CN102870763A - 一种红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法 - Google Patents

一种红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法，其包括如下步骤：取材：在繁殖季节，挤压红鳍笛鲷成熟雄鱼的腹部得到红鳍笛鲷的精液，并对得到的精液进行精子活力鉴定；添加稀释液：按体积比为精液：稀释液为1:50的稀释比例加入稀释液A或稀释液B；分段降温：将精子稀释液分装入0.5mL的冷冻麦管中，将冷冻麦管放入程序降温仪中进行分段降温；液氮长期保存；解冻：用37℃的恒温水将装有精子稀释液的冷冻麦管解冻1～2min；激活精子。本发明能够使红鳍笛鲷的精子得到长期保存，利用本发明的冷冻保存方法将红鳍笛鲷精子在液氮中保存6个月后，经解冻后的精子存活率可达85％以上，受精率可达80%以上。

Description

一种红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法
技术领域
本发明涉及一种红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法，具体的说是涉及一种使用液氮超低温冷冻保存红鳍笛鲷精子的方法。
背景技术
红鳍笛鲷（Lutjanus erythopterus Bloch 1790），属硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鲈形目、笛鲷科、笛鲷属。它体表呈红色，腹部浅红色，故称“红鱼”，栖息于水深30-100米处，底质为泥、泥沙、沙泥、贝壳及岩礁等海区，每年3－5月份集群繁殖，性喜垂直运动，黄昏和早晨多栖息底层，白天和晚上常浮游中上层，每当繁殖季节，由深海游向浅海产卵，产卵后又返回深海觅食生活。
近年来，野生的红鳍笛鲷数量随着人们对海洋的开发和渔民过度捕捞而急剧减少，养殖的红鳍笛鲷经过多代人工养殖后，种质质量不高，很难保证物种基因多样性的延续。而目前，国内外尚未开展对红鳍笛鲷的精子使用液氮进行冷冻保存的研究。因此，提供一种能够长期保存红鳍笛鲷种质资源的红鳍笛鲷精子冷冻保存方法成为了红鳍笛鲷养殖业的迫切需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种不但能够保护红鳍笛鲷的物种基因多样性，而且还能保存种质质量的红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法。
本发明的目的是通过以下方案来实现的：一种红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法，其包括如下步骤：
（1）取材：在繁殖季节，挤压红鳍笛鲷成熟雄鱼的腹部得到红鳍笛鲷的精液，并对得到的精液进行精子活力鉴定；
（2）添加稀释液：按体积比为精液：稀释液为1:50的稀释比例向精液中加入稀释液A或稀释液B，将精液与稀释液A或稀释液B混匀后制成精子稀释液，在室内静置30～35 min；
（3）分段降温：将上述步骤（2）中的所述精子稀释液分装入0.5mL的冷冻麦管中，再将装有精子稀释液的冷冻麦管放入程序降温仪中进行分段降温；
（4）液氮长期保存：将上述步骤（3）中经过分段降温后的装有精子稀释液的冷冻麦管转移至液氮中进行长期保存；
（5）解冻：用37℃的恒温水将上述步骤（4）中长期保存在液氮中装有精子稀释液的冷冻麦管解冻1～2 min；
（6）激活精子：取上述步骤（5）中经过解冻的精子稀释液与等体积的灭菌海水相互混合将精子激活，最终获得具有受精能力的精子。
所述步骤（2）中稀释液A的配方组成成分为：NaCl 137.00 mM、Na2HPO4 0.42 mM、 K2HPO4 0.44 mM、NaHCO3 4.17 mM、KCl 5.37 mM、CaCl2 1.17mM、MgSO4 0.81 mM、葡萄糖5.56 mM、甘油1370.98 mM，pH为7.5。
所述步骤（2）中稀释液B的配方组成成分为：NaCl 75.17 mM、 KCl 69.90 mM、CaCl2 2.18 mM、MgSO4 1.00 mM、Tris-HCl 54.07 mM、甘油1370.98 mM，pH为8。
所述步骤（3）中分段降温的降温程序为：首先由25℃降温至-20℃，降温速度为-10℃/min；在-20℃处平衡5 min；然后由-20℃降温至-80℃，降温速度为-10℃/min；最后在-80℃处平衡5 min后直接放入液氮中。
本发明的优点在于：本发明涉及一种使用液氮超低温冷冻保存红鳍笛鲷精子的方法，该方法能够使红鳍笛鲷的精子得到长期保存，能长期保存红鳍笛鲷的种质资源。利用本发明的冷冻保存方法将红鳍笛鲷精子在液氮中保存6个月后，经解冻后的精子存活率可达85％以上，受精率可达80%以上，与红鳍笛鲷新鲜精子的活力（99.00%±1.73）与受精能力（95.52%±2.54）比较接近。而且在红鳍笛鲷这种名贵海水鱼类的杂交育种、种质保存、雌核发育、遗传多样性及可持续利用等方面有着重要意义。
本发明可以解决由于雌雄鱼地理分布不同产生生殖隔离而导致的人工繁殖困难，扩大杂交育种的范围，培养新品种，可以运用于精子基因改良等科学研究。发挥杂种优势，克服长期近亲交配造成的种的衰退，使性转换的个体得以自交。提高精液的利用率，扩大苗种生产，排除被病源感染的威胁。可为生产及研究提供长期稳定的种源，为鱼类疾病史的研究提供了材料，促进鱼类病理学的发展。精液运输更为便利，为繁殖育种节约大量的资金。     
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：选择阴天或阴凉通风处进行试验，挑选3条性成熟的能挤出精液的红鳍笛鲷雄鱼，用纱布擦净鱼体生殖孔及其周围部分，依次通过挤压其腹部挤出乳白色精液，用50mL小烧杯于生殖孔下部收集乳白色精液，混匀，用100 μL枪头吸取100 μL精液到细胞计数板上，同时吸取100 μL灭菌海水激活精子，将细胞计数板置于显微镜（×400倍）下观察活力，观察到精子快速直线运动或曲线运动视为活力高，原地转圈或不运动视为无活力；当红鳍笛鲷新鲜精子活力达到90%以上方可用于以下操作：取红鳍笛鲷精子活力达99.00%±1.7的新鲜精子，用1000 μL枪头吸取1000 μL精液到100 mL烧杯中，同时向100 mL烧杯中加入50mL事先配好的稀释液A（NaCl 137.00 mM、Na2HPO4 0.42 mM、 K2HPO4 0.44 mM、NaHCO3 4.17 mM、KCl 5.37 mM、CaCl2 1.17 mM、MgSO4 0.81 mM、葡萄糖5.56 mM、甘油1370.98 mM，pH为7.5）进行稀释并混匀，室温静置30 min；然后将稀释后的精液分装入0.5 mL冷冻麦管，将装有稀释后精液的冷冻麦管放入程序降温仪中按降温程序（25℃至-20℃，-10℃/min；-20℃处平衡5 min；-20℃至-80℃，-10℃/min；-80℃处平衡5 min）进行降温，降温完毕后，将冷冻麦管转移至液氮中长期保存。保存约6个月以后，将冷冻精液从液氮中拿出后，立即放入37℃恒温水中解冻约1 min，吸取50 μL经解冻后的冷冻精液到细胞计数板上，同时加入等体积的灭菌海水到细胞计数板上将冷冻精子激活，然后将细胞计数板置于显微镜（×400倍）下观察活力，得红鳍笛鲷冷冻精子活力达88.00%±4.58；同时另外吸取10 μL经解冻后的冷冻精液至盛有100粒红鳍笛鲷未受精成熟卵细胞的500mL烧杯中，再立即加10 μL灭菌海水至500mL烧杯中激活冷冻精子，搅拌并完成人工授精，约1 min后，向500mL烧杯中加入500mL经200目纱绢过滤的海水，并微充气，约1 h后用体式视显微镜（×50倍）观察红鳍笛鲷卵子的受精率，受精卵发育到4细胞期就认为此卵子成功受精，观察得红鳍笛鲷冷冻精子受精率达82.14%±8.19。
实施例2：同上述实施实例1相同的实验条件下，将事先配好的稀释液A改用稀释液B（NaCl 75.17 mM、KCl 69.90 mM、CaCl2 2.18 mM、MgSO4 1.00 mM、Tris-HCl 54.07 mM、甘油1370.98 mM、pH为8）进行相同实验后，得到红鳍笛鲷冷冻精子活力达86.67%±2.89，得红鳍笛鲷冷冻精子受精率达81.25%±6.28。
以上对本发明一种红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法进行了详细介绍，本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。 

Claims (4)

1.一种红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法，其特征包括如下步骤的内容：
（1）取材：在繁殖季节，挤压红鳍笛鲷成熟雄鱼的腹部得到红鳍笛鲷的精液，并对得到的精液进行精子活力鉴定；
（2）添加稀释液：按体积比为精液：稀释液为1:50的稀释比例向精液中加入稀释液A或稀释液B，将精液与稀释液A或稀释液B混匀后制成精子稀释液，在室内静置30～35 min；
（3）分段降温：将上述步骤（2）中的所述精子稀释液分装入0.5mL的冷冻麦管中，再将装有精子稀释液的冷冻麦管放入程序降温仪中进行分段降温；
（4）液氮长期保存：将上述步骤（3）中经过分段降温后的装有精子稀释液的冷冻麦管转移至液氮中进行长期保存；
（5）解冻：用37℃的恒温水将上述步骤（4）中长期保存在液氮中装有精子稀释液的冷冻麦管解冻1～2 min；
（6）激活精子：取上述步骤（5）中经过解冻的精子稀释液与等体积的灭菌海水相互混合将精子激活，最终获得具有受精能力的精子。
2.按照权利要求1所述的红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法，其特征在于：所述步骤（2）中稀释液A的配方组成成分为：NaCl 137.00 mM、Na2HPO4 0.42 mM、 K2HPO4 0.44 mM、NaHCO3 4.17 mM、KCl 5.37 mM、CaCl2 1.17 mM、MgSO4 0.81 mM、葡萄糖5.56 mM、甘油1370.98 mM，pH为7.5。
3.按照权利要求1所述的红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法，其特征在于：所述步骤（2）中稀释液B的配方组成成分为:NaCl 75.17 mM、KCl 69.90 mM、CaCl2 2.18 mM、MgSO4 1.00 mM、Tris-HCl 54.07 mM、甘油1370.98 mM，pH为8。
4.按照权利要求1、2或3中任一项权利要求所述的红鳍笛鲷精子的冷冻保存方法，其特征在于：所述步骤（3）中分段降温的降温程序为：首先由25℃降温至-20℃，降温速度为-10℃/min；在-20℃处平衡5 min；然后由-20℃降温至-80℃，降温速度为-10℃/min；最后在-80℃处平衡5 min后直接放入液氮中。
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