CN113455497B - 一种中国明对虾精子超低温冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种中国明对虾精子超低温冷冻保存方法，属于精子保存技术领域。具体包括，用超低温冷冻保护液对采集的中国明对虾精液进行稀释后进行程序降温至‑180℃后转入液氮保存。本发明通过将经过超低温冷冻保护液稀释的中国明对虾精液进行程序降温至‑180℃后转入液氮保存，超低温环境使精子停止代谢活动，以延长寿命，超低温冷冻保护液同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，从而保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。

Description

一种中国明对虾精子超低温冷冻保存方法
技术领域
本发明涉及精子保存技术领域，具体涉及一种中国明对虾精子超低温冷冻保存方法。
背景技术
中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)，又称中国明对虾，旧称中国对虾，属节肢动物门(Arthropoda)，甲壳纲(Crustacea)，十足目(Decapoda)，对虾科(Penaeidae)，对虾属(Penaeus)，是我国主要养殖对虾品种之一。其个体较大，甲壳薄，光滑透明，虾肉香酥绵软，具有极高的经济价值。然而近年来，基于需求量的逐年上升，中国明对虾野生种群规模开始逐年锐减，严重依赖人工增殖放流。因此开展中国明对虾种质保存，进而开展种质优选、建立优良种库十分有必要。超低温冷冻技术是长期冷冻种质资源的有效方法，对水产经济动物人工繁殖、良种选繁育、雌核发育有重要意义。因此，建立一种高效、稳定的中国明对虾精子超低温冷冻保存方法，用以长期保存其精子所携带的优良基因，不仅对其种质资源保护具有重要意义，对其良种选繁育也有重要的应用价值。
目前，精子超低温冷冻保存技术在海洋动物种质保存研究主要集中在鱼类和贝类的少数几种海洋生物。不同物种生物精子的大小结构的差异及精浆离子浓度、渗透压的不同，使得他们具有各自适应的最佳抗冻液配比、最优冷冻降温速率和最适激活方法。因此，不同物种的精子冷冻技术不具有通用性。目前，水产科技工作者利用超低温冷冻保存技术已成功保存了经济鱼、贝类的精子，并建立了种质冷冻库，用以生物遗传学研究和生物多样性保护。甲壳动物(虾、蟹类)由于其特殊的生殖特性，研究相对困难，关于其精子冷冻保存研究较少。关于中国明对虾精子超低温保存研究仅柯亚夫等(1996)采用2步法对雌虾纳精囊内精子开展过相关实验，但是实验人为因素影响较大，可重复性差，且冻精存活率仅达60％，效果较一般。
发明内容
基于上述内容，本发明提供一种中国明对虾精子超低温冷冻保存方法，针对现有中国明对虾精子冷冻保存研究存在的可重复性差、效果一般等问题，开展了针对中国明对虾精子超低温冷冻保存的超低温冷冻保护液组分及配比与精密降温程序的实验，建立了一种高效并且稳定、可重复操作的超低温保存技术，使冻精存活率达到85％以上。
一种中国明对虾精子超低温冷冻保存方法，具体包括，用超低温冷冻保护液对采集的中国明对虾精液进行稀释后进行程序降温至-180℃后转入液氮保存；所述程序降温具体包括：0℃平衡20min，降至-20℃平衡5min，降至-80℃平衡5min，降至-180℃，然后置于液氮中保存。
进一步地，所述超低温冷冻保护液以灭菌天然海水为基础液，甘油为抗冻保护剂，牛血清蛋白或海藻糖为非渗透性抗冻保护剂。
进一步地，所述超低温冷冻保护液中抗冻保护剂的体积分数为5-10％，牛血清蛋白或海藻糖的浓度为0.25mol/L。
进一步地，所述中国明对虾精液和超低温冷冻保护液的稀释体积比为1:5。
进一步地，所述程序降温具体包括：0℃平衡20min，-5℃/min的降温速率降至-20℃平衡5min，-10℃/min的降温速率降至-80℃平衡5min，-20℃/min的降温速率降至-180℃，然后置于液氮中保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明通过将经超低温冷冻保护液稀释的中国明对虾精液分阶段降温至-180℃后转入液氮保存，以达到长期保存中国明对虾精子的目的。本发明配置的超低温冷冻保护液同溶液中的水分子发生水合作用，增加溶液的粘性，减少冰晶的形成，同时在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受渗透压损伤，双重作用从而保护精子免受冰晶和渗透压损伤。
本发明优选的技术方案中，将中国明对虾精液与超低温冷冻保护液按照1:5体积比混合。精子离体，所需能量仅来源自精浆。稀释比例小则精液浓度高，有毒代谢物浓度等也会相应提高，导致精子活力变低；稀释比例过大则精子因外环境理化性质(pH和渗透压)的巨大变化，产生生理性改变。因此，适当的稀释比对精子低温冷冻保存十分重要，通过实验验证表明1:5稀释比实验组冻精存活率均在72.4％以上，同时也保持了较高的精子密度，约为4.6×108/ml。
本发明优选的技术方案中，超低温冷冻保护液以灭菌天然海水为基础液，体积浓度为5-10％(v/v)的甘油为抗冻保护剂，同时添加了浓度为0.25mol/L的牛血清蛋白或海藻糖。灭菌天然海水相比其他稀释液，更易获取，更容易操作。甘油为渗透性抗冻剂，可通过渗透作用减少胞内水分，降低冰点，进而减少精子内冰晶的形成，稳定了精子内外电解质浓度。牛血清蛋白或海藻糖为非渗透性抗冻保护剂，可以稳定细胞膜，减少氧自由基的产生，有效降低精子冷休克损伤，从而避免不可逆的精子顶体损伤。该配比下的超低温冷冻保护液可以起到最佳的缓解冷冻时细胞过冷引起的脱水皱缩和复活时细胞渗透性肿胀引起的损伤的作用，能够在保持较好渗透性的同时又降低了保护剂毒性，精子冷冻保存效果更好。
降温速率在很大程度上影响精子冷冻效果。原因在于，超低温冷冻保存的原理是生物细胞、组织、器官甚至个体在超低温(-196℃)状态下代谢完全停止，生命以静止的形式得以长期保存。因此，冷冻过程中必须经历0℃～-16℃冷休克损伤温区和0℃～-60℃的冰晶形成温区。0℃～-16℃冷休克损伤主要是细胞膜脂相由液相变为了固相，进而导致复温后精子活动力丧失。控制降温速率和添加保护成分可以有效预防冷休克。通过实验证明，添加甘油、牛血清蛋白或海藻糖保护剂的条件下，在降温程序中设置0℃～-20℃温区，选择5℃/min的降温速率，并在-20℃短暂平衡5min，可以有效降低中国明对虾精子的冷休克损伤。-20℃～-60℃温区仍为冰晶形成区，胞内外形成的冰晶都会对精子产生致命的损伤。控制降温速率实现胞外结晶而胞内不结晶可以有效降低冰晶损伤。但适宜的降温速率因物种而异，实验证明，添加甘油、牛血清蛋白或海藻糖保护剂的条件下，在中国明对虾精子超低温冷冻降温程序中设置-20℃～-80℃温区，并以-10℃/min的降温速率效果最好。-80℃以下，精子内外自由水已经结冰，结合水移动受限，对精子的有害程度减少，可以适当提高降温速率，-80℃平衡后以-20℃/min的速度快速降温至-180℃，可使中国明对虾精子彻底玻璃化，避免了冻存管从程序降温仪移至液氮罐中温度骤升引起的重结晶损伤。采用本发明的降温程序方法，可以有效避免冷休克损伤和冰晶损伤，经过实验验证，本发明方法可以高效保存中国明对虾精子，冻精复活后存活率可达85％以上。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
配制以灭菌天然海水为基础液，不同浓度二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、甘油(Gly)为抗冻保护剂的超低温冷冻保护液，将采集的新鲜中国明对虾精液和不同的超低温冷冻保护液分别以1：5的稀释体积比进行稀释后放入已经0℃预冷好的程序降温仪中，运行0℃平衡20min；-5℃/min降至-80℃；-80℃平衡5min；-20℃/min降至-180℃的降温程序，之后投入-196℃的液氮中保存。从上述液氮冷冻的精液取出，迅速放入37℃水浴锅中，摇晃至精液溶化，进行质量检测，进一步确定最优的渗透性抗冻保护剂类别和浓度，结果见表1。
表1中国明对虾精子超低温冷冻保存最优渗透性抗冻保护剂的筛选
组合 抗冻保护剂 精子存活率(％)
1 5％DMSO 5.21
2 7.5％DMSO 14.69
3 10％DMSO 14.73
4 15％DMSO 14.71
5 5％EG 12.57
6 7.5％EG 16.54
7 10％EG 10.65
8 15％EG 16.77
9 5％Gly 43.42
10 7.5％Gly 65.82
11 10％Gly 63.33
12 15％Gly 47.56
经过上述实验结果显示，以7.5％、10％Gly为抗冻保护剂的实验组，精子存活率较高。
实施例2
以灭菌天然海水为基础液，10％Gly为抗冻保护剂，精液与超低温冷冻保护液稀释体积比例为1:5，降温程序同实施例1，区别在于，分别设置不同浓度海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、维生素C、牛血清蛋白为非渗透性抗冻保护剂的实验组进行超低温冷冻保存，对经过冷冻的精子进行质量检测，进一步确定最优的非渗透性抗冻保护剂类别和浓度。结果见表2。
表2中国明对虾精子超低温冷冻保存最优非渗透性抗冻保护剂的筛选
Figure BDA0003172600140000051
Figure BDA0003172600140000061
经过上述实验结果显示，添加0.25mol/L海藻糖与添加0.25mol/L牛血清蛋白实验组精子存活率显著高于未添加的对照组。
实施例3
以灭菌天然海水为基础液，10％Gly为抗冻保护剂，分别以0.25mol/L牛血清蛋白或海藻糖为非渗透性抗冻保护剂，降温程序同实施例1，区别在于，将中国明对虾精液与超低温冷冻保护液分别设置1：1、1：3、1：5、1：7、1：9五个稀释体积比实验组进行超低温冷冻保存。对经过冷冻的精子进行质量检测，进一步确定最优的稀释比例。结果见表3。
表3中国明对虾精子超低温冷冻保存最优稀释比例的筛选
Figure BDA0003172600140000062
经过上述实验结果显示，稀释比例为1:5时精子存活率最高。
实施例4
以灭菌天然海水为基础液，10％Gly为抗冻保护剂，分别以0.25mol/L牛血清蛋白、海藻糖为非渗透性抗冻保护剂，精液与超低温冷冻保护液稀释比例为1:5，区别在于，分别以a-f六个降温程序进行超低温冷冻保存。对经过冷冻的精子进行质量检测，进一步确定最优的超低温冷冻降温程序。结果见表4。
降温程序a：0℃平衡20min；-5℃/min降至-80℃；-80℃平衡5min；-20℃/min降至-180℃；然后置于液氮中保存；
降温程序b：0℃平衡20min；-10℃/min降至-80℃；-80℃平衡5min；-20℃/min降至-180℃；然后置于液氮中保存；
降温程序c：0℃平衡20min；-2℃/min降至-20℃；-20℃平衡5min；-10℃/min降至-80℃；-80℃平衡5min；-20℃/min降至-180℃；然后置于液氮中保存；
降温程序d：0℃平衡20min，-5℃/min降至-20℃；-20℃平衡5min,-10℃/min降至-80℃；-80℃平衡5min；-20℃/min降至-180℃；然后置于液氮中保存；
降温程序e：0℃平衡20min；-5℃/min降至-20℃；-20℃平衡5min；-15℃/min降至-80℃；-80℃平衡5min；-20℃/min降至-180℃；然后置于液氮中保存；
降温程序f：0℃平衡20min，-5℃/min降至-20℃；-20℃平衡5min,-10℃/min降至-80℃；-80℃平衡5min；-40℃/min降至-180℃；然后置于液氮中保存。
表4中国明对虾精子超低温冷冻保存最优降温程序的筛选
Figure BDA0003172600140000071
Figure BDA0003172600140000081
经过上述实验结果显示，采用降温程序d开展中国明对虾精子超低温冷冻保存，精子存活率最高。相比较于最优降温程序d，降温程序a、b未设置0℃～-20℃温区；降温程序c在0℃～-20℃温区降温速度较慢；降温程序c在-20℃～-80℃温区降温速度较快；降温程序f在-80℃～-180℃温区降温速度较快，精子超低温保存效果均不如降温程序d。
对比例1
选取实施例1稀释比例为1:5的精液稀释液，采用以下降温方式进行降温：
运行0℃平衡20min，-5℃/min降至-180℃的降温程序，之后投入-196℃的液氮中保存，结果显示，精子存活率为63.47％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种中国明对虾精子超低温冷冻保存方法，其特征在于，用超低温冷冻保护液对采集的中国明对虾精液进行稀释，进行程序降温至-180℃后转入液氮保存；所述程序降温具体包括：0℃平衡20min，降至-20℃平衡5min，降至-80℃平衡5min，降至-180℃，然后置于液氮中保存；
所述超低温冷冻保护液以灭菌天然海水为基础液，甘油为抗冻保护剂，牛血清蛋白或海藻糖为非渗透性抗冻保护剂；
所述超低温冷冻保护液中抗冻保护剂的体积分数为5-10％，牛血清蛋白或海藻糖的浓度为0.25mol/L；
所述中国明对虾精液和超低温冷冻保护液的体积比为1:5；
所述程序降温具体包括：0℃平衡20min，-5℃/min的降温速率降至-20℃平衡5min，-10℃/min的降温速率降至-80℃平衡5min，-20℃/min的降温速率降至-180℃，然后置于液氮中保存。
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