CN104630362A - 一种精子细胞转录调控相关基因的基因检测方法 - Google Patents

一种精子细胞转录调控相关基因的基因检测方法 Download PDF

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CN104630362A CN201510061386.1A CN201510061386A CN104630362A CN 104630362 A CN104630362 A CN 104630362A CN 201510061386 A CN201510061386 A CN 201510061386A CN 104630362 A CN104630362 A CN 104630362A
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Abstract

本发明公开了一种精子细胞转录调控相关基因检测方法,其特征在于,通过同时检测分析个体的NOS3基因、FASLG基因SNPs位点基因携带型为所有的受检者提供精子细胞转录调控相关基因检测,并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男性的不育发病风险进行预测评估。

Description

一种精子细胞转录调控相关基因的基因检测方法
技术领域
本发明涉及一种精子细胞转录调控相关基因检测方法,可用于评估精子细胞转录调控相关基因检测,属于分子生物学技术领域。
背景技术
男性进行生育功能的行使,最重要的就是男性的精子质量。无精症是一种最为常见的男性不育症,约占男性不育症患者的15%-20%。无精症不但严重影响了男性的生育能力,还会给男性的心理以及正常家庭生活带来许多负面困扰。目前认为生精相关基因的缺失、突变和遗传多态性是男性生精障碍的重要遗传病因。
无精症是一种受遗传因素和环境因素共同作用的复杂疾病,发病机制可能涉及多个基因。精子在有丝分裂和减数分裂以及精子形成的各个过程中存在多基因转录调控表达,精子发生过程任意环节表达和调控基因发生变异,都可能引起生精障碍。转录抑制因子蛋白与启动子的结合会影响基因转录活性,引起雄性激素受体敏感性降低,雄性激素受体复合物结合减少而导致雄性激素作用降低而引发生精障碍。锌指蛋白基因家族作为哺乳动物最大的基因家族之一,参与了精子发生和成熟的各个阶段的表达调控。
精子发生是一个多阶段、多步骤的持续细胞分裂和分化过程,它受到性染色体和常染色体上一系列基因的调控,包括转录和转录后水平的调控,其中任何一个环节出错都可能影响精子的发生,严重的将有可能造成无精症、少精症,从而导致男性不育。
由于遗传体质的不同,不同机体的生精细胞转录调控也有所差异,而这种差异会影响到机体不育症的易感性。我们挑选了在中国大规模人群中得到验证的与男性无精症,少精症相关的位点进行分型检测,并结合中国人群中特有的与无精症,少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男性的不育发病风险进行预测评估。通过基因检测了解男性不育与精子发生相关的遗传因素,进而给出相应的营养和生活方式干预指导,提高精子质量,孕育健康宝贝。
研究发现PATZ1、ZNF230基因与中国男性精子细胞转录调控有关。
基因简介:PATZI基因是近年来发现的无精症的一个重要候选基因,该基因主要在精原细胞和塞尔托利细胞中表达,产物蛋白是雄性激素受体的一种辅调因子,它不直接作用于雄性激素受体,但能破坏或失活雄性激素受体-RNF4复合物,进而抑制RNF4介导的依赖于雄性激素受体的转录活动,调节雄性激素受体应答基因的表达。因此,该基因可能通过调节雄性激素受体来影响生精功能。近年来的一些研究证实,PATZI基因在生精过程中发挥着关键作用。
PATZI编码一种转录抑制因子蛋白,与启动子结合而影响基因转录活性,与RNF4蛋白共同作用引起雄性激素受体敏感性降低,雄性激素受体复合物结合减少而导致雄性激素作用降低而引发生精障碍。
位点简介:PATZ1 A/G(rs2057951)是位于人类22号染色体上的一个A/G多态。在亚洲人群中,其多态分布频率A占47.6;G占52.4%。欧洲人群中A占85%;G占15%。
黄建喜对此基因外显子的rs2240424、rs714909和内含子rs2057951、rs2240427等4个位点频率分析中发现无精子症组中rs714909位点中无TT基因型分布,rs714909和rs2240427位点的等位基因和基因型在两组频率分布无差异,但rs2057951位点C等位基因频率和CT+TT基因型频率与无精子症存在明显关联性。ACAC和ACGC单倍型在无精子症组中显著高于对照组,可知C等位基因和ACAC和ACGC单体型与无精子症易感性相关联,明显提高无精子症的风险。
基因简介:ZNF230基因属于C3HC4型锌指蛋白基因,全长约30Kb,包括6个外显子,编码230个氨基酸,可能作为转录因子调控相关基因的表达。荧光原位杂交将其定位于11p15.3,相邻锌指基因突变筛查和关联与单倍型分析显示该区域与生精受损伴生育力低下有关。
Northern杂交和RT-PCR显示,ZNF230基因特异表达于正常成人睾丸组织,在胎儿、其他组织及无精症患者睾丸组织均无表达,提示该基因可能在性腺成熟或精子发生相关基因转录调控中发挥作用。睾丸活检证实生精过程停滞在精细胞期,提示该基因可能参与减数分裂后调控。从性腺发育到精子发生全过程涉及多个基因的表达和调控,其间一些突变或多态可能直接影响生育,或者与某些关键性致病基因紧密连锁而成为重要的标记。
位点简介:ZNF230 A316G是第6号外显子上的一个A/G多态。研究证明,该位点SNP多态与人类无精症密切相关。
研究表明,锌指蛋白基因家族作为哺乳动物最大的基因家族之一,参与了精子发生和成熟的各个阶段的基因表达调控。Dong JT等对中国四川99名无精症男性患者和115名正常对照组男性的ZNF230所有6个外显子进行DHPLC分析,探讨ZNF230与无精症的关系。研究认为,ZNF230与无精症发病关系显著,且ZNF230 A316G突变与血清卵泡刺激素(FSH)的水平有关。
本发明的目的是提供一种精子细胞转录调控相关基因检测方法,并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男性的不育发病风险进行预测评估。
发明内容
本发明的目的是提供一种精子细胞转录调控相关基因检测方法,并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男性的不育发病风险进行预测评估。
为实现以上目的,本发明提供一种精子细胞转录调控相关基因检测方法。其具体步骤为:
步骤1:检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上,以保证采集到足量的细胞样本;
步骤2:基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA,时间为2小时-2.5小时,经电泳检测后,用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测;
步骤3:荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入2个反应孔,同时检测2个位点,即一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983,TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110,另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔;
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计,采用TaqMan®-MGB技术,进行检测试剂合成;
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系,总体积为10µl,即浓度为20ng/µl 的DNA模板2µl 、1µl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ® MGB、0.1µl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5µl 25mM MgCl2溶液、0.02µl(5units/µl)Taq DNA聚合酶、去离子水4.98µl、3个位点分别采用不同的正向引物(20µM,0.225µl)、反向引物(20µM,0.225µl)、VIC荧光探针(10µM,0.25µl)和FAM荧光探针(10µM,0.25µl)工具进行检测,基因序列及其引物探针如下:
一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983
tccccatgcg tgccagctcg gccatcacag tgttcccgca gcgctgccct ggccgaggag
acttccgaat ctggaacagc cagctggtgc gctacgcggg ctaccggcag caggatggct
ctgtgcgggg ggacccagcc aacgtggaga tcaccgaggt gggcaccgag ggccacccat
gagggtgtcc ccaaggtgga gaatgaggaa accagtggga gaaggctcgg gggatccagg
caggaagagg ggagcctcgg tgagataaag gatgaaaaac accaaaggag gggtgcctgg
gtggtcacgg agacccagcc aatgagggac cctggagatg aaggcaggag acagtggatg
gaggggtccc tgaggagggc atgaggctca gccccagaac cccctctggc ccactcccca
cagctctgca ttcagcacgg ctggacccca ggaaacggtc gcttcgacgt gctgcccctg
ctgctgcagg ccccagatga ncccccagaa ctcttccttc tgccccccga gctggtcctt
gaggtgcccc tggagcaccc cacgtgagca ccaaagggat tgactgggtg ggatggaggg
ggccatccct gagcctctca agaagggcct gcaagggggt gctgatccca caccccaaca
cccccaggct ggagtggttt gcagccctgg gcctgcgctg gtacgccctc ccggcagtgt
ccaacatgct gctggaaatt ggggcctgga gttccccgca gcccccttca gtggctggta
catgagcact gagatcggca cgaggaacct gtgtgaccct caccgctaca acatcctgga
ggtgaggtgc gggatggggc tcgggcaccg aatgcacctg tccaaggcag gagtctggct
ctcactccat ccccaaaatg ccagccacgg ggacaatcag agcaggtcca gggttgcctc
ctaaatggga actgaggaca agctctagaa ccactgaagc
带VIC荧光A型探针 TGAgCCCCCAGAA
带FAM荧光G型探针 TGAtCCCCCAGAA
正向引物 CTCCCCACAGCTCTGCAT
反向引物 CAGTCAATCCCTTTGGTGCT
TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110
gcttctattg gagaatgatt aggactgaag ctaactactt ggaagttatt ggcatataaa
tggtatgtga ggccagagga aatggtgaga tgagcccaag tagagaggcc agctttaaac
aacaacaaca actaccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcaaaacaaa gaaataggac
acagagttag atttgaatgt cagatatatg atgaataatt gtttagtata ttccatgttt
ggacatgttt aagacctact tgtcctaaaa ataatgtatt atttatctga aattcaaatt
taactgggca ccatgtattt catctggcaa ccataacagg ggcagcacac agaaatgttg
gcagggacca ggcaggcctt tcagatagtg aggtggtgtg tgagacacag gccagtggtg
gaggctgggt gacccagaac tcctgtctct cattctcagg ggcagctgct acatacttcc
cactgattgg gtttgcagag atggcctcga gggtgtctga tattctgata tttcaaaaca
gaatagaaat atgtatttta atgtgtattt aatatatata ttttaaaata tttttaatgt
tgatattaaa agtggtcagt tgggctcagt gcagtggctc atgcctgtaa ttccagcact
ttgggaaact gaggcaggag gatgtcttga agctaggagt ttgagacaag cctgggcaac
atagcaagtc cccatctgta caaaaaaaaa aaagaataaa ttagtcaggt gtagtgactt
atgcctataa tcccagctac tcaggaggcc aaggcaagag gattgcttga gcccaggagt
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ctctgtctct atttaaataa ataagtaaat aaataaactg ggcaaacaat gaaaatgaaa
acattgngaa atacaaagca gctctgtggg ttccactggt ttgcagcctc tgatctaatt
tctaaagtgg gtgtagcagg tttttaacct gtaaattatg gtgatcggca ggtcagggta
aatggtagtt gtgtgtgggg aagagatgat ggcaacagat gttttcctcc tgcaaaaact
aaaatgtggg agtgacttct ctggcca
带VIC荧光C型探针 TTGcGAAATACAA
带FAM荧光G型探针 TTGtGAAATACAA
正向引物 GATAGCACCACTGCACTCCA
反向引物 TCATCTCTTCCCCACACACA
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应,先进行预热:50℃、2分钟,95℃、10分钟,然后再进行60个循环的95℃、30秒,60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量,得到一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983,TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110两张图。
步骤4:SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较,每个位点理论上存在三种不同的信号,纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号,分别代表该位点三种不同的基因型;
(1)、一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983
在检测结果图中,坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为GT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型,
(2)、TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110
在检测结果图中,坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为CT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型,
本发明2个位点的基因分型可以采用TaqMan®-MGB技术对这些位点进行基因分型。经重复实验验证,基因分型的准确率达到了99%以上,重复性达到了100%。除此之外,基因测序等技术也可以作为备选的基因分型手段。
本发明的优点是:检测准确率高,可重复性强。
附图说明
图1为一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983示意图。
图2为TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种精子细胞转录调控相关基因检测方法,并结合中国人群中特有的与无精症、少精症相关的环境暴露因素和生活方式影响因素对男性的不育发病风险进行预测评估。
为实现以上目的,本发明提供一种精子细胞转录调控相关基因检测方法。其具体步骤为:
步骤1:检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上,以保证采集到足量的细胞样本;
步骤2:基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA,时间为2小时-2.5小时,经电泳检测后,用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测;
步骤3:荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入2个反应孔,同时检测2个位点,即一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983,TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110,另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔;
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计,采用TaqMan®-MGB技术,进行检测试剂合成;
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系,总体积为10µl,即浓度为20ng/µl 的DNA模板2µl 、1µl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ® MGB、0.1µl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5µl 25mM MgCl2溶液、0.02µl(5units/µl)Taq DNA聚合酶、去离子水4.98µl、3个位点分别采用不同的正向引物(20µM,0.225µl)、反向引物(20µM,0.225µl)、VIC荧光探针(10µM,0.25µl)和FAM荧光探针(10µM,0.25µl)工具进行检测,基因序列及其引物探针如下:
一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983
tccccatgcg tgccagctcg gccatcacag tgttcccgca gcgctgccct ggccgaggag
acttccgaat ctggaacagc cagctggtgc gctacgcggg ctaccggcag caggatggct
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ctcactccat ccccaaaatg ccagccacgg ggacaatcag agcaggtcca gggttgcctc
ctaaatggga actgaggaca agctctagaa ccactgaagc
带VIC荧光A型探针 TGAgCCCCCAGAA
带FAM荧光G型探针 TGAtCCCCCAGAA
正向引物 CTCCCCACAGCTCTGCAT
反向引物 CAGTCAATCCCTTTGGTGCT
TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110
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带VIC荧光C型探针 TTGcGAAATACAA
带FAM荧光G型探针 TTGtGAAATACAA
正向引物 GATAGCACCACTGCACTCCA
反向引物 TCATCTCTTCCCCACACACA
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应,先进行预热:50℃、2分钟,95℃、10分钟,然后再进行60个循环的95℃、30秒,60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量,得到一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983,TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110两张图。
步骤4:SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较,每个位点理论上存在三种不同的信号,纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号,分别代表该位点三种不同的基因型;
(1)、一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983
在检测结果图中,坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为GT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型,
(2)、TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110
在检测结果图中,坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为CT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型,
步骤5:检测报告表
<110> 上海中优医药高科技有限公司
<120>一种精子细胞转录调控相关基因检测的方法
<160>10
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (501)
<223> n =g或t
<400> 1
tccccatgcg tgccagctcg gccatcacag tgttcccgca gcgctgccct ggccgaggag 60
acttccgaat ctggaacagc cagctggtgc gctacgcggg ctaccggcag caggatggct 120
ctgtgcgggg ggacccagcc aacgtggaga tcaccgaggt gggcaccgag ggccacccat 180
gagggtgtcc ccaaggtgga gaatgaggaa accagtggga gaaggctcgg gggatccagg 240
caggaagagg ggagcctcgg tgagataaag gatgaaaaac accaaaggag gggtgcctgg 300
gtggtcacgg agacccagcc aatgagggac cctggagatg aaggcaggag acagtggatg 360
gaggggtccc tgaggagggc atgaggctca gccccagaac cccctctggc ccactcccca 420
cagctctgca ttcagcacgg ctggacccca ggaaacggtc gcttcgacgt gctgcccctg 480
ctgctgcagg ccccagatga ncccccagaa ctcttccttc tgccccccga gctggtcctt 540
gaggtgcccc tggagcaccc cacgtgagca ccaaagggat tgactgggtg ggatggaggg 600
ggccatccct gagcctctca agaagggcct gcaagggggt gctgatccca caccccaaca 660
cccccaggct ggagtggttt gcagccctgg gcctgcgctg gtacgccctc ccggcagtgt 720
ccaacatgct gctggaaatt ggggcctgga gttccccgca gcccccttca gtggctggta 780
catgagcact gagatcggca cgaggaacct gtgtgaccct caccgctaca acatcctgga 840
ggtgaggtgc gggatggggc tcgggcaccg aatgcacctg tccaaggcag gagtctggct 900
ctcactccat ccccaaaatg ccagccacgg ggacaatcag agcaggtcca gggttgcctc 960
ctaaatggga actgaggaca agctctagaa ccactgaagc 1000
<210> 2
<211>1167
<212> DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221> mutation
<222> (967)
<223> n =c或t
<400> 2
gcttctattg gagaatgatt aggactgaag ctaactactt ggaagttatt ggcatataaa 60
tggtatgtga ggccagagga aatggtgaga tgagcccaag tagagaggcc agctttaaac 120
aacaacaaca actaccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcaaaacaaa gaaataggac 180
acagagttag atttgaatgt cagatatatg atgaataatt gtttagtata ttccatgttt 240
ggacatgttt aagacctact tgtcctaaaa ataatgtatt atttatctga aattcaaatt 300
taactgggca ccatgtattt catctggcaa ccataacagg ggcagcacac agaaatgttg 360
gcagggacca ggcaggcctt tcagatagtg aggtggtgtg tgagacacag gccagtggtg 420
gaggctgggt gacccagaac tcctgtctct cattctcagg ggcagctgct acatacttcc 480
cactgattgg gtttgcagag atggcctcga gggtgtctga tattctgata tttcaaaaca 540
gaatagaaat atgtatttta atgtgtattt aatatatata ttttaaaata tttttaatgt 600
tgatattaaa agtggtcagt tgggctcagt gcagtggctc atgcctgtaa ttccagcact 660
ttgggaaact gaggcaggag gatgtcttga agctaggagt ttgagacaag cctgggcaac 720
atagcaagtc cccatctgta caaaaaaaaa aaagaataaa ttagtcaggt gtagtgactt 780
atgcctataa tcccagctac tcaggaggcc aaggcaagag gattgcttga gcccaggagt 840
ttgaggctgc agttaactac gatagcacca ctgcactcca gcctgggtga cagagtgaga 900
ctctgtctct atttaaataa ataagtaaat aaataaactg ggcaaacaat gaaaatgaaa 960
acattgngaa atacaaagca gctctgtggg ttccactggt ttgcagcctc tgatctaatt 1020
tctaaagtgg gtgtagcagg tttttaacct gtaaattatg gtgatcggca ggtcagggta 1080
aatggtagtt gtgtgtgggg aagagatgat ggcaacagat gttttcctcc tgcaaaaact 1140
aaaatgtggg agtgacttct ctggcca 1167
<210>3
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光G型探针,与NOS3 rs1799983 SNP位点结合。
<400>3
tgagccccca gaa 13
<210>4
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光T型探针,与NOS3 rs1799983 SNP位点结合。
<400>4
tgatccccca gaa 13
<210>5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于NOS3 rs1799983 SNP序列扩增的正向引物。
<400>5
ctccccacag ctctgcat 18
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于NOS3 rs1799983 SNP序列扩增的反向引物。
<400>6
cagtcaatcc ctttggtgct 20
<210>7
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带VIC荧光C型探针,与FASLG rs763110 SNP位点结合。
<400>7
ttgcgaaata caa 13
<210>8
<211>13
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带FAM荧光T型探针,与FASLG rs763110 SNP位点结合。
<400>8
ttgtgaaata caa 13
<210>9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于FASLG rs763110 SNP序列扩增的正向引物。
<400>9
gatagcacca ctgcactcca 20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 用于FASLG rs763110 SNP序列扩增的反向引物。
<400>10
tcatctcttc cccacacaca 20

Claims (2)

1.一种精子细胞转录调控相关基因检测方法,其特征在于,具体步骤为
步骤1:检测的样品类型与采样方法
用采样拭在口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40次以上,以保证采集到足量的细胞样本;
步骤2:基因组DNA的抽提方法
采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA,时间为2小时-2.5小时,经电泳检测后,用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测;
步骤3:荧光定量PCR反应
将每一个被测者样本分别放入2个反应孔,同时检测2个位点,即一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983,TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110,另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔;
每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计,采用TaqMan®-MGB技术,进行检测试剂合成;
在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系,总体积为10µl,即浓度为20ng/µl 的DNA模板2µl 、1µl 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman ® MGB、0.1µl 25mM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5µl 25mM MgCl2溶液、0.02µl(5units/µl)Taq DNA聚合酶、去离子水4.98µl、3个位点分别采用不同的正向引物(20µM,0.225µl)、反向引物(20µM,0.225µl)、VIC荧光探针(10µM,0.25µl)和FAM荧光探针(10µM,0.25µl)工具进行检测,其引物探针如下:
带VIC荧光A型探针 TGAgCCCCCAGAA
带FAM荧光G型探针 TGAtCCCCCAGAA
正向引物 CTCCCCACAGCTCTGCAT
反向引物 CAGTCAATCCCTTTGGTGCT
带VIC荧光C型探针 TTGcGAAATACAA
带FAM荧光G型探针 TTGtGAAATACAA
正向引物 GATAGCACCACTGCACTCCA
反向引物 TCATCTCTTCCCCACACACA
将反应孔和空白对照在PCR扩增仪上进行反应,先进行预热:50℃、2分钟,95℃、10分钟,然后再进行60个循环的95℃、30秒,60℃、1分钟、反应结束后取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量,得到一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983,TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110两张图;
步骤4:SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的3个图和一个NTC空白对照进行比较,每个位点理论上存在三种不同的信号,纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号,分别代表该位点三种不同的基因型;
(1)、一氧化氮合酶(NOS3) rs1799983
在检测结果图中,坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为GG基因型、坐标轴右上区域为GT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型,
(2)、TNF-α家族成员Fas配体基因(FASLG) rs763110
在检测结果图中,坐标轴左下区域为空白对照、坐标轴左上区域为CC基因型、坐标轴右上区域为CT基因型、坐标轴右下区域为TT基因型。
2.权利要求书1中的所述的NOS3基因与FASLG基因的组合检测模式。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058547A (zh) * 2017-04-28 2017-08-18 首度生物科技(苏州)有限公司 一种精子的检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070269827A1 (en) * 2006-05-18 2007-11-22 Oklahoma Medical Research Foundation Predicting and Diagnosing Patients With Autoimmune Disease
CN103642932A (zh) * 2013-12-25 2014-03-19 上海中优医药高科技有限公司 一种精子细胞凋亡相关基因的基因检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070269827A1 (en) * 2006-05-18 2007-11-22 Oklahoma Medical Research Foundation Predicting and Diagnosing Patients With Autoimmune Disease
CN103642932A (zh) * 2013-12-25 2014-03-19 上海中优医药高科技有限公司 一种精子细胞凋亡相关基因的基因检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIANCA BIANCO, ET AL.: "Variants in endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene in idiopathic infertile Brazilian men", 《GENE》 *
HOU-QUN YING,ET AL.: "Genetic variants of eNOS gene may modify the susceptibility to idiopathic male infertility", 《BIOMARKERS》 *
TOSO PLASESKI,ET AL.: "Association Study of Single-Nucleotide Polymorphisms in FASLG, JMJDIA, LOC203413, TEX15, BRDT, OR2W3, INSR, and TAS2R38 Genes With Male Infertility", 《JOURNAL OF ANDROLOGY》 *
YAN L,ET AL.: "Genetic Variants in Nitric Oxide Synthase Genes and the Risk of Male Infertility in a Chinese Population: A Case-Control Study", 《PLOS ONE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058547A (zh) * 2017-04-28 2017-08-18 首度生物科技(苏州)有限公司 一种精子的检测方法

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