CN114451404B - 一种白斑狗鱼精液冷冻保存液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种白斑狗鱼精液冷冻保存液及其制备方法，通过在冷冻保护剂中添加蓝萼甲素和羟基酪醇，能够有效保证白斑狗鱼精液冻存复苏后的精子质量，维持与冻存前相当的受精率和孵化率。

Description

一种白斑狗鱼精液冷冻保存液及其制备方法
技术领域
本发明涉及鱼类养殖技术领域，尤其是涉及一种白斑狗鱼精液冷冻保存液及其制备方法。
背景技术
白斑狗鱼是狗鱼科、狗鱼属鱼类。成年雄性体长最大可达100厘米，雌性可长达150厘米，在天然水体中，一些大的个体体重可达35千克。身体细长，稍侧扁，尾柄短小，头尖，吻长且平扁，似鸭嘴状。口裂宽大，口长约达到头长的一半。其产于新疆北部额尔齐斯河流域。每年水域冰冻融化时，白斑狗鱼开始繁殖，繁殖期短，仅1个月，而且雌雄性腺发育不同步，雄鱼性腺成熟比雌鱼晚。在自然界白斑狗鱼交配率较低，受精率低，孵化率较低，鱼苗成活率也低。为了更好地繁殖白斑狗鱼并对其种质资源进行保护，在对其精子进行保存进而提高其受精率不失为一种较为理想的选择。
如今猪、牛、马、鸡精液的保存技术已经成功用于繁殖生产中，但现有技术中并没有白斑狗鱼精子保存的相关研究或者尝试，精液的保存分为常温、低温和超低温三种方式，常温保存可以延长精子寿命至几小时，低温保存可以将精子寿命延长至几天，超低温即玻璃化冷冻保存可以使精子代谢停止，甚至可以将精子寿命几年。在低温或超低温保存的情况下，需要相应的包含渗透压和抗氧化剂等冷冻保护剂对精子进行相应的保护。抗氧化剂主要是减少精子呼吸过程中产生的活性氧所引起的氧化损伤，应用最广泛的抗氧化剂为维生素C。渗透压调节剂可以维持渗透压的稳定性，避免冰晶的形成，应用最广泛最有效的渗透压调剂剂为DMSO，但是其毒性较大，因而应尽量避免使用包含DMSO的冷冻保护剂。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术中指出的针对现有技术中关于白斑狗鱼精液冷冻保护存液的空白，提供一种适用于白斑狗鱼精液的低温冷冻保存液，以提高对白斑狗鱼精液的保护，减少冷冻过程中精液冷冻保存过程中的损伤，提高其冻存质量。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，以100mL计，其由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、8mg蓝萼甲素、10mg羟基酪醇、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成。
本发明还提供了一种白斑狗鱼精液冷冻保存液的制备方法，该方法包括如下步骤：
1)按照配方称取或量取氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、原花青素、蓝萼甲素、羟基酪醇、葡萄糖、乙二醇，并将上述各成分在超纯水中混匀；
2)加入青霉素和链霉素，用重蒸水或者超纯水混合均匀定容至100mL；
3)过滤除菌，在4℃下保存。
本发明还提供了一种白斑狗鱼精液冷冻保存液的用途，其用于白斑狗鱼精液冷冻保存。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供了一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，保存液能够有效维持白斑狗鱼精液的质量，为繁殖白斑狗鱼并对其种质资源进行保护提供了有利的保障。
2、本发明意外地发现蓝萼甲素、羟基酪醇能够作为精子保存液的成分，并且两者的相互配合能够有效的维持精子的活力，两者之间具有协同作用，为精液保存液的发展开辟了一条新路径。
3、本发明中的保存液中的成分原料易得，并且不适用毒性较大的DMSO以及成分复杂天然血清等成分，能够有效的避免DMSO所带来的毒害以及天然血清等带来的细菌污染。
具体实施方式
下面结合对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，以100mL计，其由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、8mg蓝萼甲素、10mg羟基酪醇、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成。
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液的制备方法：
1)按照配方称取或量取氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、原花青素、蓝萼甲素、羟基酪醇、葡萄糖、乙二醇，并将上述各成分在超纯水中混匀；
2)加入青霉素和链霉素，用重蒸水或者超纯水混合均匀定容至100mL；
3)过滤除菌，在4℃下保存。
实施例2
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，以100mL计，其由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、8mg蓝萼甲素、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成。
其制备方法同实施例1。
实施例3
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，以100mL计，其由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、8mg蓝萼甲素、8mg羟基酪醇、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成。
其制备方法同实施例1。
实施例4
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，以100mL计，其由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、8mg蓝萼甲素、12mg羟基酪醇、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成。
其制备方法同实施例1。
实施例5
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，以100mL计，其由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、8mg蓝萼甲素、6mg羟基酪醇、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成。
其制备方法同实施例1。
实施例6
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，以100mL计，其由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、8mg蓝萼甲素、14mg羟基酪醇、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成。
其制备方法同实施例1。
实施例7
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，以100mL计，其由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、10mg羟基酪醇、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成。
其制备方法同实施例1。
实施例8
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，以100mL计，其由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、5mg蓝萼甲素、10mg羟基酪醇、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成。
其制备方法同实施例1。
实施例9
一种白斑狗鱼精液冷冻保存液，以100mL计，其由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、11mg蓝萼甲素、10mg羟基酪醇、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成。
其制备方法同实施例1。
发明人对该实施例的冷冻保护剂使用效果进行了如下试验：
1、精液采集
选择人工养殖的性腺发育成熟的白斑狗鱼，使用干毛巾擦干鱼体表面,按压弃去部分精液后，而后采集精液。在显微镜下进行精液初步质量检查,弃去已被污染的精液，选择活力较好的精子作为试验赝品。
2、精液冷冻储存和复苏
将白斑狗鱼精液和实施例1-10中的冷冻保存液加入干净的麦管中按体积比1：1进行混匀，4℃平衡25min,置于液氮面上平衡5min,于液氮中保存72h。取出装有样品的麦管,将其放入37℃恒温水浴锅中进行中解冻。
3、精子的活力检验
采用CASA检测精子激活后精子活力(MOT)、平均直线运动速度(VSL)、平均曲线运动速度(VCL)等指标。
表1精子冷冻后的参数
冻前 实例1 实例2 实例3 实例4 实例5 实例6 实例7 实例8 实例9
MOT 86.6 74.5 43.2 63.4 62.1 50.7 64.2 48.5 53.2 65.1
VSL(μm/s) 60.8 58.7 32.5 41.7 38.9 37.2 38.4 40.6 41.3 41.7
VCL(μm/s) 68.9 63.9 38.7 46.4 47.3 46.1 40.5 47.8 52.7 57.9
4、受精效果检测
人工采集白斑狗鱼卵子，使用冻存前的精子以及实施例1-9冻存复苏后的精子卵子进行人工受精并进行孵化，采用控温仪控温进行孵化并通入氧气，4小时后统计受精率以及240小时后统计孵化率。
表2受精率和孵化率
冻前 实例1 实例2 实例3 实例4 实例5 实例6 实例7 实例8 实例9
受精率 85.3 70.5 44.3 59.3 58.4 51.7 65.1 48.4 54.7 63.5
孵化率 83.4 69.7 42.1 57.6 56.4 50.8 63.4 44.2 53.5 62.3
从表1-2可以看出，本申请中的冷冻保护剂在不添加毒性较大的DMSO的情况下，能够使得白斑狗鱼精液在冷冻3天后还可以保持与冻存前相当的活力、受精率和孵化率。同时将蓝萼甲素和羟基酪醇作为保存液中的成分后达到最优的技术效果，二者之间存在协同作用。
本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种采用白斑狗鱼精液冷冻保存液冷冻白斑狗鱼精液的方法，其包括如下步骤：
(1)精液采集：选择人工养殖的性腺发育成熟的白斑狗鱼，使用干毛巾擦干鱼体表面，按压弃去部分精液后，而后采集精液，在显微镜下进行精液初步质量检查，弃去已被污染的精液，选择活力好的精子作为试验品；
(2)精液冷冻储存和复苏：将白斑狗鱼精液和冷冻保存液加入干净的麦管中，按体积比1：1进行混匀，4℃平衡25min，置于液氮面上平衡5min，于液氮中保存72h，取出装有样品的麦管将其放入37℃恒温水浴锅中进行中解冻；
(3)采用CASA检测精子激活后精子活力(MOT)、平均直线运动速度(VSL)、平均曲线运动速度(VCL)；
冷冻保存液以100mL计，由1.0g氯化钠、1.2g碳酸氢钠、2.4g磷酸氢二钠、3.1g磷酸二氢钠、0.2g青霉素、0.2g链霉素、15mg原花青素、8mg蓝萼甲素、10mg羟基酪醇、3mg葡萄糖、10mL乙二醇以及余量的超纯水组成；
冷冻保存液的制备方法包括如下步骤：1)按照配方称取或量取氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、原花青素、蓝萼甲素、羟基酪醇、葡萄糖、乙二醇，并将上述各成分在超纯水中混匀；2)加入青霉素和链霉素，用重蒸水或者超纯水混合均匀定容至100mL；3)过滤除菌，在4℃下保存。
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