CN111918876B - 抗pd-l1抗体及使用其检测pd-l1的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及抗PD‑L1抗体及其用于检测来自受试者的样本中的PD‑L1的用途。在一些实施例中，所述受试者已经用治疗性抗PD‑L1抗体进行了治疗，并且本文所述的抗PD‑L1不与所述治疗性抗PD‑L1抗体竞争结合PD‑L1。在一些实施例中，所述抗PD‑L1抗体连接至可检测的部分(例如荧光团)，并且所述抗PD‑L1抗体用于使用流式细胞术检测受试者中的PD‑L1。

Description

抗PD-L1抗体及使用其检测PD-L1的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月30日提交的美国专利申请No.62/593,125的优先权权益，该美国专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
以ASCII文本文件提交序列表
以下提交的ASCII文本文件的内容全文以引用方式并入本文：序列表的计算机可读格式(CRF)(文件名：146392040140SEQLIST.TXT，记录日期：2018年11月9日，大小：20KB)。
技术领域
本发明涉及抗PD-L1抗体及使用其检测PD-L1的方法。
背景技术
已发现T细胞功能障碍或无反应性与抑制性受体(程序性死亡1多肽(PD-1))的诱导性持续表达同时发生。因此，靶向PD-1及通过与PD-1相互作用进行信号传导的其他分子(诸如程序性死亡配体1(PD-L1))的治疗方法成为人们强烈关注的领域。PD-L1信号传导的抑制已经证实为增强T细胞免疫以用于治疗癌症的手段(例如，肿瘤免疫)。已经开发出使用抗PD-1或抗PD-L1抗体的疗法并用于治疗不同类型的癌症。参见例如美国专利No.8,217,149。
在此项技术中需要检测生物样本中的PD-L1，该生物样本来自已经用治疗性抗PD-L1抗体进行治疗的受试者。本发明提供抗PD-L1抗体，其特异性地检测PD-L1，而不会与治疗性抗PD-L1抗体竞争结合PD-L1。这些抗体适用于例如监测已经用治疗性抗PD-L1抗体进行治疗的受试者的癌症治疗。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含：
(a)重链可变区，包含：
(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列TSWMN(SEQ ID NO:1)；
(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列RIYPRDGDTYYNGKFKD(SEQ ID NO:2)；以及
(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列NPGGYYFDY(SEQ ID NO:3)；以及
(b)轻链可变区，包含：
(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列RASQDIHTYLN(SEQ ID NO:4)；
(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列YTSRLHS(SEQ ID NO:5)；以及
(iii)HVR-L3，其包含氨基酸序列QQVSSLPPWT(SEQ ID NO:6)。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在本文任何实施例的一些中，抗体或抗原结合片段不与参考抗体竞争结合人PD-L1，其中参考抗体包含：
(a)重链可变区，包含：
(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:11)；
(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:12)；以及
(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:13)；以及
(b)轻链可变区，包含：
(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:14)；
(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:15)；以及
(iii)HVR-L3，其包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:16)。
在一些实施例中，参考抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在一些实施例中，参考抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
在本文任何实施例的一些中，抗体或抗原结合片段连接至某一部分。在一些实施例中，该部分是可检测的部分。在一些实施例中，可检测的部分是生物素、链霉亲和素、发光剂、酶、荧光团、染料、放射性标记、生色团、金属离子、金粒子、银粒子、磁性粒子、多肽或寡核苷酸。在一些实施例中，可检测的部分是荧光团。在一些实施例中，荧光团是R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy7、Alexa Fluor 488、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)、BV421、BV510、APC-H7、Alexa Fluor 647或别藻蓝蛋白(APC)。
在另一方面，本发明提供一种编码本文所述的抗体或抗原结合片段的分离的核酸。
在另一方面，本发明提供一种包含本文所述的核酸的载体。在一些实施例中，载体是表达载体。
在另一方面，本发明提供一种包含本文所述的核酸的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供一种产生本文所述的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合产生抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的条件下培养本文所述的宿主细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括回收由宿主细胞产生的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供一种用于检测从受试者获得的生物样本中的PD-L1的方法，该方法包括：(a)使生物样本与本文所述的抗体或抗原结合片段接触；以及(b)检测抗体或抗原结合片段与生物样本中的PD-L1的结合，从而检测生物样本中的PD-L1。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是使用流式细胞术检测的。在本文任何实施例的一些中，生物样本是血液样本。在本文任何实施例的一些中，生物样本是骨髓样本。在本文任何实施例的一些中，生物样本是细胞或组织。在一些实施例中，细胞或组织是癌细胞或癌组织。在本文任何实施例的一些中，生物样本包含活细胞。在本文任何实施例的一些中，受试者患有癌症。在一些实施例中，癌症选自由多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和急性髓性白血病组成的组。在本文任何实施例的一些中，生物样本获得自已经施用了治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的受试者，其中治疗性抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，包含：
(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:11)；
(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:12)；以及
(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:13)；以及
(b)轻链可变区，包含：
(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:14)；
(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:15)；以及
(iii)HVR-L3，其包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:16)。
在一些实施例中，治疗性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在一些实施例中，治疗性抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。在本文任何实施例的一些中，受试者是人。
在另一方面，本发明提供一种监测受试者的癌症治疗的方法，该方法包括：(a)使第一生物样本与本文所述的抗体或抗原结合片段接触；(b)检测抗体或抗原结合片段与第一生物样本中的PD-L1的结合；(c)测定第一生物样本中存在的PD-L1的量；(d)使第二生物样本与本文所述的抗体或抗原结合片段接触，其中第二生物样本是在用治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段处理后获得的；(e)检测抗体或抗原结合片段与第二生物样本中的PD-L1的结合；(f)测定第二生物样本中存在的PD-L1的量；(g)将第一生物样本中存在的PD-L1的量与第二生物样本中存在的PD-L1的量进行比较。在一些实施例中，与第一生物样本相比第二生物样本中存在的PD-L1的量的增加表明患者对治疗性抗PD-L1抗体的治疗无反应。在一些实施例中，与第一生物样本相比第二生物样本中存在的PD-L1的量的减少表明患者对治疗性抗PD-L1抗体的治疗有反应。在本文任何实施例的一些中，第一生物样本是在用治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段治疗之前从受试者获得的。在本文任何实施例的一些中，第二生物样本是在用治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段治疗之后从受试者获得的。在本文任何实施例的一些中，第一生物样本和第二生物样本是血液样本。在本文任何实施例的一些中，第一生物样本和第二生物样本是骨髓样本。在本文任何实施例的一些中，第一生物样本和第二生物样本是细胞或组织。在一些实施例中，细胞或组织是癌细胞或癌组织。在本文任何实施例的一些中，第一生物样本和第二生物样本包含活细胞。在本文任何实施例的一些中，受试者患有选自由多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和急性髓性白血病组成的组的癌症。在本文任何实施例的一些中，治疗性抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，包含：
(i)HVR-H1，其包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:11)；
(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:12)；以及
(iii)HVR-H3，其包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:13)；以及
(b)轻链可变区，包含：
(i)HVR-L1，其包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:14)；
(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:15)；以及
(iii)HVR-L3，其包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:16)。
在一些实施例中，治疗性抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在一些实施例中，治疗性抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。在本文任何实施例的一些中，抗PD-L1抗体或抗原结合片段是使用流式细胞术检测的。在本文任何实施例的一些中，受试者是人。
在另一方面，本发明提供一种包含本文所述的抗体或抗原结合片段的组合物。
在另一方面，本发明提供一种用于检测生物样本中的PD-L1的试剂盒，该试剂盒包含本文所述的抗体或抗原结合片段或本文所述的组合物。
附图说明
图1A和图1B为针对最接近匹配的小鼠生殖系(图1A中的SEQ ID NO:21及图1B中的SEQ ID NO:22)的A)14D3抗PD-L1(SEQ ID NO:7)的重链可变区与B)14D3抗PD-L1(SEQ IDNO:8)的轻链可变区之间的序列比对图。
图2A和图2B为示出在从健康人类供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+ CD4+ T细胞的中值荧光强度(MFI)图：A)在用(Miltenyi Biotec)刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 14.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图3A和图3B为示出在从健康人类供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+ CD4+ T细胞的百分比(％)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 14.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图4A和图4B为示出在从健康人类供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+ CD8+ T细胞的中值荧光强度(MFI)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE14.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图5A和图5B为示出在从健康人类供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+ CD8+ T细胞的百分比(％)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 14.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图6A和图6B为示出在从健康人类供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+ CD19 B细胞的中值荧光强度(MFI)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE14.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图7A和图7B为示出在从健康人类供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+ CD19 B细胞的百分比(％)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 14.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图8A和图8B为示出在从人类健康供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+CD4+ T细胞的中值荧光强度(MFI)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1AF647 14.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图9A和图9B为示出在从人类健康供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+ CD4+ T细胞的百分比(％)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 AF64714.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图10A和图10B为示出在从人类健康供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+CD8+ T细胞的中值荧光强度(MFI)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1AF647 14.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图11A和图11B为示出在从人类健康供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+ CD8+ T细胞的百分比(％)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1AF647 14.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图12A和图12B为示出在从人类健康供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+CD19 B细胞的中值荧光强度(MFI)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1AF647 14.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图13A和图13B为示出在从人类健康供体获得并在以下条件下染色的血液中的PD-L1+ CD19 B细胞的百分比(％)图：A)在用刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 APC 29E.23染色；或B)在用/>刺激之后，在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1AF64714.D3染色。FMO表示荧光减一阴性门控对照。
图14A至图14C为示出在从健康供体获得并在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 PE 14.D3抗体染色的未经刺激及经刺激的血液中的A)CD4+ T细胞、B)CD8+ T细胞以及C)CD19 B细胞的中值荧光强度(MFI)图。FMO表示荧光减一阴性门控对照。Cytostim表示刺激剂。无刺激FMO：不存在抗PD-L1 PE 14.D3抗体；无刺激-药物：存在抗PD-L1 PE 14.D3抗体；无刺激+药物：存在抗PD-L1 PE 14.D3抗体和阿特珠单抗；Cytostim FMO：不存在抗PD-L1 PE 14.D3抗体；Cytostim-药物：存在抗PD-L1 PE 14.D3抗体；以及Cytostim+药物：存在抗PD-L1 PE 14.D3抗体和阿特珠单抗。
图15A至图15C为示出在从健康供体获得并在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 AF647 14.D3抗体染色的未经刺激及经刺激的血液中的A)CD4+ T细胞、B)CD8+ T细胞以及C)CD19 B细胞的中值荧光强度(MFI)图。FMO表示荧光减一阴性门控对照。Cytostim表示刺激剂。无刺激FMO：不存在抗PD-L1 AF64714.D3抗体；无刺激-药物：存在抗PD-L1 AF647 14.D3抗体；无刺激+药物：存在抗PD-L1AF647 14.D3抗体和阿特珠单抗；Cytostim FMO：不存在抗PD-L1 AF647 14.D3抗体；Cytostim-药物：存在抗PD-L1 AF647 14.D3抗体；以及Cytostim+药物：存在抗PD-L1 AF64714.D3抗体和阿特珠单抗。
图16A至图16C为示出在从健康供体获得并在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)用抗PD-L1 APC 29E.23抗体染色的未经刺激及经刺激的血液中的A)CD4+ T细胞、B)CD8+ T细胞以及C)CD19 B细胞的中值荧光强度(MFI)图。在阿特珠单抗不存在下(-药物)或在阿特珠单抗存在下(+药物)的D3抗体。FMO表示荧光减一阴性门控对照。Cytostim表示刺激剂。无刺激FMO：不存在抗PD-L1 APC 29E.23抗体；无刺激-药物：存在抗PD-L1 APC 29E.23抗体；无刺激+药物：存在抗PD-L1 APC 29E.23抗体和阿特珠单抗；Cytostim FMO：不存在抗PD-L1 APC 29E.23抗体；Cytostim-药物：存在抗PD-L1APC 29E.23抗体；以及Cytostim+药物：存在抗PD-L1 APC 29E.23抗体和阿特珠单抗。
图17为示出如通过流式细胞术所测量的在用抗PDL-1 14D3抗体染色的肝素化骨髓及全血中的多发性骨髓瘤(MM)中PD-L1的表达的图。PC表示浆细胞。BM表示骨髓。特定的细胞群在括号中加以标识。空心符号表示同一患者。
具体实施方式
I.定义
除非另外定义，否则本文所用的技术及科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology第2版，J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)，以及March，Advanced OrganicChemistry Reactions，Mechanisms and Structure第4版，John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)，为本领域技术人员提供关于本申请中使用的许多术语的一般指南。本文引用的所有参考文献(包括专利申请及公布)全部以引用的方式并入。
除非另外指出，否则本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术，其在本领域的技术范围内。以下文献中充分解释了此类技术，诸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编，1987，以及定期更新)；PCR:ThePolymerase Chain Reaction，(Mullis等人编，1994)；A Practical Guide to MolecularCloning(Perbal Bernard V.,1988)；Phage Display:A Laboratory Manual(Barbas等人，2001)。
出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括其复数，反之亦然。应理解，本文使用的术语只是为了描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。若下文阐述的任何定义与以引用的方式并入本文中的任何文献有冲突，则以下文阐述的定义为准。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。本文将描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映其是否容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生的F(ab’)2片段具有两个抗原结合位点并且仍能与抗原交联。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式存在)之外，包含该群体的各个抗体是相同的及/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“裸抗体”是指不结合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于医药制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键键合的两条相同轻链和两条相同重链组成。自N-末端至C-末端，各重链具有可变区(VH)，亦称为可变重链结构域或重链可变结构域，继之以三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，自N-末端至C-末端，各轻链具有可变区(VL)，亦称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的任一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“抗PD-L1抗体”、“抗PD-L1”、“PD-L1抗体”或“与PD-L1结合的抗体/结合PD-L1的抗体”是指能够以足够亲和力结合PD-L1的抗体，由此该抗体适用作靶向PD-L1中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施例中，例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的，抗PD-L1抗体与不相关的非PD-L1蛋白的结合程度小于该抗体与PD-L1的结合程度的约10％。在某些实施例中，与PD-L1结合的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施例中，抗PD-L1抗体与PD-L1的表位结合，该表位在来自不同物种的PD-L1中是保守的。在某些实施例中，抗PD-L1抗体与人PD-L1结合。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，所述抗体中的重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而其余重链和/或轻链来源于不同来源或物种。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在一个实施例中，对于VL，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组κI。在一个实施例中，对于VH，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组III。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，所述嵌合抗体包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有中的至少一个可变结构域，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域即可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变及/或形成结构上限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域区域中的任一个。通常，天然四链抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)发生在L1的氨基酸残基24-34、L2的氨基酸残基50-56、L3的氨基酸残基89-97、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-65，以及H3的氨基酸残基95-102处。(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)。)除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在被称为缩短CDR或a-CDR的CDR区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)发生在L1的氨基酸残基31-34、L2的氨基酸残基50-55、L3的氨基酸残基89-96、H1的氨基酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58，以及H3的氨基酸残基95-102处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)。)除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域且亦含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于Fab’片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中关于其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab’的命名。F(ab’)2抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的成对Fab’片段而产生的。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域，该C-末端区域含有恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”与“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。在某些实施例中，宿主细胞为“经分离的”宿主细胞，所述“经分离的”宿主细胞是指已自其自然环境的组分中分离的宿主细胞。
“经分离的”抗体为已自其自然环境的组分中分离的抗体。在一些实施例中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，例如通过电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)所测定。关于评定抗体纯度的方法的综述，参见，例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“经分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列一致性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列一致性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列一致性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列一致性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，并在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,California公开获得，或者可以从所述源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作系统上使用，所述UNIX操作系统包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性％(其可以替代地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列一致性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列一致性％将不等于B与A的氨基酸序列一致性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列一致性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
如本文所用的术语“载体”是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
除非另外指出，否则如本文所用的单数形式“一(a/an)”及“该/所述”包括复数个参考物。
如本文所用的术语“约”是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的实施例。
应理解，本文所述的发明的方面和实施例包括“包含”、“由以下组成”及“基本上由以下组成”所指的方面和实施例。
II.用于检测PD-L1的抗PD-L1抗体
在一个方面，本发明提供抗PD-L1抗体，其适用于例如检测和/或定量生物样本中的细胞表面上的PD-L1蛋白。在一些实施例中，抗PD-L1抗体为单克隆、嵌合或人源化的。在一些实施例中，抗PD-L1适用于检测和/或定量生物样本中的活细胞表面上的PD-L1蛋白。在一些实施例中，生物样本是外周血样本或癌症样本。在一些实施例中，生物样本是骨髓样本。在一些实施例中，生物样本包含免疫细胞或肿瘤细胞。在一些实施例中，样本来自于人受试者。在一些实施例中，抗PD-L1抗体用于使用流式细胞术检测和/或定量PD-L1蛋白。在一些实施例中，抗PD-L1抗体不与抗PD-L1参考抗体交叉竞争结合PD-L1。在一些实施例中，抗PD-L1参考抗体是阿特珠单抗。在一些实施例中，抗PD-L1抗体适用于检测已接受阿特珠单抗治疗的受试者中的PD-L1的存在。
A.用于检测PD-L1的示例性抗PD-L1抗体
一般而言，本公开的抗体免疫特异性地结合PD-L1(例如，人PD-L1)。本公开的抗体优选为单克隆的，且可为多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、小鼠抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段，以及以上任一者的PD-L1结合片段。本公开的免疫球蛋白分子可为免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
在本公开的某些实施例中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段为抗原结合片段。在某些实施例中，抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)以及包含VL或VH结构域的片段。包括单链抗体的抗原结合片段可包含单独的可变区或可变区与以下项的全部或一部分的组合：绞链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域。本公开中还包括包含可变区与绞链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域的任何组合的抗原结合片段。优选地，抗体或其抗原结合片段为人、鼠类(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。
可根据本公开的抗体所包含的特定HVR来描述或说明所述抗体。
在某些实施例中，本发明提供抗PD-L1抗体，其包含：(a)重链可变区，所述重链可变区包括：包含氨基酸序列TSWMN(SEQ ID NO:1)的HVR-H1、包含氨基酸序列RIYPRDGDTYYNGKFKD(SEQ ID NO:2)的HVR-H2和包含氨基酸序列NPGGYYFDY(SEQ ID NO:3)的HVR-H3；以及(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含：包含氨基酸序列RASQDIHTYLN(SEQID NO:4)的HVR-L1、包含氨基酸序列YTSRLHS(SEQ ID NO:5)的HVR-L2和包含氨基酸序列QQVSSLPPWT(SEQ ID NO:6)的HVR-L3。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体包含抗体14D3的一、二、三、四、五或六个HVR(Kabat)，例如，如图1A和图1B中所示。在一些实施例中，抗PD-L1抗体包含抗体14D3的VH和/或VL，例如，如图1A和图1B中所示。
在一些实施例中，提供抗PD-L1抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VH序列含有相对于参考序列的取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该VH序列的抗PD-L1抗体保留与PD-L1结合的能力。在某些实施例中，在SEQ ID NO:7中已经取代、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施例中，取代、插入或缺失出现在HVR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:7所示的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。在一具体实施例中，VH包含一、二或三个选自以下项的HVR：(a)包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的HVR-H2，以及(c)包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的HVR-H3。
在一些实施例中，提供抗PD-L1抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的VL序列含有相对于参考序列的取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该VL序列的抗PD-L1抗体保留与PD-L1抗体结合的能力。在某些实施例中，在SEQ ID NO:8中已经取代、插入和/或缺失总计1至10个氨基酸。在某些实施例中，取代、插入或缺失出现在HVR之外的区域中(即，在FR中)。任选地，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:8所示的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。在一具体实施例中，VL包含一、二或三个选自以下项的HVR：(a)包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HVR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HVR-L3。
在另一个方面，提供一种抗PD-L1抗体，其中该抗体包含如在上文提供的任一实施例中的VH以及如在上文提供的任一实施例中的VL。在一个实施例中，抗体包含SEQ ID NO:7所示的VH序列和SEQ ID NO:8所示的VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在另一个方面，提供一种抗PD-L1抗体，其中该抗体包含如在上文提供的任一实施例中的重链以及如在上文提供的任一实施例中的轻链。在一个实施例中，抗体包含SEQ IDNO:9所示的重链序列和SEQ ID NO:10所示的轻链序列，包括那些序列的翻译后修饰。
还可根据本发明的抗体与PD-L1(例如人PD-L1)的结合亲和力来描述或说明所述抗体。优选结合亲和力包括具有小于以下的解离常数或KD的那些：5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M。
在本发明进一步的方面中，根据以上实施例中任一个的抗PD-L1抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或小鼠抗体。在一个实施例中，抗PD-L1抗体是抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab'、scFv、双体抗体或F(ab')2片段。在另一实施例中，抗PD-L1抗体是全长抗体，例如，完整IgG1抗体或如本文所定义的其他抗体类别或同种型。
在本发明进一步的方面中，根据以上实施例中任一个或本文所述的抗PD-L1抗体连接或结合至异源部分或可检测的部分。在一些实施例中，可检测的部分是标记或生物素。在一些实施例中，可检测的部分是标记。在一些实施例中，可检测的部分是生物素。在一些实施例中，可检测的部分是荧光团。在一些实施例中，荧光团是R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy7、Alexa Fluor 488、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)、BV421、BV510、APC-H7、Alexa Fluor 647或别藻蓝蛋白(APC)。在一些实施例中，荧光团是R-藻红蛋白(PE)。在一些实施例中，荧光团是别藻蓝蛋白(APC)。在一些实施例中，荧光团是Alexa Fluor 647。
抗PD-L1抗体重链可变区氨基酸序列：
QVQLQQSGPELVNPGASVKISCKASGYAFSTSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPRDGDTYYNGKFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTKNPGGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:7)
抗PD-L1抗体轻链可变区氨基酸序列：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTINCRASQDIHTYLNWYQQKPDGTVKLLIFYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQVSSLPPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:8)
抗PD-L1抗体重链氨基酸序列：
QVQLQQSGPELVNPGASVKISCKASGYAFSTSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPRDGDTYYNGKFKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCTKNPGGYYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG(SEQ ID NO:9)
抗PD-L1抗体轻链氨基酸序列：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTINCRASQDIHTYLNWYQQKPDGTVKLLIFYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQVSSLPPWTFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQID NO:10)
B.参考或治疗性抗PD-L1抗体
在另一个方面，本文所述的抗PD-L1抗体不与参考抗PD-L1抗体或治疗性抗PD-L1抗体交叉竞争结合PD-L1。如本文所用的术语“参考抗PD-L1抗体”和“治疗性抗PD-L1抗体”是指除本公开的抗PD-L1以外的抗PD-L1抗体。术语“参考抗PD-L1抗体”与“治疗性抗PD-L1抗体”可互换使用，但当向受试者施用该抗体时，通常使用术语“治疗性抗PD-L1抗体”。
在某些实施例中，参考或治疗性抗PD-L1抗体包含：(a)重链可变区，所述重链可变区包括：包含氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:11)的HVR-H1、包含氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:12)的HVR-H2和包含氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:13)的HVR-H3；以及(b)轻链可变区，所述轻链可变区包括：包含氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:14)的HVR-L1、包含氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:15)的HVR-L2和包含氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:16)的HVR-L3。
在一些实施例中，参考或治疗性抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PD-L1抗体包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区与具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的重链可变区具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，所述轻链可变区与具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的轻链可变区具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。
在一些实施例中，参考或治疗性抗PD-L1抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。在一些实施例中，抗PD-L1抗体包含重链和轻链，所述重链与具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的重链具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，所述轻链与具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的轻链具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。
在一些实施例中，参考或治疗性抗PD-L1抗体是阿特珠单抗
在一些实施例中，参考或治疗性抗PD-L1抗体是单克隆、嵌合或人源化的。
示例性参考或治疗性抗PD-L1抗体重链可变区氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)
示例性参考或治疗性抗PD-L1抗体轻链可变区氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:18)
示例性参考或治疗性抗PD-L1抗体重链氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:19)
示例性参考或治疗性抗PD-L1抗体轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:20)
C.产生方法
以下是对用于产生根据本发明使用的抗体的示例性技术的描述。
i.多克隆抗体
本发明的抗体可包含多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法对于熟练技术人员是已知的。可例如通过进行一次或多次免疫剂及(若需要)佐剂注射在哺乳动物体内产生多克隆抗体。通常，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射注入哺乳动物体内。免疫剂可包括抗PD-L1、其抗原结合片段或其融合蛋白。使免疫剂缀合至已知在进行过免疫的哺乳动物中有免疫原性的蛋白质可以是有用的。此类免疫原性蛋白的示例包括但不限于匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白及大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的示例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成的海藻糖棒杆菌分枝菌酸二酯(trehalosedicorynomycolate))。免疫方案可由本领域技术人员在无不当实验下选择。然后可对哺乳动物采血，并且分析血清中的抗PD-L1抗体滴度。若需要，则可对哺乳动物进行加强直至抗体滴度提高或稳定。
ii.单克隆抗体
本发明的抗体可替代地为单克隆抗体。单克隆抗体可使用首先由Kohler等人，Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制得，或可藉由重组DNA方法(参见，例如美国专利No.4,816,567)制得。
在杂交瘤方法中，如上所述对小鼠或其他适当的宿主动物(诸如仓鼠)进行免疫以引发产生或能够产生抗体的淋巴细胞，这些抗体将与蛋白质特异性结合以用于免疫。可替换地，可在活体外免疫淋巴细胞。免疫之后，将淋巴细胞分离，接着使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986))。
将由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并使其生长，该培养基含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(亦称为融合配偶体)的生长或存活的物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基通常将包括次黄嘌呤、氨喋呤及胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。
融合配偶体骨髓瘤细胞为符合以下条件的细胞：有效地融合、支持所选产抗体细胞稳定高水平地产生抗体、并且对针对未融合的亲本细胞选出的选择性培养基敏感。骨髓瘤细胞系为鼠类骨髓瘤系，诸如来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤(可获自Salk InstituteCell Distribution Center,San Diego,California USA)，以及SP-2及衍生物，例如可获自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,USA)的X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤及小鼠-人异骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Irnmunol.,133:3001(1984)；及Brodeur等人，MonoclonalAntibodyProduction Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
关于针对抗原的单克隆抗体的产生而分析其中生长杂交瘤细胞的培养基。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等人，Anal.Biochem.,107:220(1980)中所述的Scatchard分析来测定。
一旦鉴别出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，便可通过有限稀释法对该克隆进行亚克隆并通过标准方法使其生长(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice，第59-103页(Academic Press,1986))。用于此目的的合适培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可通过例如将细胞腹腔(i.p.)注射至小鼠中而在活体内作为动物中的腹水肿瘤生长。
通过常规抗体纯化程序将由亚克隆分泌的单克隆抗体适当地自培养基、腹水或血清中分离，所述常规抗体纯化程序包括诸如亲和色谱(例如，使用蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖)或离子交换色谱、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析等。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序(例如，通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)进行分离并测序。这些杂交瘤细胞充当此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染至不另外产生抗体蛋白的宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在编码抗体的DNA的细菌中的重组表达的综述论文包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)及Pliickthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在一个进一步的实施例中，单克隆抗体或抗体片段可自使用McCafferty等人，Nature,348:552-554(1990)中所述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离。Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠类抗体及人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等人，Bio/Technology,10:779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为用于构建极大噬菌体文库(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))的策略。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
原则上，通过筛选含有显示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体克隆。针对所需抗原筛选此类噬菌体文库。表达能够与所需抗原结合的Fv片段的克隆被吸附至抗原且因此与文库中的非结合克隆分离。然后将结合克隆从抗原洗脱，并且可通过附加的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。
可变结构域可以以如下形式在功能上展示于噬菌体上：单链Fv(scFv)片段，其中VH与VL经由短的柔性肽共价连接；或Fab片段，其中这些片段各自与恒定结构域融合并且非共价地相互作用，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。
VH与VL基因的谱系可藉由聚合酶链反应(PCR)单独克隆并且在噬菌体文库中随机重组，接着可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述针对抗原结合克隆对其进行搜索。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。或者，天然谱系(naive repertoire)可经克隆以便如Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)所述在无任何免疫作用下提供针对广泛非自体以及自体抗原的人抗体的单一来源。最后，还可通过以下方式来制得天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区域并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。
文库的筛选可藉由本领域中已知的各种技术完成。例如，PD-L1可用于包被吸附板的孔，在附着于吸附板的宿主细胞上表达，或在细胞分选中使用，或缀合至生物素以用于链霉亲和素包被的珠粒的捕获，或在用于淘选显示文库的任何其他方法中使用。
可通过使用如Bass等人，Proteins,8:309-314(1990)和WO 92/09690中所述的长时间洗涤与单价噬菌体展示以及如Marks等人，Biotechnol.,10:779-783(1992)中所述的低包被密度的抗原来促进具有慢解离动力学(及良好的结合亲和力)的抗体的选择。
本发明的抗PD-L1抗体中的任一种可通过以下方式获得：设计合适的抗原筛选程序以选择感兴趣的噬菌体克隆，接着如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列及合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗PD-L1抗体克隆。
iii.抗体变体
在某些实施例中，设想了本文所提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
1.取代、插入及缺失变体
在某些实施例中，提供了具有一或多个氨基酸取代的抗体变体。取代突变的感兴趣的位点包括HVR和FR。保守取代在表1中的“保守取代”标题下示出。更多实质性改变提供于表1中的“示例性取代”标题下，并且在下文中关于氨基酸侧链类别予以进一步描述。可以将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
表1
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可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
-疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
-中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
-酸性：Asp、Glu；
-碱性：His、Lys、Arg；
-影响链取向的残基：Gly、Pro；
-芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，小鼠抗体、人源化抗体或人抗体)的一或多个高变区残基。通常，为进一步研究而选择的一种或多种所得变体相对于亲本抗体将在某些生物特性(例如，提高的亲和力、降低的免疫原性)上具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，例如，其可使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可在HVR中作出改变(例如，取代)，例如，以改善抗体亲和力。可在HVR“热点”中作出此类改变，亦即，由在体细胞成熟过程期间经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)，其中对所得变体VH或VL进行结合亲和力测试。通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已在例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中进行过描述。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向突变)中的任一者将多样性引入出于成熟目的而挑选的可变基因中。接着创建二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中将若干HVR残基(例如，每次4-6个残基)随机化。参与抗原结合的HVR残基可例如使用丙氨酸扫描突变或建模来特异性地鉴别。具体而言，常常靶向HVR-H3和HVR-L3。
在某些实施例中，取代、插入或缺失可出现在一或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可在HVR“热点”或SDR之外。在以上提供的变体VH及VL序列的某些实施例中，各HVR未改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴别可被靶向突变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，荷电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展现功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。
另选地或另外地，利用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N-末端甲硫胺酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽的融合。
iv.重组方法及组合物
可使用重组方法及组合物产生抗体，例如，如美国专利No.4,816，567中所述。在一个实施例中，提供编码本文所述的抗PD-L1抗体的经分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH(例如，抗体的轻链和/或重链)的氨基酸序列。在进一步的实施例中，提供一或多个包含此类核酸的载体(例如，表达载体)。在进一步的实施例中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施例中，宿主细胞包含(例如，已经用以下各物转化)：(1)包含核酸的载体，该核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列；或(2)包含第一载体和第二载体，该第一载体包含核酸，该核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，该第二载体包含核酸，该核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在一个实施例中，宿主细胞为真核的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，YO、NSO、Sp20细胞)。在一个实施例中，提供一种制备抗PD-L1抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上所提供的包含编码该抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。
关于抗PD-L1抗体的重组产生，将编码例如如上所述的抗体的核酸分离并插入一或多个载体中以便于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利No.5,648,237、No.5,789,199和No.5,840,523。(另请参见Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，HumanaPress,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母菌等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，所述真核微生物包括这样的真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177、No.6,040,498、No.6,420,548、No.7,125,978和No.6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他示例为由SV40转化的猴肾CV 1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，例如Graham等人，J Gen Viral.36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV l)；非洲绿猴肾细胞(VER0-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MOCK；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep 02)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括DHFK CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NSO和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。
III.测定
可通过本技术领域中已知的各种测定，对本文所提供的抗PD-L1抗体的物理/化学特性和/或生物活性来进行鉴别、筛选或表征。
a.结合测定及其他测定
在一个方面，例如通过已知方法诸如ELISA、Western blot等，对本发明的抗体进行抗原结合活性测试。可通过本技术领域中已知的常用方法测量结合亲和力。在一个实施例中，通过放射性标记抗原结合测定(RIA)测量抗体的KD，该RIA如由以下测定所述用Fab形式的抗体和抗原分子进行，所述以下测定通过下列方式来测量抗原对于Fab的溶液结合亲和力：在一系列滴定的未标记抗原存在下使Fab与最小浓度的(125I)-标记抗原平衡，接着用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原(Chen等人，(1999)J.Mol.Biol 293:865-881)。为了确定用于测定的条件，在50mM碳酸钠(pH 9.6)中用5ug/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，且随后在室温(大约23℃)下在PBS中用2％(w/v)牛血清白蛋白阻断二至五小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与感兴趣的Fab的系列稀释液(遵循在Presta等人，(1997)Cancer Res.57:4593-4599中抗VEGF抗体(Fab-12)的评定)混合。接着将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如，65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板以在室温下温育一小时。随后移除溶液并且用在PBS中的0.1％Tween-20洗涤该板八次。当板已干燥时，添加150ul/孔的闪烁体(MicroScint-20；Packard)，并且在Topcountγ计数器(Packard)上对板计数十分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度以用于竞争性结合测定中。
根据另一实施例，在25℃下，用经固定化的抗原CM5芯片，在10个响应单位(RU)下，使用或/>仪器(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)，通过表面等离子体共振测定测量KD。简而言之，根据供应商说明书，用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化的葡聚糖生物感测器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。将抗原用10mM醋酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(0.2μM)，之后以5μL/分钟的流率进行注射以获得大约10响应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原之后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。关于动力学测量，在25℃下，以大约25μL/min的流率，注射在含有0.05％TWEEN 20TM表面活性剂(PBST)的PBS中的Fab的两倍系列稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单的一对一Langmuir结合模型(/>Evaluation Software 3.2版)，通过同时拟合缔合与解离感测器图来计算缔合速率(kon)与解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。若通过上述表面等离子体共振测定得出缔合速率超过106M-1s-1，则可通过使用荧光淬灭技术测定缔合速率，即如在分光计诸如配备止流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯所测量的，在浓度渐增的抗原存在下，测量PBS pH 7.2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少。
在另一个方面，竞争测定可用于确定本文所述的抗PD-L1抗体是否与本文所述的治疗性或参考抗体竞争结合PD-L1。在某些实施例中，用于确定本文所述的抗PD-L1抗体是否与本文所述的治疗性或参考抗体竞争结合PD-L1的竞争测定为流式细胞术。在某些实施例中，这种竞争抗体与PD-L1的相同表位(例如，线性或构象性表位)结合。关于绘制抗体所结合的表位的详细示例性方法提供于Methods in Molecular Biology(Humana Press,Totowa,NJ)中的Morris(1996)"Epitope Mapping Protocols"里。在一些实施例中，本文所述的抗PD-L1抗体不与本文所述的治疗性或参考抗体竞争结合PD-L1。在一些实施例中，若在竞争测定中抗PD-L1抗体将治疗性或参考抗体与PD-L1的结合阻断了小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％，则该抗体不与本文所述的治疗性或参考抗体竞争结合PD-L1。在一些实施例中，若在竞争测定中抗PD-L1抗体将治疗性或参考抗体与PD-L1的结合阻断了大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％，则该抗体与本文所述的治疗性或参考抗体竞争结合PD-L1。在一些实施例中，PD-L1是人PD-L1。
在示例性竞争测定中，将固定化PD-L1在包含第一标记抗体(例如，第一标记抗PD-L1抗体)和第二未标记抗体(例如，第二未标记抗PD-L1抗体)的溶液中温育，该第一标记抗体与PD-L1抗体结合，所测试的是该第二未标记抗体与该第一抗体竞争结合PD-L1的能力。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化PD-L1在包含第一标记抗体而非包含第二未标记抗体的溶液中温育。在容许第一抗体与PD-L1结合的条件下温育之后，去除过量未结合的抗体，并且测量与固定化PD-L1缔合的标记的量。若与固定化PD-L1缔合的标记的量相对于对照样本在测试样本中基本上减少，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合PD-L1。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。还可以使用用PD-L1转染并在细胞表面上表达PD-L1的细胞，通过FACS以如上所述的方式来执行竞争测定。另外，采用PD-L1的ELISA亦可用于竞争测定中。在一些实施例中，竞争测定为流式细胞术。
IV.使用抗PD-L1抗体的方法
本公开的某些方面涉及检测或定量例如来自患有癌症的受试者的生物样本中的人PD-L1的表达水平，以评定例如受试者对治疗性抗PD-L1抗体治疗的反应性的方法。如本文所公开且不希望受理论约束，PD-L1的表达水准，例如在生物样本中的细胞表面上表达的人PD-L1水平，可用于诊断癌症(例如，表达PD-L1的癌症)并且评定对癌症疗法(例如，治疗性抗PD-L1抗体治疗)的反应性。如本文所公开，本公开的抗PD-L1抗体不与治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)竞争结合人PD-L1(参见，实例1和实例2)。有利地，使用例如流式细胞术测定，本公开的抗PD-L1抗体可用于定量来自免疫和肿瘤细胞并且在治疗性抗PD-L1抗体(诸如阿特珠单抗)存在下的PD-L1表达。这与其他市售的抗PD-L1抗体(诸如PD-L1克隆29E.23)形成对比，该市售抗体与治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)竞争结合人抗PD-L1，因此不能用于定量免疫和肿瘤细胞表面上的PD-L1表达。
本公开的方法可尤其用于：调节/调整/确定/选择患有癌症且将用/已用/正用治疗性抗PD-L1抗体治疗的受试者的给药；选择患有癌症的受试者以使用治疗性抗PD-L1抗体予以治疗；评定受试者对治疗性抗PD-L1抗体的反应性；评定患有癌症且用治疗性抗PD-L1抗体治疗的受试者的无进展存活；评定患有癌症且用治疗性抗PD-L1抗体治疗的受试者中的肿瘤负荷；预测患有癌症且用治疗性抗PD-L1抗体治疗的受试者中的癌症进展；诊断患有表达PD-L1的癌症的受试者；诊断患有对治疗性抗PD-L1抗体治疗有反应的癌症的受试者；以及诊断患有癌症且用治疗性抗PD-L1抗体治疗的受试者中的癌症进展。癌症的示例可包括但不限于多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和/或急性髓性白血病。在一些实施例中，癌症为表达PD-L1的癌症。
如本文所提供的抗PD-L1抗体中的任一种适用于检测生物样本中的PD-L1的存在。在某些实施例中，如本文所提供的抗PD-L1抗体中的任一种适用于定量生物样本中的PD-L1水平。在某些实施例中，如本文所述的抗PD-L1抗体中的任一种适用于检测包含免疫细胞的生物样本中的PD-L1的存在。在某些实施例中，如本文所述的抗PD-L1抗体中的任一种适用于检测包含肿瘤细胞的生物样本中的PD-L1的存在。在某些实施例中，如本文所述的抗PD-L1抗体中的任一种适用于检测包含活细胞的生物样本中的PD-L1的存在。在某些实施例中，如本文所述的抗PD-L1抗体中的任一种适用于检测生物样本中的PD-L1的存在，其中该生物样本来自于已用治疗性抗PD-L1抗体治疗的受试者。在某些实施例中，如本文所提供的抗PD-L1抗体中的任一种适用于使用例如流式细胞术、免疫测定(例如基于ELISA的测定和亲近延伸测定)、免疫印迹(Western blotting)、肽微阵列、免疫组织化学和/或质谱法检测生物样本中的PD-L1的存在。在某些实施例中，如本文所提供的抗PD-L1抗体中的任一种适用于检测生物样本中的PD-L1的存在，其中该生物样本为血液样本。在某些实施例中，如本文所提供的抗PD-L1抗体中的任一种适用于检测生物样本中的PD-L1的存在，其中该生物样本为骨髓样本。
检测标记
在一些实施例中，抗PD-L1抗体与符合以下条件的任何标记部分缀合，即该标记部分可经由反应性部分、活化部分或反应性半胱氨酸硫醇基共价地附着至抗体(Singh等人(2002)Anal.Biochem.304:147-15；Harlow E.和Lane,D.(1999)Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification，第2版，CRCPress,Boca Raton,FL)。附着标记可用于：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用以修改由第一标记或第二标记所提供的可检测信号，例如以便产生FRET(荧光共振能量转移)；(iii)稳定化与抗原或配体的相互作用或提高其结合亲和力；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数影响移动性，例如，电泳移动性或细胞渗透性；或(v)提供捕获部分，以调节配体亲和力、抗体/抗原结合或离子复合。
荧光标记诸如稀土螯合物(铕螯合物)；荧光素类型，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；玫瑰红类型，包括TAMRA；丹磺酰；丽丝胺(Lissamine)；花青；藻红蛋白；得克萨斯(Texas)红；及其类似物。可使用例如Current Protocols in Immunology，出处同上中所公开的技术将荧光标记缀合至抗体。荧光染料和荧光标记试剂包括从Invitrogen/Molecular Probes(Eugene,Or)和Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL)商购的那些。在一些实施例中，荧光团是R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy7、Alexa Fluor 488、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)、BV421、BV510、APC-H7、Alexa Fluor647或别藻蓝蛋白(APC)。在一些实施例中，荧光团是R-藻红蛋白(PE)。在一些实施例中，荧光团是PE-Cy7。在一些实施例中，荧光团是Alexa Fluor 488。在一些实施例中，荧光团是异硫氰酸荧光素(FITC)。在一些实施例中，荧光团是多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)。在一些实施例中，荧光团是BV421。在一些实施例中，荧光团是BV510。在一些实施例中，荧光团是APC-H7。在一些实施例中，荧光团是Alexa Fluor 647。在一些实施例中，荧光团是别藻蓝蛋白(APC)。
经标记的半胱氨酸工程抗体可适用于诊断测定，例如用于检测感兴趣的抗原在特定的细胞、组织或血清中的表达。关于诊断应用，抗体通常将用可检测部分进行标记。许多标记是可获得的，其通常划分成以下类别：
放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或213Bi。放射性同位素标记的抗体适用于受体靶向成像实验。可使用Current Protocols in Immunology，第1卷和第2卷，Coligen等人编Wiley-Interscience,New York,NY,Pubs.(1991)中所述的技术，用配体试剂标记抗体，该配体试剂结合、螯合或以其他方式复合放射性同位素金属，其中该试剂与抗体的工程半胱氨酸硫醇反应。可复合金属离子的螯合配体包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA和TETA(Macrocyclics,Dallas,TX)。放射性核素可经由与本发明的抗体-药物缀合物的复合而经靶向(Wu等人(2005)Nature Biotechnology 23(9):1137-1146)。
接头试剂诸如DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚胺基丁酰氨基苄基-DOTA)可通过以下方式制备：遵循Axworthy等人((2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(4):1802-1807)的程序使氨基苄基-DOTA与用氯甲酸异丙酯(Aldrich)活化的4-马来酰亚胺基丁酸(Fluka)反应。DOTA-马来酰亚胺试剂与半胱氨酸工程抗体的游离半胱氨酸氨基酸反应并且提供在抗体上的金属复合配体(Lewis等人(1998)Bioconj.Chem.9:72-86)。螯合接头标记试剂诸如DOTA-NHS(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯)是市售的(Macrocyclics,Dallas,TX)。用放射性核素标记抗体成像的受体靶标可藉由检测并定量抗体在肿瘤组织中的渐进性积聚来提供途径活化的标志物(Albert等人(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8:1207-1210)。缀合的放射金属可在溶酶体降解之后保留在胞内。
适用作成像实验的抗体标记的金属螯合复合物公开以下文献中：US 5,342,606；US 5,428,155；US 5,316,757；US 5,480,990；US 5,462,725；US 5,428,139；US 5,385,893；US 5,739,294；US 5,750,660；US 5,834,456；Hnatowich等人(1983)J.Immunol.Methods 65:147-157；Meares等人(1984)Anal.Biochem.142:68-78；Mirzadeh等人(1990)Bioconjugate Chem.1:59-65；Meares等人(1990)J.Cancer1990，增刊10:21-26；Izard等人(1992)Bioconjugate Chem.3:346-350；Nikula等人(1995)Nucl.Med.Biol.22:387-90；Camera等人(1993)Nucl.Med.Biol.20:955-62；Kukis等人(1998)J.Nucl.Med.39:2105-2110；Verel等人(2003)J.Nucl.Med.44:1663-1670；Camera等人(1994)J.Nucl.Med.21:640-646；Ruegg等人(1990)Cancer Res.50:4221-4226；Verel等人(2003)J.Nucl.Med.44:1663-1670；Lee等人(2001)Cancer Res.61:4474-4482；Mitchell等人(2003)J.Nucl.Med.44:1105-1112；Kobayashi等人(1999)Bioconjugate Chem.10:103-111；Miederer等人(2004)J.Nucl.Med.45:129-137；DeNardo等人(1998)ClinicalCancer Research 4:2483-90；Blend等人(2003)Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals 18:355-363；Nikula等人(1999)J.Nucl.Med.40:166-76；Kobayashi等人(1998)J.Nucl.Med.39:829-36；Mardirossian等人(1993)Nucl.Med.Biol.20:65-74；Roselli等人(1999)Cancer Biotherapy&Radiopharmaceuticals,14:209-20。
各种酶-底物标记是可获得或公开的(US 4275149)。该酶一般催化可使用各种技术测量的显色底物的化学改变。例如，该酶可催化底物中的颜色变化，该变化可经由分光光度法来测量。或者，该酶可改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光中的变化的技术如上所述。化学发光底物藉由化学反应变成电子激发态且接着可发射可经测量的光(使用例如化学发光计)或将能量提供给荧光受体。酶标记的示例包括荧光素酶(例如，荧光虫荧光素酶和细菌荧光素酶；US 4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪酮(2,3-dihydrophthalazinediones)、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合至抗体的技术描述于Methods in Enzym.中的O'Sullivan等人(1981)“Methods for the Preparation of Enzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay”(J.Langone&H.Van Vunakis编)，AcademicPress,New York,73:147-166里。酶-底物组合的示例包括例如：(i)辣根过氧化物酶(HRP)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸盐；以及(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如，对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷酶。本领域技术人员可利用许多其他酶-底物组合。关于一般综述，参见US 4275149和US 4318980。
标记可与氨基酸侧链、活化的氨基酸侧链、半胱氨酸工程抗体等间接缀合。例如，抗体可与生物素缀合并且以上提及的三大类标记中的任一者可与亲和素或链霉亲和素缀合，或反之亦然。生物素与链霉亲和素选择性结合，并且因此，标记可以用这种间接方式与抗体缀合。或者，为了使标记与多肽变体间接缀合，多肽变体与小型半抗原(例如，地高辛)缀合并且以上提及的不同类型标记中的一者与抗半抗原多肽变体(例如，抗地高辛抗体)缀合。因此，可达成标记与多肽变体的间接结合(Hermanson,G.(1996)发表于BioconjugateTechniques Academic Press,San Diego)。
检测标记可适用于定位、目测及定量结合或识别事件。本发明的标记抗体可检测细胞-表面受体。可检测地标记的抗体的另一用途是基于珠粒的免疫捕获方法，包含将珠粒与荧光标记抗体缀合并在配体结合之后检测荧光信号。相似的结合检测方法利用表面等离子体共振(SPR)效应来测量并检测抗体-抗原相互作用。
检测标记诸如荧光染料及化学发光染料(Briggs等人(1997)"Synthesis ofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and AminoAcids,"J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1:1051-1058)提供可检测信号且通常适用于优选具有下列特性的标记抗体：(i)标记抗体将在低背景下产生极高信号以便可在无细胞和基于细胞的测定中灵敏地检测出少量抗体；以及(ii)标记抗体将为光稳定的以便可在无显著光致漂白下观察、监测并记录荧光信号。对于涉及标记抗体与膜或细胞表面(特别是活细胞)的细胞表面结合的应用，标记优选地(iii)具有良好的水溶性以实现有效缀合物浓度和检测灵敏度，并且(iv)对活细胞无毒，如此不会破坏细胞的正常代谢过程或引起过早的细胞死亡。
细胞荧光强度的直接定量及荧光标记事件的枚举，例如肽-染料缀合物的细胞表面结合，可在用活细胞或珠粒自动执行混合读取(mix-and-read)、非放射性测定的系统(8100 HTS System,Applied Biosystems,Foster City,Calif.)上进行(Miraglia,"Homogeneous cell-and bead-based assays for high throughputscreening using fluorometric microvolume assay technology",(1999)J.ofBiomolecular Screening 4:193-204)。标记抗体的用途还包括细胞表面受体结合测定、免疫捕获测定、荧光连接免疫吸附测定(FLISA)、半胱天冬酶裂解(Zheng,"Caspase-3controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediatedapoptosis in vivo",(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:618-23；US 6,372,907)、凋亡(Vermes,"A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluoresceinlabelled Annexin V"(1995)J.Immunol.Methods 184:39-51)以及细胞毒性测定。荧光微量测定技术可用于鉴定藉由靶向细胞表面的分子的上调或下调(Swartzman,"Ahomogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening usingfluorometric microvolume assay technology",(1999)Anal.Biochem.271:143-51)。
本公开的标记抗PD-L1抗体可通过诸如以下的各种生物医学和分子成像方法和技术用作成像生物标志物和探针：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)MicroCT(计算机断层扫描)；(iii)SPECT(单光子发射计算机断层扫描)；(iv)PET(正电子发射断层扫描)Chen等人(2004)Bioconjugate Chem.15:41-49；(v)生物发光；(vi)荧光；以及(vii)超声。免疫闪烁扫描是一种成像程序，其中向动物或人患者给予用放射性物质标记的抗体并拍摄抗体定位的身体部位的图片(US 6528624)。可将成像生物标志物作为正常生物过程、病理过程或对治疗干预的药理学反应的指标进行客观测量和评估。生物标志物可具有若干类型：0型为疾病的自然病史标志物并且纵向地与已知临床指数相关，例如，在类风湿性关节炎中的滑液炎症的MRI评定；I型标志物根据作用机制捕获干预效应，尽管该机制可与临床结果不相关；II型标志物用作替代终点，其中生物标志物的变化或来自生物标志物的信号预测“验证”靶向反应的临床益处，诸如在类风湿性关节炎中藉由CT测量骨侵蚀。成像生物标志物因此可提供关于以下的药效学(PD)治疗信息：(i)靶蛋白的表达；(ii)治疗剂与靶蛋白的结合，亦即选择性；以及(iii)清除率和半衰期药物动力学数据。体内成像生物标志物相对于基于实验室的生物标志物的优势包括：非侵入式治疗、可量化、全身评定、重复给药及评定(亦即多个时间点)、以及自临床前(小动物)至临床(人)结果的潜在可转移效应。对于一些应用，生物成像代替或使临床前研究中的动物实验数量最小化。
生物样本
在某些实施例中，生物样本是生物流体，诸如全血或全血组分，包括红血球、白血球、血小板、血清和血浆、腹水、玻璃状液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊水、乳汁、唾液、痰液、泪、汗、黏液、脑脊液、尿及身体的其他成分。在某些实施例中，生物样本是外周血样本。在某些实施例中，生物样本是骨髓样本。在某些实施例中，生物样本是癌症样本。在某些实施例中，生物样本是肿瘤活检。在各种实施例中，样本是来自任何动物的身体样本。在各种实施例中，样本是来自人的样本。在某些实施例中，样本包含活细胞。在某些实施例中，样本包含免疫细胞。在某些实施例中，样本包含肿瘤细胞。
因此，本公开的某些方面涉及用于检测从受试者获得的生物样本中的PD-L1的方法，该方法包括以下步骤：使生物样本与如本文所述的抗体或抗原结合片段接触并检测抗体或抗原结合片段与生物样本中的PD-L1的结合，由此检测生物样本中的PD-L1。在一些实施例中，使用以下方法检测抗体或抗原结合片段：流式细胞术、免疫测定(例如基于ELISA的测定和亲近延伸测定)、免疫印迹(Western blotting)、肽微阵列、免疫组织化学和/或质谱法。在某些实施例中，使用流式细胞术检测抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，生物样本是血液样本。在一些实施例中，生物样本是骨髓样本。在一些实施例中，生物样本是细胞或组织。在一些实施例中，细胞或组织是癌细胞或癌组织。在一些实施例中，生物样本包含活细胞。在一些实施例中，受试者患有癌症。在一些实施例中，癌症为表达PD-L1的癌症。在一些实施例中，癌症为多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和/或急性髓性白血病。在一些实施例中，生物样本获得自已经施用了本公开的治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的受试者。在一些实施例中，治疗性抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含阿特珠单抗的三个HVR(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)氨基酸序列，所述轻链可变区包含阿特珠单抗的三个HVR(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)氨基酸序列。在一些实施例中，治疗性抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗的重链可变区氨基酸序列和阿特珠单抗的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施例中，治疗性抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗的重链氨基酸序列和阿特珠单抗的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，治疗性抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。在一些实施例中，受试者是人。
预测/监测/评定反应性
在某些实施例中，本公开的方法涉及通过以下方式监测受试者中的癌症治疗的方法：使第一生物样本与本公开的抗PD-L1抗体或抗原结合片段接触；检测抗体或抗原结合片段与第一生物样本中的PD-L1的结合；测定第一生物样本中存在的PD-L1的量；使第二生物样本与本公开的抗PD-L1抗体或抗原结合片段接触，其中第二生物样本是在用治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段(例如，阿特珠单抗)治疗后获得的；检测抗体或抗原结合片段与第二生物样本中的PD-L1的结合；测定第二生物样本中存在的PD-L1的量；以及将第一生物样本中存在的PD-L1的量与第二生物样本中存在的PD-L1的量进行比较。
在一些实施例中，与第一生物样本相比第二生物样本中存在的PD-L1的量的增加表明受试者对治疗性抗PD-L1抗体的治疗无反应。在一些实施例中，与第一生物样本相比第二生物样本存在的PD-L1的量的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％增加表明受试者对治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)无反应。
在一些实施例中，与第一生物样本相比第二生物样本中存在的PD-L1的量的减少表明受试者对治疗性抗PD-L1抗体的治疗有反应。在一些实施例中，与第一生物样本相比第二生物样本中存在的PD-L1的量的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％减少表明受试者对治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)的治疗有反应。
在一些实施例中，第一生物样本是在用治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段治疗之前从受试者获得的。在一些实施例中，第二生物样本是在用治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段治疗之后从受试者获得的。在一些实施例中，第一生物样本和第二生物样本是血液样本。在一些实施例中，第一生物样本和第二生物样本是骨髓样本。在一些实施例中，第一生物样本和第二生物样本是细胞或组织。在一些实施例中，细胞或组织是癌细胞或癌组织。在一些实施例中，第一生物样本和第二生物样本包含活细胞。在一些实施例中，受试者患有的癌症为多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和/或急性髓性白血病。在一些实施例中，受试者患有癌症。在一些实施例中，癌症为表达PD-L1的癌症。在一些实施例中，癌症为多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和/或急性髓性白血病。在一些实施例中，生物样本获得自已经施用了本公开的治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的受试者。在一些实施例中，治疗性抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含阿特珠单抗的三个HVR(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)氨基酸序列，所述轻链可变区包含阿特珠单抗的三个HVR(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)氨基酸序列。在一些实施例中，治疗性抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗的重链可变区氨基酸序列和阿特珠单抗的轻链可变区氨基酸序列。在一些实施例中，治疗性抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗的重链氨基酸序列和阿特珠单抗的轻链氨基酸序列。在一些实施例中，治疗性抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。在一些实施例中，使用以下方法检测抗体或抗原结合片段：流式细胞术、免疫测定(例如基于ELISA的测定和亲近延伸测定)、免疫印迹(Western blotting)、肽微阵列、免疫组织化学和/或质谱法。在某些实施例中，使用流式细胞术检测抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，受试者是人。
在某些实施例中，本公开的方法涉及用于评定、监测或预测患有癌症(例如，表达PD-L1的癌症)的受试者对治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)治疗的反应性的方法。在一些实施例中，该方法包括：在第一时间点测量或检测从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平，以及在第二时间点测量或检测从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点是在施用治疗性抗PD-L1抗体之后。在一些实施例中，受试者未曾接受过治疗性抗PD-L1抗体。在一些实施例中，受试者正在进行治疗性抗PD-L1抗体的治疗。
在一些实施例中，该方法包括：在第一时间点测量或检测从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平；向受试者施用治疗有效量的治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)；以及在第二时间点测量或检测从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第一时间点是在向受试者施用治疗性抗PD-L1抗体之前。在一些实施例中，第二时间点是在施用治疗性抗PD-L1抗体之后。在一些实施例中，受试者未曾接受过治疗性抗PD-L1抗体。在一些实施例中，受试者正在进行治疗性抗PD-L1抗体的治疗。
在一些实施例中，该方法包括基于与第一时间点相比在第二时间点下从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平，将受试者分为对治疗性抗PD-L1抗体的治疗有反应或无反应，其中在第二时间点下PD-L1表达水平的减少表明受试者对或可对治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)的治疗有反应。
在一些实施例中，自第一时间点至第二时间点在PD-L1的表达水平上小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％的下降、无下降，或大于1％、大于2％、大于3％、大于4％、大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于100％的升高表明受试者对治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)无反应。在一些实施例中，自第一时间点至第二时间点在PD-L1的表达水平上无下降表明受试者对治疗性抗PD-L1抗体无反应。在一些实施例中，自第一时间点至第二时间点在PD-L1的表达水平上的升高表明受试者对治疗性抗PD-L1抗体无反应。
在一些实施例中，自第一时间点至第二时间点在PD-L1的表达水平上至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的下降表明受试者对治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)有反应。
在一些实施例中，反应性可指的是治疗功效。本领域技术人员应理解，治疗功效的许多量度及其组合可为有用的。在一些实施例中，治疗功效可包括肿瘤反应(例如，肿瘤尺寸、生长或组织学分期的稳定化或缩减)。在一些实施例中，治疗功效可包括延长存活期(例如，一年、5年、无病或总体)、提高生活质量、延缓进展速度或降低发病率。此类因素可例如通过使用统计工具诸如逻辑回归、Cox比例风险回归或Kaplan-Meier估计来评定。
继续/中止/调整治疗
如本文所公开，在施用治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)之后对来自受试者的样本中的PD-L1的表达水平进行的测量可用于指导后续治疗，例如，继续治疗性抗PD-L1抗体治疗、中止治疗性抗PD-L1抗体治疗或调整治疗性抗PD-L1抗体治疗。因此，在某些实施例中，本公开的方法涉及用于调整患有癌症(例如，表达PD-L1的癌症)的受试者中的治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)的治疗的方法。在一些实施例中，该方法包括：在第一时间点测量或检测从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平；向受试者施用治疗有效量的治疗性抗PD-L1抗体；在第二时间点测量或检测从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平；以及基于第一时间点与第二时间点之间PD-L1表达水平的变化来调整向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体的量。在一些实施例中，第一时间点是在向受试者施用治疗性抗PD-L1抗体之前。在一些实施例中，第二时间点是在施用治疗性抗PD-L1抗体之后。
在一些实施例中，调整向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体的量包括将向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体维持在相同水平。
在一些实施例中，调整向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体的量包括提高向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体的水平。提高向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体的水平可能是指但不限于以下一或多者：增加向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体的量、剂量、剂量的数量或频率，或浓度。
在一些实施例中，调整向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体的量包括降低向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体的水平。降低向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体的水平可能是指但不限于以下一或多者：减少向受试者施用的治疗性抗PD-L1抗体的量、剂量、剂量的数量或频率，或浓度。
预测癌症进展
在某些实施例中，本公开的方法涉及用于评定患有癌症(例如，表达PD-L1的癌症)的受试者中的无进展存活的方法。在一些实施例中，该方法包括：在第一时间点测量或检测从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平；向受试者施用治疗有效量的治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)；以及在第二时间点测量或检测从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第一时间点是在向受试者施用治疗性抗PD-L1抗体之前。在一些实施例中，第二时间点是在施用治疗性抗PD-L1抗体之后。
在一些实施例中，自第一时间点至第二时间点在PD-L1表达水平上至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的下降表明治疗性抗PD-L1抗体延长无进展存活。
本文还提供用于预测患有表达PD-L1的癌症的受试者中的癌症进展的方法。在一些实施例中，该方法包括：在第一时间点测量或检测从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平；向受试者施用治疗有效量的治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)；以及在第二时间点测量或检测从受试者获得的样本中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第一时间点是在向受试者施用治疗性抗PD-L1抗体之前。在一些实施例中，第二时间点是在施用治疗性抗PD-L1抗体之后。
在一些实施例中，自第一时间点至第二时间点在PD-L1表达水平上小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％的降低、无降低，或大于1％、大于2％、大于3％、大于4％、大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于100％的升高表明受试者患有可能进展的癌症。
时间点测量
在本公开的方法中，比较患有癌症(例如，表达PD-L1的癌症)的受试者中介于第一时间点(例如，基线)与第二时间点之间的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，受试者患有表达PD-L1的癌症。
在一些实施例中，第一时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)治疗之前受试者中的PD-L1的表达水平。例如，可在治疗性抗PD-L1抗体治疗之前测量受试者中的PD-L1的表达水平，并且在进行治疗性抗PD-L1抗体后续治疗之后采集的一或多个样本可尤其用于监测治疗功效、确定是否继续或中止治疗、调整治疗、监测对治疗的反应性、预测对维持治疗的反应性、预测癌症进展，诸如此类。
在一些实施例中，第一时间点用于测量或检测在以下时间下受试者中的PD-L1的表达水平：恰在治疗性抗PD-L1抗体治疗之前、或之前约10秒、之前约30秒、之前约1分钟、之前约5分钟、之前约10分钟、之前约15分钟、之前约30分钟、之前约45分钟、之前约1小时、之前约1.5小时、之前约2小时、之前约2.5小时、之前约3小时、之前约3.5小时、之前约4小时、之前约4.5小时、之前约5小时、之前约5.5小时、之前约6小时、之前约7小时、之前约8小时、之前约9小时、之前约10小时、之前约11小时、之前约12小时、之前约18小时、之前约1天、之前约2天、之前约3天、之前约4天、之前约5天、之前约6天、之前约1周、之前约2周、之前约3周或之前约4周。在一些实施例中，第一时间点用于测量或检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之前约1小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第一时间点用于测量或检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之前约4小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第一时间点用于测量或检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之前约1天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第一时间点用于测量或检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之前约3天受试者中的PD-L1的表达水平。在特定实施例中，用于治疗的治疗性抗PD-L1抗体为阿特珠单抗。
在一些实施例中，第一时间点用于测量或检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之前受试者中的PD-L1的表达水平，并且可与在第二时间点下的PD-L1的表达水平进行比较。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后受试者中的PD-L1的表达水平(例如，可在施用治疗有效量的治疗性抗PD-L1抗体的初始剂量之前的第一时间点下采集样本并且与施用治疗性抗PD-L1抗体的第一、第二、第三、第四或随后剂量之后的第二时间点下采集的样本进行比较)。在一些实施例中，第二时间点用于检测在以下时间下受试者中的PD-L1的表达水平：治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约1小时、之后约2小时、之后约3小时、之后约4小时、之后约5小时、之后约6小时、之后约7小时、之后约8小时、之后约9小时、之后约10小时、之后约11小时、之后约12小时、之后约18小时、之后约1天、之后约1.5天、之后约2天、之后约2.5天、之后约3天、之后约3.5天、之后约4天、之后约4.5天、之后约5天、之后约5.5天、之后约6天、之后约6.5天、之后约1周、之后约1.5周、之后约2周、之后约2.5周、之后约3周、之后约3.5周、之后约4周、之后约1个月、之后约1.5个月、之后约2个月、之后约2.5个月、之后约3个月、之后约3.5个月、之后约4个月、之后约4.5个月、之后约5个月、之后约5.5个月、之后约6个月、之后约6.5个月、之后约7个月、之后约7.5个月、之后约8个月、之后约8.5个月、之后约9个月、之后约9.5个月、之后约10个月、之后约10.5个月、之后约11个月、之后约11.5个月或之后约12个月。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约1小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约4小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约8小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约12小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约18小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约1天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约1.5天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约2天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约2.5天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约3天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约3.5天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约4天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约4.5天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于检测在治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约5天受试者中的PD-L1的表达水平。在特定实施例中，用于治疗的治疗性抗PD-L1抗体为阿特珠单抗。
在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在治疗性抗PD-L1抗体的任何随后或后续治疗之后受试者中的PD-L1的表达水平(例如，可在施用治疗性抗PD-L1抗体的第一剂量之后的第一时间点下采集样本并且与施用治疗性抗PD-L1抗体的第二剂量或第三剂量之后采集的样本进行比较)。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在以下时间下受试者中的PD-L1的表达水平：在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约1小时、之后约2小时、之后约3小时、之后约4小时、之后约5小时、之后约6小时、之后约7小时、之后约8小时、之后约9小时、之后约10小时、之后约11小时、之后约12小时、之后约18小时、之后约1天、之后约1.5天、之后约2天、之后约2.5天、之后约3天、之后约3.5天、之后约4天、之后约4.5天、之后约5天、之后约5.5天、之后约6天、之后约6.5天、之后约1周、之后约1.5周、之后约2周、之后约2.5周、之后约3周、之后约3.5周、之后约4周、之后约1个月、之后约1.5个月、之后约2个月、之后约2.5个月、之后约3个月、之后约3.5个月、之后约4个月、之后约4.5个月、之后约5个月、之后约5.5个月、之后约6个月、之后约6.5个月、之后约7个月、之后约7.5个月、之后约8个月、之后约8.5个月、之后约9个月、之后约9.5个月、之后约10个月、之后约10.5个月、之后约11个月、之后约11.5个月或之后约12个月。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约1小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约4小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约8小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约12小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约18小时受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约1天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约1.5天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约2天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约2.5天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约3天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约3.5天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约4天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约4.5天受试者中的PD-L1的表达水平。在一些实施例中，第二时间点用于测量或检测在任何随后或后续治疗性抗PD-L1抗体治疗之后约5天受试者中的PD-L1的表达水平。在特定实施例中，用于治疗的治疗性抗PD-L1抗体为阿特珠单抗。
在某些实施例中，第一时间点与第二时间点之间的PD-L1表达水平的变化用于评定响应于治疗性抗PD-L1抗体疗法的疾病的进展。在某些实施例中，第一时间点与第二时间点之间的PD-L1表达水平的变化用于评定响应于治疗性抗PD-L1抗体疗法的疾病稳定性。在某些实施例中，第一时间点与第二时间点之间的PD-L1表达水平的变化用于确定治疗性抗PD-L1抗体疗法的持续剂量。在某些实施例中，第一时间点与第二时间点之间的PD-L1表达水平的变化用于确定治疗性抗PD-L1抗体疗法的过程(例如，继续给药、中止给药、与第二或第三化疗剂组合给药、增加给药、减少给药、维持给药等)。在特定实施例中，用于治疗的治疗性抗PD-L1抗体为阿特珠单抗。
基线的另外实施例如下：在某些实施例中，基线是指在用治疗性抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗)治疗之前取自受试者的样本；在特定实施例中，用于治疗的治疗性抗PD-L1抗体为阿特珠单抗；在特定实施例中，基线为在用治疗性抗PD-L1抗体进行任何治疗之前采集的样本并且可用于与在用治疗性抗PD-L1抗体治疗之后采集的样本进行比较(例如，基线可在治疗性抗PD-L1抗体的第一剂量之前采集并且与治疗性抗PD-L1抗体的第一剂量、第二剂量、第三剂量、第四剂量或随后剂量之后采集的样本进行比较)；并且在特定实施例中，基线为在用治疗性抗PD-L1抗体进行任何给定治疗之前采集的样本并且可用于与在用治疗性抗PD-L1抗体进行任何随后治疗之后采集的样本进行比较(例如，基线可在治疗性抗PD-L1抗体的第一剂量之后采集并且与治疗性抗PD-L1抗体的第二剂量或第三剂量之后采集的样本进行比较)。
V.试剂盒
本发明的测定方法可以以试剂盒形式提供。在一个实施例中，此类试剂盒包含抗PD-L1抗体或含有如本文所述的抗PD-L1抗体的组合物。在一些实施例中，此类试剂盒为包括以下基本要素的封装组合：抗PD-L1抗体，以及关于如何使用这些试剂实施测定方法的说明书。在上文中定义了这些基本要素。
试剂盒可进一步包含用于抗PD-L1抗体的固相支撑体，所述固相支撑体可作为单独要素提供或者抗PD-L1抗体已固定于其上。
试剂盒还可含有其他添加剂，诸如稳定剂、洗涤与温育缓冲剂等。
试剂盒的组分可以以预定比率提供，其中各种试剂的相对量适当地变化以提供试剂在溶液中的浓度，这些浓度基本上使测定的灵敏度最大化。具体而言，这些试剂可以以包括赋形剂的干燥粉末形式提供，通常为冻干的，所述干燥粉末一旦溶解将提供具有适当浓度的试剂溶液以便与待测试的样本组合。
实例
以下实例仅用于说明性目的并且不旨在限制本发明的范畴。
实例1：抗PD-L1抗体克隆14D3特征的评价
克隆14D3是单克隆抗PD-L1抗体的特异性非竞争克隆，称为阿特珠单抗。14D3是具有IgG1同种型和κ轻链的小鼠抗体。用于生成14D3的免疫原为MOLM-1巨核细胞细胞系并且与人PD-L1以及食蟹猴PD-L1有交叉反应性。针对市售的抗人PD-L1抗体评价抗体14D3(即抗人PD-L1抗体)的竞争与非竞争特征。
方法
抗体
将两种市售抗人PD-L1抗体的PD-L1结合特征与抗PDL-1 14D3抗体的PD-L1结合特征进行比较。将两种形式的14D3抗体用于比较研究中，一种形式用藻红蛋白(PE)标记，在本文中称为抗PD-L1 PE 14D3，且另一种形式用Alexa Fluor(Af647)标记，在本文中称为抗PD-L1 AF647 14D3。商售抗体为用PE(Biolegend)标记的抗PD-L1抗体克隆29E.23，在本文中称为抗PD-L1 PE 29E.23；以及用别藻蓝蛋白(APC)(Biolegend)标记的抗PD-L1抗体克隆29E.23，在本文中称为抗PD-L1 APC 29E.23。
血液刺激
从健康人受试者获得约4mL至5mL的全血并且置于含有肝素钠作为抗凝剂的真空采血管中。准备两个15mL锥形管并且标记如下：1)无刺激的血液；以及2)有刺激的血液。各个管均用3mL健康血液填充。根据Miltenyi Biotec，推荐每mL全血使用20μl。因此，将60μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)添加至含有3mL全血的管1(即非刺激管)中，并且将60μl(Miltenyi Biotec)添加至含有3mL全血的管2中。将管上的帽松弛地固定以便容许氧气与CO2流入并流出这些管。将这些管在37℃下的CO2温育箱中放置24小时。
用阿特珠单抗阻断
五个5mL圆底试管为一组，准备四组并且分组如下：1)刺激且无药物；2)刺激+药物；3)无刺激且无药物；以及4)无刺激+药物。在刺激步骤期间温育血液样本24小时后，将100μL经刺激的血液添加至组1与组2的各试管中，而将100μL未经刺激的血液添加至组3与组4的各试管中。
阿特珠单抗充当药物用于测定的阻断部分。关于药物的制备，将2μL阿特珠单抗以100μg/mL的浓度添加至18μL PBS中以用于1:10稀释。对于标记为“+药物”的试管(即组2与组4)，将1.6μl经稀释的阿特珠单抗添加至各试管中。标记为“无药物”(即组1与组3)的试管接受1.6μL PBS。将试管藉由涡旋充分混合，并随后在室温下避光温育30分钟。
表面标志物染色
制备五种表面标志物混合物(表2)。
表2.表面标志物混合物
在与药物(即阿特珠单抗)或与PBS一起温育之后，将表面标志物的混合物添加至含有血液的各试管中，有或无抗PD-L1且有或无刺激(表2)。在添加所示量的混合物之后，添加所示量的PBS以使总混合物体积达到100μL(表3)。随后将试管在室温下避光温育30分钟。
表3.四个测试组的表面染色
活细胞或死细胞染色
使Live Dead试剂盒(Invitrogen)达到室温。试剂盒包含近IR荧光反应性染料和DMSO。通过在90mL蒸馏水中混合10mL 10X Pharm Lyse(BD Biosciences)来制备1X PharmLyse。在试管中表面染色细胞之后，将这些管涡旋并且将3mL 1X Pharm Lyse添加至各试管中。将试管再次涡旋以增强在Pharm Lyse存在下细胞的裂解。随后将试管在室温下避光温育15分钟。温育之后，将试管在300RCF/1500至1600RPM下离心5分钟。离心之后，在不妨碍细胞沉淀的情况下尽可能多地抽吸上清液。随后轻弹各试管的底部以分散细胞沉淀，之后将细胞在3mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤。将试管再次在300RCF/1500至1600RPM下离心5分钟。接着，如前所述在不妨碍细胞沉淀的情况下抽吸上清液。轻弹各试管的底部以分散细胞沉淀并且将1mL PBS添加至各试管中。选择试管以使用BioRad TC20细胞计数器进行细胞计数。若该管中的细胞计数每mL PBS超过2百万活细胞，则将浓度调节至每mL 1百万活细胞且相应地使用PBS稀释。将50μL DMSO添加至近IR荧光反应性染料管中接着进行混合，借此制备来自试剂盒的Live/Dead染料。向各试管添加1μL的量的Live-Dead染料并充分混合。将试管在室温下避光温育30分钟。温育之后，将细胞在2mL BD Pharmigen FBS中洗涤，接着在300RCF/1500至1600RPM下离心5分钟。在不妨碍细胞沉淀的情况下尽可能多地抽吸上清液。通过将3mL的16％多聚甲醛添加至45mL PBS中来制备1％多聚甲醛溶液。轻弹各试管的底部以分散细胞沉淀并且将250μL 1％多聚甲醛添加至各试管中，之后涡旋这些试管。在完成制备4小时内在BD FACSCantoTM II(BD Biosciences)上从试管样本获取信号。
建立补偿对照(表4)。为了建立补偿对照，形成含有以下各物的九个5mL圆底管：1)对照管-无染色；2)AF488/FITC；3)PE；4)PerCP；5)PE-Cy7；6)AF647/APC；7)BV421；8)BV510；以及9)APC-H7。向各管添加一滴UltraComp eBeads(Invitrogen)。以所示体积添加所示抗体(表3)。将补偿对照在室温下避光温育15-20分钟。随后将这些管在3mL BD FBS中洗涤，然后在300RCF/1500至1600RPM下离心5分钟。在不妨碍珠粒沉淀的情况下尽可能多地抽吸上清液。向各补偿对照管添加100μL的量的BD FBS以准备在BD FACSCantoTM II上获取。
表4.用于各表面标志物混合物的补偿对照
结果
观察到，当存在阿特珠单抗时，PD-L1表面表达检测水平在用商售抗PD-L1 PE29E.23抗体染色的细胞中有所降低。特定而言，通过流式细胞术的结合分析确定商售抗PD-L1 PE 29E.23抗体与阿特珠单抗竞争结合在来自健康供体的经刺激的血液中由CD4+ T细胞(图2A和图3A)、CD8+ T细胞(图4A和图5A)及CD19 B细胞(图6A和图7A)表达的PD-L1。对于在CD4+ T细胞(图8A和图9A)、CD8+ T细胞(图10A和图11A)及CD19 B细胞(图12A和图13A)中使用商售抗PD-L1 APC 29E.23抗体的测定，观察到相似的结合结果。
相反，抗PD-L1 PE 14D3抗体不与阿特珠单抗竞争结合在来自健康供体的经刺激的血液中由CD4+ T细胞(图2B和图3B)、CD8+ T细胞(图4B和图5B)及CD19 B细胞(图6B和图7B)表达的PD-L1。这些结果亦扩展至在CD4+ T细胞(图8B和图9B)、CD8+ T细胞(图10B和图11B)及CD19 B细胞(图12B和图13B)中用AF647标记的抗PD-L1 14D3抗体(即，抗PD-L1AF647 14D3抗体)。
当与未经刺激的健康血液中的结合相比时，在经刺激的健康血液中观察到，在阿特珠单抗存在下，用PE(图14)或AF647(图15)标记的抗PD-L1 14D3抗体结合CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及CD19 B细胞上的PD-L1的能力。当与未经刺激的健康血液中的结合相比时，在经刺激的健康血液中可见用APC(图16)标记的抗PD-L1 29E.23抗体与阿特珠单抗竞争结合CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及CD19 B细胞上的PD-L1。
结论
这些结果显示14D3抗体不与阿特珠单抗竞争，甚至在预期为阿特珠单抗的饱和浓度的水平下亦如此。已确定，可在检测测定中使用经标记的14D3抗体，诸如藉由流式细胞术测定，甚至在阿特珠单抗存在下定量免疫及肿瘤细胞(例如，活免疫及肿瘤细胞)表面上的PD-L1表达。然而，其他市售抗体(诸如PD-L1克隆29E.23)与阿特珠单抗竞争，因此不能用作定量PD-L1在免疫及肿瘤细胞中的表达的最佳试剂。
实例2：使用抗PD-L1 14D3抗体评价在多发性骨髓瘤中的PD-L1表达
对14D3检测患有血液学恶性肿瘤(特别是多发性骨髓瘤)的患者中的PD-L1表达的能力进行评定。
方法
新鲜骨髓及新鲜全血收集自患有多发性骨髓瘤(MM)的患者。样本也是收集自健康受试者。将骨髓及全血肝素化并且进行染色，得到如实例1中所述的包括抗PD-L1 14D3抗体的表面标志物。
结果
抗PD-L1 14D3抗体能够检测收集自患有多发性骨髓瘤且未用PD-1检查点抑制剂治疗的患者的骨髓及全血中的PD-L1的存在(图17)。
结论
14D3抗体可用于PD-L1的基线检测中，该PD-L1是由来自循环外周血的免疫细胞以及由来自诊断患有血液学恶性肿瘤(诸如多发性骨髓瘤)的患者的血液及骨髓的恶性细胞表达。
实例3：使用抗PD-L1 14D3抗体评价在急性髓性白血病和骨髓增生异常综合征中 的PD-L1表达
评定14D3在检测患有血液学恶性肿瘤(特别是急性髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS))的患者中的PD-L1表达方面的能力。
方法
新鲜骨髓及新鲜全血收集自患有急性髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)的患者。样本也是收集自健康受试者。将骨髓及全血肝素化并且进行染色，得到如实例1中所述的包括抗PD-L1 14D3抗体的表面标志物。
实例4：评价患有血液学恶性肿瘤并用阿特珠单抗治疗的受试者中的PD-L1表达
由于14D3抗体与阿特珠单抗的表位是非竞争的，所以评定14D3抗体关于其检测在给予阿特珠单抗的患者中的PD-L1表达的能力以便监测治疗性治疗的有效性。
方法
关于骨髓与血液样本中的PD-L1的基线表达来评定患有包括以下的血液学恶性肿瘤的患者：多发性骨髓瘤(MM)、急性髓性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)。如实例2中所述收集并处理样本。用连接至可检测标记诸如PE的抗PD-L1 14D3抗体进行染色，以测定PD-L1表达。使样本经受流式细胞术以测定PD-L1在患者中的基线表达。以适于治疗血液学恶性肿瘤的给药方案对患者进行阿特珠单抗治疗。在用阿特珠单抗治疗之后一或多个时间点下收集血液及骨髓样本。将样本如上所述处理并用连接至可检测标记(例如，PE)的抗PD-L1 14D3抗体染色。测定来自经治疗的患者的细胞(诸如活的免疫细胞和/或肿瘤细胞)中的PD-L1表达，如藉由通过流式细胞术检测经标记的抗PD-L1 14D3抗体所测定。
序列表
<110> 基因泰克公司(Genentech, Inc.)
D·金姆（Kim, Doris）
T·王（Wong, Terence）
A·春塔拉帕伊（Chuntharapai, Anan）
C·L·格林（Green, Cherie Louise）
<120> 抗PD-L1抗体及使用其检测PD-L1的方法
<130> 14639-20401.40
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/593,125
<151> 2017-11-30
<160> 22
<170> 用于 Windows 4.0 版的 FastSEQ
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Thr Ser Trp Met Asn
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Arg Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Asn Pro Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Thr Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gln Gln Val Ser Ser Leu Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Asn Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Thr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Lys Asn Pro Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Val Ser Ser Leu Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Asn Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Thr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Lys Asn Pro Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn
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Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr
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195 200 205
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Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
245 250 255
Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
260 265 270
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
275 280 285
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val
290 295 300
Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu
340 345 350
Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys
355 360 365
Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn
370 375 380
Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys
405 410 415
Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly
420 425 430
Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
435 440 445
<210> 10
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Val Ser Ser Leu Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130 135 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145 150 155 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180 185 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 12
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 17
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 20
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 21
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列 (Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (44)

1.一种分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
(a)重链可变区，包含：
(i)HVR-H1，其如氨基酸序列TSWMN(SEQ ID NO:1)所示；
(ii)HVR-H2，其如氨基酸序列RIYPRDGDTYYNGKFKD(SEQID NO:2)所示，以及
(iii)HVR-H3，其如氨基酸序列NPGGYYFDY(SEQ ID NO:3)所示，以及
(b)轻链可变区，包含：
(i)HVR-L1，其如氨基酸序列RASQDIHTYLN(SEQ ID NO:4)所示；
(ii)HVR-L2，其如氨基酸序列YTSRLHS(SEQ ID NO:5)所示；以及
(iii)HVR-L3，其如氨基酸序列QQVSSLPPWT(SEQ ID NO:6)所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段不与参考抗体竞争结合人PD-L1，其中所述参考抗体包含：
(a)重链可变区，包含：
(i)HVR-H1，其如氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:11)所示；
(ii)HVR-H2，其如氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:12)所示；以及
(iii)HVR-H3，其如氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:13)所示；以及
(b)轻链可变区，包含：
(i)HVR-L1，其如氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:
14)所示；
(ii)HVR-L2，其如氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:15)所示；以及
(iii)HVR-L3，其如氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:16)所示。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述参考抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述参考抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段连接至可检测的部分。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述可检测的部分是生物素、链霉亲和素、发光剂、酶、荧光团、染料、放射性标记、生色团、金属离子、金粒子、银粒子或磁性粒子。
9.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述可检测的部分是荧光团。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述荧光团是R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy7、Alexa Fluor 488、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物(PerCP)、BV421、BV510、APC-H7、Alexa Fluor 647或别藻蓝蛋白(APC)。
11.一种分离的核酸，其编码权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
12.一种载体，其包含权利要求11所述的核酸。
13.根据权利要求12所述的载体，其特征在于，所述载体是表达载体。
14.一种宿主细胞，其包含权利要求11所述的核酸。
15.一种产生抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合产生抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据权利要求14所述的宿主细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法还包括回收由所述宿主细胞产生的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
17.权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段制备供一种用于检测从受试者获得的生物样本中的PD-L1的方法使用的试剂或试剂盒的用途，所述方法包括：
(a)使所述生物样本与权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及
(b)检测所述抗体或其抗原结合片段与所述生物样本中的PD-L1的结合，从而检测所述生物样本中的PD-L1。
18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，使用流式细胞术检测所述抗体或其抗原结合片段。
19.根据权利要求17-18中任一项所述的用途，其特征在于，所述生物样本是血液样本。
20.根据权利要求17-18中任一项所述的用途，其特征在于，所述生物样本是骨髓样本。
21.根据权利要求17-18中任一项所述的用途，其特征在于，所述生物样本是细胞或组织。
22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述细胞或组织是癌细胞或癌组织。
23.根据权利要求17-18中任一项所述的用途，其特征在于，所述生物样本包含活细胞。
24.根据权利要求17-18中任一项所述的用途，其特征在于，所述受试者患有癌症。
25.根据权利要求24所述的用途，其特征在于，所述癌症选自由多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和急性髓性白血病组成的组。
26.根据权利要求17-18中任一项所述的用途，其特征在于，所述生物样本获得自已经施用了治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的受试者，其中所述治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，包含：
(i)HVR-H1，其如氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:11)所示；
(ii)HVR-H2，其如氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:12)所示；以及
(iii)HVR-H3，其如氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:13)所示；以及
(b)轻链可变区，包含：
(i)HVR-L1，其如氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:
14)所示；
(ii)HVR-L2，其如氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:15)所示；以及
(iii)HVR-L3，其如氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:16)所示。
27.根据权利要求26所述的用途，其特征在于，所述治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
28.根据权利要求27所述的用途，其特征在于，所述治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求17-18中任一项所述的用途，其特征在于，所述受试者是人。
30.权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段制备供一种监测受试者的癌症治疗的方法使用的试剂或试剂盒的用途，所述方法包括：
(a)使自所述受试者获得的第一生物样本与权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，其中所述第一生物样本是在用治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段治疗前获得的；
(b)检测所述抗体或其抗原结合片段与所述第一生物样本中的PD-L1的结合；
(c)测定所述第一生物样本中存在的PD-L1的量；
(d)使自所述受试者获得的第二生物样本与权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，其中所述第二生物样本是在用治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段治疗后获得的；
(e)检测所述抗体或其抗原结合片段与所述第二生物样本中的PD-L1的结合；
(f)测定所述第二生物样本中存在的PD-L1的量；
(g)将所述第一生物样本中存在的PD-L1的量与所述第二生物样本中存在的PD-L1的量进行比较，
其中所述治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，包含：
(i)HVR-H1，其如氨基酸序列GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:11)所示；
(ii)HVR-H2，其如氨基酸序列AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:12)所示；以及
(iii)HVR-H3，其如氨基酸序列RHWPGGFDY(SEQ ID NO:13)所示；以及
(b)轻链可变区，包含：
(i)HVR-L1，其如氨基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:14)所示；
(ii)HVR-L2，其如氨基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO:15)所示；以及
(iii)HVR-L3，其如氨基酸序列QQYLYHPAT(SEQ ID NO:16)所示。
31.根据权利要求30所述的用途，其特征在于，与所述第一生物样本相比，所述第二生物样本中存在的PD-L1的量的增加表明所述受试者对所述治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的治疗无反应。
32.根据权利要求30所述的用途，其特征在于，与所述第一生物样本相比，所述第二生物样本中存在的PD-L1的量的减少表明所述受试者对所述治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段的治疗有反应。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的用途，其特征在于，所述第一生物样本和所述第二生物样本是血液样本。
34.根据权利要求30-32中任一项所述的用途，其特征在于，所述第一生物样本和所述第二生物样本是骨髓样本。
35.根据权利要求30-32中任一项所述的用途，其特征在于，所述第一生物样本和所述第二生物样本是细胞或组织。
36.根据权利要求35所述的用途，其特征在于，所述细胞或组织是癌细胞或癌组织。
37.根据权利要求30-32中任一项所述的用途，其特征在于，所述第一生物样本和所述第二生物样本包含活细胞。
38.根据权利要求30-32中任一项所述的用途，其特征在于，所述受试者患有的癌症选自由多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征和急性髓性白血病组成的组。
39.根据权利要求30-32中任一项所述的用途，其特征在于，所述治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
40.根据权利要求39所述的用途，其特征在于，所述治疗性抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列。
41.根据权利要求30-32中任一项所述的用途，其特征在于，使用流式细胞术检测所述抗体或其抗原结合片段。
42.根据权利要求30-32中任一项所述的用途，其特征在于，所述受试者是人。
43.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
44.一种用于检测生物样本中的PD-L1的试剂盒，其包含权利要求1-10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求43所述的组合物。
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