CN107653305A - 一种快速检测家牛y染色体单倍型组构成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,属于畜牧兽医技术领域。本发明公开的方法通过对家牛Y染色体ZFY‑10标记上1个C>T核苷酸转换和1个GT核苷酸插入/缺失位点的联合定型分析,可以快速、准确地检测家牛3种不同的单倍型组,即普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3单倍型组,进而确定其父系支系组成和起源。相比先前研究中使用多个Y染色体标记上的多个Y‑SNPs的联合定型分析以及酶切分析,该方法只需通过ZFY‑10标记的PCR扩增和直接测序,依据其核苷酸变异就可准确可靠、快速简便、省时省力地确定家牛品种的Y染色体单倍型组成,进而用于其父系支系组成和起源预测,这将大大的提高家牛品种的父系支系组成检测效率,揭示群体遗传结构组成。
Description
技术领域
本发明属于畜牧兽医技术领域,涉及一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法。
背景技术
Y染色体具有遵循父系遗传、单倍型完整等特点,对探究哺乳动物父系遗传多样性、群体遗传结构、迁徙路线、起源和进化等问题具有重要的科学价值。家牛(包括普通牛和瘤牛)Y染色体单核苷酸多态位点(Y-SNPs)的研究表明:家牛由3种Y染色体单倍型组构成,包括Y1和Y2两种普通牛单倍型组和Y3瘤牛单倍型组( et al.2005,Ginja etal.2009)。然而,在当前国内外家牛Y染色体单倍型组构成的研究中,研究者大多采用存在于Y染色体标记上的多个Y-SNPs的联合定型分析来确定各家牛品种的单倍型组构成,进而对其父系支系组成和起源做出推断(Ginja et al.2010,Pérez-Pardal et al.2010,Cortés et al.2011,Edwards et al.2011,常振华2011,Li et al.2013a,Li et al.2013b,Zhang et al.2013,Yue et al.2014),这种联合定型的方法耗时耗力、费用相对较高,在一定程度上影响家牛Y染色体单倍型组构成的检测效率。
为了能够快速准确、经济可靠的确定这3种单倍型组在不同家牛品种内的分布状况,进而揭示其群体父系遗传结构和起源,Bonfiglio等(2012)基于Y染色体USP9Y(Y-linked Ubiquitin-specific Protease 9)基因内含子26上1个81bp的插入和1个限制性酶切位点发展出了一种只借助于PCR扩增和酶切电泳就可以鉴别这3种家牛单倍型组的方法。然而,该方法虽然提高了检测效率,但是需要借助酶切分析,操作相对繁琐,不够简便,检测耗时也较长。除上述研究之外,目前尚未见其他简单可行、快速准确、费用较低的鉴别这3种家牛单倍型组的方法报道。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺陷,本发明的目的在于提供一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,该方法能够快速简便、省时省力、经济可靠地确定家牛品种的Y染色体单倍型组成,结果准确可靠,能够提高家牛品种的父系支系组成检测效率。
本发明是通过以下技术方案来实现:
本发明公开的一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,包括以下步骤:
1)样品采集和基因组DNA提取
采集待检测牛的血样或耳组织,提取待检测牛的基因组DNA,备用;
2)引物合成和PCR扩增
以家牛Y染色体ZFY-10标记引物序列合成1对引物,以步骤1)提取的基因组DNA为模板DNA,进行PCR扩增,得到PCR扩增产物,其中:
上游引物序列如SEQ ID NO:1所示;
下游引物序列如SEQ ID NO:2所示;
3)测序、单倍型组定型分析
将步骤2)获得的待检测牛的PCR扩增产物进行正、反向测序,测序引物为扩增引物,得到待检测牛的ZFY-10标记测序序列结果,进行序列比对分析,检测核苷酸变异位点,依据该标记的核苷酸变异位点确定单倍型组类型;
在测定的序列比对中:
若待检测牛所测序列中存在GT缺失,则直接判定该头牛属于普通牛Y1单倍型组,此时SNP位点为C核苷酸;
若待检测牛所测序列中不存在GT缺失,则看SNP位点的C>T核苷酸类型,如果SNP位点为C核苷酸,则判定该头牛为普通牛Y2单倍型组,反之,如果SNP位点为T核苷酸,则判定为Y3瘤牛单倍型组。
优选地,本发明方法可以同时检测多头牛的Y染色体单倍型组构成,只需要分别采集血样或耳组织提取基因组DNA,然后进行引物合成和PCR扩增,测序、分析比对后进行单倍型组的构成判断和确认。
优选地,步骤1)中,采用基因组DNA提取试剂盒提取待检测牛的基因组DNA,稀释至终浓度为25~50ng/μL,备用。
优选地,步骤2)中,PCR扩增的反应体系共计25μL,包括:
优选地,步骤2)中,PCR扩增时反应程序为:98℃变性10s,52℃退火15s,72℃延伸10s,重复35个循环后冷却至4℃保存。
优选地,步骤2)中,扩增长度为286bp。
优选地,步骤3)中,将待检测牛的PCR扩增产物进行正、反向测序后,将测序结果用Chromas 2.6.4软件进行核实,得到每头公牛的ZFY-10标记测序序列结果。
优选地,步骤3)中,采用BioEdit 7.2.5软件进行序列比对分析,检测核苷酸变异位点。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
本发明公开了一种能够快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的分子生物学方法,通过对家牛Y染色体ZFY-10标记上1个C>T核苷酸转换和1个GT核苷酸插入/缺失位点的联合定型分析,可以快速、准确地检测家牛3种不同的单倍型组,即普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3单倍型组,进而确定其父系支系组成和起源。相比先前研究中使用多个Y染色体标记上的多个Y-SNPs的联合定型分析以及酶切分析,该方法只需通过ZFY-10标记的PCR扩增和直接测序,依据其核苷酸变异就可快速准确、经济可靠、省时省力地确定家牛品种的Y染色体单倍型组成,进而用于其父系支系组成和起源预测,这将大大的提高家牛品种的父系支系组成检测效率。
附图说明
图1为柴达木黄牛和大别山牛单倍型组序列比对分析结果图。
图中:“▲”示核苷酸转换位点;“□”示核苷酸插入/缺失位点;“Y1”和“Y2”分别代表柴达木黄牛2种普通牛单倍型组序列;“Y3”代表大别山牛Y3瘤牛单倍型组序列。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
一、实验方法
本发明公开的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,包括如下步骤:
1)样品采集和基因组DNA提取
采集待检测牛的血样或耳组织,冷冻保存带回实验室,用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,稀释终浓度至25-50ng/μL保存备用。
所用基因组DNA提取试剂盒采用艾德莱生物公司提供的全血组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒,货号为DN10。
2)引物合成和PCR扩增
针对家牛Y染色体ZFY-10标记引物序列合成1对引物,其中,
上游引物(PF):5′-CCAAAATGGTTGAGCTTTATGA-3′;
下游引物(PR):5′-GGAGCATAAGTGATCCAATGAA-3′;
以步骤1)提取的基因组DNA为模板DNA,进行PCR扩增,预期扩增长度为286bp。
PCR反应体系(25uL)为:2×PrimeSTAR Max Premix(上海宝生物公司)10.5μL,上、下游引物(10pmol/L)各0.5μL,模板DNA 1μL,超纯水12.5μL。
PCR反应程序为:98℃变性10sec,52℃退火15sec,72℃延伸10sec,35个循环,后冷却至4℃保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶(含GoldView核酸染料)电泳后,凝胶成像系统拍照检测。
3)测序、单倍型组定型分析
将步骤2)获得的待检测牛的PCR扩增产物采用DNA测序仪进行正、反向测序,测序引物为扩增引物,测序结果用Chromas 2.6.4软件进行核实和校正,得到每头公牛的ZFY-10标记测序序列结果。
用BioEdit 7.2.5软件(Hall 1999)进行序列比对分析,检测核苷酸变异位点,依据该标记的核苷酸变异确定不同个体的单倍型组类型。
在测定的序列比对中:
若所测序列中存在GT缺失则可直接判定该序列对应的检测牛为普通牛Y1单倍型组,此时SNP位点为C核苷酸。若不存在GT缺失,则看SNP位点的C>T核苷酸类型,如果SNP位点为C核苷酸则判定检测牛为Y2普通牛单倍型组,反之,如果SNP位点为T核苷酸则判定为Y3瘤牛单倍型组。
此处所测序列,是指以步骤1)中待检测牛的DNA为模板,PCR扩增后的PCR产物进行直接测序的测序结果。
二、实验效果验证
为了验证本发明方法的可行性和可靠性,通过对106头柴达木黄牛和30头大别山牛(瘤牛)ZFY-10标记的PCR扩增产物进行纯化测序,然后进行序列比对分析,结果参见图1。结果表明:106头柴达木黄牛在该标记中存在GT插入/缺失位点多态性,而在先前Ginja等(Ginja et al.2009)报道的该标记家牛SNP(C>T)位点,未检测到柴达木黄牛品种内SNP变异。然而,在柴达木黄牛和大别山牛(瘤牛)序列比对分析中,发现在该SNP位点柴达木黄牛为C核苷酸,而大别山牛为T核苷酸,存在C>T核苷酸转换,说明该SNP位点为普通牛和瘤牛间的核苷酸变异。充分说明本发明方法的准确性和可靠性很高。
依据该标记核苷酸变异进行定型分析,结果表明:106头柴达木黄牛可确定为Y1和Y2两种普通牛单倍型组,其中23头牛为普通牛Y1单倍型组个体,83头为普通牛Y2单倍型组个体,提示柴达木黄牛由2种普通牛单倍型组构成,以Y2单倍型组为主,Y1单倍型组为辅,其对应2种普通牛父系支系,为普通牛父系起源。而30头大别山牛均为Y3瘤牛单倍型组,属瘤牛支系,为瘤牛起源。通过以上实验,说明该方法简单可行,准确率高,结果可靠。
综上所述,本发明只需通过对ZFY-10标记的PCR扩增和直接测序,依据其核苷酸变异就可准确可靠、快速简便、省时省力省钱地确定家牛品种的Y染色体单倍型组成,进而用于其父系支系组成和起源预测,这将大大的提高家牛品种的父系支系组成检测效率,揭示群体遗传结构组成。
序列表
<110> 青海省畜牧兽医科学院
<120> 一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> 人工合成
<400> 1
<210> 2
<211> 22
<212> 人工合成
<400> 2
Claims (7)
1.一种快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)样品采集和基因组DNA提取
采集待检测牛的血样或耳组织,提取待检测牛的基因组DNA,备用;
2)引物合成和PCR扩增
以家牛Y染色体ZFY-10标记引物序列合成1对引物,以步骤1)提取的基因组DNA为模板DNA,进行PCR扩增,得到PCR扩增产物,其中:
上游引物序列如SEQ ID NO:1所示;
下游引物序列如SEQ ID NO:2所示;
3)测序、单倍型组定型分析
将步骤2)获得的待检测牛的PCR扩增产物进行正、反向测序,测序引物为扩增引物,得到待检测牛的ZFY-10标记测序序列结果,再进行序列比对分析,检测核苷酸变异位点,依据该标记的核苷酸变异位点确定待检测牛的单倍型组类型;
在测定的序列比对中:
若待检测牛所测序列中存在GT缺失,则直接判定该头牛属于普通牛Y1单倍型组,此时SNP位点为C核苷酸;
若待检测牛所测序列中不存在GT缺失,则看SNP位点的C>T核苷酸类型,如果SNP位点为C核苷酸,则判定该头牛为普通牛Y2单倍型组,反之,如果SNP位点为T核苷酸,则判定为Y3瘤牛单倍型组。
2.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,其特征在于,步骤1)中,采用基因组DNA提取试剂盒提取待检测牛的基因组DNA,稀释至终浓度为25~50ng/μL,备用。
3.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,其特征在于,步骤2)中,PCR扩增的反应体系共计25μL,包括:
2×PrimeSTAR Max Premix 10.5μL;
上游引物 0.5μL;
下游引物 0.5μL;
模板DNA 1μL;
超纯水 12.5μL。
4.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,其特征在于,步骤2)中,PCR扩增时反应程序为:98℃变性10s,52℃退火15s,72℃延伸10s,重复35个循环后冷却至4℃保存。
5.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,其特征在于,步骤2)中,扩增长度为286bp。
6.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,其特征在于,步骤3)中,将待检测牛的PCR扩增产物进行正、反向测序后,将测序结果用Chromas 2.6.4软件进行核实,得到每头公牛的ZFY-10标记测序序列结果。
7.根据权利要求1所述的快速检测家牛Y染色体单倍型组构成的方法,其特征在于,步骤3)中,采用BioEdit 7.2.5软件进行序列比对分析,检测核苷酸变异位点。
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