KR20060013732A - 형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법 - Google Patents

형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법 Download PDF

Info

Publication number
KR20060013732A
KR20060013732A KR1020040062317A KR20040062317A KR20060013732A KR 20060013732 A KR20060013732 A KR 20060013732A KR 1020040062317 A KR1020040062317 A KR 1020040062317A KR 20040062317 A KR20040062317 A KR 20040062317A KR 20060013732 A KR20060013732 A KR 20060013732A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bovine
probe
chromosome
specific dna
fertilized egg
Prior art date
Application number
KR1020040062317A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100679154B1 (ko
Inventor
손시환
Original Assignee
진주산업대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 진주산업대학교 산학협력단 filed Critical 진주산업대학교 산학협력단
Priority to KR1020040062317A priority Critical patent/KR100679154B1/ko
Publication of KR20060013732A publication Critical patent/KR20060013732A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100679154B1 publication Critical patent/KR100679154B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 소 수정란의 성을 감별하는 방법에 관한 것으로, 서열 번호 1로 표시되는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 제조하는 단계; 상기 제조된 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 소 수정란에 처리하여 소 Y-염색체와 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 접합시키는 단계; 및 상기 소 Y-염색체와 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브가 접합된 소 수정란을 현미경으로 관찰하고, 관찰된 이미지로부터 Y-염색체 특이적 시그널을 검출함을 특징으로 하는 소 수정란의 성을 감별하는 방법에 관한 것이다.
소 수정란, Y-염색체, 형광접합보인법

Description

형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법{Sex Determination of Bovine Embryos by Fluorescence in situ Hybridization Technique}
도 1은 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브가 접합된 수소(male bovine) 림프세포의 세포 분열 중기상 염색체를 나타낸 사진이다.
도 2는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 처리한 암소(female bovine) 림프세포의 세포 분열 중기상 염색체를 나타낸 사진이다.
도 3은 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브가 접합된 소 수정란의 세포 분열 중기상 염색체를 나타낸 사진이다.
도 4는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 처리한 Y-염색체가 존재하지 않는 소 수정란의 세포 분열 중기상 염색체를 나타낸 사진이다.
도 5는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브가 접합된 소 수정란의 간기핵을 나타낸 사진이다.
도 6은 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 처리한 Y-염색체가 존재하지 않는 소 수정란의 간기핵을 나타낸 사진이다.
본 발명은 소 수정란의 성을 감별하는 방법으로서, 보다 자세하게는 ⒜ 서열 번호 1로 표시되는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 제조하는 단계; ⒝ 단계 ⒜의 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 소 수정란에 처리하여 소 Y-염색체와 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 접합시키는 단계; 및 ⒞ 단계 ⒝의 소 수정란을 현미경으로 관찰하고, 관찰된 이미지로부터 Y-염색체 특이적 시그널을 검출함을 특징으로 하는 소 수정란의 성을 감별하는 방법에 관한 것이다.
포유류 수정란의 성감별은 성 조절된 동물의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다. 이러한 기술이 산업적으로 이용되기 위해서는 체외 수정란의 생산, 현미조작 기술(micromanipulation), 수정란의 동결보존, 수정란 이식 및 수정란의 성 분석 기술이 통합적으로 이루어져야만 가능하다.
현재까지 알려진 포유류 수정란의 성을 감별하는 방법으로는 수정란의 초기 단계에서 핵형을 분석하는 방법(Wintenberger-Torres et al. Theriogenology, 1980, Vol. 14, p.309; Picard et al. Vet. Rec., 1985, Vol. 117, p.603; Sohn et al. Kor. J. Animal Repod., Vol. 20, p.179), 수컷 특이적 항원을 찾기 위한 항원을 이용하는 방법 (Wachtel et al. Nature, 1975, Vol. 257, p.235; White et al. Theriogenology, 1982, Vol. 18, p.655; Anderson G.B. Theriogenology, 1987, Vol. 27, p.81; Utsumi et al. J. Exp. Zoology, 1991, Vol. 260, p.99), 수컷 및 암컷으로 추정되는 수정란 사이의 물질대사 차이점을 분석하는 방법 (Williams T.J. Theriogenology, 1986, Vol. 25, p.733) 및 DNA 접합(hybridization)을 이용 한 수컷-특이적 Y-염색체 DNA 서열을 탐지하는 방법 (Leonard et al. Theriogenology, 1987, Vol. 27, p.248; Bondioli et al. Theriogenology, 1989, Vol. 31, p.95) 등이 있다.
한편, 상기와 같이 포유류 수정란의 성감별을 위해 다양한 방법들이 연구되어 왔으나, 그 중 PCR (polymerase chain reaction)이 가장 진보적이고 보편화된 방법이다 (Herr et al. Theriogenology, 1991, Vol. 35, p.45; Bredbacka et al. Theriogenology, 1995, Vol. 44, p.167; Lopes et al. Theriogenology, 2001, Vol. 56, p.1383; Park et al. Theriogenology, 2001, Vol. 55, p.1843). 상기 PCR 방법은 수컷-특이적 DNA 서열을 짧은 시간 안에 증폭시킬 수 있고, 정확한 결과를 제공하며, 수정란의 성에 대한 신뢰성 있는 정보를 줄 수 있다. 또한, 소 수정란의 성감별에 있어서, 상기 PCR 방법은 소 수정란의 착상 전 유전학적 진단의 대표적인 방법으로 소 수정란의 성을 감별하는 수단을 제공할 수 있다 (Thibier et al. Theriogenology, 1995, Vol. 43, p.71; Shea B.F. et al. Theriogenology, 1999, Vol. 51, p.841).
상기 PCR 방법의 유리한 점에도 불구하고, PCR 방법은 비 특이적 서열 또는 혼재된 DNA 산물(contaminated association)로 인한 DNA 증폭으로부터 성감별의 잘못된 판단을 초래할 수 있으며, 또한 성 염색체 모자이크 양상을 지닌 경우 PCR 방법을 이용한 수정란의 성감별 방법은 불가능해질 수 있다 (Herr et al. Theriogenology, 1991, Vol. 35, p.45; Lee et al. Zygote, 2003, Vol. 11, p.87).
따라서, 상기 PCR 방법의 문제점을 해결하고자, 최근에는 형광접합보인법 (fluorescence in situ hybridization, FISH)을 이용하여 수정란의 성을 감별하려는 방법이 소개되고 있다 (Kobayashi et al. Mol. Reprod. and Dev., 1998, Vol 51, p.390). 상기 형광접합보인법은 형광물질을 이용하여 염색체에 핵산 탐침의 접합을 검출하는 방법으로서, 특이적 유전자 또는 DNA 서열의 위치에 염색된 형광물질을 띠게 하여 개체의 특이적 진핵세포 염색체를 검출할 수 있다.
또한, 형광물질과 결합된 탐침과 검출하고자 하는 유전자의 접합 시그널은 형광 현미경으로부터 쉽게 발견할 수 있기 때문에 상기 형광접합보인법은 생물의 유전자 지도 및 유전학적 진단에 사용되고 있으며 (Klinger et al. Am. J. Hum. Genet., 1992, Vol. 51, p.55; Delhanty et al. Hum. Mol. Genet., 1993, Vol. 2, p.1183; Iannuzzi et al. Cytogent. Genome Res., 2003, Vol. 102, p.65), 사람의 체외 수정란 염색체 변이를 빠르고 간편하게 검출하는 방법이 잘 알려져 있다 (Munne et al. J. Assist Reprod., 1993, Vol. 10, p.82).
그러나, 소 등의 가축에 대한 Y-염색체 특이적 염기서열이 알려져 있음에도 불구하고, 이로부터 Y-염색체 탐침 프로브를 제조하여 형광접합보인법에 의한 가축 수정란의 성을 감별하려는 연구는 매우 미진하며, 또한 현재 이용되는 탐침 프로브도 BC1.2 (Cotinot et al. Genomics, 1991, Vol. 10, p.646)로 국한되어 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 형광접합보인법을 이용하여 가축으로서 대표적인 소의 수정란을 대상으로 보다 효율적이고 실용적인 성감별 방법을 실험적으로 입증하였 다. 즉, 수소 특이적 DNA로부터 새로운 형광접합탐침 프로브를 제조하고 이를 이용하여 소 수정란의 성을 감별하는 방법을 개발하고자 하였다.
따라서, 본 발명은 ⒜ 서열 번호 1로 표시되는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 제조하는 단계;
⒝ 단계 ⒜의 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 소 수정란에 처리하여 소 Y-염색체와 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 접합시키는 단계; 및
⒞ 단계 ⒝의 소 수정란을 현미경으로 관찰하고, 관찰된 이미지로부터 Y-염색체 특이적 시그널을 검출함을 특징으로 하는 소 수정란의 성을 감별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 소 수정란의 성을 감별하는 방법에 관한 것으로서, ⒜ 서열 번호 1로 표시되는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 제조하는 단계; ⒝ 단계 ⒜의 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 소 수정란에 처리하여 소 Y-염색체와 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 접합시키는 단계; 및 ⒞ 단계 ⒝의 소 수정란을 현미경으로 관찰하고, 관찰된 이미지로부터 Y-염색체 특이적 시그널을 검출함을 특징으로 하는 소 수정란의 성을 감별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 성을 감별하고자 하는 소 수정란은 체내 수정란 또는 체외 수정란일 수 있으나, 바람직하게는 성 조절된 소의 대량 생산을 위해 인공적으로 수정된 체외 수정란의 성을 감별할 수 있다. 상기 소 체외 수정란은 당업계에서 통상 적으로 사용하는 방법으로 수득할 수 있다. 즉, 암소로부터 난소를 적출 한 후, 상기 적출된 난소로부터 난구-난자 복합체 (cumulus-oocyte complexes, COCs)를 흡인하고, 상기 흡인된 난구-난자 복합체로부터 난모세포(oocyte)를 회수하여 체외성숙용 배양액으로 배양시킨 후, 상기 난모세포가 있는 배양액에 정액을 주입하여 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에서 성을 감별하고자 하는 소 수정란은 8 세포기에서부터 배반포까지 어느 시기에든 성감별을 위해 이용할 수 있지만, 정확한 성감별의 검증을 위해 각 시기 중 세포 분열 중기상 염색체 또는 간기핵이 나타나는 시기를 인위적으로 유도하여 이용할 수 있다. 상기 소 수정란에서 세포 분열 중기상 염색체 또는 간기핵이 나타나도록 하는 방법은 소 수정란을 유사분열 억제제가 포함된 배양액으로 배양한 후, 상기 배양된 소 수정란에 저장성 용액을 처리하여 고정시키는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 소 수정란에 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 처리하여 수정란의 Y-염색체와 상기 탐침을 접합(hybridization)시킴을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브는 수소 특이적 DNA로 잘 알려진 btDYZ-1 서열의 일부분으로서 (Perret et al. Genomics, 1990, Vol. 6, p.482), 소 Y-염색체에 특이적으로 결합할 수 있으며 총 길이가 385bp인 단편으로 제작할 수 있다. 한편, 상기 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브는 수소 특이적 DNA인 btDYZ-1 서열로부터 디자인된 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 제조할 수 있다. 즉, "w-5"로 명명된 정방향 프라이머(서열번호 2) 및 "w-3"으로 명명된 역방향 프라이머(서열번호 3)를 프라미어 쌍으로 하여 수소 게놈 DNA를 주형으로 통상적인 PCR 방법을 통해 제조할 수 있다. 상기 PCR 방법으로 제조된 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브의 염기 서열을 서열번호 1로 나타내었다.
또한, 본 발명에서 사용되는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브는 형광 표지 물질이 결합되어 있음을 특징으로 한다. 상기 형광 표지 물질은 소 수정란의 Y-염색체가 상기 탐침 프로브와 접합시 표시되도록 하기 위한 것으로서 디곡시제닌(Digoxigenin, 이하"Dig"라 함), 바이오틴 (Biotin) 또는 플루오레세인 (Fluorescein) 등의 형광물질이 결합된 탐침을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 디곡시제닌으로 표지된 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 소 수정란의 성을 감별하는 방법은 소 수정란의 Y-염색체와 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브가 결합된 양상을 현미경으로 관찰하고, 상기 관찰된 이미지로부터 형광 표지 물질의 접합 시그널(signal)을 분석함을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 현미경으로는 형광 표지 물질을 관찰할 수 있으며, 관찰된 이미지를 디지털 이미지로 획득할 수 있는 형광현미경을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 소 수정란의 성을 감별하는 방법은 현미경을 통해 나타난 소 수정란의 이미지를 디지털 이미지로 획득한 후, 소 수정란으로부터 나타나는 형광 표지 물질의 접합 시그널로 수정란의 성을 감별할 수 있다. 즉, 형광 표지 물질이 표시되는 소 수정란의 경우, XY 염색체가 존재하는 소 수정란으로 판단하고, 형광 표지 물질이 표시되지 않은 소 수정란의 경우, XX 염색체가 존재하는 소 수정란으로 판단할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1
소 수정란의 생산
소 수정란을 7 내지 8일 동안 체외에서 배양하여 성숙 및 수정시켜 생산하였다. 즉, 도축장에서 홀스타인 종 또는 한우 종의 난소를 적출하였다. 상기 적출된 난소로부터 난구-난자 복합체를 흡인하였고, 이 때 난구세포(cumulus cell)로 둘러싸인 30 내지 50개의 난모세포를 회수하여 TCM-199 배지 (Invitrogen Life Technologies, U.S.A.)로 이동시켰다. 상기 배지에서 22 내지 24시간 동안 배양한 후, 배양된 난구-난자 복합체를 BSA(bovine serum albumin) 및 헤파린(heparin)이 첨가된 50㎕ BO 배양액 (Brackett, B.G. and Oliphant, G. Biol. Reprod., 1975, Vol. 12, p.260)으로 세척하고 보관하였다.
한편, 소의 동결정액을 해동하고, 상기 해동된 정액의 정자를 카페인(caffeine)을 첨가한 BO 배양액으로 두 번 세척하였다. 세척한 정자를 포함하는 50㎕의 정액 부유물 (2×106정자/㎖ 내지 4×106정자/㎖)을 수정을 위해 상기 난구-난자 복합체를 포함하는 배양액으로 도입시켰다.
상기 수정된 수정란을 난관상피세포가 들어있는 CR1 배양액 (Rosenkrans et al. Biol. Reprod., 1993, Vol. 49, p.459)으로 이동시켰다. 수정 후 72시간이 경과한 8 세포 시기의 수정란을 글루코오스(glucose)가 첨가된 BO 배양액으로 이동시켰다. 또한, 수정 후 120시간이 경과한 상실배(Morulae) 시기의 수정란을 BSA 대신 글루코오스 및 FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 BO 배양액으로 재이동시켜 보관하였다.
실시예 2
세포 분열 중기상의 유도
대조군으로서, 소의 세포 분열 중기상의 염색체는 소의 혈액을 배양하여 제조하였다. 즉, 0.5㎖의 혈액을 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% PWM(pokeweed mitogen) 및 10% FBS (v/v, Invitrogen Life Technologies, U.S.A.)를 첨가한 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 한편, 상기 배양된 혈액에 존재하는 림프세포(lymphocytes)는 5% 이산화탄소 및 95% 공기 조건 하에 37℃에서 72시간동안 배양하였으며, 이 때 콜세미드(colcemid, 0.1㎍/㎖, Invitrogen Life Technologies, U.S.A.) 용액을 배양종료 50분전에 첨가하였다. 상기 콜세미드 용액을 처리한 림프세포에 0.06M 염화칼륨 저장성 용액(Sigma Chem., U.S.A.)을 처리하였다. 상기 염화칼륨 저장성 용액을 처리한 림프세포를 메탄올 대 아세트산의 비율이 3 : 1인 고정용액으로 고정하였다. 상기 고정과정을 수 차례 반복한 후, 고정된 림프세포를 슬라이드 글라스 위에 떨어뜨렸고, 이를 하룻밤 동안 건조시켰다.
한편, 체외 수정된 소의 수정란으로부터 세포 분열 중기상의 염색체를 유도하였다 (Sohn et al. Kor. J. Animal Reprod., 1996, Vol. 20, p.179). 즉, 체외 수정된 소 수정란을 0.1㎍/㎖의 콜세미드 용액을 포함하는 0.5㎖ CR1 배양액에 넣고 6 내지 8시간 동안 배양하였다. PBS로 상기 수정란을 세척한 후, 상기 수정란을 저장성 용액인 0.9% 구연산나트륨 용액에 이동시켰고, 상기 저장성 용액을 처리한 수정란을 여러번 고정처리하였다. 고정용액은 메탄올 대 아세트산의 비율이 3:1인 용액이며, 상기 고정용액을 저장성 용액에 떨어뜨려 수정란을 고정하였다. 상기 고정된 수정란을 슬라이드 글라스에 위치시키고, 아세트산을 수정란의 분할된 난할구에 미세한 방울로 떨어뜨렸으며, 상기 고정액으로 다시 고정하였다.
만약 세포질이 남아있다면, 상기 수정란에 고정용액인 메탄올, 아세트산 및 물의 비율이 4:3:1인 용액을 한 방울씩 떨어뜨려 세포질을 제거하였다. 상기 수정란을 실온에서 하룻밤 동안 건조시켰다.
실시예 3
소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브의 제조
형광접합보인법을 위한 소 Y 염색체-특이적 DNA 탐침 프로브는 수소 특이적 DNA로 잘 알려진 btDYZ-1 서열의 일부분을 사용하였다 (Perret et al. Genomics, 1990, Vol. 6, p.482).
즉, "w-5" (5'-GTGTGTGTGCTGTTCTCAAC-3': 서열번호 2) 및 "w-3" (5'-CACACGACAAAATATTGCAC-3': 서열번호 3)으로 명명된 PCR 프라이머 쌍 및 수소 게놈 DNA를 주형으로 하여 제조사의 PCR 방법 (Boehringer-Mannheim, U.S.A.)을 통해 385bp의 단편인 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브 (서열 번호 1)를 제조하였으며, 상기 탐침에 형광 표지 물질인 (dig)-dUTP (Boehringer-Mannheim, U.S.A.)를 표지하였다.
실시예 4
형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별
소 수정란의 성을 감별하기 위해 사용되는 형광접합보인법은 Kobayashi 등의 방법을 변형하여 사용하였다 (Kobayashi et al. Mol. Reprod. and Dev., 1998, Vol. 51. p.390). 즉, 상기 실시예 2에서 제조한 림프세포 또는 소 수정란이 존재하는 슬라이드 (이하 "표본 슬라이드"라 함)에 5㎍의 RNase A가 포함된 2×SSC (Sigma Chemical Co., U.S.A.) 용액을 처리한 후, ddH2O 용액으로 세척하였다. 상기 세척된 표본 슬라이드를 에탄올의 양을 증가시켜 반복적으로 처리하여 탈수시켰다. 한편, 실시예 3에서 제조한 100ng의 dig-표지된 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 포함하는 접합 완충액 (40% 4×SCC, 50% 포름아미드(formamide) 및 10% 덱스트란 설페이트(dextran sulfate))을 상기 표본 슬라이드에 처리하였다. 상기 표본 슬라이드 및 탐침을 72℃ 열판에서 10분간 변성시키고 38.5℃에서 1시간동안 접합시켰다. 상기 표본 슬라이드를 2×SSC 용액으로 72℃에서 5분동안 세척하였고, 그 후 PN 완충용액 (0.1% sodium phosphate 및 0.1% nonidet P-40)으로 상온에서 2분 동안 세척하였다.
상기 건조시킨 표본 슬라이드를 항-dig (anti-dig)-플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC) 접합체 (Boehringer-Mannheim, U.S.A.)로 38.5℃에서 30분간 처리하였다. 상기 표본 슬라이드를 PN 완충용액으로 세척한 후, 대조염색으로 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)로 염색하였고, WIB 532㎚-패스 필터가 장착된 형광 현미경 (Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 상기 관찰된 이미지를 디지털 CCD(DP-70, Olympus, Japan)로 획득하였다.
각 표본 슬라이드로부터 림프세포 또는 수정란의 중기 또는 간기핵의 Y-염색 체 특이적 접합 시그널을 분석하여 도 1 내지 도 6 및 표 1에 접합 시그널 및 분석결과를 나타내었다.
소 수정란에서 나타나는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브의 접합 시그널 검출 비율
수정란의 발생단계 수정란의 수(%)
검사한 수정란 분석 가능한 수정란 dig-시그널 검출* dig-시그널 비검출
8세포(8-cell) 63 51(80.9) 22(43.1) 29(56.9)
16세포(16-cell) 18 17(94.4) 8(47.1) 9(52.9)
상실배(Morula) 70 68(97.1) 31(45.6) 37(54.4)
배반포 (Blastocyst) 99 96(97.0) 41(42.7) 55(57.3)
수정란의 총개수 250 232(92.8) 102(44.0) 130(56.0)
* 상기 dig-시그널이 Y-염색체에서 발현하는 것을 의미한다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군으로서 정상의 수소 및 암소 림프세포의 세포분열 중기상 염색체 및 간기핵으로부터 dig-표지된 탐침 프로브의 접합 시그널을 관찰한 결과, Y-염색체의 접합 시그널은 수소의 림프세포로부터 검출하였으나(도 1), 암소의 림프세포에서는 접합 시그널을 발견할 수 없었다(도 2).
한편, 배양하지 않은 림포세포에서도 dig-표지된 탐침의 접합 시그널이 수소의 림프세포 간기핵에서 나타났으나, 암소의 림프세포 간기핵에서는 접합 시그널이 발견되지 않았다.
상기와 같은 결과에 따라, 본 발명자들은 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로 브가 소 Y-염색체에 특이적으로 접합함을 확인하였다. 즉, 도 3 내지 도 6에 도시한 바와 같이, XY-염색체를 갖는 소 수정란은 세포 분열 중기상 염색체 및 간기핵상에서 dig-표지된 탐침 프로브의 접합 시그널이 검출되었지만(도 3 및 도 4), XX-염색체를 갖는 소 수정란은 세포 분열 중기상 염색체 및 간기핵상에서 dig-표지된 탐침 프로브의 접합 시그널이 나타나지 않았다(도 5 및 도 6). 이러한 dig-표지된 탐침의 접합 시그널의 검출유무에 따라, 접합 시그널이 검출되는 수정란은 수컷의 성을 갖는 것이고(도 3 및 4), 접합 시그널이 검출되지 않는 수정란은 암컷의 성을 갖는 것이다(도 5 및 도 6).
한편 상기 표 1은 소 수정란에서 나타나는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브의 접합 시그널 검출 비율을 나타낸 것이다. 체외 수정된 총 250개의 수정란을 실험에 사용하였고, 실험에 사용되는 수정란의 발생 단계는 8세포, 16세포, 상실배 및 배반포 시기였다. 전체 수정란 중 표적이 되는 232개의 수정란 (92.8%)을 형광접합보인법으로 판단할 수 있었다. dig-표지된 탐침 프로브의 접합 시그널의 발현에 따라, 102개의 수정란 (44.0%)은 양성 시그널을 갖고 있었고, 130개의 수정란 (56.0%)은 접합 시그널을 나타내지 않았다.
본 발명은 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 이용하여 소 수정란의 성을 감별하는 방법으로서 소 수정란의 성을 정확하고 신속하게 판단할 수 있다.
<110> Jinju National University Industry-Academia Cooperation Foundation <120> Sex Determination of Bovine Embryos by Fluorescence in situ Hybridization Technique <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 385 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bovine Y-chromosome specfic DNA probe <400> 1 gtgtgtgtgc tgttctcaac ccattgccct ggcgattgtt caaccagttt gtgtatatgt 60 gtgtgtagat gtgtgtgcca tcctgagcct tgtgccctgg caactgggga aacggtgtgt 120 gtgtgttgtg tgtctgtgtg tgtgctgatt tcagccatgt gcccttctga ctgtgcaact 180 ggtttgtgtg tgtgtgcacg cgattctcac ctctgtgtcc tggcgactgt gtaaccgttt 240 gtgtgtgtga gtgtgtgtaa gtgtgtgctc ttttcagccc tgtttcctag agactgtgga 300 accggttggt gtgtgtgtgt gtctgtgtgt gtgtgtgcca ttctcagccc tgtgccctgg 360 cgactgtgca atattttgtc gtgtg 385 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> w-5 primer <400> 2 gtgtgtgtgc tgttctcaac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> w-3 primer <400> 3 cacacgacaa aatattgcac 20

Claims (4)

  1. ⒜ 서열 번호 1로 표시되는 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 제조하는 단계;
    ⒝ 단계 ⒜의 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 소 수정란에 처리하여 소 Y-염색체와 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 접합시키는 단계; 및
    ⒞ 단계 ⒝의 소 수정란을 현미경으로 관찰하고, 관찰된 이미지로부터 Y-염색체 특이적 시그널을 검출함을 특징으로 하는 소 수정란의 성을 감별하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 소 Y-염색체 특이적 DNA 탐침 프로브를 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로 표시되는 프라이머 쌍 및 수소 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR 방법으로 제조함을 특징으로 하는 소 수정란의 성을 감별하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 소 수정란이 체외 수정란임을 특징으로 하는 소 수정란의 성을 감별하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 소 수정란의 성을 감별하는 방법이 형광접합보인법을 이용하는 방법.
KR1020040062317A 2004-08-09 2004-08-09 형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법 KR100679154B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040062317A KR100679154B1 (ko) 2004-08-09 2004-08-09 형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020040062317A KR100679154B1 (ko) 2004-08-09 2004-08-09 형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060013732A true KR20060013732A (ko) 2006-02-14
KR100679154B1 KR100679154B1 (ko) 2007-02-05

Family

ID=37122901

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020040062317A KR100679154B1 (ko) 2004-08-09 2004-08-09 형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100679154B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107653305A (zh) * 2017-11-03 2018-02-02 青海省畜牧兽医科学院 一种快速检测家牛y染色体单倍型组构成的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3201780B2 (ja) * 1991-06-06 2001-08-27 誠 岩谷 ウシの雄特異的ｄｎａおよびウシ雌雄の判別方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107653305A (zh) * 2017-11-03 2018-02-02 青海省畜牧兽医科学院 一种快速检测家牛y染色体单倍型组构成的方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR100679154B1 (ko) 2007-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Coonen et al. Optimal preparation of preimplantation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in-situ hybridization
Benkhalifa et al. Assessment of polyploidy in human morulae and blastocysts using co-culture and fluorescent in-situ hybridization
Choudhary et al. Advances in reproductive biotechnologies
US20080085836A1 (en) Method for genetic testing of human embryos for chromosome abnormalities, segregating genetic disorders with or without a known mutation and mitochondrial disorders following in vitro fertilization (IVF), embryo culture and embryo biopsy
JP2593021B2 (ja) ウシ胚の性の識別方法
Peippo et al. Sex diagnosis of equine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction
CN113286892B (zh) 一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品
CN102459635A (zh) 用于选择对于妊娠结果具有高潜能的感受态卵母细胞和感受态胚胎的方法
US5759772A (en) Method for determining the sex of an embryo
AU2005252470B2 (en) Identifying chromosomal abnormalities in cells obtained from follicular fluid
CN111440857B (zh) 用于无创胚胎植入前遗传性检测的方法
Kawarasaki et al. Sexing of porcine embryo by in situ hybridization using chromosome Y-and 1-specific DNA probes
Bondioli Embryo sexing: a review of current techniques and their potential for commercial amdication in livestock production
Peippo et al. Birth of correctly genotyped calves after multiplex marker detection from bovine embryo microblade biopsies
KR100679154B1 (ko) 형광접합보인법을 이용한 소 수정란의 성감별법
KR100991168B1 (ko) 정자의 성 선별방법 및 특정 성별을 갖는 포유동물의생산방법
Leichthammer et al. Behavior of living primordial germ cells of livestock in vitro
Fajfar‐Whetstone et al. Sex determination of porcine preimplantation embryos via y‐chromosome specific DNA sequences
US6489536B2 (en) Method for producing cloned bovines from cells of a bovine intramuscular preadipocyte cell line
Sarradin et al. Semen from scrapie-infected rams does not transmit prion infection to transgenic mice
Rychlik et al. The phenomenon of cell chimerism in goats
US20220025323A1 (en) Methods for generating, evaluating, gene editing and cloning pluripotent stem cells comprising a lethal haplotype
Iannuzzi Cytogenetics in animal production
Kozubska-Sobocinska et al. Identification of heterosomes in spermatoza of rams with 54, XX/54, XY chimerism
Han et al. Sex determination of in vitro fertilized bovine embryos by fluorescence in situ hybridization technique

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120106

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130109

Year of fee payment: 7

LAPS Lapse due to unpaid annual fee