU，经由颈静脉)后，弓状核的p(tyr)免疫反应染色神经元数量有所增长(图26B)。这个结果反映出弓状核神经元可能表达胰岛素受体和其底物(例如IRS-1)，这两种物质在胰岛素结合后都进行了磷酸化。对胰岛素具抗性的/患有糖尿病的db/db鼠(载体处理10天)进行的分析揭示了一个在胰岛素处理后(25D)具有检测不到的变化的组成性高p(tyr)免疫活性染色模式(Figure 26C)。对db/db鼠进行的为期10天的Ax-15处理减少了高基底部1p(tyr)反应性(图26E和26G)并保留了胰岛素p(tyr)的敏感性(Figure 26F and 26H)。

(8)Ax-15处理对db/db鼠肝脏中胰岛素刺激的信号的影响。图27A-27B展示了实验结果，这些实验时设计来评价Ax-15处理对db/db鼠肝脏中胰岛素刺激的信号的影响的。对雄性db/db鼠进行了为期10天的载体(7和8泳道)、pairfed到药物处理水平(1和2泳道)或Ax-15(0.1mg/kg/天，泳道5 & 6；0.3mg/kg/天，泳道4 &5).处理。在第11天利用戊巴比妥和从门静脉注射盐水(-)或1IU普通胰岛素，使动物麻醉。1分钟后将肝脏取出，利用抗p(tyr)特异性抗体4G10对蛋白提取物进行免疫沉淀，随后利用一种抗血清对p85调节亚基PI3-激酶进行标准的Western blot分析(图27A)；利用IRS-1特异性抗血清对蛋白提取物进行免疫沉淀，紧接着利用抗p(tyr)特异性抗体进行标准的Western blot分析(图27B，上部)以及利用一种IRS-1-特异性抗血清(图27B，底部)对蛋白提取物进行免疫沉淀。以与免疫沉淀和印记对照组相同的方法对非免疫对照免疫沉淀(NI)、无裂解物对照(NL)以及p85的3T3-L1裂解物对照(C)进行的电泳。

对Ax-15处理过的鼠外周组织的胰岛素作用分析显示了增强的特定底物(IRS-1)的酪氨酸磷酸化作用，也增强了与p(tyr)相关的PI3激酶对急性i.v.胰岛素大丸剂的响应。在CNS的弓状核水平进行的免疫组织化学评定表明Ax-15处理降低了升高的基底部p(tyr)水平并保留了胰岛素刺激的p(tyr)，而这种升高的p(tyr)水平在载体处理的db/db中可观察到。这些数据表明，在对缺乏leptin受体的功能性长型(即db/db)的实验动物进行Ax-15处理后，提高了外周葡萄糖耐受性，并保留了外周和中枢的胰岛素依赖性信号级联反应。

这些结果表明Ax-15具有在由体重损失单独引起的效用过程中和其效用之上使葡萄糖代谢正常化的能力，也暗示了CNTF或其变体在患有异常葡糖代谢如胰导功能亢进、低血糖或糖尿病，尤其是II型糖尿病或非胰岛素依赖型(NIDDM)糖尿病的病人葡糖代谢正常化中的有效性。

虽然前述的发明的许多细节是通过图示和例解的方式来描述的，其目的是给以清晰的理解，按照本发明的教义，对于本领域中的普通熟练技术人员来讲，本发明很容易理解的，并且在不偏离附加权利要求的前提下可对其做特定的变动与修改。

Claims

1.修饰的睫状神经营养因子Ax-15在一种药剂的制造中的应用，而这种药剂用于哺乳动物糖尿病的治疗。

2.权利要求1中的应用，其中的糖尿病是非胰岛素依赖性糖尿病或妊娠期糖尿病。

3.权利要求1或2中的应用用于减轻胰岛素抗性或提高胰岛素敏感性。

4.修饰的睫状神经营养因子Ax-15在一种药剂的制造中的应用，而这种药剂用于降低哺乳动物血清中的游离脂肪酸。

5.修饰的睫状神经营养因子Ax-15在一种药剂的制造中的应用，而这种药剂用于哺乳动物内分泌系统疾病和失调的治疗。

6.修饰的睫状神经营养因子Ax-15在一种药剂的制造中的应用，而这种药剂用于在防治哺乳动物非胰岛素依赖性糖尿病和妊娠期糖尿病发生。

7.前述任一权利要求中的应用，其中该哺乳动物是人。

8.前述任一权利要求中在药剂制造方面的应用，这些药剂是通过选自静脉内、皮下、肌肉内、鞘内(intrathecal)、intracerebroventricular、intraperitoneal以及实质内(intraparenchymal)给药的药物传递途径来给药的。

9.权利要求8中的应用，其中的给药是通过植入可释放Ax-15的细胞来实现的。

10.前述任意权利要求中的应用，其中的Ax-15是PEG化的。

11.治疗哺乳动物糖尿病的方法，包括对哺乳动物给药以包含在载体中的修饰的睫状神经营养因子Ax-15。

12.权利要求11中的方法，其中的糖尿病是非胰岛素依赖性糖尿病或妊娠期糖尿病。

13.降低哺乳动物胰岛素抗性的方法，包括对哺乳动物给药以包含在载体中的修饰的睫状神经营养因子Ax-15。

14.提高哺乳动物胰岛素敏感性的方法，包括对哺乳动物给药以包含在载体中的修饰的睫状神经营养因子Ax-15。

15.降低哺乳动物血清游离脂肪酸水平的方法，包括对哺乳动物给药以包含在载体中的修饰的睫状神经营养因子Ax-15。

16.治疗内分泌系统疾病和病症的方法，包括对哺乳动物给药以包含在载体中的修饰的睫状神经营养因子Ax-15。

17.预防哺乳动物妊娠期糖尿病和非胰岛素依赖型糖尿病发生的方法，包括对哺乳动物给药以包含在载体中的修饰的睫状神经营养因子Ax-15。

18.包括包含在载体中的修饰的睫状神经营养因子Ax-15的组合物，其可用于治疗哺乳动物糖尿病。

19.包括包含在载体中的修饰的睫状神经营养因子Ax-15的组合物，其可用于降低哺乳动物血清中游离脂肪酸水平。

20.包括包含在载体中的修饰的睫状神经营养因子Ax-15的组合物，其可用于治疗哺乳动物内分泌系统疾病和失调。

21.包括包含在载体中的修饰的睫状神经营养因子Ax-15的组合物，其可用于预防哺乳动物妊娠性糖尿病和非胰岛素依赖性糖尿病发生。