CN104430087A - 一种筛选太门哲罗鲑优质精子的方法 - Google Patents
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Abstract
一种筛选太门哲罗鲑优质精子的方法，它涉及一种筛选哲罗鲑优质精子的方法。他解决了目前无法确定精子质量，导致实际生产过程中受精率和孵化率低下、畸形率较高的问题。筛选方法：一、测量太门哲罗鲑的血清中睾酮和精液中Se和Ze的含量；二、选出雄鱼血清中4.9175μg/mg<睾酮<12.4951μg/mg，并且精液满足Se＞0.1024μg/mg和Ze＞11.8725μg/mg的太门哲罗鲑的精液，获得优质太门哲罗鲑精子。本发明筛选出的优质太门哲罗鲑精子受精率高，孵化率高，畸形率低，极大地提高了人工饲养太门哲罗鲑的养殖效率，节省饲养成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种筛选哲罗鲑优质精子的方法。
背景技术
太门哲罗鲑属鲑科(Salmonisdae)、哲罗鲑属(Hucho)。太门哲罗鲑主要分布在俄罗斯、中国、蒙古和日本。历史上哲罗鲑在我国广泛分布，2003年考古工作者从淹埋在沙漠中的楼兰古城的壁画中发现当时人们捕获哲罗鲑的画面。目前野生哲罗鲑在我国已属于濒危物种，仅在乌苏里江、黑龙江和新疆的哈纳斯湖有少量的繁殖群体存在。太门哲罗鲑作为我国土著冷水性鱼类的典型代表，无论从种质资源保护，还是从养殖效益考虑，都具有极其重要的科研意义和社会价值。同时太门哲罗鲑也是具有国际品牌的旅游垂钓品种，深受日本、欧美鱼类垂钓协会的重视。日本鱼类垂钓爱好者将哲罗鲑当作图腾崇拜，垂钓到它是终生吉祥平安的象征。太门哲罗鲑是凶猛肉食性鱼类，人们称老虎为山中之王，太门哲罗鲑就是名符其实的水中之王。新疆哈纳斯湖发现的“湖怪”，其中一种猜测认为“湖怪”很可能是重达数百斤的太门哲罗鲑(当地俗称大红鱼)。
作为我国少数几种土著鲑科鱼类中唯一的大型鱼类，中国水产科学研究院黑龙江水产研究所对太门哲罗鲑的研究一直非常重视。2001年人工驯养的野生幼鱼在池塘养殖环境中达到性成熟，人工繁殖出鱼苗，并养成商品鱼。这是国际上首次在人工养殖环境中太门哲罗鲑性成熟，人工繁殖成功。太门哲罗鲑是肉食性鱼类，仔鱼在自然环境中以其它鱼类的幼苗为食，2005年研究取得进一步突破，在深入研究太门哲罗鲑仔鱼消化系统发育、组织胚胎学、生理生化规律的基础上，成功实现仔鱼摄食人工饲料的规模化驯化，为哲罗鲑的规模化养殖奠定了基础。
太门哲罗鲑经过10多年的努力，目前已在云南、四川、黑龙江、辽宁、吉林和山东等全国20多个省市自治区进行了推广养殖和增殖放流，深受养殖户和社会的欢迎。近年随着哲罗鲑人工养殖产业的扩大，苗种的需求量也在成倍的增长，伴随着出现了新问题——雄性亲鱼精子质量参差不齐。
太门哲罗鲑规模化人工开发时间较短，因此太门哲罗鲑精子质量的鉴别目前仍采用传统方法，即在人工繁殖过程中由操作人员在显微镜下凭经验直观的观察精子激活后的游动时间和激活的数量。由于操作人员技术水平不同和激活后同时运动的精子数量十分庞大，很难准确的观察出精子的实际情况，且显微镜观察的方法仅仅能粗略的观察精子的活力，仅能粗略的推测精子的受精能力，无法获知精子质量的真实情况，导致实际生产过程中受精率和孵化率低下、畸形率较高。由于精子优劣混杂，难以区分，所以目前太门哲罗鲑的整体孵化率不足60％，畸形率更是高达3％以上，严重制约了哲罗鱼养殖产业的发展。
发明内容
本发明是为了解决目前无法确定精子质量，导致实际生产过程中受精率和孵化率低下、畸形率较高的问题，而提供的一种筛选太门哲罗鲑优质精子的方法。
本发明按以下步骤筛选太门哲罗鲑优质精子：
一、测量太门哲罗鲑血清中睾酮和精液中Se和Ze的含量；
二、选出雄鱼血清中4.9175μg/mg<睾酮<12.4951μg/mg，并且精液满足Se＞0.1024μg/mg和Ze＞11.8725μg/mg的太门哲罗鲑的精液，即完成太门哲罗鲑优质精子的筛选，获得优质太门哲罗鲑精子。
本发明筛选出的优质太门哲罗鲑精子受精率高于90％，孵化率高于80％，畸形率低于2.32％，极大地提高了人工饲养太门哲罗鲑的养殖效率，节省饲养成本。
本发明筛选太门哲罗鲑优质精子的方法具有早期、快速和准确的特性，而且方法简单，容易操作；能够在太门哲罗鲑精子尚未受精前，对精子质量的优劣实现早期鉴别，提前和快速的淘汰劣质精子。对太门哲罗鲑种质资源复壮和养殖产业的发展具有重大意义。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式按以下步骤筛选太门哲罗鲑优质精子：
一、测量太门哲罗鲑血清中睾酮和精液中Se和Ze的含量；
二、选出雄鱼血清中4.9175μg/mg<睾酮<12.4951μg/mg，并且精液满足Se＞0.1024μg/mg和Ze＞11.8725μg/mg的太门哲罗鲑的精液，即完成太门哲罗鲑优质精子的筛选，获得优质太门哲罗鲑精子。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一测量精液中微量元素Se和Ze的浓度按以下步骤进行：
一、将精液样本震荡混匀，然后取0.5ml加入微波消解罐，再加入2.5ml HNO3和2.5mlH2O2进行微波消解，微波消解温度在15min内由室温升高到180℃，之后180℃保温消解10min，消解结束后过滤，澄清溶液定容待测；
二、采用标准曲线法，用1％的HNO3稀释多元素标准溶液配成浓度为0、10、20、50、100和200μg/L的标准系列工作液，用美国Agilent7500电感藕合等离子体质谱仪进行测定，每尾鱼精液样本测量3个平行。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一测量血清中睾酮的浓度按以下步骤进行：
每尾雄鱼采集血清5ml，置于3500r/min的离心机中离心15min，取出采用贝克曼AccessⅡ化学发光免疫分析仪和检测试剂盒测定血清睾酮的浓度，每尾雄鱼血清样本测量3个平行。其它步骤及参数与实施方式一相同。
实施例1
一、随机取出100尾性成熟的雄性亲鱼，编号后麻醉，再依次采集精液置于对应编号的20ml小烧杯中，待人工授精使用；分别在每个小烧杯中取出0.5ml放置于对应编号的采样管中，用于测量微量元素Se和Ze；每尾雄鱼采集血清5ml，置于3500r/min的离心机中离心15min，取出血清放置对应编号的采样管中用于测量睾酮。
二、根据检测结果将精液和血清分组；
第1组血清满足4.9175μg/mg<睾酮<12.4951μg/mg，并且精液满足0.1024μg/mg<Se和11.8725μg/mg<Ze；
第2组血清满足睾酮<4.9175μg/mg，并且精液满足0.1024μg/mg<Se和11.8725μg/mg<Ze；
第3组血清满足12.4951μg/mg<睾酮，并且精液满足0.1024μg/mg<Se和11.8725μg/mg<Ze；
第4组血清满足4.9175μg/mg<睾酮<12.4951μg/mg，并且精液满足Se<0.1024μg/mg和11.8725μg/mg<Ze；
第5组血清满足4.9175μg/mg<睾酮<12.4951μg/mg，并且精液满足0.1024μg/mg<Se和Ze<11.8725μg/mg；
第6组血清满足睾酮<4.9175μg/mg，并且精液满足Se<0.1024μg/mg和11.8725μg/mg<Ze；
第7组血清满足睾酮<4.9175μg/mg，并且精液满足0.1024μg/mg<Se和Ze<11.8725μg/mg；
第8组血清满足12.4951μg/mg<睾酮，并且精液满足Se<0.1024μg/mg和11.8725μg/mg<Ze；
第9组血清满足12.4951μg/mg<睾酮，并且精液满足0.1024μg/mg<Se和Ze<11.8725μg/mg；
第10组血清满足睾酮<4.9175μg/mg，并且精液满足Se<0.1024μg/mg和Ze<11.8725μg/mg；
第11组血清满足12.4951μg/mg<睾酮，并且精液满足Se<0.1024μg/mg和Ze<11.8725μg/mg；
三、挑选成熟较好个体较大的雌性亲鱼，麻醉后采集卵子，根据发明专利申请“一种快速物理辨别太门哲罗鲑成熟卵子优劣的方法”(申请号201310589776.7)记载的方法选出优质的卵子，然后放入带有编号的100个盆子中，将对应编号的精液倒入盛放有卵子的盆子中进行人工授精。然后再将100组受精卵分别单独放入流水中孵化，待孵化10天分别测定每尾鱼的受精率，待孵化22天后测定每尾鱼的孵化率，待受精卵全部破膜后统计畸形率。
各组精液的统计数据如表1所示。
表1
| 尾数 | 受精率(％) | 孵化率(％) | 畸形率(％) | |
| 第1组 | 21 | 94 | 86 | 2.32 |
| 第2组 | 7 | 76 | 75 | 2.41 |
| 第3组 | 8 | 81 | 77 | 2.53 |
| 第4组 | 12 | 76 | 74 | 2.82 |
| 第5组 | 7 | 77 | 71 | 3.02 |
| 第6组 | 8 | 74 | 64 | 3.12 |
| 第7组 | 4 | 68 | 65 | 2.74 |
| 第8组 | 6 | 71 | 48 | 2.43 |
| 第9组 | 7 | 67 | 43 | 2.95 |
| 第10组 | 9 | 63 | 27 | 3.51 |
| 第11组 | 11 | 56 | 39 | 2.98 |
根据表1的实验数据，可以确定本发明方法可靠、稳定，能筛选出优质的太门哲罗鲑精子。
实施例2
一、随机取出100尾性成熟的雄性亲鱼，编号后麻醉，再依次采集精液置于对应编号的20ml小烧杯中，待人工授精使用；分别在每个小烧杯中取出4ml放置于对应编号的采样管中，用于显微镜下观察检测；
二、根据检测结果将精液分成优质组、中等组和劣等组；
三、挑选成熟较好个体较大的雌性亲鱼，麻醉后采集卵子，根据发明专利申请“一种快速物理辨别太门哲罗鲑成熟卵子优劣的方法”(申请号201310589776.7)记载的方法选出优质的卵子，然后放入带有编号的100个盆子中，将对应编号的精液倒入盛放有卵子的盆子中进行人工授精。然后再将100组受精卵分别单独放入流水中孵化，待孵化10天分别测定每尾鱼的受精率，待孵化22天后测定每尾鱼的孵化率，待受精卵全部破膜后统计畸形率。
各组精液的统计数据如表2所示。
表2
| 尾数 | 受精率(％) | 孵化率(％) | 畸形率(％) | |
| 优质组 | 36 | 76 | 65 | 2.83 |
| 中等组 | 31 | 74 | 67 | 3.03 |
| 劣等组 | 33 | 62 | 43 | 3.14 |
| 总体 | 100 | 70 | 58 | 3.00 |
表2说明传统检测、筛选方法准确性低。
Claims (3)
1.一种筛选太门哲罗鲑优质精子的方法，其特征在于按以下步骤筛选太门哲罗鲑优质精子：
一、测量太门哲罗鲑血清中睾酮和精液中Se和Ze的含量；
二、选出雄鱼血清中4.9175μg/mg<睾酮<12.4951μg/mg，并且精液满足Se＞0.1024μg/mg和Ze＞11.8725μg/mg的太门哲罗鲑的精液，即完成太门哲罗鲑优质精子的筛选，获得优质太门哲罗鲑精子。
2.根据权利要求1所述的一种筛选太门哲罗鲑优质精子的方法，其特征在于步骤一测量精液中微量元素Se和Ze的浓度按以下步骤进行：
一、将精液样本震荡混匀，然后取0.5ml加入微波消解罐，再加入2.5ml HNO3和2.5mlH2O2进行微波消解，微波消解温度在15min内由室温升高到180℃，之后180℃保温消解10min，消解结束后过滤，澄清溶液定容待测；
二、采用标准曲线法，用1％的HNO3稀释多元素标准溶液配成浓度为0、10、20、50、100和200μg/L的标准系列工作液，用美国Agilent7500电感藕合等离子体质谱仪进行测定，每尾鱼精液样本测量3个平行。
3.根据权利要求1所述的一种筛选太门哲罗鲑优质精子的方法，其特征在于步骤一测量血清中睾酮的浓度按以下步骤进行：
每尾雄鱼采集血清5ml，置于3500r/min的离心机中离心15min，取出采用贝克曼AccessⅡ化学发光免疫分析仪和检测试剂盒测定血清睾酮的浓度，每尾雄鱼血清样本测量3个平行。
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