CN116034992B - 刺参精子低温保存液及应用和刺参精子的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于精子保存技术领域，具体涉及一种刺参精子低温保存液及应用和刺参精子的保存方法。低温保存液的成分以等渗缓冲液为基础液，再添加胎牛血清和青链霉素混合液制成。低温短期保存和超低温冷冻长期保存技术结合使用的方法能使刺参精子在4℃保存条件下，4d内保持70%以上的活力，10d内保持50%以上的活力，并在短期保存4d内进行超低温冷冻保存能够获得具有35%以上活力的刺参冷冻精子；该方法中精子短期保存操作简单方便，能够延长精子寿命，有效保持精子活力和生产应用价值。

Description

刺参精子低温保存液及应用和刺参精子的保存方法

技术领域

本发明属于精子保存技术领域，具体涉及一种刺参精子低温保存液及应用和刺参精子的保存方法。

背景技术

刺参具有补肾、益精、养血等功效，营养价值极高，是我国北方重要的海珍品之一。刺参增养殖业已成为继海带、对虾、扇贝与鲆鲽鱼类之后的又一关键支柱性养殖产业。然而，随着刺参养殖产业规模的不断拓展，种质退化、生长缓慢、抵御环境变化能力差、病害频发以及商品品质下降等一系列制约或潜在制约产业发展的瓶颈问题也日益凸显。同时，受过度捕捞与栖息地被破坏等人为因素的干扰，我国自然海区的野生海参种质数量急剧下降，自然资源趋于枯竭。

精子的保存技术对水产动物的增养殖、良种培育、资源保护以及生物学研究都有重要意义。在刺参的种质保存和良种繁育工作中，由于需从不同地区引种或培育新种，不同地区的刺参繁殖期不尽相同，长途运输种参运输成本高，运输数量有限，在运输过程中种参还容易因温度过高、晃动干扰过大等出现吐脏甚至化皮死亡等问题，雌雄亲参性腺发育不同步，雌性刺参需要经历促熟和促排才能排出成熟的能够受精的卵子，因此在科研与生产实践中需要对精液进行保存。

精子保存技术通常为低温保存和超低温冻存，低温保存原理是低温能够降低精子的代谢活动，从而将精子寿命延长；超低温冻存则是使精子处于-196℃条件下，其代谢与运动完全停止，生命以静止的状态得以长期保存。超低温冷冻保存技术理论上可以无限期保存精子活力，但需要复杂的降温、冷冻和解冻程序，任一环节的失误都会造成复苏后精子活力低下，并且严重依赖液氮设备，在户外作业中的应用难度大。相较于冷冻保存而言，精子的低温(4℃)保存具有操作简单、保存条件易满足和重复性强的优点，也能够防止速冻导致细胞内冰晶的形成导致超微结构受损，但延长精子寿命有限，并且随着保存时间延长精子质量降低。将低温保存和超低温冷冻长期保存技术相结合能够充分利用两种保存方式的优点，平衡缺点，精子在短期保存时运输，短期保存后进行生产应用或超低温冷冻保存，解决种质保存和良种繁育工作中遇到的亲本运输或质量下降等问题。目前，刺参精液的超低温冷冻保存技术已经取得了不错的进展，并且冷冻精子具有一定的生产应用价值，但国内外关于刺参精子的低温保存技术尚未见报道，关于精子低温短期保存和超低温冷冻长期保存两种方法结合使用的技术亦尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种仿刺参精子的低温保存液、冷冻保护液配方及低温短期保存和超低温冷冻长期保存方法。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

一种刺参精子低温保存液，低温保存液由溶液、胎牛血清、青链霉素混合液组成，其中各组分体积比依次为985μL:5μL:10μL；

所述溶液为等渗缓冲液或自然海水。

所述等渗缓冲液的配方为0.001 M EGTA、0.34 M NaCl、0.01 M Tris-HCl、溶剂为纯水。

一种刺参精子低温保存液的应用，所述低温保存液在用于保存刺参新鲜精液中的应用。

进一步的的说，所述低温保存液在用于短期保存刺参新鲜精液中的应用。

一种利用所述的刺参精子低温保存液对刺参精子的保存方法，包括以下步骤：

（1）精液获取：取处于繁殖期的刺参获得其新鲜精液，待用；

（2）精液与低温保存液混合：将刺参新鲜精液与低温保存液按1:1的体积比充分混合置于容器中；

（3）低温处理：混合后置于4℃低温冰箱或4℃低温环境中，即实现刺参精子低温短期保存。

进一步的说，

（1）精液获取：取处于繁殖期的刺参获得其新鲜精液，待用；

（2）精液与低温保存液混合：将刺参新鲜精液与低温保存液按1:1的体积比充分混合置于容器中；

（3）低温处理：混合后置于4℃低温冰箱或4℃低温环境中，即实现刺参精子低温短期保存；

（4）精液与冷冻保存液混合：将经步骤（3）低温保存液短期保存2-4d内刺参新鲜精液与冷冻保护液按1:2的体积比充分混合置于容器中；

（5）程序降温：混合后置于程序降温仪中，运行降温程序，降温程序为0℃下平衡5min，以10℃/min的降温速率降温至-80℃，-80℃下平衡5分钟，以20℃/min的降温速率降温至-150℃，平衡5分钟后取出并放入到液氮中长期保存，即实现刺参精子低温短期保存下的超低温冷冻长期保存。

所述冷冻保护液由等渗缓冲液、二甲基亚砜DMSO组成，其中各自体积比为27mL:5mL；或，所述冷冻保护液由自然海水、二甲基亚砜DMSO和葡萄糖组成，其中各自质量体积比为27mL:5mL: 0.79g；

所述等渗缓冲液的配方为0.001 M EGTA、0.34 M NaCl、0.01 M Tris-HCl、溶剂为纯水。

上述葡萄糖为一水葡萄糖。

所述冷冻保存刺参精子置于20℃水浴中解冻，轻轻摇动使温度均匀，待只剩少量固体时立即取出(约120S)，在空气中继续摇动使其完全融化；吸取冻精加入到激活剂中混匀，使刺参原精稀释总倍数达600倍，激活液配方是含5wt％胎牛血清的过滤自然海水。

上述使用的低温保存液在4℃条件下保存的刺参精子在4d内能保持70%以上的精子活力，在10d内能保持50%以上的精子活力。

上述使用的刺参精子短期保存和超低温冷冻长期保存联用的方法能获得具有35%以上精子活力的刺参冷冻精子。

本发明所具有的优点：

本发明刺参精子低温保存液成分简单，可提前配制，方便携带；刺参精子低温短期保存方法操作简单，操作时间短，无需离心机等设备，能够满足大多数养殖场应用，并且避免了长途运输刺参种参成本高，效果差等问题；刺参精子低温保存方法能够明显延长刺参精子活力，使刺参精子在4℃条件下，保存4d内保持70%以上的精子活力，保存10d内保持50%以上的精子活力；首次提出的刺参精子低温短期保存和超低温冷冻长期保存技术结合使用的方法能够充分利用刺参精子，使刺参精子在短期保存时运输，短期保存后进行生产应用或超低温冷冻保存，在短期保存4d内进行超低温冷冻保存能够获得具有35%以上精子活力的具有生产应用价值的刺参冷冻精子，能够应对刺参种质保存和良种繁育工作中遇到的亲本运输或质量下降等大部分问题，为刺参的良种选育和种质资源保护提供技术支撑。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

本发明仿刺参精子的低温保存液、冷冻保护液配方及低温短期保存和超低温冷冻长期保存技术结合使用的方法，该方法能使刺参精子在4℃保存条件下，4d内保持70%以上的精子活力，10d内保持50%以上的精子活力，并在短期保存4d内进行超低温冷冻保存能够获得具有35%以上精子活力的刺参冷冻精子；采用所述的低温保存液、冷冻保护液及方法能够短期保存刺参精子以应对在繁殖季节运送种参至实验场地造成的运输成本高、种参死亡等问题，提高刺参精子的存活时间，并能够继续长期保存刺参精子，为刺参种质资源进行保护、开发和遗传育种研究提供技术支持。

本发明方法中精子短期保存操作简单方便，能够延长精子寿命，有效保持精子活力和生产应用价值，并使精子运输便利，可应对如种参运输不便、精子活力在运输中损失较多和超低温冷冻保存操作因设备需求不易现场开展等问题，满足刺参的良种选育和超低温冷冻保存技术对精子的需求，为刺参的良种选育和种质资源保护提供技术支撑。

下述实施例中葡萄糖为一水葡萄糖。

实施例1

a.配制低温保存液：按照现用现配的原则配制低温保护液，刺参精子的低温保护液配方为98.5mL等渗缓冲液，0.5mL胎牛血清，1mL青链霉素混合液；其中，等渗缓冲液配方为0.001 M EGTA、0.34 M NaCl、0.01 M Tris-HCl、溶剂为1L的纯水，可提前配制并在4℃条件下长期保存；胎牛血清和青链霉素混合液均可提前从试剂公司购买，-20℃长期保存，待使用时提前放置到4℃条件下解冻，青霉素的工作浓度为 100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL。将配好的低温保护液在4℃恒温冰箱预冷至使用。

b.精液获取：取处于繁殖期刺参，待其排出大量体腔内水分后擦干参体（避免海水接触精子将其激活）。用无菌消毒的解剖刀从腹部解剖海参，避免性腺被划破，用镊子挑出完整的性腺，用吸水纸吸干性腺表面体液移至无菌培养皿中，用剪刀剪碎，并用300目筛绢过滤至无菌的50mL离心管中，4℃恒温培养箱放置至使用。

c.精液与低温保存液混合：将上述步骤获得刺参新鲜精液与低温保存液按1:1的体积比充分混合置于15mL或50mL无菌离心管中（本实施例采用15mL无菌离心管），整个过程在放置有冰块的保温盒中进行。

d.低温保存：将离心管固定放置到架子上，置于4℃低温冰箱或4℃低温环境中（即，短期保存）。

e.精子活力检测：混匀步骤d中离心管中的液体，从中取出4μL液体进行对其中的刺参精子活力检测，重复4次，每2天检测一次；用CASA系统进行刺参精子活力检测，将4μL液体加入到1996μL激活剂中，使刺参鲜精稀释总倍数达1000倍，从而使得CASA每个视野中保持70-120个精子；吸取10μL激活后的精液，加入到精子计数板，用CASA进行精子活力分析；激活剂的成分是含5wt％胎牛血清的过滤自然海水。

f.配制冷冻保护液：按照现用现配的原则，配制新鲜的超低温冷冻保护液，刺参精子的超低温冷冻保护液配方27mL等渗缓冲液，5mL纯度≥99 .97％的二甲基亚砜(DMSO)；其中等渗缓冲液配方为0.001 M EGTA、0.34 M NaCl、0.01 M Tris-HCl、溶剂为1L的纯水，可提前配制并在4℃条件下长期保存。将配好的冷冻保护液在4℃恒温冰箱预冷至使用。

g.低温保存精液与冷冻保护液混合：每次进行步骤e后，再次混匀步骤d中离心管中的液体与冷冻保护液混合，即，从步骤d中取出160μL混合液与320μL冷冻保护液按1:2的体积比充分混合后分装在2mL冻存管，重复4次；使用程序降温仪对低温短期保存的刺参精液进行超低温长期冷冻保存。

h.程序降温：将冻存管用冻存管架放入程序降温仪中，运行降温程序，降温程序为0℃下平衡5min，以10℃/min的降温速率降温至-80℃，-80℃下平衡5分钟，以20℃/min的降温速率降温至-150℃，平衡5分钟后取出，投入液氮(-196℃)中长期保存。

i. 解冻与冷冻精子活力分析：将步骤h中的冻存管从液氮中取出，冻存管置于20℃水浴中解冻，轻轻摇动使温度均匀，待只剩少量固体时立即取出(约120S)，在空气中继续摇动使其完全融化；吸取冻精加入到激活剂中，使刺参鲜精稀释总倍数达600倍，从而使得CASA每个视野中保持70-120个精子，吸取10μL激活后的冻精，加入到精子计数板，用CASA进行精子活力分析。

统计结果显示：此实施例中的刺参新鲜精子经低温短期保存2d、4d、6d、8d、10d、12d后的精子活力分别为82.45±2.84%、73.68±2.29%、66.04±1.04%、57.91±1.52%、49.14±1.78%、22.13±0.38%，由上述刺参精子经低温短期保存2d、4d、6d后直接再进行超低温冷冻保存得到冷冻精子的精子活力分别为47.90±3.52%、36.02±1.54%、17.09±0.78%，通过实验测定认为活力＞50%的刺参新鲜精子具有生产应用价值，活力＞30%的刺参冷冻精子具有生产应用价值，因此本实施例能短期保存刺参精子的应用价值达10d，并可在短期保存4d内对刺参精子进行超低温冷冻长期保存，得到的冷冻精子仍具有生产应用价值。

实施例2

a.配制低温保存液：按照现用现配的原则配制低温保护液，刺参精子的低温保护液配方为98.5mL自然海水，0.5mL胎牛血清，1mL青链霉素混合液；其中自然海水为用孔径0.45μm滤膜过滤后灭菌的自然海水，可提前处理并在4℃条件下长期保存；胎牛血清和青链霉素混合液均可提前从试剂公司购买，-20℃长期保存，待使用时提前放置到4℃条件下解冻，青霉素的工作浓度为 100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL。将配好的低温保护液在4℃恒温冰箱预冷至使用。

b.精液获取：取处于繁殖期刺参，待其排出大量体腔内水分后擦干参体（避免海水接触精子将其激活）。用无菌消毒的解剖刀从腹部解剖海参，避免性腺被划破，用镊子挑出完整的性腺，用吸水纸吸干性腺表面体液移至无菌培养皿中，用剪刀剪碎，并用300目筛绢过滤至无菌的50mL离心管中，4℃恒温培养箱放置至使用。

c.精液与低温保存液混合：将刺参新鲜精液与低温保存液按1:1的体积比充分混合置于15mL或50mL无菌离心管中，整个过程在放置有冰块的保温盒中进行。

d.低温保存：将离心管固定放置到架子上，置于4℃低温冰箱或4℃低温环境中。

e.精子活力检测：混匀步骤d中离心管中的液体，从中取出4μL混合液进行刺参精子活力检测，重复4次，每2天检测一次；用CASA系统进行刺参精子活力检测，将4μL混合液加入到1996μL激活剂中，使刺参鲜精稀释总倍数达1000倍，从而使得CASA每个视野中保持70-120个精子；吸取10μL激活后的精液，加入到精子计数板，用CASA进行精子活力分析；激活剂的成分是含5wt％胎牛血清的过滤自然海水。

f.配制冷冻保护液：按照现用现配的原则，配制新鲜的超低温冷冻保护液，刺参精子的超低温冷冻保护液配方为27mL自然海水，5mL纯度≥99 .97％的二甲基亚砜(DMSO)和0.79g葡萄糖；其中自然海水为用孔径0.45μm滤膜过滤后灭菌的自然海水，可提前处理并在4℃条件下长期保存。将配好的冷冻保护液在4℃恒温冰箱预冷至使用。

g.低温保存精液与冷冻保护液混合：每次进行步骤e后，再次混匀步骤d中离心管中的液体，从中取出160μL混合液与320μL冷冻保护液按1:2的体积比充分混合后分装在2mL冻存管，重复4次；使用程序降温仪对低温短期保存的刺参精液进行超低温长期冷冻保存。

h.程序降温：将冻存管用冻存管架放入程序降温仪中，运行降温程序，降温程序为0℃下平衡5min，以10℃/min的降温速率降温至-80℃，-80℃下平衡5分钟，以20℃/min的降温速率降温至-150℃，平衡5分钟后取出，投入液氮(-196℃)中长期保存。

i. 解冻与冷冻精子活力分析：将步骤h中的冻存管从液氮中取出，冻存管置于20℃水浴中解冻，轻轻摇动使温度均匀，待只剩少量固体时立即取出(约120S)，在空气中继续摇动使其完全融化；吸取冻精加入到激活剂中，使刺参鲜精稀释总倍数达600倍，从而使得CASA每个视野中保持70-120个精子，吸取10μL激活后的冻精，加入到精子计数板，用CASA进行精子活力分析。

统计结果显示：此实施例中的刺参新鲜精子经低温短期保存2d、4d、6d、8d、10d、12d后的精子活力分别为82.11±2.26%、72.30±0.92%、65.43±1.83%、53.66±2.55%、26.87±2.55%、9.92±1.42%，由上述刺参精子经低温短期保存2d、4d、6d后直接再进行超低温冷冻保存得到冷冻精子的精子活力分别为41.82±1.14%、31.02±2.17%、14.52±0.85%，通过实验测定认为活力＞50%的刺参新鲜精子具有生产应用价值，活力＞30%的刺参冷冻精子具有生产应用价值，因此本实施例能短期保存刺参精子的应用价值达8d，并可在短期保存4d内对刺参精子进行超低温冷冻长期保存，得到的冷冻精子仍具有生产应用价值。

对比例1

a.精液获取：同实施例1。

b.室温保存：不向步骤a中获得刺参新鲜精液加入任何低温保存液，将刺参鲜精置于15mL或50mL无菌离心管中，并放置到避光的常温环境中（10~25℃）保存。

c.精子活力检测：混匀步骤b中离心管中的刺参精液，取出2μL进行刺参精子活力检测，重复4次，每2天检测一次；用CASA系统进行刺参精子活力检测，将2μL混合液加入到1998μL激活剂中，使刺参鲜精稀释总倍数达1000倍，从而使得CASA每个视野中保持70-120个精子；吸取10μL激活后的精液，加入到精子计数板，用CASA进行精子活力分析；激活剂的成分是含5wt％胎牛血清的过滤自然海水。

统计结果显示：此实施例中的刺参精子在保存2d后即已经出现浓重的腥臭味，并且液体浑浊、粘稠度增加，精子已完全丧失活力，无需进行超低温冷冻保存，CASA视野下刺参精子周围细菌滋生，根据精液损失严重程度，推测刺参精子在不添加任何低温保存液、室温保存条件下放置1d内即可能出现严重的活力损失现象。

对比例2

a.配制低温保存液：同实施例1。

b.精液获取：同实施例1。

c.精液与低温保存液混合：同实施例1。

d.室温保存：将离心管固定放置到架子上，放置到避光的常温环境中（10~25℃）保存。

e. 精子活力检测：同实施例1。

统计结果显示：此实施例中的刺参精子在保存2d后出现了腥臭味，并且液体变浑浊、粘稠度增加，精子已基本丧失活力，活力＜5%，无需进行超低温冷冻保存，CASA视野下刺参精子有少许的细菌滋生，这种现象表明，即使刺参精子在添加和实施例1相同的低温保存液，但在室温条件下保存，放置2d即会出现严重的活力损失现象。

对比例3

a.精液获取：同实施例1。

b.低温保存：不向刺参新鲜精液加入任何低温保存液，将其置于15mL或50mL无菌离心管中，并放置到4℃低温冰箱环境中保存。

c.精子活力检测：同对比例1。

d.配制冷冻保护液：按照现用现配的原则，配制新鲜的超低温冷冻保护液，刺参精子的超低温冷冻保护液配方为87.5mL用0.45μm滤膜过滤的自然海水，12.5mL纯度≥99.97％的二甲基亚砜(DMSO)和1 .98g葡萄糖。将配好的冷冻保护液在4℃恒温冰箱预冷至使用。

e.低温保存精液与冷冻保护液混合：每次进行步骤c后，再次混匀步骤b中离心管中的液体，从中取出80μL刺参鲜精与400μL冷冻保护液按1:5的体积比充分混合后分装在2mL冻存管，重复4次；使用程序降温仪对低温短期保存的刺参精液进行超低温长期冷冻保存。

f.程序降温：同实施例1。

g.解冻与冷冻精子活力分析：同实施例1。

统计结果显示：此对比例中的刺参新鲜精子经低温短期保存2d、4d、6d、8d、10d后的精子活力分别为54.95±2.97%、17.90±2.19%、8.92±1.04%、6.56±0.92%、5.52±0.73%，由上述刺参精子经低温短期保存2d、4d后再直接进行超低温冷冻保存得到冷冻精子的精子活力分别为26.17±1.34%、13.23±1.71%。该结果表明，刺参精液在不添加任何低温保存液、4℃低温保存条件下放置2d内有一定的应用价值，但无进一步进行超低温冷冻长期保存的价值；刺参精子在此对比例条件下放置超过2d会出现活力急剧下降的现象，无应用价值。

对比例4

a.配制低温保存液：按照现用现配的原则配制低温保护液，刺参精子的低温保护液配方为98.5mLD-Hanks’缓冲液，0.5mL胎牛血清，1mL青链霉素混合液；其中D-Hanks’缓冲液的配方为8 g/L NaCl， 0.4 g/L KCl，1g/L 葡萄糖， 60 mg/L KH₂PO4，47.5 mg/LNa₂HPO4，调pH至7.2，可从试剂公司订购，在4℃条件下保存。胎牛血清和青链霉素混合液均可提前从试剂公司购买，-20℃长期保存，待使用时提前放置到4℃条件下解冻，青霉素的工作浓度为 100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL。将配好的低温保护液在4℃恒温冰箱预冷至使用。

b.精液获取：同实施例1。

c.精液与低温保存液混合：同实施例1。

d.低温保存：同实施例1。

e.精子活力检测：同实施例1。

f.配制冷冻保护液：按照现用现配的原则，配制新鲜的超低温冷冻保护液，刺参精子的超低温冷冻保护液配方为27mLD-Hanks’缓冲液，5mL纯度≥99.97％的二甲基亚砜(DMSO)。将配好的冷冻保护液在4℃恒温冰箱预冷至使用。

g.低温保存精液与冷冻保护液混合：同实施例1。

h.程序降温：同实施例1。

i. 解冻与冷冻精子活力分析：同实施例1。

统计结果显示：此实施例中的刺参新鲜精子经低温短期保存2d、4d、6d、8d、10d后的精子活力分别为59.68±2.17%、45.05±1.67%、27.24±1.58%、19.45±1.92%、9.47±2.24%，由上述刺参精子经低温短期保存2d、4d后再直接进行超低温冷冻保存得到冷冻精子的精子活力分别为19.90±2.55%、5.52±1.42%。该结果表明，刺参精液在添加以D-Hanks’缓冲液为主要成分的低温保存液、4℃低温保存条件下放置4d内有一定的应用价值，但保存2d内即失去了超低温冷冻长期保存的价值；通过对比实施例1、对比例3和对比例4也可以看出D-Hanks’缓冲液不适合用于刺参精子的低温保存液和冷冻保护液。

由上述各实施例可见按照本发明特定低温保存液、冷冻保护液及刺参精子低温短期保存结合超低温冷冻长期保存技术对仿刺参精子处理，能使刺参精子4d内保持70%以上的精子活力，10d内保持近50%的精子活力，并在短期保存4d内进行超低温冷冻保存能够获得具有35%以上精子活力的刺参冷冻精子，其低温保存液和冷冻保护液中的等渗缓冲液成分与刺参精液的渗透压相等，精子在其中不会因渗透失衡等原因有太大的体积，能够更好的进行营养物质和冷冻保护剂的渗透；胎牛血清能给精子提供能量，青链霉素混合液能一定程度预防微生物污染；相对于常温保存，低温保存对刺参精子是必须的，4℃低温条件能够降低精子的新陈代谢，减少其能量消耗，延长精子活力，并不像零下温度那样对精子活力造成冷冻损伤；而即使同样在4℃保存条件下，不添加低温保存液或者使用其他种类的低温保存液（如以D-Hanks’缓冲液为主要成分的低温保存液），由于缺乏适宜的精子保存环境，刺参精子在低温保存和超低温冷冻保存过程中活力损失严重，进而可见本发明实施例提供的方案具有独特的技术效果。

Claims (5)

1.一种刺参精子低温保存液，其特征在于：所述低温保存液由溶液、胎牛血清、青链霉素混合液组成，其中各组分体积比依次为985μL:5μL:10μL；

所述溶液为等渗缓冲液；

所述等渗缓冲液的配方为0.001 M EGTA、0.34 M NaCl、0.01 M Tris-HCl、溶剂为纯水。

2.一种如权利要求1所述的刺参精子低温保存液的应用，其特征在于：所述低温保存液在用于保存刺参新鲜精液中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的刺参精子低温保存液对刺参精子的保存方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）精液获取：取处于繁殖期的刺参获得其新鲜精液，待用；

（2）精液与低温保存液混合：将刺参新鲜精液与低温保存液按1:1的体积比充分混合置于容器中；

（3）低温处理：混合后置于4℃低温冰箱或4℃低温环境中，即实现刺参精子低温短期保存。

4.按权利要求3所述的刺参精子的保存方法，其特征在于：

（1）精液与冷冻保护液混合：将经权利要求3步骤（3）低温保存液短期保存2-4d内刺参新鲜精液与冷冻保护液按1:2的体积比充分混合置于容器中；

（2）程序降温：混合后置于程序降温仪中，运行降温程序，降温程序为0℃下平衡5min，以10℃/min的降温速率降温至-80℃，-80℃下平衡5分钟，以20℃/min的降温速率降温至-150℃，平衡5分钟后取出并放入到液氮中长期保存，即实现刺参精子低温短期保存下的超低温冷冻长期保存。

5.按权利要求4所述的刺参精子的保存方法，其特征在于：

所述冷冻保护液由等渗缓冲液、二甲基亚砜DMSO组成，其中各自体积比为27mL:5mL；或，所述冷冻保护液由自然海水、二甲基亚砜DMSO和葡萄糖组成，其中各自质量体积比为27mL:5mL: 0.79g；

所述等渗缓冲液的配方为0.001 M EGTA、0.34 M NaCl、0.01 M Tris-HCl、溶剂为纯水。