CN103555829A - 一种检测trem2基因r47h突变的探针、试剂盒和方法 - Google Patents

一种检测trem2基因r47h突变的探针、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种检测TREM2基因R47H突变的探针、试剂盒和方法。所述探针能检测到TREM2基因rs75932628位点碱基G是否突变为A。应用该探针，可实现单管封闭、快速简单的检测样品中TREM2基因是否有R47H突变；大大减少了交叉污染的几率；操作简便，检测快速，只需要1.5个小时即可；检测结果直观，根据不同的荧光信号即可定性判断待测样本中TREM2的三种基因型，无需繁琐的分析过程。

Description

一种检测TREM2基因R47H突变的探针、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域。具体的，涉及一种检测TREM2基因R47H突变的探针、试剂盒和方法。
背景技术
髓样细胞表达激发受体2（triggering receptorsexpressed on myeloid cells, TREM2）为免疫球蛋白超家族受体成员之一，主要表达在单核/巨噬细胞、中性粒细胞，树突状细胞、破骨细胞上，参与天然免疫应答并且能够调节应答的发展时相。编码TREM2的基因定位于6号染色体，全长横跨4.7kbDNA，编码的蛋白质含230个氨基酸，分子量为25.447KDa，在脑、肺、血液、心脏、皮肤及唾液中都有表达，在人类脑中，TREM2在白质、海马及新皮层表达量非常高，而在小脑中表达量低，这与阿尔兹海默病理特征相似。在脑组织中，TREM2充当小神经胶质细胞（microglia）的“on/off”开关。它识别内源配体，通过DAP12蛋白启动清除神经系统细胞碎片及损坏的神经组织的信号，并释放抗炎症因子保护神经组织。
2012年11月，研究人员报道了除APOE基因外，TREM2基因与晚发型阿尔茨海默病发病几率也密切相关。TREM2基因的核酸位点rs75932628在人群中具有两种不同的形式，鸟嘌呤（G）或胸腺嘧啶（A），前者在人群中出现几率很高（～99.5%），这种形式的TREM2基因编码出功能正常的野生型TREM2蛋白；后者出现的几率较低（～0.5%），它导致TREM2蛋白第47位的精氨酸突变为组氨酸（即R47H突变），该突变能导致阿尔茨海默病患病的风险大大增加。目前TREM2基因R47H突变检测的方法主要有：传统DNA测序法、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法、聚合酶链反应-单链构象多态性法、聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性法、高分辨率溶解曲线法等。然而，目前快速确定该突变的方法仍可改进。
目前检测TREM2 基因R47H突变的方法主要有：
1、聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性（PCR-RFLP）：该法使用引物扩增TREM2基因包括了rs75932628的DNA片段。SNP核苷酸的变化可以形成不同的酶切位点。将扩增产物用特异的核酸内切酶消化，再进行电泳分析，根据片段大小，可确定rs75932628为何种核苷酸，进而确定TREM2是否为R47H突变。该方法需至少PCR扩增、酶切、电泳、凝胶成像分析四个步骤，至少耗时5~6小时，需要大量人工操作，自动化程度低，人为误差大；
2、高分辨率溶解曲线法（HRM）：首先通过PCR扩增出含有rs75932628的DNA片段。然后用荧光探针检测PCR产物的退火溶解曲线。由于SNP的核苷酸差异会导致PCR产物的Tm值发生微小变化，并能从其退火溶解曲线中反应出来。因此根据溶解曲线的差异即可判断是否有碱基突变。该方法需要PCR扩增、退火、溶解曲线分析三个步骤，耗时约3个小时，易实现自动化，人为误差较小，但是该技术要求性比较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单管封闭、快速简单的TREM2基因是否有R47H突变的检测方法。
为实现上述目的，本发明提供一种用于检测TREM2基因R47H突变的探针，其为下述（A）的寡核苷酸的探针和下述（B）的寡核苷酸的探针的至少一种，
（A）SEQ ID NO:3的碱基序列，5’和3’两端分别偶联上荧光基团和淬灭基团；
（B）SEQ ID NO:4的碱基序列，5’和3’两端分别偶联上与(A)不同的荧光基团和相应的淬灭基团。
所述（A）和（B）的寡核苷酸的探针为用于检测SEQ ID NO:5的碱基序列中第140位碱基G→A 的突变的探针。
所述（A）的5’和3’两端分别偶联上FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团；所述（B）的5’和3’两端分别偶联上HEX荧光基团和BHQ1淬灭基团。
本发明还提供一种试剂盒，其特征在于，包含所述的探针。
本发明还提供一种用于检测TREM2基因R47H突变的检测系统，其特征在于，包括，
PCR扩增装置，用于扩增待测样品DNA片段，包含了待检测的位点；
分子量检测装置，所述PCR扩增装置与所述分子量检测装置相连，以便确定所述扩增产物的分子量；以及
荧光读取装置，用于读取荧光值；
结果分析装置，基于读取的荧光值，确定所述预定位点的突变类型；
优选的，所述PCR扩增装置内设置有扩增引物对和检测探针。
还提供一种用于TREM2基因R47H突变的检测方法，其特征在于，包括使用所述探针或者所述试剂盒的步骤。所述步骤为，
采用SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2作为PCR扩增引物，所述探针或者所述试剂盒中的探针作为荧光检测探针；对要检测的DNA样品进行PCR扩增检测，最后读取荧光值，根据荧光值进行结果判断；
所述PCR扩增反应程序为：95℃5min；95℃5s，54℃30s，72℃10s共40个循环。
所述结果判断为，如果仅有(A)荧光信号则样品DNA为WT/WT纯合子，即rs75932628位点为G/G；如果仅有（B）荧光信号则荧光信号则样品DNA为R47H/R47H突变纯合子，即rs75932628位点为A/A；如果既有(A)荧光信号又有（B）荧光信号则样品DNA为WT/R47H杂合子，即rs75932628位点为G/A。 
本发明还保护所述探针或者所述试剂盒中的探针用于检测TREM2基因R47H突变的用途。
本发明方法包括：针对TREM2基因rs75932628（SEQ ID NO:5)位点两端设计正向引物和反向引物，使之扩增片段在70-200bp之间，并且根据rs75932628位点存在G或A碱基，分别设计一小段特异性DNA分子（rs75932628位点分别为G或A），在DNA分子两端加上一段6个碱基长度的反向互补序列，形成探针；在其中一条探针（rs75932628位点为G，称为野生型探针）的5’和3’两端分别偶联上FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团，在另外在另外一条探针（rs75932628位点为A，称为突变型探针）5’和3’两端分别偶联上HEX荧光基团和BHQ1淬灭基团，使之形成茎-环结构的同时，荧光基团和淬灭基团靠近发生能量共振转移，不发出荧光值。
 在进行PCR扩增前，在相应的PCR反应体系中加入以上所述的正向和反向引物以及两种DNA分子荧光探针，正向引物和反向引物将含TREM2基因的rs75932628 DNA片段扩增出来，如果rs75932628为G，则在扩增退火阶段，野生型探针的环结构跟扩增的靶序列完全匹配，使茎-环结构打开，FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团分离发出荧光。如果rs75932628为A，则在扩增退火阶段，突变型探针的环结构跟扩增的靶序列完全匹配，使茎-环结构打开，HEX荧光基团和BHQ1淬灭基团分离发出荧光。根据不同的荧光值扩增曲线，就可以实现在单管封闭的情况下一次性检测人DNA样品的TREM2基因是否有R47H突变，并且可以判断出人体的TREM2基因rs75932628位点三种基因型：即G/G，A/A和G/A，如果只有FAM荧光值，即为G/G纯合型；如果只有HEX荧光值，即为A/A纯合型；如果既有FAM荧光值又有HEX荧光值，即为G/A杂合型。
图1中，1表示含SNP rs75932628的TREM2基因DNA片段示意图，用不同的颜色分别表示该位点的G或A，2和3表示经过PCR后产生的含G或A的TREM2 DNA片段。正向引物（核酸序列为SEQ ID NO:1，5’- GTGTCTTGCCCCTATGACTCCA -3’）位于SNP rs75932628的上游，反向引物（核酸序列为SEQ ID NO:2，5’- GTGCTCCCATTCCACCTCCT-3’）位于SNP rs75932628的下游。由此，正向引物和反向引物对样品进行PCR可以特应性扩增出含有rs75932628为G或A的两种TREM2 DNA片段产物，片段大小为146bp。通过后面的荧光信号的分析可以确定DNA样品中人TREM2基因是否有R47H突变。
 图2中，1表示一段含rs75932628位点的TREM2基因DNA序列，2表示带有荧光基因和淬灭基团的DNA分子荧光探针，在存在完全匹配的靶序列的情况下，荧光基因和淬灭基团分离发出荧光。核酸探针2的两端分别偶联有荧光基团和淬灭基团，此时由于淬灭基团能吸收荧光基团的激发能量，在自由状态时由于6个碱基的反向互补序列，使荧光探针分子形成茎-环结构，使荧光分子与淬灭分子靠近(约为7-10nm)。此时发生荧光共振能量转移，使荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当核酸探针2能与TREM2基因DNA模板反义链特异互补匹配，茎-环结构的茎区域被打开，荧光分子和淬灭分子距离增大，荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与PCR反应体系中扩增的靶序列的量成正比。
图3中，5和6分别表示为TREM2野生型和TREM2 R47H突变型PCR扩增的过程。在该图中，5和6分别表示 rs75932628位点为G和A的TREM2 DNA片段，野生型探针特异性结合只含G的DNA片段而发出FAM荧光，突变型探针特异性结合只含A的DNA片段而发出HEX荧光。正向扩增引物和核酸探针将与TREM2基因DNA模板反义链结合，反向扩增引物将与TREM2基因DNA模板正义链结合，在DNA聚合酶的作用下开始扩增模板DNA。如果rs75932628为G，则在扩增退火阶段，野生型探针（序列为5’-FAM-CGGTCAACTGGGGGAGGCGCAAGGTGACCG-BHQ1-3’）的环结构跟扩增的靶序列完全匹配，使茎-环结构打开，FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团分离发出荧光。如果rs75932628为A，则在扩增退火阶段，突变型探针(序列为5’-FAM-CGCGTA TGGGGGAGGCACAAGGCTACGCG-BHQ1-3’)的环结构跟扩增的靶序列完全匹配，使茎-环结构打开，HEX荧光基团和BHQ1淬灭基团分离发出荧光。在PCR的过程中可以根据这两个荧光信号来判断人样品中TREM2基因是否有R47H突变。
 该发明具有以下几个优点：该发明为单管封闭检测分析，大大减少了交叉污染的几率；该发明操作简便，检测快速，只需要1.5个小时即可；该发明的检测结果直观，根据不同的荧光信号即可定性判断待测样本中TREM2的三种基因型，无需繁琐的分析过程。
附图说明
图1是扩增含rs75932628的TREM2的DNA片段的示意图。
图2是DNA分子荧光探针工作原理示意图。
图3是TREM2 rs75932628位点检测示意图。
图4 A、B、C是三种TREM2基因型的PCR扩增结果荧光示意图。
图5A、B、C、D为利用本发明对三个已知TREM2基因型的阳性标准品和一实例未知人DNA样品进行PCR扩增分析的荧光结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实时定量PCR仪器，ABI，7500 Fast；2×扩增预混液，TAKARA，RR390A。
实施例1 
人工合成以下序列(Invitrogen公司)，具体为：
正向引物：5’- GTGTCTTGCCCCTATGACTCCA -3’（SEQ ID NO:1）；位于SNP rs75932628的上游，
反向引物：5’- GTGCTCCCATTCCACCTCCT-3’（SEQ ID NO:2）；位于SNP rs75932628的下游。
野生型探针为序列SEQ ID NO:3的5’和3’两端分别偶联上FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团；
突变型探针为序列SEQ ID NO:4的5’和3’两端分别偶联上HEX荧光基团和BHQ1淬灭基团。
SEQ ID NO:3：5’ CGGTCAACTGGGGGAGGCGCAAGGTGACCG  3’
SEQ ID NO:4：5’ CGCGTATGGGGGAGGCACAAGGCTACGCG   3’
PCR扩增体系为： 
                  2×扩增预混液               5.0ul
              正向引物（100uM）         0.325ul
              反向引物（100uM）         0.325ul
              野生型探针（100uM）      0.325ul
              突变型探针（100uM）      0.325ul
              模板                      　　　　10.0ng
               总反应体积                　　 10.0ul
PCR扩增反应程序见表1，     表1
试验结果见图4。其中图4A仅有FAM荧光信号，则样品DNA为WT/WT纯合子（即rs75932628位点为G/G）；图4B仅有HEX荧光信号，则样品DNA为R47H/R47H突变纯合子（即rs75932628位点为A/A）；图4C既有FAM荧光信号又有HEX荧光信号则样品DNA为WT/R47H杂合子（即rs75932628位点为G/A）。    
实施例2：检测未知人DNA样品
按照实施例1的方法和步骤，进行PCR扩增。
其中模板分别为：已知TREM2基因型的阳性标准品WT即阳性标准品1(上海生物生工合成)；已知TREM2基因型的阳性标准品R47H即阳性标准品2(上海生物生工合成)；已知TREM2基因型的阳性标准品WT/R47H即阳性标准品3(由阳性标准品WT和阳性标准品R47H等量混合)；一例人DNA待测样品（厦门中山医院）试验结果见图5。图5A为已知TREM2基因型的阳性标准品1，仅有FAM荧光信号，为WT/WT纯合子（即rs75932628位点为G/G），与实际情况相符；图5B为已知TREM2基因型的阳性标准品2，仅有HEX荧光信号，为R47H/R47H突变纯合子（即rs75932628位点为A/A），与实际情况相符；图5C为已知TREM2基因型的阳性标准品3，既有FAM荧光信号又有HEX荧光信号，为WT/R47H杂合子（即rs75932628位点为G/A），与实际情况相符；图5D为未知人DNA样品，从图中可以看出与图5A同相同，仅有FAM荧光信号，即为WT/WT纯合子（即rs75932628位点为G/G），可以判断该未知样品的TREM2没有R47H突变。
 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种用于检测TREM2基因R47H突变的探针，其为下述（A）的寡核苷酸的探针和下述（B）的寡核苷酸的探针的至少一种，
（A）SEQ ID NO:3的碱基序列，5’和3’两端分别偶联上荧光基团和淬灭基团；
（B）SEQ ID NO:4的碱基序列，5’和3’两端分别偶联上与(A)不同的荧光基团和相应的淬灭基团。
2.权利要求1的探针，其特征在于，所述（A）和（B）的寡核苷酸的探针为用于检测SEQ ID NO:5的碱基序列中第140位碱基G  →A 的突变的探针。
3.权利要求1的探针，其特征在于，所述（A）的5’和3’两端分别偶联上FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团；所述（B）的5’和3’两端分别偶联上HEX荧光基团和BHQ1淬灭基团。
4.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一所述的探针。
5.一种用于检测TREM2基因R47H突变的检测系统，其特征在于，包括，
PCR扩增装置，用于扩增待测样品DNA片段，包含了待检测的位点；
分子量检测装置，所述PCR扩增装置与所述分子量检测装置相连，以便确定所述扩增产物的分子量；以及
荧光读取装置，用于读取荧光值；
结果分析装置，基于读取的荧光值，确定所述预定位点的突变类型；
优选的，所述PCR扩增装置内设置有扩增引物对和检测探针。
6.一种用于TREM2基因R47H突变的检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1-3任一所述探针或者权利要求4所述试剂盒的步骤。
7.权利要求6的检测方法，其特征在于，所述步骤为，
采用SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2作为PCR扩增引物，权利要求1-3任一所述探针或者权利要求4所述试剂盒中的探针作为荧光检测探针；对要检测的DNA样品进行PCR扩增检测，最后读取荧光值，根据荧光值进行结果判断。
8.权利要求7的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：95℃5min；95℃5s，54℃30s，72℃10s共40个循环。
9.权利要求7的检测方法，其特征在于，所述结果判断为，如果仅有(A)荧光信号则样品DNA为WT/WT纯合子，即rs75932628位点为G/G；如果仅有（B）荧光信号则荧光信号则样品DNA为R47H/R47H突变纯合子，即rs75932628位点为A/A；如果既有(A)荧光信号又有（B）荧光信号则样品DNA为WT/R47H杂合子，即rs75932628位点为G/A。
10. 权利要求1-3任一所述探针或者权利要求4所述试剂盒中的探针用于检测TREM2基因R47H突变的用途。
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