CN113367122A - 一种中华鲟f2精子超低温冷冻保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中华鲟F₂精子的超低温冷冻保存方法，涉及鲟鱼类精子超低温冷冻保存技术领域，包括亲鱼催产、鲜精采集、鲜精活力检测、测定精子质量、冻存液配制、精液稀释、冷藏平衡、降温入液氮等步骤，本发明根据F₂中华鲟精子特性研发出适用于F₂中华鲟精子超低温冷冻保存相关试剂的具体配方及用量，包括稀释液配方、抗冻剂配方、冻存液配方、冻存液和鲜精稀释比率、抗冻剂终浓度。结合F₂中华鲟精子超低温冷冻保存中的平衡过程与降温方法，即4‑6℃平衡15min，液氮面上10cm处平衡10min，投入‑196℃的液氮，能让精子在液氮中长期保存，解冻后精子活力最高达35％。

Description

一种中华鲟F2精子超低温冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及到鲟鱼类精子超低温冷冻保存方法，保存对象为全人工繁殖并全 淡水养殖的中华鲟子二代(F₂)的精子。

背景技术

精子冷冻保存技术应用已广为人知，在畜牧、水产方面得到了广泛的应用。 用适当的冻存液和冻存方法冷冻精子，可以使生殖周期不同步或存在地理间隔的 品系随时获得精子，实现人工繁殖；对于遗传育种学而言，可以不间断地提供配 子用于研究；同时，冷冻精子也保存了鱼类基因，实现了珍稀特有鱼类遗传种质 资源的长期保存。目前已有200多种鱼类精子获得了成功的冷冻保存，许多鱼类 冷冻精子已经达到了冷冻库及应用的目的。近年来开展的淡水鱼类精子冷冻保存 包括兴国红鲤、圆口铜鱼、大鳞副泥鳅等。鲟鱼的精子冷冻保存，已在杂交鲟、 西伯利亚鲟、中华鲟、达氏鲟、史氏鲟、匙吻鲟和俄罗斯鲟等鲟类中有较多报道， 但冻存激活后精子的活力和受精率难达到鲜精的水平。

中华鲟(Acipenser sinensis)隶属于鲟形目、鲟科、鲟属，是典型的溯河生殖 洄游性鱼类，主要分布于我国东海、黄海和渤海大陆架水域及流入其中的大型河 流中，是我国特有的古老珍稀鱼类，属国家一级水生野生保护动物，被世界自然 保护联盟列为濒危物种。

繁殖量减少的同时，中华鲟精子的质量也有下降趋势。统计1973-1976年、 1982-1984年、1988年、1998-2004年、2005-2006年5个时期野生中华鲟精子 剧烈运动时间分别为248、130、90、103和76s，寿命分别为1 788、1 579、1 205、 923和162s，可见精子的质量在下降。2012-2018年，对74尾性成熟的子一代 中华鲟实施人工催产，精子剧烈运动时间平均49.11±13.38s；寿命在平均220.75 ±56.47s。对比野生中华鲟的精子质量，子一代中华鲟精子快速运动时间和寿命 均有所下降。

为了保护中华鲟，国内采取了诸多保护措施，包括每年的增殖放流、人工繁 殖、异地圈养等，而研究中华鲟精子冷冻保存技术，可为中华鲟的人工繁殖及生 产应用提供技术支撑，对保护中华鲟种质资源具有十分重要的意义。有学者开展 了野生中华鲟精液超低温冷冻保存技术研究。但是中华鲟F₂从出生到性成熟全 程在淡水中养殖，其精子质量与野生中华鲟相比有明显的退化，因此对操作技术 的要求更高，原有的中华鲟精子超低温冷冻保存技术需要进一步改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种中华鲟子二代(F₂)精子的超低温冷冻保存方法， 包括精子采集后适当的保存方法，在最佳稀释液和抗冻剂中进行精子和冻存液混 匀后平衡，最后选择适当的冷冻方法，让精子在液氮中长期保存，解冻后精子活 力最高达35％。

本发明的技术方案如下：一种中华鲟F₂精子超低温冷冻保存方法，包括以 下具体步骤：

1)亲鱼催产：B超检查性腺，挑选性腺发育至Ⅳ期、健壮无疾病的中华鲟 F₂雄鱼，称重、根据重量注射促黄体素释放激素后放入暂养池培育；

2)鲜精采集：14-20h后采集精液在4℃冷藏避光保存；

3)鲜精活力检测：测定精子质量，在显微镜下进行观察，选择鲜精平均活 力达80％、快速运动达10秒、寿命达80秒的精子进行冻存；

4)冻存液配制：冻存液包括精子稀释液和抗冻剂，中华鲟F₂精子稀释液 用超纯水配制，配方：蔗糖23.4mmol/L，Tris 30mmol/L，KCl 0.25mmol/L， 调节pH值到8.0，置于4℃冰箱冷藏备用。采用甲醇作为抗冻剂，并提前置于4℃ 冰箱预冷。将4℃预冷的稀释液与甲醇按照4:1的体积比配制冻存液；稀释液的 冷冻保存效果与其渗透压、pH及离子组成密切相关，精子可被与精浆等渗或接 近等渗的溶液抑制；酸性溶液会降低或抑制精子运动。

5)精液稀释：精液由精浆和精子细胞组成，密度较高且有一定粘稠度，大 体积混匀，容易导致混匀不充分，精子细胞不能完全浸润到冻存液中，而且要考 虑分装时间，建议新鲜精液以100mL以内与等体积或不同体积的冻存液进行混 匀，本发明以等体积混匀。取4℃预冷的冻存液到玻璃烧杯中，取等体积预冷的 鲜精混匀，混匀后立即分装到1.8mL的冻存管，每管分装1-1.5mL，方便在短时 间内实现快速解冻，分装体积太大解冻较慢，贴管壁的精液接触水温较高，影响 冻后活力。

6)冷藏平衡：分装完成后，将冻存管装到布袋中，于4-6℃冰箱中平衡15min；

7)降温入液氮：平衡完毕，取出布袋，在液氮表面上方10cm处平衡10min 后，投入-196℃的液氮中长期保存。同一尾F₂采集的精子可重复步骤4)-7)进 行冻存。

作为优选，步骤1)中，所述的促黄体素释放激素为宁波第二激素厂生产的 “注射用促黄体素释放激素A2”，用量为1μg/kg。

作为优选，步骤2)中，采集精液的具体操作为：用有刻度带盖的500mL 广口塑料瓶采用腹部挤压法采集精液，采精时避免吸到尿液、粪便及血液。

作为优选，步骤3)中，具体操作为：在10×10倍生物显微镜下进行观察， 选择鲜精平均活力达80％、快速运动达10秒、寿命达80秒的精子进行冻存。

本发明的有益效果是：鱼类精子的超低温保存原理主要是将精子置于等渗 透压的稀释液中，抑制精子的运动，防止其被激活；同时加入适当的抗冻剂，使 冰点下降，防止在冷冻过程中冰晶的生成对精子细胞产生损伤；最后，采取适合 的降温速率和复苏方法，使精子经过液氮温区(-196℃)冷冻后恢复一定的活力， 进行生命活动。但是针对不同鱼类的精子，超低温冷冻保存过程中鲜精的活力与 寿命、稀释液配方、稀释液和鲜精的稀释比率、抗冻剂种类和浓度、冻存降温方 法、解冻温度和冻精激活液等都与解冻后精子的活力息息相关，因为野生中华鲟 生在淡水，长在海水，洄游到淡水繁殖，而中华鲟F₂生长都是纯淡水环境以及 繁殖力比野生中华鲟下降等原因，野生中华鲟精子冷冻方法已不适用于F₂，甚 至在野生中华鲟精子中应用良好的冻存方法用于F₂中华鲟精子中可能会产生较 差的效果，本发明申请人根据F₂中华鲟精子特性研发出适用于F₂中华鲟精子超 低温冷冻保存相关试剂的具体配方及用量，包括稀释液配方、抗冻剂配方、冻存 液配方、冻存液和鲜精稀释比率、抗冻剂终浓度。结合F₂中华鲟精子超低温冷 冻保存中的平衡过程与降温方法，即4-6℃平衡15min，液氮面上10cm处平衡 10min，投入-196℃的液氮，能让精子在液氮中长期保存，解冻后精子活力最高 达35％。本发明的降温方法简单易行，无需借助实验室内专门的程序降温仪，在 液氮罐中就可轻易实现，在一般的养殖基地均可完成。本发明将稀释液与抗冻剂 预先配好并预冷，比单独加稀释液混匀再加抗冻剂再次混匀的操作相比节约时间，短时间内就能可实现大批量冻存，尤其适合中华鲟等精液量大的物种。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下 具体实施例。

实施例1

实验鱼的来源：

实验鱼为F₂中华鲟，于2009年9月底由水利部中国科学院水工程生态研 究所与三峡集团中华鲟研究所共同进行中华鲟全人工繁殖获得，全淡水养殖。

中华鲟F₂精子大量冷冻保存，以350mL精液为例，说明具体操作过程：

1.亲鱼催产：B超检查性腺，挑选性腺发育至Ⅳ期健壮无疾病的中华鲟F₂雄鱼，体重60kg，注射宁波第二激素厂生产的“注射用促黄体素释放激素A2” 60μg，然后放入暂养池。

2.鲜精采集：18h后用腹部挤压法采集精液，用有刻度带盖的500mL广口 塑料瓶采集精液，采精时避免吸到尿液、粪便及血液，以免激活精子。采集的鲜 精盖好盖子，在4℃冰箱或冰盒中冷藏避光保存。

3.鲜精活力检测：采集后立即测定精子质量。在10×10倍生物显微镜下进行 观察，选择鲜精平均活力达80％、快速运动达10秒、寿命达80秒以上的精子进 行冻存。

4.冻存液配制：取4℃预冷的稀释液280mL与70mL甲醇配置冻存液，混匀 后4℃冰箱预冷。

5.精液稀释：取50mL 4℃预冷的冻存液到玻璃烧杯中，取50mL预冷的鲜 精轻柔的吹打充分混匀，混匀后立即用多通道移液器(8支枪头)分装到冻存管， 每管分装1.5mL，约分装8次完成，除去损耗，共分装约64管，分装后盖紧瓶 盖。

6.冷藏平衡：分装完成后，将64支冻存管均分到2个小布袋中，4℃冰箱平 衡15min。

7.降温入液氮：4℃平衡完毕，取出小布袋，在液氮面上10cm处平衡10min， 投入-196℃的液氮中长期保存。

8.步骤6放入冰箱后，就可再进行第2批冻存，重复5-7步骤进行批量冻存。 同时，设置定时器，15min后，第1批进行步骤7。

按照上述步骤进行操作，完成350mL鲜精的冷冻时间为3-3.5小时。

测试解冻精子活力：

测得采用本实施例方案冻存的中华鲟F₂精子解冻后精子活力达35％。

实施例2

精子稀释液的筛选，具体操作过程：

1.配置稀释液。在超纯水中加入不同比例的Tris、Sucrose(蔗糖)、KCl、 NaCl、Glucose(葡萄糖)，配制成7种精子稀释液，编号依次为S1-S7，4℃冰 箱冷藏待用，具体配方如下表。

表1中华鲟F₂精子冷冻保存稀释液配方 单位：mM

2.稀释液与精液混匀。取0.1mL的鲜精，加入等体积的精子稀释液并混匀， 镜检稀释液对精子的抑制情况。

3.激活观察。加水激活检查精子活力，如果检查精子无运动情况，说明稀 释液抑制了精子活动，可进一步加抗冻剂进行检测；如果检查精子有运动甚至剧 烈运动，则说明该稀释液没有对精子产生抑制作用，不能用于中华鲟F₂精子的 超低温冷冻保存。

4.重复2-3步骤操作，加入S1-S7的稀释液进行筛选，筛选结果表2所示， S1和S6稀释液对精子活力抑制较好，而且加水激活后精子活力和寿命均高于其 他四种；加入8％的甲醇(MeOH)冷冻后，解冻活力S1的更高，因此筛选出适 宜中华鲟F₂的精子冷冻保存稀释液为S1。

实施例3

不同浓度精子抗冻剂的筛选，具体操作过程：

1.取9支2mL冻存管，各加入S1稀释液0.5mL，再以1:1比例加入等体积 新鲜精液。

2.9支冻存管分成3组，分别标记5％MeOH、8％MeOH、10％MeOH组。

3.三组分别加入53μl、87μl和112μl的甲醇，使甲醇的终浓度为5％、8％ 和10％。

4.激活检测精子在3种浓度下的活力和寿命，检测结果如下表：

表3

从上表看出，中华鲟F₂在10％MeOH的冻存液中的活力和精子寿命最高， 故本发明采用该冻存液。

以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡 采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之 内。

Claims (6)

1.一种中华鲟F₂精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

1)亲鱼催产：B超检查性腺，挑选性腺发育至Ⅳ期、健壮无疾病的中华鲟F2雄鱼，称重、根据重量注射促黄体素释放激素后放入暂养池培育；

2)鲜精采集：14-20h后采集精液在4℃冷藏避光保存；

3)鲜精活力检测：测定精子质量，在显微镜下进行观察，选择鲜精平均活力达80％、快速运动达10秒、寿命达80秒的精子进行冻存；

4)冻存液配制：冻存液包括精子稀释液和抗冻剂，中华鲟F2精子稀释液用超纯水配制，配方：蔗糖23.4mmol/L，Tris 30mmol/L，KCl 0.25mmol/L，调节pH值到8.0，置于4℃冰箱冷藏备用；采用甲醇作为抗冻剂，并提前置于4℃冰箱预冷；将4℃预冷的稀释液与甲醇按照4:1的体积比配制冻存液；

5)精液稀释：取4℃预冷的冻存液到玻璃烧杯中，取等体积预冷的鲜精混匀，混匀后立即分装到1.8mL的冻存管，每管分装1-1.5mL；

6)冷藏平衡：分装完成后，将冻存管装到布袋中，于4-6℃冰箱中平衡15min；

7)降温入液氮：平衡完毕，取出布袋，在液氮表面上方10cm处平衡10min后，投入-196℃的液氮中长期保存。

2.根据权利要求1所示的中华鲟F₂精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤1)中，所述的促黄体素释放激素为：注射用促黄体素释放激素A2。

3.根据权利要求2所示的中华鲟F₂精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，所述的促黄体素释放激素用量为1μg/kg。

4.根据权利要求1所示的中华鲟F₂精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤2)中，采集精液的具体操作为：用有刻度带盖的500mL广口塑料瓶采用腹部挤压法采集精液，采精时避免吸到尿液、粪便及血液。

5.根据权利要求1所示的中华鲟F₂精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤3)中，具体操作为：在10×10倍生物显微镜下进行观察，选择鲜精平均活力达80％、快速运动达10秒、寿命达80秒的精子进行冻存。

6.根据权利要求1所示的中华鲟F₂精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，同一尾中华鲟F2采集的精子可重复步骤4)-7)进行冻存。