CN101573136A - αB晶体蛋白用作炎症治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供炎症疾病的治疗方法，该方法包括给予对象有效量的能提供αB晶体蛋白活性的药物，所述剂量能有效抑制或防止疾病的发生、发展或复发，包括抑制或防止已患疾病的发展。在某些实施方式中，本发明方法包括给予原先已存在炎症疾病的对象有效量的αB晶体蛋白来抑制或防止疾病的复发。

Description

αB晶体蛋白用作炎症治疗剂

发明背景

αB晶体蛋白(αBC)是小热激蛋白家族的成员之一，发现其在眼晶状体中含量很高。αBC与αA、β和γ-晶体蛋白一起形成了脊椎动物眼晶状体的主要水溶性结构蛋白，能产生所需的折光率。研究提出α晶体蛋白也涉及分子伴侣作用，能结合去折叠展开的变性蛋白质而抑制晶状体的非特异性凝聚并维持其透明度。令人感兴趣的是，敲除αBC基因的裸小鼠具有正常的晶状体，表明这种晶体蛋白不是透明晶状体发育所必需。除了眼晶状体外，成人心肌和骨骼肌中αBC的含量水平也高，而肾、肺、中枢神经系统(CNS)胶质、肝和发育的心脏及体节中表达较低。

αBC表达与一些病理状况有关。αBC水平升高见于致癌性恶变和各种神经疾病如亚力山大病(婴儿型脑白质营养不良)、克-雅二氏病(传染性海绵样脑病)、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症和嗜神经性感染疾病的CNS胶质。热激和过渡态金属也可能诱导原代星形胶质细胞表达此种晶体蛋白。

多发性硬化症(MS)是一种病因未明的CNS自身免疫疾病，影响约40万美国人。在MS中，髓鞘的反应活性T细胞进入大脑和脊髓，介导了神经元周围的髓鞘破坏，导致进行性运动功能障碍和最终瘫痪。目前的治疗策略包括将促炎症的Th 1T细胞表型转变为抗炎Th 2应答反应，防止这种致脑炎T细胞渗入脑中，诱导T细胞耐受、无应答或凋亡，以及修复或置换受损的CNS细胞如神经元和少突胶质细胞。

此类疾病的病程变化很大且不可预测。大多数患者，特别是开始为视神经炎的MS患者，缓解期可持续数月至＞10年。然而，某些患者发作频繁并迅速残疾，虽然只有非常严重的病例生命时间才缩短。

治疗目的包括缩短急性恶化期，减少发生恶化的频率和缓解症状；维持患者的步行能力特别重要。可用皮质激素短期疗法治疗急性恶化。然而，虽然皮质激素能缩短急性发作期也许还能减慢疾病发展，但显示不能影响疾病的长期结局。

免疫调节治疗能降低发生急性恶化的频率并延缓最终残疾。免疫调节药物包括干扰素(IFN)如IFN-β1b和IFN-β1a，也可采用乙酸格拉默(glatiramer)。其它可能的治疗方法包括免疫抑制剂氨甲喋呤和能阻止白细胞穿过血脑屏障的一种抗-α₄整联蛋白抗体那他珠单抗(Natalizumab)。免疫抑制剂如霉酚酸酯和环磷酰胺已用于许多严重的进行性MS患者，但有争议。

除了抑制病理性免疫应答反应外，至关重要的是保护CNS细胞免遭进一步损伤和诱导受损伤细胞的修复，因为成年哺乳动物脑中某些细胞如神经元的祖代细胞稀少而有限。

对MS患者的早期研究提示，此病中αBC可能具有自身抗原作用。从MS脑中分离得到的髓鞘包含有单一组分，即位于少突胶质细胞和星形胶质细胞中的αBC，并证明其对MS为高度免疫原显性，能通过诱导增殖和产生IFN-γ而调控T细胞。在用机器测定基因序列制作的MS脑病损大规模转录图谱(Chabas等.(2001)Science 294，1731-5)中也发现早期活性MS患者转录的最丰富基因是αBC。也已发现αBC基因中存在的C249G、C650G和A652G三种多态性与MS易感性和疾病表达有关(van Veen等.(2003)Neurology 61，1245-9)。在MS中αBC的自身抗原作用的其它证据包括：在早期活性MS患者对αBC肽的应答反应中，由CD4+T细胞增殖、产生的IL-2、IFN-γ和TNF均增强(Chou等，(2004)J Neurosci Res 75，516-23)。已提出该蛋白被局部APC摄入向T细胞提呈MHC-II类限制性分子是造成这些损伤的原因。

在例如van Stipdonk等.(2000)J Neuroimmunol 103，103-11；van Stipdonk等.(2000)Cell Immunol 204，128-34；Thoua等.(2000)J Neuroimmunol 104，47-57；和Sotgiu等.(2003)Eur J Neurol 10，583-6(2003)中讨论了αBC在EAE和MS中的作用。

近年来经大量工作确定了应激期间αBC的凋亡作用。αB晶体蛋白显示能保护细胞抵抗热、渗透压和氧化造成的损伤，抵抗十字孢碱(staurosporine)、TNF、冈田酸、过氧化氢、卡西霉素和表鬼臼毒素的攻击。此外，αBC转基因小鼠受到保护能抵抗心肌缺血和重灌注时的心肌凋亡和坏死。

此种保护作用看来是由于抑制了胱冬酶-3的活性。正常时，线粒体通路和死亡受体通路分别激活胱冬酶8和9，此二酶会聚通过蛋白水解激活下游的死亡执行分子(executioner)胱冬酶-3。看来αBC抑制胱冬酶-3通过自身蛋白水解而成熟为中间介质p24，从而抑制此凋亡通路。其他研究显示αBC与Bax和Bc1-Xs相互反应防止了这些促凋亡调节剂转位到线粒体中，而导致下游凋亡活动消除。除了此抗凋亡功能外，近年的工作也证明α-晶体蛋白有抗炎症作用。用α-晶体蛋白预先治疗的小鼠受到保护能抵抗硝酸银引起的神经炎，这是通过其降低新皮质区中GFAP、NF-kB的表达，逆转细胞内钙水平，乙酰胆碱酯酶活性和葡萄糖的消耗，并防止脑中产生氧化亚氮和脂质过氧化产物。

进一步阐明αBC在炎症中的作用是极其令人感兴趣的。

发明概述

本发明提供治疗炎症疾病的方法，所述疾病包括可能是脱髓鞘自身免疫病的神经性炎症疾病，例如多发性硬化症、慢性炎性脱髓鞘多发神经病等等。在其它实施方式中，炎症疾病包括但不限于：类风湿关节炎、动脉粥样硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病和卢高(lou Gehrig)病。本发明的方法包括：给予对象有效量的能提供αB晶体蛋白活性的药物，所述剂量能有效抑制或防止疾病的发生、发展和复发，包括抑制或防止已患疾病的发展。在某些实施方式中，本发明的方法包括给予先前已存在炎症疾病的对象有效量的αB晶体蛋白来抑制或防止疾病的复发。

在某些实施方式中，提供了抑制对象炎症疾病的方法，该方法包括给予对象预防有效量的能特异性提高αB晶体蛋白水平的核酸，例如提供操作性连接有启动子的编码αB晶体蛋白的核酸。在其他实施方式中，提供了抑制对象自身免疫疾病的方法，该方法包括给予对象治疗有效量的αB晶体蛋白多肽，例如重组产生的多肽。此种治疗药物可全身给予如静脉内(i.v)，或局部给予如在炎症损伤部位。

在本发明的某些方法中，所述对象是人。在某些方法中，治疗期间监测患者细胞中的αB晶体蛋白水平，所述细胞选自T细胞、神经元、巨噬细胞、血管内皮细胞、星形细胞或小神经胶质细胞。在某些方法中，所述患者正患炎症疾病，所述方法还包括监测响应αB晶体蛋白给予后患者症状的减轻。

在本发明的某些实施方式中，监测髓鞘反应活性T细胞或其它活化T细胞，如MS患者CSF中的T细胞，或RA患者关节滑膜液中的T细胞中一种或多种细胞因子，如IL-2、IFN-γ和/或IL-7的表达；和p38MAPK与ERK的上调或磷酸化，以确定(例如)此种治疗是否有效降低了这类T细胞的活化。

附图的简要说明

图1.αBC^-/-小鼠发生了临床上严重的EAE伴有免疫细胞活化增强、CNS炎症和神经胶质细胞死亡。(A)平均值±标准差。用MOG 35-55免疫后不同天数时WT(□)和αBC^-/-(■)小鼠的临床评分。^*表示用Mann-Whitney U统计学检验与WT组相比有显著性差异(p＜0.05)。(B)患EAE的WT(□)和αBC^-/-(■)小鼠淋巴结细胞和脾细胞的增殖速率和(C)促炎症细胞因子IFN-γ、TNF、IL-2、IL-12p40、IL-17的分泌。(D-J)对取自EAE WT(D，G，I)和αBC^-/-(E-F，H，J)的小鼠42天时脊髓作石蜡包埋切片，免疫染色显示已切割的胱冬酶-3(D-F)、未切割的胱冬酶-3(G，H)和TUNEL(I，J)。(D-E，G-H)20X倍放大；(F)40X倍放大；(I，J)75X倍放大。箭头指出的胶质细胞为已切割胱冬酶-3(F)和TUNEL(I，J)免疫染色阳性。

图2.αBC^-/-EAE小鼠的T细胞是超反应性细胞。(A)用经放射线照射过的同基因脾细胞和MOG 35-55肽刺激WT(□)和αBC^-/-(■)EAE小鼠的分离CD3+T细胞，测定其增殖速率(cpm)和Th1细胞因子(IFN-γ，IL-2)，Th17细胞因子(IL-17)及IL-10的分泌(pg/ml)。(B)用经放射线照射过的同基因脾细胞和MOG 35-55肽刺激1小时后，WT和αBC^-/-EAE小鼠CD3+T细胞p-38和磷酸化-p38表达的免疫印迹图。

图3.αBC缺陷巨噬细胞是超反应性细胞。(A)体外用LPS刺激后WT(□)和αBC^-/-(■)小鼠巨噬细胞产生的细胞因子(IL-1β、TNF、IL-6、IL-12p40、IL-10)(pg/ml)。(B)用LPS刺激后72小时WT和αBC^-/-缺陷小鼠巨噬细胞中p38和磷酸化-p38表达的免疫印迹分析。

图4.αBC^-/-小鼠的星形细胞对细胞死亡更敏感并增强了ERK和NF-κB信号转导。(A)TNF刺激后48小时WT(□)和αBC^-/-(■)小鼠星形细胞产生的IL-6。(B)TNF刺激后48小时WT和αBC^-/-小鼠星形细胞中NF-κB p50和NF-κB p65的DNA结合活性。(C)TNF刺激后72小时WT和αBC^-/-缺陷小鼠星形细胞中表达的αBC、磷酸化-αBC、已切割和未切割的胱冬酶-3、p-38、磷酸化-p-38、ERK、磷酸化-ERK、NF-κB p105/p50、NF-κB p65和IκB-α分子。

图5.髓鞘抗原的分布分析证明抗体是针对RRMS患者的αBC。对RRMS患者和OND对照患者进行了髓鞘(抗原)分布分析。采用统计学算法SAM鉴定到RRMS的抗体反应活性与OND对照样品相比有显著差异，用等级群集算法排列样品与命中的髓鞘抗原，结果显示为热点图。RRMS患者显示针对各种髓鞘蛋白表位(包括αBC蛋白和肽)的自身抗体反应活性显著升高。

图6.重组αBC能抑制EAE临床疾病症状和炎症。(A)用MOG 33-35和百日咳毒素免疫后不同天数，以重组αBC(■)或PBS pH 7.0(□)治疗的WT EAE小鼠的临床平均评分。(B)以重组αBC(■)或PBS(□)治疗EAE小鼠25天时取得的脾细胞的增殖速率(cpm)和产生的细胞因子(pg/ml)。^*表示用Mann-Whitney U统计学检验与WT组相比有显著性差异(p＜0.05)。

图7.急性和进行性EAE中，αBC^-/-小鼠的炎症/脱髓鞘病变更为严重。将从患EAE的WT(A，B)和αBC^-/-(C，D)小鼠14天(A，C)和42天时(B，D)取得的脊髓作石蜡包埋切片，用勒克司光兰(luxol fast blue)和苏木精-伊红染色，1640X倍放大。

图8.急性EAE时αBC^-/-小鼠表达了较高的已切割胱冬酶-3。将从患EAE的WT(A，B)和αBC^-/-(C，D)小鼠14天时取得的脊髓作石蜡包埋切片，对已切割胱冬酶-3(B，D)和未切割胱冬酶-3(A，C)作免疫染色。20X倍放大。

图9.用αBC治疗的EAE小鼠其脊髓中TUNEL阳性细胞较少。对用PBS(A，B)和重组αBC(C，D)治疗的EAE WT小鼠32天时取得的石蜡包埋脊髓切片作TUNEL染色。160X倍放大。

图10.参与炎症的通路的示意图。

图11.在胶原蛋白诱导的关节炎模型中用αB晶体蛋白治疗已建立的自身免疫性关节炎。用弗氏完全佐剂乳化的II型牛胶原蛋白诱导，21天后用弗氏不完全佐剂和II型牛胶原蛋白加强免疫，使DBA/1小鼠产生胶原诱导的关节炎(CIA)。小鼠产生临床关节炎(脚爪平均增厚大约1.95mm)后，将关节炎小鼠随机分组，分别接受αBC(10μg重组人αBC(美国生物公司(US Biological)，马萨诸塞州斯沃斯考特(Swampscott，MA))；盐水稀释液)、肌球蛋白对照(10μg)或PBS(盐水对照)隔天治疗。用αBC治疗已患关节炎的小鼠，统计学分析显示其关节炎的严重程度比用肌球蛋白或PBS对照治疗的小鼠轻(P＜0.05)。

图12.αBC治疗减轻了已建立CIA的滑膜炎、血管翳和骨破坏。用αBC或PBS治疗CIA小鼠，治疗后处死小鼠收集后爪作盲法组织学分析。由盲法评审员评估后爪关节切片的滑膜炎(炎症)、血管翳(滑膜层生长)和骨破坏(骨侵蚀)程度。αBC治疗的CIA小鼠显示滑膜炎、血管翳和骨破坏有统计学意义的减少(p＜0.05)，进一步证明了αBC治疗的效果。

图13.经αBC治疗CIA小鼠脾细胞增殖和促炎细胞因子分泌减少。用弗氏完全佐剂乳化的II型牛胶原蛋白诱导，21天后用弗氏不完全佐剂和II型牛胶原蛋白加强免疫，使DBA/1小鼠产生胶原诱导的关节炎(CIA)。小鼠产生临床关节炎后，开始用重组αBC治疗，或用PBS对照治疗。2周后处死收集脾细胞用ConA刺激(X轴为剂量)。以³H-胸苷掺入量(A)，ELISA测定的TNF(B)、IL-10(C)和IFN-γ(D)产生量来衡量增殖反应。用αBC体内治疗的CIA小鼠脾细胞增殖反应(A)和促炎细胞因子产生(B，D)减少。

图14.在RA的滑膜组织中αBC高水平表达。征得受试人同意和协议得到斯坦福大学批准后，在RA患者和OA患者进行关节成型术时，获取手术剩余的滑膜组织。固定此滑膜组织，石蜡包埋并切片。用抗αBC特异性抗体及同种型匹配的对照抗体对切片进行免疫组化分析，显示在RA滑膜中有高水平的αBC蛋白表达，OA滑膜则没有。

图15.αBC能保护海马神经元避免Aβ诱导的凋亡。

发明详述

在描述本发明方法之前，应理解本发明不受所述的具体方法限制，许多具体方法当然是可以改变的。也应理解，本文所述的术语目的只是为了描述具体的实施方式，不意味限制，本发明的范围只受所附权利要求书的限制。

当提到数值的范围时，除非文中另有明确叙述，该范围的上限与下限之间以下限单位的十分之一计的各个中间值，和所述范围内的任何其它所述值或中间值，均包括在本发明范围内。这些较小范围的上下限可独自包括在从属于所述范围特地排除的任何限度以外的较小范围内。本文和所附权利要求书中所用的单数形式“一种”和“这种”包括其复数，除非另有明确叙述。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同含义。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料来实施或检验本发明，但现在所述的是优选的方法和材料。本文提到的纳入本文作为参考的所有出版物公开和描述了与引用出版物相关的方法和材料。

提供本文所述的出版物只是因为它们的发表先于本申请提交日。不能将本文的任何内容解释为承认本发明不能授权是由于这类出版物的公开先于本发明。还有，本文提供的公开日可能不同于实际公开日，这需要独立确认。

αBC晶体蛋白的“活性”指该蛋白可执行的任何酶解功能或结合功能。

“相当的细胞”指该细胞的类型与相比较的另一种细胞相同。相当的细胞的例子是同一细胞系的细胞。

“可表达的核酸”指编码感兴趣核酸和/或感兴趣蛋白质的核酸，此种核酸可以是表达载体、质粒或其它构建物，当将其置于细胞内时，允许此感兴趣的核酸或蛋白质的表达。表达载体和质粒是本领域熟知的。

“抑制”疾病发作指降低疾病发作的可能性，或预防疾病全面发作。在优选实施方式中，抑制疾病发作指防止其全面发作。本文所用的发作指经历疾病复发后缓解的患者又发作疾病。本发明的方法特别可用于诊断为自身免疫病的患者。治疗的目的是治疗或防止导致已有疾病恶化的复发。

“抑制”细胞中某基因的表达指降低该基因表达的程度，或完全防止其表达。

“核酸”指任何核酸分子，包括但不限于DNA、RNA及其杂合体。组成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U以及它们的衍生物。这些衍生物是本领域熟知的，实例参见“PCR系统、试剂和消耗品(PCR Systems，Reagents and Consumables)”(PK目录(Perkin Elmer Catalogue)1996-1997，罗氏分子系统有限公司(Roche Molecular Systems，Inc.)，美国新泽西州的布朗伯克(Branchburg，N.J.，USA))。

“αB晶体蛋白”指GenBank登录号BT006770和Dubin等(1990)Genomnics7：594-601所述的mRNA序列编码的人蛋白及其所有的可用于本文的天然变体和同系物，及此蛋白的所有抗原性片段。此晶体蛋白包括约90％的可溶性脊椎动物眼晶状体蛋白，包括3个主要的遍在表达的晶体蛋白家族：α、β和γ。αB晶体蛋白是小热激蛋白家族的成员。人的CRYAB基因编码175个氨基酸的蛋白质，分子量20kD。α晶体蛋白的亚单位αA和αB本身或相互间可形成寡聚体。有报导说αA(或αB)与β-B2或γ-C-晶体蛋白之间有相互作用，但相互作用的强度大大低于αA-αB相互作用。用N-和C-末端区截短的突变蛋白做实验，显示N-和C-末端区对αA晶体蛋白自身相互作用至关重要，但对αB晶体蛋白自身相互作用至关重要的主要是C-末端区。

αB晶体蛋白的活性片段具有与全长αB晶体蛋白相同的功能或结合特性。

αB晶体蛋白的表位片段能结合与全长αB晶体蛋白相结合的单克隆抗体。

“αB晶体蛋白相关疾病”指αB晶体蛋白表达致病的任何疾病。

αB晶体蛋白过度表达，指其表达水平高于正常个体人群的平均值加一个标准差。优选其表达水平至少是正常个体人群平均值的10倍。

就第一核酸而言，与核酸“特异性杂交”指该第一核酸与第二核酸杂交的亲和力比与任何其它核酸都高。

“特异性抑制”某蛋白质的表达指对该蛋白表达的抑制(a)高于任何其它蛋白的表达，或(b)高于几乎10种或较少种其它蛋白的表达。

“对象”或“患者”指任何动物，如人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、豚鼠或家兔。

“适当的条件”含义取决于运用此术语时的上下文内容。即当与抗体联用时，此术语指允许抗体结合其相应抗原时的条件。当此术语与核酸杂交联用时，指允许长至少15个核苷酸的核酸与其互补序列杂交的条件。当与使某试剂接触细胞联用时，此术语指允许该试剂接触从而进入细胞执行其功能的条件。在一实施方式中，术语“适当的条件”本文中用于指生理条件。

术语“炎症”应答反应指产生的体液(抗体介导)和/或细胞(抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)应答反应，包括产生针对αB晶体蛋白的成分。“免疫原”是当给予哺乳动物或由于自身免疫疾病，能诱导产生针对其本身免疫应答反应的成分。

术语“裸多聚核苷酸”指未与胶质形成复合物的多聚核苷酸。有时将裸多聚核苷酸克隆在质粒载体中。

术语“佐剂”指当与某抗原一起给予时能促进对此抗原产生免疫应答，但单独给予不能产生对此抗原免疫应答的化合物。佐剂可通过多种机制增强免疫应答，包括募集淋巴细胞、激活B和/或T细胞，及激活巨噬细胞。

除非文中另有所说明，本发明的所有元件、步骤或特征与其它元件、步骤或特征可以任何组合使用。

分子和细胞生物化学的通用方法可参见标准教课书，如“分子克隆：实验室手册”第3版(Sambrook等.，Harbor Laboratory Press 2001)；“分子生物学简便实验草案(Short Protocols in Molecular Biology)”第4版(Ausubel等编.，JohnWiley&Sons 1999)；“蛋白质方法(Protein Methods)”(Bollag等，John Wiley &Sons 1996)；“基因治疗用的非病毒载体(Nonviral Vectors for GeneTherapy)”(Wagner等编，Academic Press 1999)；“病毒载体”(Kaplift & Loewy编.，Academic Press 1995)；“免疫学方法手册”(I.Lefkovits编.，Academic Press 1997)以及“细胞和组织培养：生物技术实验操作(Cell and Tissue Culture：LaboratoryProcedures in Biotechnology)”(Doyle & Griffiths，John Wiley & Sons 1998)。与本文内容有关的用于基因操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商品销售公司如BD公司(BioRad)、斯塔吉公司(Stratagene)、英吉公司(Invitrogen)、西格玛阿尔得里奇公司(Sigma-Aldrich)和克隆技术公司(ClonTech)购得。

通过本发明人发现的或提出的具体实施方式描述了本发明包含的实施本发明的优选方式。本领域技术人员将理解，就本文公开的内容而言，可对所例举的具体实施方式作出许多修改和变化而不背离本发明的范围。例如，由于密码子的简并性，可改变潜在的DNA序列而不会影响蛋白质序列。还有，考虑到生物学功能相同性，对蛋白质结构作出的改变应不影响其生物学功能的类型和数量。所有这些修改均包括在本发明所附权利要求书的范围内。

采用所述方法目的是预防或治疗。如本文所用，术语“治疗”用于指防止复发和治疗现有疾病二者。例如，可在疾病复发之前给予药物来预防自身免疫疾病。治疗现有疾病，指这种治疗可稳定或改善患者的临床症状，这是特别令人感兴趣的。

本发明提供治疗炎症疾病的方法。炎症疾病包括：神经炎性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、卢高病等；和脱髓鞘疾病，如多发性硬化症、慢性炎性脱髓鞘多发神经病等；以及炎症疾病，如类风湿关节炎。本发明方法包括给予对象能提供αB晶体蛋白活性的有效量药物以抑制或预防疾病的发生、发展或复发。

如本文所示，αB晶体蛋白具有多种功能，可通过抑制促炎细胞因子的产生治疗炎症疾病。也可获得对神经细胞的治疗效益，包括保护CNS细胞避免进一步损伤；诱导CNS细胞如神经元和胶质前体细胞的修复避免损伤和死亡；抑制T细胞和巨噬细胞增殖。

在某些治疗方法中，将αBC编码序列引入细胞中以上调αBC表达，此类细胞可以是免疫细胞、神经系统细胞等。或者，给予对象治疗有效量的αB晶体蛋白多肽、或其活性片段或衍生物，来治疗该对象的自身免疫疾病。

在本发明中，可用该领域技术人员已知的各种方法和递送系统给予本发明的组合物。实施给药可通过例如静脉内、口服、通过植入、透粘膜、透皮、肌肉内、鞘内和皮下途径。给予本发明组合物的采用常规使用的药物载体的以下递送系统只是设想的许多实施方式的代表。

疾病的分析和治疗

发现本发明的组合物和方法可联合用于各种炎症疾病，包括神经炎性疾病、复发性自身免疫病和复发性神经炎性疾病。

免疫组化和分子生物学证据表明大脑能发生免疫应答反应，结果可能损伤宿主细胞。大脑不是免疫特免区域，而可能是特别脆弱的区域，因为神经元是有丝分裂期后的细胞，它们不能再分化，因此一旦受损后它们不能复制再生。已得到广泛研究的阿尔茨海默病(AD)证明其大脑慢性炎症反应特别强，而且有证据表明在帕金森病(PD)和ALS以及自身免疫神经疾病如MS、EAE等中大脑受患区域也可发生局部免疫反应。这些反应可涉及由局部神经元和胶质细胞，特别是常驻的吞噬细胞(在大脑中是小胶质细胞)产生的炎症组分。补体系统、小胶质细胞和炎性细胞因子看来起着关键作用。

炎性神经疾病包括多发性硬化症(MS)，其特征是CNS机能障碍产生的各种症状和体症，缓解-复发而恶化。最常见的症状是一条或多条肢体、躯干或一侧面部感觉异常；腿或手软弱或笨拙；视觉障碍如一只眼部分失明和疼痛(球后视神经炎)、视力不清或有盲点。其它常见的早期症状是眼原性麻痹导致的复视，一条或多条肢体短时软弱，四肢轻度僵硬或不寻常的易疲劳，轻度步态失调，膀胱排尿控制困难，眩晕和轻度情绪障碍；所有这一切表明有散在的CNS病变参与，常常在认识到此病之前已发生了数月或数年。过度发热可加重症状和体症。

大多数患者的病程变化很大，不可预测且忽重忽轻。起初可能表现为数月或数年的缓解，特别是以球后视神经炎开始发病时。然而，某些患者发作频繁而迅速残疾；少数患者的病程可能发展迅速(原发性进行性MS、PPMS)。复发-缓解性MS(RR MS)的临床特征是在数月至数年中发生病情复发和缓解，两次发作之间的神经缺陷能部分或完全恢复。这些患者表现为每年发作或复发大约一次。在10-20年间，约50％的RR MS患者发生了继发性进行性MS(SP MS)，其特征是两次发作之间的恢复不完全，神经缺陷的累积导致残疾程度加重。

通过临床、射线(磁共振[MR]扫描有大脑空斑)检查推导可间接作出诊断，实验室检查(CSF分析有寡克隆条带)贡献较少。典型病例常常可根据临床表现作出肯定诊断。第一次发作后的诊断可能有怀疑，此后，缓解和恶化病史以及散布在一个以上区域的CNS病损临床证据具有很高的提示性。

最灵敏的诊断影象学技术MRI可能显示有大脑空斑。也可检测出脊髓与脑髓质连接处的能治疗的非脱髓鞘病损(如蛛网膜下腔囊肿、枕骨大孔肿瘤)，它们有时会引起各种波动的运动和感觉神经症状谱，类似于MS。钆-对比增强可以区分旧脑空斑的活性炎症区域。在对比-增强CT扫描图上也可见MS病损；给予二倍剂量的碘和延迟扫描(双倍剂量延迟CT扫描)可提高检测灵敏度。

MS的治疗包括给予干扰素β(Avonex，Betaseron，Rebif)、考帕西通(Copaxone)(乙酸格拉默)和抗-VLA4(Tysabri，那它珠单抗)，它们能降低复发率，迄今只显示对疾病发展有适度影响。也可用免疫抑制剂治疗MS，包括甲基氢化泼尼松、其它类固醇、氨甲喋呤、克拉屈滨和环磷酰胺。治疗MS的许多生物制剂如抗-IFNγ抗体、CTLA4-Ig(Abetacept)、抗-CD20抗体(Rituxan)和其它抗细胞因子药物正在临床开发中。

外周神经病变包括：格-巴二氏综合征(GBS)，及其亚型急性炎性脱髓鞘多发性神经根神经病、急性运动轴突神经病、急性运动和感觉轴突神经病、米勒-费希尔(Miller Fisher)综合征和急性全植物神经失调症；慢性炎性脱髓鞘多发性神经病(CIDP)，及其亚型经典CIDP、CIDP伴糖尿病、意义未确定的CIDP/单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、感觉神经CIDP、多病灶运动神经病(MMN)、多病灶获得性脱髓鞘感觉和运动神经病或露易斯-桑那(Lewis-Sumner)综合征、多病灶获得性感觉和运动神经病，及末梢获得性脱髓鞘感觉神经病；IgM单克隆丙种球蛋白病及其亚型瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)巨球蛋白血症、髓鞘相关和糖蛋白相关的丙种球蛋白病、多神经病、器官巨大症、内分泌疾病、M-蛋白皮肤改变综合征、混合性冷球蛋白症、步态共济失调症、迟发性多发神经综合征和MGUS。

帕金森病是一种特发性发展缓慢的退变性CNS疾病，特征是动作迟缓和减少、肌肉强直、静止性震颤和姿态不稳定。作出临床诊断。用左旋多巴+卡比多巴、及其它药物治疗，顽固症状可用外科手术。在帕金森病中，黑质、蓝斑和其它脑干多巴胺能细胞群的色素神经元损失。突入尾状核和硬膜中的黑质神经元损失，耗尽了这些区域中的多巴胺。

已证明在PD和家族性PD的黑质细胞内向心性多层的圆形小体(lewybodies)和少突神经胶质上存在有补体蛋白，包括补体膜攻击复合体的所有组分。已将这种少突神经胶质描述为补体攻击的少突神经胶质。

不仅在特发性PD，而且在家族性PD的黑质和新纹状体中，以及在帕金森-痴呆的关岛(Guam)复合体中均发现了丰富的反应活性小神经胶质细胞。在PD的6-羟基多巴胺和MPTP动物模型的基底神经节中发现了反应活性小神经胶质细胞，有几份报导说抗炎治疗抑制了这类动物模型的多巴胺能神经毒性。经典补体级联反应可通过产生各种炎性细胞因子和嗜铬粒蛋白A(报导说其产生于PD的黑质中)激活小神经胶质细胞。

已发现在PD患者的基底神经节和CNS中IL-1β、IL-6和TNFα水平升高。也已报告在PD患者的黑质中存在TNF-α和/或IL-1β免疫反应活性的神经胶质细胞。

阿尔茨海默病引起进行性认知退化，其特征是大脑皮层和皮层下灰质有老年斑、β-淀粉样沉积物和神经原纤维缠结。大多数病例是散发的，发作迟(60岁以上)，病因不清楚。然而约5-15％为家族性；这些病例中的一半发作早(小于60岁)，通常与特定基因突变相关。典型病变为胞外β-淀粉样沉积、胞内神经原纤维缠结(成对的螺旋状纤丝)和产生老年斑，神经元损失。常见脑皮层萎缩，脑葡萄糖利用率减少。顶叶、颞叶皮质和额前叶皮质血液灌注减少。

阿尔茨海默病(AD)的一个特征是强烈的炎症反应伴胞外淀粉样β-蛋白(Aβ)沉积。AD大脑中参与炎症反应的优势免疫细胞是小神经胶质细胞。小神经胶质细胞的激活通过分泌促炎细胞因子，如IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α以及其它神经毒因子而导致神经退变。流行病学研究表明，采用非类固醇抗炎药治疗的患者发生AD的风险降低，提示炎症可能促进病情发展。

肌萎缩侧索硬化症(ALS)：ALS(高卢病，夏科(Charcot)综合征)是最常见的运动神经元疾病。患者有随机的不对称症状，包括痉挛、虚弱和手(最常见)或脚肌肉萎缩。肌纤维自发性收缩、痉挛、深腱反射过度活跃、伸肌跖反射、笨拙、四肢运动强直、体重减轻、疲劳、和面部表情和舌头迅速移动控制困难。其它症状包括声音嘶哑、吞咽困难、言语不清、液体饮用窒息倾向。此病后期可发生不适当的无意识、不能控制的大笑或哭泣(假延髓病作用)。呼吸肌衰竭常常导致死亡。

实验证据支持在ALS神经退变模型中引起运动神经元死亡的是非神经元细胞如小神经胶质细胞。此病病程中，脊髓小神经胶质细胞可能被激活而获得氧化性损伤附近大分子和ALS炎症组织中回巢细胞的能力。也已发现在人散发性ALS病例死亡后的脊髓中小神经胶质细胞、NADPH氧化酶上调和蛋白质羰基化的证据，这也支持发生炎症介导的氧化损伤是流行性非家族性ALS散发形式的ALS的病理学标志的结论。

类风湿关节炎是一种慢性综合征，特征是常见外周关节对称炎症，可导致关节和关节周围结构的进行性破坏，伴有或没有全身症状。原因未明。已鉴定到遗传倾向并且在白人群体中定位于II型组织相容性基因的HLA-DR β1基因座的五肽。环境因素也起作用。多种因素可引起免疫学变化。此病影响了所有人群的约0.6％。妇女比男人发病多2-3倍。任何年龄均可发病，常见于25-50岁。

显著的免疫异常可能是其发病的重要原因，包括在关节液细胞中发现有免疫复合物和血管炎。浆细胞产生的抗体导致产生这些复合物。浸润滑膜组织的淋巴细胞主要是能产生促炎细胞因子的T辅助细胞。在患病滑膜中巨噬细胞及其细胞因子(如肿瘤坏死因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)也很丰富。升高的粘附分子导致炎性细胞迁入并停留在滑膜组织中。疾病早期主要是巨噬细胞衍生的内膜层细胞增加，伴有某些淋巴细胞和血管变化。

在慢性患病的关节中，由于滑膜内层细胞数量和大小增加和淋巴细胞及浆细胞的定居，通常精细的滑膜产生了许多绒毛翳并增厚。此内层细胞可产生各种物质，包括可导致软骨破坏的胶原蛋白酶和基质降解酶；可刺激淋巴细胞增殖的IL-1；和前列腺素。浸润的细胞最初在静脉血管周围，随后形成淋巴滤泡和生发中心，合成IL-2、其它细胞因子、RF和其它免疫球蛋白。也存在纤维素沉积、纤维变性和坏死。增生肥大的滑膜组织(血管翳)可侵蚀软骨、软骨下面的骨、关节囊和韧带。滑膜中PMN细胞不是主要细胞但在滑液中常为主要细胞。

发病通常隐伏，不断涉及关节，但可以突然，同时有多个关节炎症。所有发炎关节附近有触痛是最灵敏的物理症状。滑膜增厚是最特异的机体症状，最后发生在大多数涉及的关节。通常对称性涉及到手的小关节(特别是邻近的指节关节和掌指关节)、足关节(跖趾关节)、腕关节、肘关节和踝关节，但最初病变可发生于任何关节。

SLE：全身性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫疾病，特征为多克隆B细胞被激活，导致产生多种抗蛋白和非蛋白的自身抗体(参见Kotzin等.(1996)Cell85：303-306对此病的综述)。这些自身抗体形成免疫复合物沉积在多个器官系统中导致组织破坏。SLE是难治疾病，具有以恶化-缓解为特征的变化病程。例如，一些患者主要表现为皮疹和关节疼痛，显示能自发缓解而对药物需求少。此类疾病谱的另一极端包括出现严重的进行性肾病(肾小球肾炎)的患者，需要用高剂量的类固醇和细胞毒性药物如环磷酰胺治疗。

多种因素可能导致发生SLE。几个基因位点可能导致易感性，包括组织相容性抗原HLA-DR2和HLA-DR3。同卵双胞胎同时发病率适中，在25％-60％之间，提示此种遗传倾向具有多基因性质以及环境因素的作用。

已提出许多原因导致了自身抗体的产生。提出T细胞辅助了抗-dsDNA抗体分泌的机制，包括T细胞识别DNA-相关蛋白抗原如组蛋白，和识别MHC II类分子中的抗-DNA抗体衍生肽。这类抗体也可能是致病因子。在NZB/NZW小鼠遗传性狼疮病中，带阳电荷的IgG2a抗-双链(ds)DNA抗体是致病因子。这些动物分泌的自身抗体从IgM转变为IgG发生在大约6月龄，T细胞对调节IgG的产生起着重要作用。

由于免疫复合物沉积、白细胞血栓症或血栓形成导致反复血管损伤而出现疾病症状。此外，细胞毒性抗体可介导自身免疫性溶血性贫血和血小板减少，而抗特异性细胞抗原的抗体可能破坏细胞功能。后者的例子是抗神经元抗体与神经精神医学SLE之间的关联。

动脉粥样硬化症。动脉粥样硬化斑块由累积在细胞内和细胞外的脂肪、平滑肌细胞、结缔组织和氨基葡聚糖组成。巨噬细胞与动脉粥样硬化的产生是一体的。修饰的或氧化的LDL使单核细胞趋化，促进它们移行到内膜而早期出现在脂肪条块中，在血管内膜下腔转化和停留转变成巨噬细胞。巨噬细胞表面的清除受体有助于氧化LDL进入这些细胞，使它们转变为载脂巨噬细胞和泡沫细胞。氧化的LDL对内皮细胞也有细胞毒性，可导致内皮细胞功能障碍或从较晚期病灶中消失。

慢性内皮损伤假说，假设内皮的损伤系由各种机制导致的内皮损失，血小板粘附内皮下层，血小板集聚，单核细胞和T-淋巴细胞趋化，及释放血小板产生的和单核细胞产生的生长因子诱导平滑肌细胞从中层迁移到血管内层，在那里它们复制、合成结缔组织和蛋白聚糖形成纤维斑块。其它细胞如巨噬细胞、内皮细胞、动脉平滑肌细胞也能产生生长因子，可能导致平滑肌增生肥大和产生胞外基质。

内皮功能障碍包括内皮对脂蛋白和其它血浆成分的通透性升高，表达粘附分子和分泌生长因子而导致单核细胞、巨噬细胞和T-淋巴细胞粘附增加。这些细胞移行穿过血管内膜侵入内皮下层。泡沫细胞也能释放生长因子和细胞因子，促进平滑肌细胞迁移刺激新内膜增生，导致脂肪积累和内皮细胞功能失调。临床和实验室研究显示，在动脉粥样斑块开始发生、发展和失去稳定性阶段，炎症都起着重要作用。

“自身免疫”假说，假设免疫性炎症过程的特征是，针对内源性抗原的体液和细胞免疫应答反应引起了最早期的动脉粥样硬化。人Hsp60表达本身可导致作为动脉粥样硬化风险因子(如高血压)的几种应激因子所引起的损伤。氧化的LDL是动脉粥样硬化中的另一种候选自身抗原。已在动脉粥样硬化症患者中检测到抗氧化LDL的抗体，发现它们存在于动脉粥样病损中。分离自人动脉粥样病损的T-淋巴细胞显示对氧化LDL起应答反应，是细胞免疫应答中的主要自身抗原。已提出与动脉粥样硬化相关的第三种自身抗原是2-糖蛋白I(2GPI)，这种糖蛋白在体外起抗凝血剂作用。2GPI见于动脉粥样斑块中，在有动脉粥样硬化倾向的转基因小鼠中，用2GPI的超免疫或2GPI反应活性T细胞的转移促进了脂肪条块的形成。

感染可通过诱导炎症和自身免疫导致动脉粥样硬化。大量研究证明了感染因子：病毒(巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、肠道病毒、甲肝病毒)和细菌(肺炎球菌、幽门螺杆菌、牙周病病原体)二者的作用。近年来提出了新的“病原体负载”假说，此假说提出动脉粥样硬化由多种感染因子所导致；感染引起心血管疾病的风险与个体接触多种病原体相关。在单一微生物中，肺炎球菌很可能与动脉粥样硬化紧密相关。

这些假说密切相关且不互相排斥。修饰的LDL对培养的内皮细胞有细胞毒性并可导致内皮细胞损伤，吸引单核细胞和巨噬细胞，刺激平滑肌细胞生长。修饰的LDL也能抑制巨噬细胞移行，一旦巨噬细胞在内皮下间隙转变为泡沫细胞就定居在该处。此外，再生的内皮细胞(损伤后)功能受损，摄取血浆LDL增加。

动脉粥样硬化的特征是保持沉默直到临界狭窄、血栓形成、动脉瘤或并发栓塞。起初，症状和体症表现为进入受损组织的血流不能随需要而增加，如劳累时发作心绞痛，间歇性跛行。通常症状和体症随动脉粥样斑块慢慢侵入血管内腔而逐渐发展。然而，当主要动脉被严重堵塞时，症状和体症显著。

目前，由于缺乏适当的诊断方法，一半以上冠心病患者的最初临床表现为心肌梗塞或死亡。预防和治疗方法的进一步发展取决于能否开发出预防和治疗血管壁最初炎症过程的药物，这是治疗动脉粥样硬化病病因的基础。

治疗药物

在本发明一实施方式中，采用αB晶体蛋白活性调节剂，如αBC多肽、编码αBC的核酸等来治疗炎症疾病，包括类风湿关节炎和脱髓鞘自身免疫疾病如MS。

可用于本发明方法的αB晶体蛋白多肽含有αB晶体蛋白的至少约50个氨基酸，常常至少约100个氨基酸，至少约150个氨基酸，至少约160个氨基酸，至少约170个氨基酸，最多达175个氨基酸，或其修饰形式，还可包括除提供的序列之外的本领域已知的融合多肽。该αB晶体蛋白序列可来自任何哺乳动物或禽类，如灵长动物，具体是人；啮齿动物包括小鼠、大鼠和仓鼠；家兔；马；牛；犬；猫等等。特别感兴趣的是人蛋白。

在本明的某些实施方式中，给予患者αBC蛋白或其功能性片段。用于本发明的αBC多肽也包括天然产生的αBC多肽的衍生物、变体和其生物学活性片段。“变体”多肽指如以下定义的与天然多肽序列的序列相同性小于100％的生物学活性多肽。这类变体包括在天然序列的N-或C-末端或其中间，添加了一个或多个氨基酸残基；删除了1-40个氨基酸残基，和任选置换了一个或多个氨基酸残基的多肽，及上述多肽的衍生物；其中对氨基酸残基共价修饰所得的产物含有非天然产生的氨基酸。通常，生物学活性变体含有的氨基酸序列与天然序列多肽至少有约90％的氨基酸序列相同，优选至少约95％，更优选至少约99％相同。

上述αB晶体蛋白肽的序列可用本领域已知的任何方法加以改变来产生预定的序列变化。这种序列变化可以是置换、插入或删除。可利用这种变化来改变蛋白质的性能，影响其稳定性、特异性等等。体外诱变克隆基因的技术是已知的。扫描突变方法的例子可参见Gustin等.，Biotechniques 14：22(1993)；Barany，Gene 37：111-23(1985)；Colicelli等.，Mol Gen Genet 199：537-9(1985)和Prentki等.，Gene 29：303-13(1984)。定点诱变的方法可参见Sambrook等.，“分子克隆：实验室手册”CSH Press 1989，第15.3-15.108页；Weiner等.，Gene126：35-41(1993)；Sayers等.，Biotechniques 13：592-6(1992)；Jones和Winistorfer，Biotechniques 12：528-30(1992)；Barton等.，Nucleic Acids Res 18：7349-55(1990)；Marotti和Tomich，Gene Anal Tech 6：67-70(1989)以及Zhu.，Anal Biochem177：120-4(1989)。

可将此肽与各种各样其它寡肽或蛋白质相连接用于各种目的。通过提供本发明肽的表达，可实现各种表达后修饰。例如，采用适当的编码序列可提供法尼基化或异戊烯化的肽。可PEG化此肽，提供的聚氧乙烯基团能延长其在血流中的寿命。也可使此肽与其它蛋白连接(这二种蛋白正常时是不连接的)成为融合蛋白，例如与具有补体结合性能的同种型IgG的Fc部分，毒素如篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素等等融合，或利用特异性结合试剂使之靶向靶细胞上的特定分子。

αBC可融合于另一多肽而提供额外功能，如提高体内稳定性。通常这类融合伴侣是稳定的血浆蛋白，从而例如当αBC与之融合后可延长其在体内血浆中的半衰期，具体说，这种稳定的血浆蛋白是免疫球蛋白的恒定区。

大多数情况下，这类稳定的血浆蛋白为多聚体形式，如免疫球蛋白或脂蛋白，它们的相同或不同多肽链通过二硫键和/或非共价结合装配形成多链多肽，产生含αBC的任何蛋白并且可用作与稳定的血浆蛋白前体具有大致相同结构的多聚体。这些多聚体就αBC而言为同质体，它们包含或可含有一个以上的αBC。

稳定的血浆蛋白是通常含有约30-2000个残基的蛋白质，在其天然环境的循环血液中具有延长的即超过约20个小时的半衰期。稳定的血浆蛋白的适当例子有：免疫球蛋白、白蛋白、脂蛋白、载脂蛋白和转铁蛋白。通常将αBC融合于此种血浆蛋白(如IgG)或其片段的N-末端，从而赋予αBC延长的半衰期。其血浆半衰期延长超过约100％才算满意。通常将αBC的C-末端融合于免疫球蛋白恒定区的N-末端取代其可变区，然而，也可采用N-末端融合蛋白。

通常，这类融合蛋白至少保留了免疫球蛋白重链恒定区的功能活性绞链区CH2区和CH3区，重链包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、和IgD，常为IgG类的一种或其组合。融合也可以是恒定区Fc部分的C-末端，或紧靠重链CH1区的N-末端或轻链的相应区域。一般通过构建适当的DNA序列并在培养的重组细胞中表达来实施。或者，可用已知方法合成此多肽。

选择融合位点以优化αBC的生物学活性、分泌或结合特性。对于一些实施方式，融合蛋白应包含抗体识别的αBC免疫原性表位。可用常规实验确定这种优化位点。

在一些实施方式中，此种杂交免疫球蛋白被装配成单体，或异质-或同质多聚体，具体为二聚体或四聚体。这些装配好的免疫球蛋白的结构单元通常已知。IgG、IgD和IgE即为此种4链基础单元结构的形式。分子量较高的免疫球蛋白IgM中重复了此4链单元，以二硫键将5个4链基础单元结合在一起形成五聚体。血清中也存在多聚体形式的IgA免疫球蛋白，偶尔有多聚体形式的免疫球蛋白IgG。对于多聚体，其4链单元各自可相同或不同。

可由真核或原核细胞产生或体外合成用于本发明方法的此种αB晶体蛋白。当由原核细胞产生此蛋白时，需要用本领域已知方法展开，如热变性、DTT还原等作进一步加工并重新折叠。

不会改变其一级结构的对该多肽进行的感兴趣修饰包括化学衍生化，如酰化、乙酰化、羧化、酰胺化等等。还包括糖基化修饰，如在此多肽的合成和加工中，或在进一步加工步骤中，使该多肽接触能影响糖基化的酶，如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶，来修改此多肽的糖基化模式。还包括其序列中氨基酸残基的磷酸化，如磷酸酪氨酸、磷酸丝氮酸或磷酸苏氨酸。

本发明也包括用普通分子生物学技术和合成化学技术修饰此多肽，以提高其对抗蛋白水解降解的抗性，或优化其溶解性能，或使其成为更适合的治疗药物。此多肽的类似物可包括含有不同于天然L-氨基酸的残基如D-氨基酸，或非天然来源的合成产生的氨基酸的那些多肽。可用D-氨基酸取代某些或所有的氨基酸残基。

可用本领域已知的常规方法体外合成本发明的多肽。可购买到各种商品化多肽合成仪，例如加利福尼亚州福特斯城的应用生物公司(Applied Biosystems，Foster City，CA)，贝克曼公司(Beckman)等的自动化合成仪。利用此合成仪以非天然氨基酸取代天然氨基酸。具体序列和制备方法应方便、经济，纯度达到要求等等。

如果需要，可在合成或表达期间在此肽中引入与其它分子或表面连接的各种基团。可利用半胱氨酸制备硫醚，利用组氨酸连接金属离子络合体，利用羧基形成酰胺或酯，利用氨基形成酰胺等等。

也可按照常规重组合成方法分离和纯化此多肽。制备表达此多肽的宿主细胞裂解物，用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析或其它纯化技术纯化此裂解物。大部分情况下，所用组合物含有至少20％(重量)的所需产物，更常至少约75％(重量)，优选至少约95％(重量)；为治疗目的，应常常含有至少约99.5％(重量)的产物，这与产物制备方法相关的污染物及产物纯度有关。通常根据总蛋白计算此百分比。

在本发明一实施方式中，αB晶体蛋白多肽基本上是长175个氨基酸组成的多肽序列，具有上述αB晶体蛋白的肽序列。本文中述及多肽时的术语“基本上由....组成”指该多肽由αB晶体蛋白的序列组成，此序列可侧接不会实质影响该多肽基本特性的一个或多个氨基酸或其它残基。

本发明包括编码αB晶体蛋白多肽的核酸。编码上述αB晶体蛋白多肽的核酸序列可从公众数据库获得。采用常规筛选DNA库或生物样品的方法，筛选出与已知αB晶体蛋白序列相似程度高的DNA序列来鉴定其它αB晶体蛋白。感兴趣的多聚核苷酸包括：编码基本上由αB晶体蛋白的至少约50个氨基酸，常常至少约100个氨基酸，至少约150个氨基酸，至少约160个氨基酸，至少约170个氨基酸，可包含最多达175个氨基酸的多肽序列组成的多肽的多聚核苷酸。这种多聚核苷酸可操作性连接于调控序列，如转录起始位点、终止位点、翻译位点、启动子等等。多聚核苷酸也可包含αB晶体蛋白编码序列与相融合的多肽编码序列。

可用本领域已知方法，如体外合成、重组方法等来产生αB晶体蛋白编码序列，以提供与αB晶体蛋白多肽对应的编码核酸序列，可将其作为产生αB晶体蛋白肽的中间体。利用已知的遗传密码，可产生适合的编码序列。按照常规方法，通过限制性酶消化、PCR扩增等化学合成寡核苷酸，可获得此DNA序列的双链或单链片段。

提供的αB晶体蛋白编码核酸可以是线性分子，或在环形分子内，可以在自主复制分子(载体)内或在无复制序列的分子内。该核酸可自身调节或用本领域已知的其它调节序列调节其表达。可用本领域已有的各种技术，如转铁蛋白聚阳离子介导的DNA转移、裸核酸或包裹核酸转染、脂质体介导的DNA转移、包被DNA的乳胶微球胞内转运、原生质体融合、病毒感染、电穿孔、基因枪、磷酸钙介导的转染等等将此核酸引入合适的宿主细胞中。

可利用表达载体将αB晶体蛋白编码序列引入细胞中。这类载体通常含有位于启动子序列附近的适位限制性酶识别位点供插入核酸序列。制备的转录盒包含转录起始区、靶基因或其片段和转录终止区。可将转录盒引入各种载体，如质粒、逆转录病毒如慢病毒、腺病毒等中，载体能短暂或稳定地维持在细胞中，通常至少约一天，更常至少约几天至几周。

可经许多途径，包括病毒感染、显微注射或泡囊融合，将此核酸引入组织或宿主细胞中。也可如Furth等.(1992)Anal Biochem 205：365-368所述采用喷气注射进行肌内给药。可将DNA包被在金微粒上，通过文献所述的粒子轰击器或“基因枪”(参见例如Tang等.(1992)Nature 356：152-154)作皮内递送，此时包被了αB晶体蛋白或DNA的金微粒被轰击进入皮肤细胞中。

也可提供联合治疗方法，联合治疗具有额外加合或协同效果。可联用αB晶体蛋白与第二种药物，此种药物可选自通常在自身免疫病非抗原特异性治疗中常用的一种或多种全身性药物，包括皮质类固醇和疾病改善药物；或抗原特异性药物。皮质类固醇产生的作用短暂，而疾病改善药物具有数周或数月的临床治疗效果。这些药物包括：氨甲喋呤、来氟米特(Arava^TM)、依那西普(etanercept)(Enbrel^TM)、英夫利昔单抗(Remicade^TM)、阿达木单抗(Humira^TM)、阿那白滞素(Kineret^TM)、利妥昔单抗(Rituxan^TM)、CTLA4-Ig(abatacept)、抗疟药、金盐、柳氮磺吡啶、d-青霉胺、环孢霉素A、环磷酰胺、硫唑嘌呤等等。

皮质类固醇，如泼尼松、甲基泼尼松、强的松龙、甲强龙等具有抗炎和免疫调节双重活性。它们可全身给药或局部注射。疾病早期可用皮质类固醇作临时性辅助治疗，同时等待疾病改善药物发挥作用。对严重患者也可用皮质类固醇作为长期辅助治疗。

在RA中，已证明疾病改善性抗类风湿药或DMARD能改变病程和改善放疗效果。本领域技术人员知道这些药物也可用于治疗其它自身免疫病。

氨甲喋呤(MTX)是常用的一线药物，因为其起效早(4-6周)、效果良好、毒性谱有利，给药容易且价格低。MTX是唯一的常规DMARD药物，大多数患者可持续治疗5年以上。MTX能有效减轻RA的体症和症状，以及减慢或停止放疗损伤。虽然MTX有免疫抑制和细胞毒性作用，这部分是由于抑制了二氢叶酸还原酶，但其对类风湿关节炎的抗炎作用看来至少部分与阻断腺苷和TNF通路有关。此药起效为4-6周，70％患者有一些反应，建议试验用药3-6个月。

抗原特异性治疗方法包括给予抗原或表位特异性治疗药物。在MS中，抗αB晶体蛋白的自身抗体(图5)可能会阻断αBC的保护性免疫抑制作用，从而加重疾病的严重程度。因此，重要的治疗方法是诱导对αB晶体蛋白的抗原特异性耐受，从而减少对αB晶体蛋白的自身反应性T细胞和自身抗体应答。减少对αB晶体蛋白的自身抗体将(1)减少对髓鞘的自身免疫损伤，和(2)使这种负调节剂能抑制MS中的致病性免疫应答和组织破坏而提供疗效。

诱导免疫耐受的一种方法是采用致耐受性DNA疫苗(Garren等.(2001)Inmunity，15：15-22；Robinson等.(2003)Nature Biotechnology 21：1033-9)。致耐受性DNA疫苗是DNA质粒，含有能在哺乳动物细胞中表达编码cDNA序列所需的调控区，经工程改造而含有αB晶体蛋白所有部分或一部分的编码cDNA序列，以诱导对所编码表位的免疫耐受。为提高这种质粒诱导免疫耐受的能力，可减少质粒载体中免疫刺激性CpG基序(Krieg等.(1998)TrendsMicrobiol.6：23-27)的数目或将其完全去除。此外，可在载体中加入免疫抑制性GpG基序(参见Ho等.(2005)J.Immunology，175：6226-34)。肌内递送编码αB晶体蛋白的致耐受性DNA疫苗可诱导对αB晶体蛋白的免疫耐受，从而减少抗-αB晶体蛋白的T细胞和自身抗体应答，减少髓鞘的自身免疫损伤和减少抗体对αB晶体蛋白保护性作用的封闭。

另一替代方法，或者除DNA致耐受性之外，可给予特异性肽、变体肽或蛋白治疗以诱导抗原-特异性耐受来治疗自身免疫。可递送自身免疫应答针对的天然肽来诱导抗原-特异性耐受(Science 258：1491-4)。已利用静脉内递送天然肽来诱导免疫耐受(J Neurol Sci.152：31-8)。递送由天然肽改变的肽也是本领域已知的。含有关键残基选择性改变(变体肽配基或“APL”)的天然肽变体能诱导无应答，或能改变抗原特异性自身反应性T细胞的应答。在另一实施方式中，可递送自身免疫应答所针对的全蛋白抗原以恢复免疫耐受来治疗自身免疫(Science 263：1139)。

药物组合物

活性多肽或多聚核苷酸作为活性成分配制在药物组合物中，以供治疗上述各种疾病。此活性成分以治疗有效量提供，即给药量足以实质上发挥所述蛋白或多肽的效力来治疗疾病或介导医学效应。此组合物也可包含各种其它药物以改善递送和效力，如改善活性成分的递送和稳定性。

例如，根据配制所需，该组合物也可包含药学上可接受的无毒性运载体或稀释剂，它们通常用于配制供动物或人给药的药物组合物。所选稀释剂联用时不应影响组合的生物学活性。这类稀释剂的例子是蒸馏水、缓冲液、生理盐水、PBS、林格氏液、葡聚糖液和汉格氏液。此外，该药物组合物或制剂可包含其它运载体、辅佐剂、或无毒性无治疗作用无免疫原性的稳定剂、赋形剂等等。该组合物也可包含能使其接近生理状况的其它物质，如pH调节剂和缓冲剂，毒性调节剂、润湿剂和去污剂。该组合物也可包含多种稳定剂之一，如抗氧化剂。

当该药物组合物包含多肽作为活性成分时，此多肽可与各种熟知的能改善其体内稳定性或提高其药理性能(如延长该多肽半衰期，降低其毒性、改善其溶解或吸收性能)的化合物组成复合物。这种修饰或复合剂的例子包括：硫酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸和磷酸盐。组合物中的多肽也可与能改善其体内性能的分子组成复合物。这类分子包括，例如糖、多胺、氨基酸、其它肽、离子(如钠、钾、钙、镁、锰)和脂质。

有关适合各种给药方式的制剂的其它指导可参见“雷明顿药物科学”MacePublishing Company，Philadelphia，PA，第17版(1985)。药物递送方法的简要综述可参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)。

可给予该组合物进行预防和/或治疗。可按照标准的细胞培养和/或实验动物的药学方案来测定此活性成分的毒性和治疗效果，包括例如测定LD₅₀(导致50％群体死亡的剂量)和ED₅₀(对50％群体治疗有效时的剂量)。毒性与治疗有效剂量的比例是治疗指数，表示为LD₅₀/ED₅₀之比。优选治疗指数高的化合物。

可利用细胞培养和/或动物研究获得的数据来阐明人用剂量的范围。活性成分的剂量一般在包括ED₅₀的血液循环浓度范围内，没有或几乎没有毒性。剂量可在此范围内变化，取决于所用剂型和给药途径。

可经各种不同途径给予本文所述的药物组合物。例子包括：口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、真皮下、透皮、鞘膜内或颅内方式给予包含药学上可接受运载体的组合物。

对于口服给药，可以固体剂型，如胶囊、片剂和粉末剂；或液体剂型，如酏剂、糖浆剂和混悬剂，给予该活性成分。可将此活性成分与无活性的成分和粉末运载体如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或其衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁一起包封在明胶胶囊中。可加入胶囊中提供所需颜色、味道、稳定性、缓冲力、分散作用或其它已知的所需特性的其它无活性成分的例子有：三氧化铁、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛和可食用白墨水。可利用类似的稀释剂压制成片。可将药片和胶囊制成缓释产品以提供数小时的药物连续释放。可对压制的药片包糖衣或薄膜衣以掩盖不愉快的味道和保护药片隔离大气，或利用肠溶包衣在肠胃道内选择性崩解。口服给药的液体剂型可包含着色剂和芳香剂以提高患者接受度。

可将此活性成分单独或与其它适当的组分组合制成气溶胶剂型(如可将其制成“气雾”)，通过吸入给药。可将气溶胶制剂置于合适的压缩喷气推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气。

适合直肠给药的制剂包括例如栓剂，其由经包装的活性成分与栓剂基质组成。合适的栓剂基质包括天然或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，也可采用明胶直肠胶囊，它由经包装的活性成分与基质(包括例如液态甘油三酯、聚乙二醇和石蜡烃)的组合构成。

适合胃肠外，例如关节内、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径给药的制剂包括：水性和非水的等渗除菌注射液，可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与接受者血液等渗的溶质；水性和非水除菌悬浮液，可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。

用于配制该药物组合物的各组分优选纯度高，基本上没有潜在的有害污染物(如至少是国家食品(NF)级，一般至少是分析级，更常至少是药用级)。而且，体内应用的组合物优选无菌。给予的化合物在应用前必须经深度综合处理，最终产品宜基本上无任何潜在的毒性物质，如合成和纯化加工期间存在的内毒素。胃肠外给药的组合物也优选无菌、基本上等渗和在GMP条件下生产。

αB晶体蛋白表达的调节

αB晶体蛋白基因、基因片段，或编码的蛋白质或蛋白片段在基因治疗中可用于治疗炎症疾病。可利用表达载体将αB晶体蛋白编码序列引入细胞中。这类载体通常含有位于启动子序列附近的适位限制性位点，可供插入核酸序列。制备的转录盒可包含转录起始区、靶基因或其片段，和转录终止区。可将转录盒引入各种载体，如质粒、逆转录病毒如慢病毒、腺病毒等中，此种载体能短暂或稳定地维持在细胞中，通常至少约1周，更优选至少约几天至几周。

可经许多途径，包括病毒感染、显微注射或载体融合，将此核酸引入组织或宿主细胞中。也可如Furth等.(1992)Anal Biochem 205：365-368所述，采用喷气注射进行肌内给予。可将DNA包被在金微粒上，通过文献所述的粒子轰击器或“基因枪”(参见例如Tang等.(1992)Nature 356：152-154)作皮内递送，此时包被了DNA的金微粒被轰击进入皮肤细胞中。

治疗方法

可给予单剂或多剂量，通常是多次剂量的αBC组合物一段时间，如每天、隔天、每周、一周二次、每月等等，给药时间应足以减轻炎症疾病的严重性，包括1、2、3、4、6、10次或更多次剂量。

可根据动物实验数据用常规计算方法确定能提供αBC活性作用的治疗或预防有效剂量。在一实施方式中，此治疗或预防有效剂量包括约0.1mg到约1g之间的核酸或蛋白质。在另一实施方式中，此有效量包括约1mg-100mg的核酸或蛋白质。在还有一实施方式中，此有效量包括约10mg-50mg的核酸或蛋白质。有效量至少部分取决于给药途径。可经口服、喷雾、注射如肌内、皮下、腹膜内、静脉内注射等给予药物。在一些实施方式中，优选除静脉内之外的给药方式。剂量为每千克患者体重约0.1μg，约1μg，约10μg，约100μg。

给予在药学上可接受赋形剂中的αBC组合物。术语“药学上可接受的”指药学和兽医学领域所用的无毒性因而可接受的赋形剂，否则不可接受。此药物制剂中本发明αBC组合物的含量可有很大不同，即其重量百分比从低于约0.1％，通常等于或至少约2％，到高达20％-50％或更高，主要按照所选的具体给药方式，由液体体积、粘度等进行选择。

治疗、处理或治愈疾病或疾患意味着通过给予αBC组合物来减缓、停止或逆转疾病的发展。在优选实施方式中，治疗疾病意味着逆转疾病的发展，理想地是达到消除疾病本身的目的。本文所用的改善疾病与治疗疾病有相等含义。本发明内容中所用的预防、防止或阻止疾病或疾患的术语，指给予αBC组合物来预防疾病或疾患，或预防疾病或疾患的一些或所有症状的发生或发作，或减少疾病或疾患发作的可能性。

现参见以下实施例以更好理解本发明，但本领域技术人员不难理解，提供这些详细信息只是为了阐述本发明，在所附权利要求书中有更全面的描述。

实验

结果

我们首先检查了用MOG 35-55和CFA免疫的αBC裸小鼠(αBC^-/-)的EAE疾病。与129S6野生型(WT)小鼠相比，这些小鼠出现了更为严重的临床EAE疾病，特别是此病的高峰期和较晚期(图1A)。这种差别与疾病急性期(第14天)和发展期(第42天)αBC裸鼠大脑和脊髓中的更严重炎症和脱髓鞘有关(表1，图7)。

表1.WT和αBC^-/-EAE小鼠大脑和脊髓中炎性浸润的定量分析

	脑脊膜	实质	总体
				第14天
WT	59±17.6	49.5±12.3	108.5±29.1
				αBC-/-	127.6±17.7*	116.4±7.2*	234±17.7*
第42天
				WT	20±10.1	21±11.1	41±11.1
αBC-/-	135±25.1*	151±49.1*	286±24.1*

数值为平均值±标准差；^*表示与WT对照相比有显著性差异p＜0.05；n＝4

为了确定αBC^-/-小鼠是否有更多细胞死亡而导致病情恶化，我们对WT和αBC^-/-裸EAE小鼠的脑和脊髓作切割和未切割胱冬酶-3表达的免疫染色。与WT小鼠相比，在EAE的急性期(第14天，图8))和较晚期(第42天，图1G-H)，缺乏αBC表达的小鼠大脑、特别是脊髓中的炎性病灶未切割胱冬酶-3表达的免疫染色较强(图1G-H)。只是在第42天才观察到WT和αBC^-/-EAE小鼠二者有切割胱冬酶-3的表达。αBC^-/-小鼠显示有大核和丰富胞质的细胞染色较强，这与脑白质中的胶质细胞形态一致，免疫细胞免疫阳性很少(图1E，F)。为了研究切割胱冬酶的表达是否与凋亡的相关性，我们对晚期EAE小鼠CNS组织进行了TUNEL染色。WT EAE小鼠中的大多数TUNEL-阳性细胞显示典型的致密细胞核染色(图1I)，而αBC^-/-小鼠的TUNEL-阳性细胞更多，较大比例的阳性细胞有更丰富的胞质染色，提示它们为胶质细胞(图1J)。这些结果提示，αBC在防止EAE期间CNS胶质细胞的凋亡中可能起了作用。

对髓鞘蛋白和脂质的病理性免疫应答导致了EAE。αBC可能具有消炎作用。为了确定患EAE的αBC^-/-小鼠是否也受到针对组成性表达的髓鞘蛋白的免疫应答反应的影响，我们比较了αBC^-/-小鼠与WT小鼠的脾和淋巴结淋巴样细胞的增殖能力和细胞因子分泌。与WT小鼠相比，MOG-免疫的αBC^-/-小鼠脾和淋巴结细胞显示出显著高得多的增殖和Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF、IL-12p40的分泌(图1B，C)。裸小鼠的这些细胞也分泌了较多的IL-17(图1C)。在αBC^-/-或WT小鼠的这些类型细胞中没检测到Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)分泌。

为确定EAE期间αBC^-/-小鼠中的此种特定类型细胞是否为超强反应性细胞，我们评估了T细胞和抗原提呈细胞(APC)如巨噬细胞的增殖能力和产生的细胞因子。与脾细胞和淋巴结细胞相似，与WT对照小鼠相比，用MOG33-55刺激的MOG-免疫αBC^-/-小鼠的CD3+T细胞增殖更强(cpm)，分泌了更高浓度的IL-2、IFN-γ和IL-17(pg/ml)(图2A)。用抗-CD3和抗-CD28抗体刺激的裸鼠原初CD3⁺T细胞也显示了类似的超强应答反应。

为确定APC的功能是否也受到影响，我们从巯基乙酸处理的WT和αBC^-/-小鼠分离了巨噬细胞并用LPS进行刺激。αBC^-/-小鼠的巨噬细胞也显示分泌促炎细胞因子能力增强，释放更多的IL-12p40、IL-6和IL-1β。TNF的产生无差异。令人感兴趣的是，这些细胞也分泌更多的IL-10(图3A)。

由于MAP激酶信号转导通路与αBC的功能有关，我们测定了JNK、ERK或p38通路是否在患EAE的αBC^-/-小鼠中所见的免疫细胞超强应答反应中起作用。我们发现受刺激的αBC^-/-CD3⁺T细胞(图2B)和巨噬细胞(图3B)中总p38和磷酸化p38表达均上调。JNK和ERK通路分子的表达在WT与αBC^-/-T细胞和巨噬细胞之间无差别。这些结果证明αBC^-/-小鼠的炎症应答反应过强，提示EAE期间αBC可能对T细胞和巨噬细胞群具有抑制作用，虽然这种抑制作用本身不足以完全根除疾病。

EAE中星形细胞利用NF-κB通路来调节炎症，EAE和MS期间它们上调了αBC的表达。我们评估了αBC^-/-小鼠星形细胞的功能是否有所改变。分离的αBC^-/-乳鼠原代星形细胞在TNF或十字孢碱刺激后48小时产生的IL-6比WT星形细胞多(图4A)。因为αBC是抗凋亡蛋白，我们评估了αBC^-/-星形细胞与WT星形细胞相比，是否经历了不同程度的细胞死亡。αBC显示通过结合胱冬酶-3前体下调了胱冬酶-3的表达而保护细胞免于凋亡。WT和αBC^-/-小鼠的原初星形细胞培养4周后均表达了胱冬酶-3。然而αBC^-/-小鼠的原初星形细胞显示经切割的胱冬酶-3的表达与WT星形细胞存在差异，此凋亡因子甚至在用TNF刺激后仍未被切割。相反，TNF刺激后72小时观察到αBC^-/-细胞中切割的胱冬酶-3有额外的小量增加(图4B)。此外，经和不经TNF刺激，与WT小鼠相比，更高百分比的裸鼠星形细胞显示了更强的TUNEL染色(图4C)，提示αBC能保护星形细胞避免正常的细胞死亡和应激损伤(图4C)。

为确定是否有潜在的信号传递机制介导了αBC^-/-星形细胞死亡增加，我们评估了与αBC功能有关的MAP激酶信号转导通路分子的表达。TNF刺激72小时后WT小鼠星形细胞表达αBC增加。这些细胞也显示p-αBC(p59)表达增加，但p-αBC(Ser45)略为降低(图4B)。裸鼠星形细胞中未见有αBC。在各种细胞中，p38和ERK通路受αBC调节。αBC能防止ERK通路的激活从而抑制胱冬酶-3成熟和细胞死亡³¹。我们发现TNF刺激后72小时αBC^-/-星形细胞中p-ERK和ERK均上调。WT星形细胞的p-ERK表达也增加，虽然总ERK维持不变。TNF刺激后裸鼠星形细胞中p38也上调，但未检测到此蛋白磷酸化。WT和αBC^-/-星形细胞中未见JNK和p-JNK表达变化(未显示)。

然后我们评估了NF-κB通路是否受αBC调节。裸鼠星形细胞在TNF刺激后，αBC上调了NF-κB活性亚基p65和p105/p50的表达，同时下调了其负调节剂IκB-α(图4B)。另一方面，WT星形细胞显示抑制剂IκB-α增加，甚至在TNF刺激后此基因型小鼠也无NF-κB p50(表达)(图4B)。NF-κB DNA结合试验证实，与WT胶质细胞相比，TNF刺激的αBC^-/-星形细胞中NF-κB p50和NF-κB p65DNA结合活性增强(图4D)。因此，αBC可通过抑制胱冬酶-3激活而防止星形细胞死亡，并抑制脱髓鞘疾病期间星形细胞中NF-KB的促炎症作用。

我们构建了大规模的阵列来检测针对各种髓鞘蛋白的自身抗体，此阵列包含全长αBC和其许多表位肽。在EAE中，用PLPp139-151免疫后17天的血清中出现了抗αBC的p16-35、p26-45和p116-135表位的抗体。在多发性硬化症中，我们用髓鞘抗原阵列分析了复发-缓解型MS(RRMS)患者脑脊液中的抗αBC抗体。检测到显著的抗天然αBC和抗αBC的p21-40和116-135表位的抗体(图5)。

我们的结果表明αBC对免疫细胞功能有抑制作用，对CNS胶质细胞有抗凋亡作用。为了证明是由于MS患者脑脊液(CSF)中的抗αBC抗体参与而使EAE病情恶化，如同我们和其他学者先前已证明的那样，表位播散所导致的EAE中已经升高的抗αBC抗体的事实使结果变得更加复杂。因此，将人CSF的抗体转移给小鼠有困难，这类似于30多年前所做的实验显示重症肌无力患者的免疫球蛋白能转移给小鼠使小鼠也患肌无力。我们因此评估了重组αBC本身是否能解决(治愈)小鼠EAE疾病。为了检验此想法，我们每隔2天静脉内给予10μg重组人αBC治疗EAE WT小鼠。经αBC治疗的小鼠与PBS治疗的小鼠相比，显示临床疾病症状显著降低(图6A)。这种疾病改善部分是由于浸润到脑和脊髓中的免疫细胞的减少(表2)以及免疫细胞功能的抑制(图6B)。我们观察到用重组αBC治疗的小鼠脾细胞增殖以及Th1型(IL-2、IL-12p40、TNF、IFN-γ)和IL-17细胞因子产生降低(图6B)。有趣的是，在高浓度MOG刺激时观察到免疫抑制性细胞因子IL-10产生增加(图6B)。在体外用抗-CD3/抗-CD28抗体刺激和用重组αBC治疗小鼠的CD3+T细胞也观察到类似的免疫细胞功能降低。

为了评估αBC治疗是否影响CNS细胞死亡，我们对PBS和αBC治疗的EAE小鼠脑和脊髓切片进行了TUNEL染色。在αBC治疗小鼠的CNS实质中观察到TUNEL染色比注射PBS的小鼠弱(表2，图9)。此外，发现αBC治疗小鼠CNS中弥散性TUNEL染色(提示为濒死胶质细胞)的细胞较少，提示给予外源性重组αBC对胶质细胞有保护作用。

表2：用PBS和重组αBC治疗患有EAE的WI小鼠的脑和脊髓中炎性浸润细胞和TUNEL阳性细胞的定量分析

	脑脊膜	实质	总体	TUNEL
					PBS	115.3±31.8	107.7±28.3	223±60.1	487.1±104.1
重组αBC	48.7±19.8*	52±38.5*	100.7±55.8*	152.7±74*

数值为平均值±标准差；^*表示与WT对照相比有显著性差别p＜0.05；n＝3

对损伤的应答反应往往伴随有保护机制，起着对抗损伤和介导修复过程的作用。这个概念关系到自身免疫疾病如MS，目前的实验性治疗方法主要目的是减少免疫反应从而减少炎症。在MS中，除了抑制病理性炎症应答外，当神经元和胶质前体细胞为损伤对象时，保护CNS细胞免于损伤和/或诱导修复也很重要。我们的发现表明，αBC是负调节剂，其作用是阻断几条炎症通路，包括免疫细胞中的p38激酶通路和胶质细胞中的胱冬酶-3介导的细胞死亡通路。值得注意的是，在对MS病灶独特的基因转录研究中，发现αBC最为丰富。αBC也被鉴定为MS患者脑髓鞘中能触发MS患者最强T细胞应答的组分(Robinson等，(2003)Nat Biotechnol 21，1033-9)，现已证明MS患者的脑脊液中存在针对αBC的抗体应答。

看起来也许自相矛盾，在EAE中，αBC不仅抑制T细胞和巨噬细胞增殖及p38信号转导通路的促炎细胞因子分泌，而且抑制胶质细胞死亡和免疫细胞浸润CNS。αBC保护胶质细胞免于胱冬酶-3介导的细胞死亡的能力是通过ERK和NF-κB通路介导的。αBC的这些抗炎和促存活功能对逆转EAE可能有治疗作用。

虽然在MS和EAE的CNS中αBC显著上调，但其保护作用受到炎症应答反应的压制，或αBC功能可能受到破坏。MS患者(van Noort等.(2006)MultScler 12，287-93)血清和EAE小鼠血清中存在的抗体的确可能损害αBC的功能，妨碍其保护作用。MS患者脑脊液中强烈的应答反应，包括T细胞识别αBC和对αBC的抗体应答，意味着这种获得性免疫可能抑制MS患者的αBC活性，损害此主要保护性机制。我们探索了是否αBC给药本身就能缓解EAE的发展。显然，给予的αBC本身就有治疗作用。

MS及其动物模型、EAE中的一种主要获得性免疫应答是针对应激可诱导性蛋白质αBC的。这种针对脑炎负调节剂的免疫应答相当于对已有危险倾向的载体制动系统的损伤。显然，加入相同的应激蛋白，以恢复失效的制动系统，回复控制。αBC作为EAE和MS大脑炎症的负调控剂和胶质细胞凋亡的强效调节剂，在MS的病理生理演变过程中显然处于非常关键的端点。

方法

小鼠：为NIH国立眼科研究所培育的αBC裸鼠(αBC^-/-)。这些小鼠产生自具有129S4/SvJae背景的ES细胞，保留了129S6/SvEvTac X 129S4/SvJae背景。αBC^-/-小鼠能生育繁殖，出生前没有明显缺陷，眼晶状体透明度正常。老龄小鼠显示有姿态缺陷和进行性肌病，约40周龄时明显。我们研究的这些小鼠为8-12周龄，故去除了肌病对临床评价的可能影响。129S6/SvEvTac(TaconicFarms)小鼠用作对照。WT和αBC^-/-鼠群维持在动物室中并按照斯坦福大学比较医学指南(Comparative Medicine guidelines)要求饲养。

诱导EAE：用100μg髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG p35-55)肽与完全弗氏佐剂(含4mg/ml热灭活结核分枝杆菌H37Ra，迪夫可实验室(DifcoLaboratories))，以1∶1体积比混合制成的乳液皮下免疫8-12周龄雌性αBC^-/-和WT 129S6/SvEvTac小鼠。免疫时和免疫后2天还给小鼠静脉注射用PBS配的50ng博代百日咳杆菌毒素(BPT)(迪夫可实验室)。MOG p35-55肽由斯坦福通用实验室(Pan Facility)合成并经高效液相层析(HPLC)纯化。每天检查小鼠(n＝8-10/组)有无EAE临床症状并如下评分：0＝无临床疾病，1＝靠尾跛行，2＝后肢软弱，3＝后肢完全瘫痪，4＝后肢瘫痪+部分前肢瘫痪，5＝濒死或死亡。所有的小鼠实验方案得到斯坦福大学比较医学系批准，按国立卫生研究院指南维持饲养。

组织学分析：解剖取得小鼠的脑和脊髓，用10％福尔马林PBS液固定、石蜡包埋。用苏木精伊红染色7张微米厚切片检测炎性浸润细胞，勒克司坚蓝染色检测脱髓鞘。由不知道动物处理情况的检查员计数脑、胸腰脊髓切片炎症病灶中的细胞。

星形细胞培养：星形细胞得自2日龄WT和oBC^-/-乳鼠。简言之，解剖得到每种基因型3只乳鼠的大脑皮层置于含有青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养液(DMEM，英吉公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡斯班德(Carlsbad，CA))中。去除脑脊膜并将皮层置于含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的1ml完全Dulbecco改良的Eagle培养液中(英吉公司(Invitrogen))。研碎皮质，高速混旋1分钟，使之通过18.5号针头。然后将混合液用25-mmSwinnex针筒过滤架(密里普公司(Millipore))依次通过80-μm和11-μm滤器(密里普公司(Millipore)，马萨诸塞州贝德福德(Bedford，MA))。滤过细胞用完全DMEM培养液稀释至1ml，置于装有10ml完全DMEM液的3个75-cm²组织培养瓶中，移入5％CO₂培养箱中37℃进行培养。用100ng/ml重组TNF(生物源公司(BioSource)，加利福尼亚州卡玛里奥(Camarillo，CA))或100nM十字孢碱(西格玛公司(Sigma)，密西根州圣路易斯(Saint Louis，MI))刺激汇合的星形细胞，收集刺激后的细胞和上清液作ELISA和免疫印迹分析。

免疫细胞活化试验和细胞因子分析：将脾细胞和淋巴结细胞(5x10⁵个细胞/孔)或CD3⁺T细胞(5x10⁴个细胞/孔，经负选择纯化，研发体系(R&DSystems)，明尼苏达州明尼阿波利斯(Minneapolis，MN))培养在96孔平底板中，培养液为添加了2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、0.5μM 2-巯基乙醇和10％胎牛血清的RPMI1640液，加入MOG p35-55肽(5-20μg/ml)。为了检测体内T细胞功能，将MOG-免疫9天的小鼠脾细胞和淋巴结细胞纯化得到的CD3+T细胞以1∶5比例与照射过的同基因型(小鼠)脾细胞和MOG p35-55肽(5-20μg/ml)一起培养。

在WT和αBC^-/-小鼠腹腔注射3ml 3％(w/v)硫胶质(BD诊断公司(BDDiagnostics Systems)，马里兰州斯帕克斯(Sparks，MD)后3天分离获得其腹腔原代巨噬细胞(1x10⁶个细胞/ml)，培养在24-孔板的培养液(DMEM，添加了10％胎牛血清、1mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)中72小时，然后用100ng/ml的LPS激活。

为评估增殖率，培养细胞72小时后用[³H]胸苷(1μCi/每孔)脉冲，18小时后收集细胞于滤纸上，用β-射线计数器读取每分钟掺入的[³H]胸苷数(cpm)。用OPTEIA ELISA试剂盒(BD药源公司(BD Pharmingen)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA))检测培养细胞上清液的细胞因子。所述上清液取自各细胞因子产生峰值时(48小时：IL-2、IL-12p40、IL-6、IL-1β；72小时：IFN-γ、TNFα；96小时：IL-17；120小时：IL-4、IL-10)。

重组αBC治疗：用MOG35-55和百日咳毒素诱导EAE WT小鼠。将后肢瘫痪小鼠分成临床疾病评分相平衡的2组，每隔2天静脉内注射pH7.0盐水或10μg盐水稀释的重组人αBC(美国生物公司(US Biological)，马萨诸塞州斯沃斯考特(Swampscott，MA))。为测定αBC治疗对EAE免疫细胞功能的影响，分离得到缓解期的脾细胞并在体外用MOG35-55肽刺激。

免疫印迹分析：用含1％NP-40、10％甘油、1mM EDTA、1mM Na₃VO₄、1mM NaF、1mM DTT、4.5mM焦磷酸钠、10mM β-磷酸甘油和蛋白酶抑制剂混合物药片(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)，德国潘博克(Penzberg，Germany))的50mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4裂解CD3+T细胞、巨噬细胞和星形细胞。4℃13,000rpm离心30分钟收集上清液，用分光光度计280nm吸光值测定蛋白含量。将裂解蛋白(30-50μg)悬浮在二倍体积的双倍强度十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液(BD实验室(Bio-Rad Laboratories)，加利福尼亚州赫库(Hercules，CA))中，采用现成的10％或15％Tris-HCl凝胶(BD实验室(Bio-RadLaboratories))作SDS-PAGE电泳。将蛋白带转移到PVDF膜上，用含0.05％吐温-20的5％脱脂奶20mM Tris-HCl-缓冲盐水(TBS)，pH 7.4封闭。4℃用以下抗体1∶500稀释液对此膜作免疫印迹：抗p-αBC(Ser 45)、p-αBC(Ser 59)、αBC(应激生物试剂公司(StressGen BioReagents)，加拿大维多利亚(Victoria，Canada))；抗肌动蛋白(西格玛公司(Sigma))、p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-SAPK/JNK、SAPK/JNK、胱冬酶-3、NFκBp105/p50、NF-κBp65、IκB-α(细胞信号转导技术公司(Cell Signaling Technology)，马萨诸塞州单弗(Danvers，MA))。用含0.1％吐温-20的TBS缓冲液洗涤膜3次持续15分钟。用偶联过氧化物酶的第二抗体(安玛西亚公司(Amersham)，英国白金汉郡(Buckinghamshire，England))显示结合的抗体，然后用ECL试剂盒(皮尔斯公司(Pierce)，伊利诺斯州罗克福德(Rockford，IL))检测。为了复染，先用缓冲液(62.5mM Tris-HCl，pH 6.8，含2％SDS和100mM β-巯基乙醇)50℃浸泡1小时剥离膜条。

免疫组化分析：用10mM柠檬酸钠液水合并处理石蜡包埋的皮层矢状面切片(7μm)，用1％过氧化氢液培育切片以淬灭内源性过氧化物酶，用PBS配制的1％BSA液室温封闭1小时，4℃与胱冬酶-3(1∶50)或经切割的胱冬酶-3(1∶400)(细胞信号转导公司(Cell Signaling))培育过夜。结合的抗体用Vectastain ABC抗兔试剂盒(载体实验公司(Vector Laboratories)，加利福尼亚州伯林盖姆(Burlingame，CA))和3，5-二氨基联苯胺(DAB)/H₂O₂试剂作底物进行检测。固定前，切片用Mayer苏木精复染和等级乙醇脱水。为用TUNEL法检测凋亡，我们采用了ApopTag过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒，按照石蜡包埋切片的厂商说明书(凯米科公司(Chemicon)，美国加利福尼亚州泰科拉(Temecula，CA，USA))操作。

NF-κB结合试验：用100ng/ml TNF(生物源公司(BioSource)，加利福尼亚州卡玛里奥(Camarillo，CA))刺激WT和αBC^-/-星形细胞72小时，用Clontech实验室的转因子(Transfactor)抽提试剂盒分离核蛋白提取物。用CTF(Clontech Transfactor Family)-NF-κB比色试剂盒检测NF-κB p50和NF-κB DNA与15μg核蛋白的结合。

髓鞘阵列：按先前所述印刷和探测髓鞘抗原阵列。简言之，将代表候选髓鞘自身抗原的蛋白和肽印制在SuperEpoxy显微镜载玻片(特开公司(TeleChem)，加利福尼亚州芒廷维尤(Mountain View，CA))上形成有序阵列。先与缓解-复发型MS(RRMS)或其它对照神经疾病(OND)患者的1∶20稀释脑脊液(CSF)反应，然后与偶联CY-3-的抗人IgG/M二抗(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoresearch))反应，探测此髓鞘阵列。扫描阵列作荧光定量测定衡量自身抗体的结合。

统计学分析：数据表示为平均值±标准差。当数据为参数(峭度和偏度＜2)且组方差齐性(Bartlett齐性检验)时，采用方差和Scheffépost-hoc检验(＞2组)或t-检验(N＝2组)来检测组间差异。当数据为非参数时，用Kruskal-Wallis检验和非参数检验作多重比较(＞2组)或Mann-Whitney U检验(N＝2组)比较秩和。P值＜0.05认为有显著性差异。用微阵列显著性分析(SAM)鉴定抗体反应性中有显著性差异的抗体特征来分析髓鞘阵列。然后用等级群集算法给这些“命中”抗原和患者样品排序，结果用树状图(TreeView)软件显示为热点图。

实施例2

称为MAP激酶的有丝分裂素活化的蛋白激酶是炎症的关键因子。P38MapK和胞外信号调节激酶ERK在炎症应答反应中至关重要，已证明它在心肌梗塞、中风和外周动脉局部缺血、阿尔茨海默症、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症中起着关键作用。例如，γ干扰素受p38MapK和ERK信号传导的调控，参见图10。

我们证明缺乏aBC会影响脑和外周巨噬细胞和淋巴细胞的p38MapK和ERK通路。给予aBC通过影响中枢神经系统中的这些通路而能影响炎性神经疾病，如阿尔茨海默症、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症和中风。

如图1所示，给予aBC减少了外周血淋巴细胞产生促炎细胞因子。如图2所示，缺乏aBC降低了外周血T淋巴细胞和巨噬细胞(图3)及CNS星形细胞的p38Map K和ERK。缺乏aBC的星形细胞ERK信号传导有缺陷(图4)。

在一些疾病中，p38Map K和ERK起着关键作用。如表1所示，缺乏aBC诱导了炎症，而给药可逆转炎症的作用。在表2中，我们通过给予重组aBC降低了大脑炎症。aBC也能减少p38Map K和ERK的磷酸化(图2B、3B和4B)。

给予aBC有可能减轻局部缺血病损，包括心肌梗塞、中风和动脉闭塞的范围和严重性。

实施例3

用aB晶体蛋白治疗胶原诱导关节炎动物模型的自身免疫关节炎。

除了对MS的EAE模型进行研究外，本文证明aBC能治疗啮齿动物RA模型的已发生的自身免疫关节炎。在这些研究中，用弗氏完全佐剂乳化的II型牛胶原蛋白诱导，21天后用弗氏不完全佐剂配的II型牛胶原蛋白加强，使小鼠产生了胶原性关节炎。

小鼠产生临床关节炎后，将关节炎小鼠随机分组分别接受aBC((10μg，每隔一天)、肌球蛋白(10μg)或PBS(盐水对照)隔天治疗。用aBC治疗已产生关节炎的小鼠与用肌球蛋白或PBS对照治疗的小鼠相比，关节炎严重程度显著降低(P＜0.05)(图11)。然后处死小鼠收集关节，固定、脱钙、石蜡包埋、切片，用甲苯胺蓝染色，由盲法评审员评分滑膜的(炎症)程度、血管翳(滑膜内层生长)和骨破坏(骨侵蚀)程度。aBC治疗小鼠显示有统计学意义的滑膜炎(P＜0.05)血管翳形成(P＜0.05)和骨破坏(P＜0.05)的减轻(图12)。此外，收集的aBC治疗CIA小鼠脾细胞显示增殖应答和产生的促炎细胞因子(TNF和IFN-γ)降低(图13)。免疫组化分析RA滑膜显示RA血管翳中有高水平aBC表达，而在OA患者产生的滑膜内层没检测到其显著表达(图14)。

实施例4

αBC保护海马神经元避免Aβ-诱导的凋亡。

收获E15-16乳鼠的海马组织，将其收集在冰冷的无钙镁HBSS液中，然后用0.05％胰蛋白酶37℃消化5分钟。细胞解离并重悬于无血清DMEM/F12液中。组织培养孔(Costar 96-孔A/2平板，0.16cm²/每孔)预先用25μL/每孔的聚L-赖氨酸(用磷酸缓冲盐水配成10μg/ml，Sigma)37℃包被1小时。吸去液体后，各孔加入45μl细胞悬液(2000个神经元/孔；12,500个细胞/cm²)和含N₂补充物及重组BDNF(研发体系(R&D Systems)，明尼苏达州明尼阿波利斯(Minneapolis，MN))的5μl无血清DMEM/F12培养液。包括低密度细胞和无血清DMED的培养条件与Lindholm等(1996)报导的培养原代海马细胞所用条件相似。6-7天体外培养(DIV)后，使海马神经元接触单纯培养液(CM)或接触含4uM Ab1-42和有或无5-10μM重组人±BC的培养液。72小时后固定，进行TUNEL试验。用荧光显微镜拍摄培养细胞的照片，用Image Pro MDA 6.1计数DAPI和TUNEL-阳性细胞。数据表示为1次实验n＝20-40个视野细胞计数的平均值±标准差。状况用ANOVA检验与Ab1-42作比较(^***p＜0.001)。

Claims (17)

1.一种抑制患者炎症疾病的方法，所述方法包括：

给予所述患者治疗有效量的能提高αB晶体蛋白活性的药物，其中，在所述药物的存在下，组织中受自身免疫病影响的免疫细胞的活性降低。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述炎症疾病是神经炎性疾病。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述神经炎性疾病是脱髓鞘疾病。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疾病是多发性硬化症。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述神经炎性疾病是帕金森病。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述神经炎性疾病是阿尔茨海默症。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述神经炎性疾病是肌萎缩侧索硬化症。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述炎性疾病是动脉粥样硬化症。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述炎性疾病是类风湿关节炎。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述给药步骤之前，哺乳动物已诊断患有自身免疫病。

11.如权利要求1所述的方法，还包括：

监测组织中受自身免疫疾病影响的T细胞的活性。

12.如权利要求11所述的方法，还包括：

监测组织中受自身免疫疾病影响的活化T细胞促炎细胞因子的分泌，其中，分泌减少表示已给予了治疗有效量的αB晶体蛋白。

13.如权利要求11所述的方法，还包括：监测p38MAPK或ERK的表达和/或磷酸化，其中，表达或磷酸化减少表示已给予了治疗有效量的αB晶体蛋白。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物是αB晶体蛋白或其片段或其衍生物。

15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述药物是αBC与免疫球蛋白Fc多肽组成的融合多肽。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物是编码αB晶体蛋白的核酸。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物与第二抗原特异性或非抗原特异性药物一起给予进行联合治疗。

Images