CN116076485A - 一种葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻保护液及超低温冷冻保存的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻保护液及超低温冷冻保存的方法。所述冷冻保护液包括DZ0.45稀释液和10%二甲基亚砜（DMSO），所述稀释液包含营养物质，而且具有不激活精子和精子等渗的特点；所述冷冻保护液兼具了渗透性抗冻剂和非渗透性抗冻剂的功能，使精子在冷冻过程中得到了双重保护。本发明样品冻存量增大至5 mL，提高了精子的利用率，且解冻复苏后的精子能够正常受精和发育，冻精的相对受精率和相对孵化率分别达到106.76%和99.42%。本发明基于生产需求，提供了一种操作简单、抗冻效果明显、可批量保存的精子超低温冷冻保存方法，为保存葡萄牙牡蛎种质资源和打破时空限制，加快繁育优良新品种提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种葡萄牙牡蛎精子的超低温冷冻保护液及超低温冷冻保存的方法。
背景技术
葡萄牙牡蛎（
Crassostrea angulata）隶属软体动物门（Mollusca）、双壳纲（Bivalvia）、珍珠贝目（Pterioida）、牡蛎科（Ostreidae），是一种重要的海洋生物资源，是中国重要的经济贝类之一。近年来，随着养殖规模的不断扩大，葡萄牙牡蛎不仅在夏季出现大规模死亡，而且还表现出个体小、生长缓慢和适应性差等种质退化现象。因此，开展葡萄牙牡蛎种质保存，建立优良种质资源库，对于优良品种创制具有重要意义。
超低温冷冻保存技术是以精子、卵子、受精卵、幼体等生物材料作为研究对象，添加适当的冷冻保护液，使其在冷冻过程中免受或减少冰晶损伤、渗透损伤和溶质损伤等低温损伤的影响，并通过一定的降温速率，使之快速越过危险区（-15℃~-60℃），最后投入液氮中（-196℃）进行长期保存的过程。该技术是种质资源长期保存的重要方法，具有突破地理隔离、实现远缘杂交、保护种质资源、解决种质退化、保护濒危物种、节约育种成本、降低疾病传播风险和提高配子利用率等作用。
对于精子的超低温冷冻保存技术，由稀释液和抗冻剂混合而成的冷冻保护液的配制对于精子最终的保存效果是至关重要的。一般认为，稀释液应遵守抑制精子活力、维持细胞电解质和渗透压平衡、提供精子所需营养物质、无毒且含有抗菌物质等原则，能够降低或抑制精子活力的稀释液可保存冷冻前精子的代谢能量，有利于提高解冻复苏后精子的质量。对于抗冻剂，根据其能否透过细胞膜分为渗透性和非渗透性抗冻剂，渗透性抗冻剂的保护机制是能够渗透到细胞内发生水合作用，从而弱化水的结晶过程达到抗冻的目的；非渗透性抗冻剂包括糖类和蛋白质，不仅具有抗冻保护的作用，还能作为精子的营养来源，但分解后会产生大量的代谢产物。因此，选择抗冻剂时，除了具备低毒和高水溶性两个特点，还应联合使用不同类型的抗冻剂，特别是联合使用渗透性和非渗透性抗冻剂，两者结合就能起到相互补充的作用，从而提高精子冷冻保存的成功率。
20世纪90年代，我国开始研究海水贝类精子超低温冷冻技术，主要研究对象有扇贝、贻贝、太平洋牡蛎等，但未形成一个标准化的冷冻方案。先前的研究表明，常用的自然过滤海水（FSW）和无钙汉克斯平衡盐溶液（D-Hank’s）均能激活葡萄牙牡蛎的精子，这对冻精质量有所影响。目前有关葡萄牙牡蛎的报道中使用的是单一类型的冷冻保护液，这会导致精子在解冻复苏后的活力下降，此外，虽然学者利用复苏后的精子进行了人工授精，但并没有培育到D形幼虫阶段，因此经该方案冷冻复苏后的精子能否正常发育不得而知。另外，已知的报道中普遍使用的冷冻容器是0.5 mL冷冻麦管或者1 mL冻存管，虽然也有较好的冷冻效果，但存在成本高、冻存量小、精子利用率低、操作繁琐、水浴解冻时易进水使精子失活等缺点，因而不适用于产业上大批量保存和使用。
因此急需针对上述问题，结合葡萄牙牡蛎精子的特性开发一种冷冻保护液，并发明一整套简单、高效、实用且可批量保存精子的超低温冷冻保存方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻保护液及超低温冷冻保存的方法。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
一种葡萄牙牡蛎精子的冷冻保护液，包括精子稀释液、营养物质和抗冻剂。
进一步地，所述精子稀释液由D-14溶液和蔗糖混合而成，以确保葡萄牙精子获得较高的活力；所述营养物质包括蔗糖和D-葡萄糖；所述抗冻剂为蔗糖、D-葡萄糖和二甲亚砜（DMSO）。
进一步地，所述精子稀释液由D-14溶液和0.45 mol/L蔗糖组合而成，其中D-14溶液由7 g/L氯化钠、0.5 g/L氯化钾、15 g/L D-葡萄糖组成。
进一步地，所述冷冻保护液由DZ0.45溶液和质量百分比为10%的二甲基亚砜（DMSO）组成。
一种葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻保存的方法，其特征是包括以下步骤：
1. 溶液的配制：先配制好稀释液，再向其加入抗冻剂－二甲基亚砜（DMSO）形成冷冻保护液，之后置于4℃冰箱中预冷备用；
2. 精子的采集：在葡萄牙牡蛎的繁殖季节（6-9月份），选择3个以上性腺发育成熟且精子活力旺盛的健康雄性亲贝，用干净吸水纸擦拭性腺表面的杂质和海水，轻轻按压性腺表面直至从输精管流出乳白色精液，用50mL离心管收集精液，再用一次性吸管搅匀，备用；
3. 混合：将葡萄牙牡蛎精子冷冻保护液与精液在50 mL离心管中按照1：10的体积比混匀，再将精液分装到5 mL冻存管，得到样品A；
4. 平衡：将样品A置于4℃冰箱中，平衡30 min；
5. 程序降温及冷冻：采用程序降温仪对样品A进行两步法降温，首先从4℃以15℃/min的降温速率降至-60℃，在-60℃处平衡2 min，之后从-60℃以20℃/min的降温速率降至-140℃，在-140℃处平衡5 min，仪器报警后，迅速将样品A转移至液氮罐中，冷冻长期保存；
6. 解冻及复苏：将冷冻中的样品A迅速转移到37℃的恒温水浴锅中，轻轻摇晃冻存管，直至样品完全融化，采用自然过滤海水（FSW）对冻精进行激活。
与现有的冷冻方案相比，本发明具有以下优点：
1. 本发明的稀释液与精子等渗，DZ0.45溶液的渗透压为935.33 mOsm/kg，精子的渗透压为961.22 mOsm/kg，并且精子与该溶液接触能使精子处于非激活状态，而再次接触自然海水后便又能被有效激活；同时包含D-葡萄糖和蔗糖，既能为精子提供适宜的体外环境，延长其在体外存活的时间，又有利于精子以良好的生理状态抵抗冷冻损伤；
2. 本发明的冷冻保护液是一种混合型的冷冻保护液，既有非渗透性的D-葡萄糖和蔗糖，又有渗透性的二甲基亚砜（DMSO），互补抗冻剂的联合使用不仅减少了二甲基亚砜（DMSO）对精子的毒性作用，又有利于降低细胞膜内外形成的冰晶对精子的损伤，同时也能防止因内外渗透压差而对精子带来的损伤；
3. 本发明的冷冻体积为5 mL，相比0.5 mL的冷冻麦管，冷冻体积明显增大，不仅提高了精子的利用率，而且也能在数量上弥补精子因冷冻损伤活力弱而导致的受精率和孵化率低的不足，操作方便且安全，有利于产业应用；
4. 本发明的平衡温度是4℃，平衡时间为30 min，葡萄牙牡蛎精子在此条件下平衡可使二甲基亚砜（DMSO）充分渗透到精子内，有利于增强精子的耐冻性，为下一步超低温冷冻做好生理上的准备，减少在冷冻过程中有害温区冰晶对精子的损害；
5. 本发明的降温方式是采用程序降温仪进行降温，降温程序采用的是两步程序，先以-15℃/min稳定速率降温使精子安全度过有害温区（-15℃~-60℃），然后再以-20℃/min使精子进入稳定状态（-140℃~-180℃），最后再投入液氮中冷冻保存。此法能够保证精子的降温速率是稳定且精确的，可以减少精子的冷冻损害。
具体实施方式
下面结合具体实施例子对本发明做进一步详细的描述。
实施例1
本实施例是为确定最优的稀释液种类。
1. 溶液的配制（稀释液和冷冻保护液现配现用）：
(1) 稀释液：本次要筛选的是DZ0.45溶液、过滤海水（FSW）、含0.45 mol/L蔗糖的无钙汉克斯平衡盐溶液（D-Hank’s）这3种稀释液。具体配制方法如下：
DZ0.45溶液，氯化钠 0.7g、氯化钾 0.1g、D-葡萄糖 1.5g、蔗糖15.4g，准确称量上述药品，于纯水中溶解至100 mL；
过滤海水（FSW），采用循环水式多用真空泵进行过滤，滤膜规格为0.45μm，海水盐度为25‰；
(2) 冷冻保护液：分别以上述这3种稀释液为基础液，配制终浓度为10%二甲基亚砜（DMSO）的冷冻保护液，放于4℃中预冷，备用。
2. 精子的收集：葡萄牙牡蛎是在9月份取自福建莆田，暂养两天后，解剖牡蛎，利用水滴法辨别雌雄。之后挑取3个活力超过80%的雄性个体，用干净吸水纸擦拭性腺表面的杂质和海水，轻轻按压性腺表面直至从输精管流出乳白色精液，用50 mL离心管收集精液，再用一次性吸管搅匀，备用。
3. 混合：在室温中将精液与各组冷冻保护液以1：10的体积比在50 mL离心管中混匀后，再分装到5 mL冻存管中，得到样品B，等待放入冰箱中平衡。
4. 平衡：将样品B置于4℃冰箱中，平衡30 min。
5. 程序降温及冷冻：采用程序降温仪对样品B进行两步法降温，首先从4℃以-15℃/min的降温速率降至-60℃，在-60℃处平衡2 min，之后从-60℃以-20 ℃/min的降温速率降至-140℃，在-140℃平衡5 min，仪器报警后，迅速将样品B转移至液氮罐中。
6. 解冻及复苏：冷冻保存结束后，将样品B迅速转移到37℃的恒温水浴锅中，轻轻摇晃冻存管，直至样品完全融化，采用自然过滤海水（FSW）对冻精进行激活。
7. 受精：冻精激活后采用常规的方法进行人工授精，DZ0.45组获得的相对受精率和相对孵化率分别达到106.76%和99.42%，因此将DZ0.45溶液确定为本发明的稀释液。
实施例2
本实施例是为确定最优的抗冻剂种类。
1. 溶液的配制（稀释液和冷冻保护液现配现用）：
(1) 稀释液：DZ0.45溶液，氯化钠 0.7g、氯化钾 0.1g、D-葡萄糖 1.5g、蔗糖15.4g，准确称量上述药品，于纯水中溶解至100 mL；
(2) 冷冻保护液：以DZ0.45为稀释液，选二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）为抗冻剂，均配制成终浓度为10%的冷冻保护液，此后放于4℃中预冷，备用；
(3) 过滤海水（FSW）：采用循环水式多用真空泵进行过滤，滤膜规格为0.45μm，海水盐度为25‰。
2. 精子的收集：葡萄牙牡蛎是在9月份取自福建莆田，暂养两天后，解剖牡蛎，利用水滴法辨别雌雄。之后挑取3个活力超过80%以上的雄性个体，用干净吸水纸擦拭性腺表面的杂质和海水，轻轻按压性腺表面直至从输精管流出乳白色精液，用50 mL离心管收集精液，再用一次性吸管搅匀，备用。
3. 混合：在室温中将精液与各组冷冻保护液以1：10的体积比在50 mL离心管中混匀后，再分装到5 mL冻存管中，得到样品C，等待放入冰箱中平衡。
4. 平衡：将样品C置于4℃冰箱中，平衡30 min。
5. 程序降温及冷冻：采用程序降温仪对样品C进行两步法降温，首先从4℃以-15℃/min的降温速率降至-60℃，在-60℃处平衡2 min，之后从-60℃以-20 ℃/min的降温速率降至-140℃，在-140℃平衡5 min，仪器报警后，迅速将样品B转移至液氮罐中。
6. 解冻及复苏：冷冻保存结束后，将样品C迅速转移到37℃的恒温水浴锅中，轻轻摇晃冻存管，直至样品完全融化，采用自然过滤海水（FSW）对冻精进行激活。
7. 受精：冻精激活后采用常规的方法进行人工授精，10%DMSO组获得的相对受精率和相对孵化率分别达到106.76%和99.42%，因此将10%DMSO确定为本发明的抗冻剂。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种葡萄牙牡蛎精子的冷冻保护液，其特征在于，包括精子稀释液、营养物质和抗冻剂。
2.根据权利要求1所述的葡萄牙牡蛎精子的冷冻保护液，其特征在于，所述精子稀释液由D-14溶液和蔗糖组成。
3.根据权利要求1所述的葡萄牙牡蛎精子的冷冻保护液，其特征在于，所述营养物质可以是蔗糖和D-葡萄糖中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的葡萄牙牡蛎精子的冷冻保护液，其特征在于，所述抗冻剂可以是蔗糖、 D-葡萄糖和二甲亚砜（DMSO）中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的葡萄牙牡蛎精子的稀释液，其特征在于，DZ0.45溶液的组分包括0.45 mol/L蔗糖、7 g/L氯化钠、0.5 g/L氯化钾和15 g/L D-葡萄糖。
6.根据权利要求1所述的葡萄牙牡蛎精子的冷冻保护液，其特征在于，所述抗冻剂为质量百分比10%的二甲基亚砜（DMSO）。
7.一种葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）精子的采集：在葡萄牙牡蛎的繁殖季节，选择3个以上性腺发育成熟且精子活力较好的健康雄性亲贝，解剖后用干净吸水纸擦拭性腺表面的杂质和海水，轻轻按压性腺表面直至流出乳白色精液，用离心管收集精液，再用一次性吸管搅匀，备用；
（2）溶液的配制：先配制稀释液，再向其加入抗冻剂－二甲基亚砜（DMSO）形成冷冻保护液，之后置于4℃冰箱中预冷备用；
（3）精液与冷冻保护液的混合：将葡萄牙牡蛎的精液与冷冻保护液在50 mL离心管中按照1：10的体积比混匀，再分装到5 mL冻存管中；
（4）平衡：将冻存管置于4℃冰箱中，平衡30 min；
（5）程序降温及冷冻：采用程序降温仪对样品进行两步法降温，首先从4℃以-15℃/min的降温速率降至-60℃，在-60℃处平衡2 min，之后从-60℃以-20℃/min的降温速率降至-140℃，在-140℃处平衡5 min，仪器报警后，迅速将样品转移至液氮罐中冷冻保存。
8.根据权利要求7所述的葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻方法，其特征在于，所述超低温冷冻保存的精子解冻是将样品迅速转移到37℃的恒温水浴锅中，轻轻摇晃冻存管，直至样品完全融化。
9.根据权利要求8所述的葡萄牙牡蛎精子超低温冷冻方法，其特征在于，所述超低温冷冻保存的精子复苏是将解冻后的精子使用自然过滤海水（FSW）进行激活。
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