CN101928776A - 一种hla基因分型的pcr-sbt方法及其试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种HLA基因分型的PCR-SBT方法，它对HLA-A位点1-7外显子、HLA-B位点1-7外显子、HLA-C位点1-7外显子进行基因分型，包括以下步骤：(1)、制备人基因组DNA；(2)、设计扩增引物；(3)、将扩增产物进行双酶切纯化；(4)、设计测序引物，将纯化产物进行测序PCR反应；(5)、将测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；(6)、将获得的序列通过软件分析，确定其基因型。本发明通过对HLA-A、B、C位点1-7外显子进行全长序列测序，获得HLA-A、B、C位点相关外显子的全长和部分内含子寡核苷酸序列，精确地对其基因型进行分型。
Description
技术领域
本发明涉及基因分型检测方法及其试剂，尤其涉及一种用于HLA-A、B、C位点1-7外显子基因分型的分子生物学检测方法及其试剂。
背景技术
人类白细胞抗原（HLA）基因位于第6号染色体短臂21.3区域，是调控人体特异性免疫应答的主要基因系统，是目前所知的最富多态性的遗传系统。HLA抗原与同种器官移植的排斥反应密切相关，器官移植术后移植物能否存活很大程度上取决于供者与受者之间HLA型别是否相合。HLA位点分型对选择合适的供体、降低移植物抗宿主病（GVHD）的发生率、提高移植物的存活率均有重要意义。
HLA-A、-B、-C座位基因为经典的HLA-Ⅰ类基因，具有高度遗传多态性，广泛表达在各种有核细胞表面。编码HLA-HLA-A、-B、-C的基因具有相似的基因结构，一般含有7个内含子和8个外显子，其大小约为3.5kb。第1外显子编码前导链，第2、3、4外显子分别编码α链的α1、α2、α3结构域，第5外显子编码连接多肽和跨膜区蛋白，第6、7、8外显子分别编码胞内区域和非翻译区蛋白。HLA-A、-B、-C的多态性主要由编码α1、α2区的第2、3外显子决定，但是在第1、4、5、6、7外显子上也有一定的多态性。
HLA分型技术已广泛应用于多个领域，如HLA多态性的研究、HLA的生物学功能、器官和骨髓移植前供受者组织相容性配型、HLA与某些疾病的关联、亲子鉴定以及人类遗传学等方面。HLA的分型技术主要有血清学分型技术、细胞学分型技术、基因分型技术等。个体HLA遗传学差异的本质在于编码其抗原产物的基因上，所以分析个体HLA的基因型无疑是对HLA型别分析的最准确的方法，其准确性远高于血清学与细胞学分型。目前以DNA为基础的HLA基因分型技术日趋成熟，并逐渐取代血清学方法和细胞学分型技术。基因分型方法具有独特的优点：需要的血样少，标本可长期保存，相应的分型试剂可大量制备，来源不受限制。特别重要的是基因分型精确可靠，重复性好，其分型错误率远低于血清学方法，基因分型技术已在实际工作中得到了广泛的应用。
HLA的基因分型方法基本上可分为两种类型。一类是以鉴别HLA基因序列不同为基础的HLA分型技术，如序列特异性引物PCR（polymerase chain reaction sequence specific primer, PCR-SSP）、序列特异性寡核苷酸探针分型技术（polymerase chain reaction sequence specific oligonucleotide probe, PCR-SSO）、单核苷酸序列分析（PCR sequence base-typing，PCR-SBT）、基因芯片、流式细胞术（Luminex）等。另一类基于不同HLA等位基因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有不同的构象而设计的。实际工作中一般采用PCR-SSP、PCR-SSO、PCR-SBT、基因芯片、流式细胞术等技术，其中HLA分型的直接测序方法（PCR-SBT）是最准确的HLA分型方法，也是目前的金标准方法。但现阶段的HLA-A、B、C位点PCR-SBT分型方法主要针对多态性位点比较集中的2、3、4号外显子的测定来确定其基因型，而对第1、5、6、7号外显子不进行测序，由于HLA高度遗传多态性，在第1、5、6、7外显子上也有一定的多态性，因此现有的方法测定2-4外显子多态性，可能引起部分等位基因无法指定，存在歧义或错误的结果，严重影响临床工作。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是提供一种HLA基因分型的PCR-SBT方法，以克服现有HLA-A、B、C位点分型技术中的上述缺陷。为此，本发明采用以下技术方案： 它对HLA-A位点1-7外显子、HLA-B位点1-7外显子、HLA-C位点1-7外显子进行基因分型，包括以下步骤：
（1）、制备人基因组DNA；
（2）、设计扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中HLA-A、HLA-C位点基因外显子1-8全长序列和HLA-B位点基因外显子1-7全长序列；
（3）、将步骤（2）得到的扩增产物进行双酶切纯化；
（4）、设计测序引物，将步骤（3）得到的纯化产物进行测序PCR反应；
（5）、将步骤（4）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；
（6）、将步骤（5）获得的序列通过软件分析，确定其基因型。
本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种HLA基因分型的PCR-SBT方法所用的试剂。为此，本发明采用以下技术方案：它由用于扩增的引物和36条用于测序分析的寡核苷酸测序引物组成；
所述用于扩增的引物为：
HLA-A基因组全长扩增引物：HLA-AF1或HLA-AF2中的其中一种以及HLA-AR，
HLA-AF1：5’-TGTCGGGTTTCCAGAGAAGC-3’
HLA-AF2：5’-GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’
HLA-AR：5’-TTGGGGAGGGAGCACAGGTCAGCGTGGGAAG-3’；
HLA-B基因组全长扩增引物：HLA-BF1或HLA-BF2中的其中一种以及HLA-BR，
HLA-BF1：5’-GGCAGACAGTGTGACAAAGAGGC-3’
HLA-BF2：5’- GAGTTTCACTTCTTCTCCCAAC-3’
HLA-BR：5’- CTGGGGAGGAAACACAGGTCAGCATGGG-3’；
HLA-C基因组全长扩增引物：HLA-CF1或HLA-CF2中的其中一种以及HLA-CR，
HLA-CF1：5’- TCAGGCACACAGTGTGACAAAGAT-3’
HLA-CF2：5’- CCAATTCCCACTCCCATTG-3’
HLA-CR：5’- TCGGGGAGGGAACACAGGTCAGTGTGGGGAC-3’；
所述36条寡核苷酸测序引物序列如下：
HLA-A外显子1-7的测序引物：
HLA-A1F：5’- GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’
HLA-A1R：5’- CMCGACCCCGCACTCACC-3’
HLA-A2F：5’- GCCTCTGYGGGGAGAAGC-3’
HLA-A2R：5’-GCCCGTCCGTGGGGGATGA-3’
HLA-A3F：5’- CCCACAGTCTCCGGGTCCGA-3’
HLA-A3R：5’- GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT-3’
HLA-A4F：5’- GGTGTSCTGTCCATTCTCAAG-3’
HLA-A4R：5’-GACACCCCCRTCTCCCTC -3’
HLA-A5F：5’- CCACAAGGAGGGGAGACAAT-3’
HLA-A5R：5’- CACCTGAGCTRTTCCTCCTC-3’
HLA-A67F：5’- CACATTTCTGGAAACTTCTCTG-3’
HLA-A67R：5’- CGCATGCTCAATACATCCAA-3’；
HLA-B外显子1-7的测序引物：
HLA-B1F：5’- GIGGTCCCAGTTCTAAAGTCC-3’
HLA-B1R：5’- ACTCACCRGCCCAGGTCT-3’
HLA-B2F：5’- GCCGCGCCGGKAGGAGGGTC-3’
HLA-B2R：5’- GACCCSGGCCGTMCGT-3’
HLA-B3F：5’- ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’
HLA-B3R：5’- GGCCATCCCCGSCGACCTAT-3’
HLA-B4F：5’- GGTCACATGGGTGGTCCTAG-3’
HLA-B4R：5’- GGGCTCCTGCTTTCCCTG-3’
HLA-B5F：5’- GTCRGGRCCCCTCRTCTTC-3’
HLA-B5R：5’- TTCATTGTCACATGTGCTG-3’
HLA-B67F：5’- GTCCAGGACCCACACTTGCT-3’
HLA-B67R：5’- CCCACTCTAGACCCCAAGAA-3’；
HLA-C外显子1-7的测序引物：
HLA-C1F：5’- CCAATTCCCACTCCCATTG-3’
HLA-C1R：5’- TCCYAACCYCGCACTCAC-3’
HLA-C2F：5’- GACCCGGGGAGCCGCGCA-3’
HLA-C2R：5’- CGACCCGGG CCGTCCGTG-3’
HLA-C3F：5’- ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’
HLA-C3R：5’-AGGCCATICCGGGAGATCTA -3’
HLA-C4F：5’- GGTGTCCTGTCCITTCTCA-3’
HLA-C4R：5’- GICTICTGCTTTCICTGA-3’
HLA-C5F：5’- GCCCTTCAGCYRGGTCAG-3’
HLA-C5R：5’- ACTTCTACCTGGGGCTTGAA-3’
HLA-C67F：5’- GGGTCCAAGACTAGGAGGTT-3’
HLA-C67R：5’- CACCACACATTCGAAACGTC-3’。
本发明中引物设计是PCR扩增的关键，有关引物设计的方法和软件均可从英特网上免费获得。本发明所设计的寡核苷酸引物是根据IMGT/HLA数据库（ http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/）中人类HLA-A、B、C位点基因序列中包括多态性位点在内的连续寡核苷酸序列而设计获得的。所有引物的设计均避开突变位点或采用简并引物方法，以免因位点的漏检而导致分型的错误。本发明以6对寡核苷酸引物分别扩增包含全部外显子的HLA-A、B、C位点全长片段，可保证包含所有外显子的有效扩增。扩增引物的设计避开了HLA-A、B、C位点编码序列的多态性位点，避免了任何突变点的漏检从而导致的基因型误判。测序引物的设计能保证清晰准确测得所扩增片段的全长序列，对外显子序列进行双向测序，从而将标本进行精确的基因分型。
本发明通过对HLA-A、B、C位点1-7外显子进行全长序列测序，获得HLA-A、B、C位点相关外显子的全长和部分内含子寡核苷酸序列，精确地对其基因型进行分型。随着DNA序列分析仪的普及，PCR-SBT技术广泛应用于临床检测。高通量获得的所有HLA-A、B、C位点编码序列精确信息在基因分型，多态性检测，基因频率调查分析等方面的应用受到广泛重视，特别是造血干细胞移植供受者配型选择和中国造血干细胞捐献者资料库的供者配型。
本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了HLA-A、B、C位点的准确分型鉴定问题，发挥PCR-SBT对HLA-A、B、C位点基因定型操作结果精确和高通量的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。特别是有利于提高造血干细胞移植供受者HLA配型的准确性，这对进一步提高器官移植的成功率和生存率具有重要的意义，有利于选择更合适的移植供者，降低移植过程中的排斥反应，从而提高器官移植水平。
附图说明
图1为本发明中检测标本的HLA-A、HLA-B、HLA-C位点基因组全长的PCR扩增电泳图谱。M为DNA Marker（DL15000，TaKaRa，从上到下条带长度分别为15000bp，10000bp,7500bp，5000bp，2500bp，1000bp）,1为HLA-A位点扩增片段，2为HLA-B位点扩增片段，3为HLA-C位点扩增片段。
图2为本发明中对1例检测标本HLA-A（A*02:07:01）的第1-7外显子的全部测序电泳图谱。图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。E1表示1号外显子序列，E2表示2号外显子序列，E3表示3号外显子序列，E4表示4号外显子序列，E5表示5号外显子序列，E6表示6号外显子序列，E7表示7号外显子序列。
图3为本发明中对1例检测标本HLA-B(B*15:01:01)的第1-7外显子的全部测序电泳图谱。图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。E1表示1号外显子序列，E2表示2号外显子序列，E3表示3号外显子序列，E4表示4号外显子序列，E5表示5号外显子序列，E6表示6号外显子序列，E7表示7号外显子序列。
图4为本发明中对1例检测标本HLA-C(C*01:02:01)的第1-7外显子的全部测序电泳图谱。图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶。E1表示1号外显子序列，E2表示2号外显子序列，E3表示3号外显子序列，E4表示4号外显子序列，E5表示5号外显子序列，E6表示6号外显子序列，E7表示7号外显子序列。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明内容作进一步详细说明。
实施例1：
本实施具体以白血病患者进行HLA-A、HLA-B和HLA-C基因分型为例对本发明内容做详细说明，本发明所采用的一种HLA-A、HLA-B和HLA-C基因分型的PCR-SBT方法具体包括以下步骤：
1、制备人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。
取待检全血200μL，按照invitrogen DNA isolation试剂盒说明书提取基因组DNA（可采用其他的方法抽提基因组DNA），利用分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度。
2、合成6对扩增引物和36条测序引物，将扩增引物用纯水稀释至50μM，所述扩增引物和测序引物见发明内容中，在此不再赘述，
准备LA Taq酶（TaKaRa）、10×缓冲液（TaKaRa）、dNTP（TaKaRa）、Mg2+（TaKaRa）、纯水，与步骤1所制备的PCR扩增模板按表1所述体系配制PCR扩增体系：
表1：步骤2中HLA-A、HLA-B和HLA-C基因组全长PCR扩增体系
| PCR扩增体系 | 体积（μl） |
| 10×buffer | 2.5 |
| dNTP（2.5 mM） | 2.0 |
| Mg2+（25 mM） | 2.0 |
| 引物1 | 0.1 |
| 引物2 | 0.1 |
| LA Taq酶（5U/μL） | 0.2 |
| H2O | 15.6 |
| 模板 | 2.5 |
| 总体系 | 25.0 |
其中HLA-A的扩增体系中，引物1：HLA-AF1或者HLA-AF2中选择任意一条，引物2：HLA-AR；HLA-B的扩增体系中，引物1：HLA-BF1或者HLA-BF2中选择任意一条，引物2：HLA-BR； HLA-C的扩增体系中，引物1：HLA-CF1或者HLA-CF2中选择任意一条，引物2：HLA-CR。
用PCR仪（ABI9700）分别按以下程序扩增：
扩增条件：预变性95°C 5min；95°C 30s，67°C 45s，72°C，3min30s，35个循环；72°C 10min冷却到4°C。
3、扩增产物的双酶切纯化。HLA-A、B、C位点所扩增片段各取3 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，扩增后可得到单一片段，长度与预期大小符合，约为3.2-3.3Kb，表明体系扩增成功。在剩余的PCR产物中分别加入虾碱性磷酸酶（SAP，1 U/μL, Promega）和核酸外切酶Ⅰ（Exo-Ⅰ，5 U/μL，TaKaRa），利用虾碱性磷酸酶（SAP）的DNA 5′ 端去磷酸化功能以及核酸外切酶Ⅰ（Exo-Ⅰ）的单链特异性3′→5′ 核酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。在25μL扩增产物体系中加入SAP 1μL和Exo-Ⅰ2 μL，37 ℃ 30 min酶切反应，80 ℃ 15 min灭活酶的活性。
4、对PCR产物进行测序PCR。将步骤3中纯化之后的PCR产物中加入25μL纯水稀释，混匀。测序引物用纯水稀释至3.2 μM，以BigDye terminator v3.1 sequencing kit（美国ABI公司）试剂按照表2配制反应体系：
表2：步骤4中PCR产物的PCR测序体系
| 反应体系 | 体积（μl） |
| 5×缓冲液 | 1.5 |
| BigDye mix | 1.0 |
| 测序引物 | 1.0 |
| DNA | 2.0 |
| H2O | 4.5 |
| 总体积 | 10.0 |
以所扩增纯化的片段为模板，分别进行48个反应体系，用PCR仪（ABI9700）按以下程序扩增：96°C 1min；96°C 10s，50°C 5s，60°C 4min，25个循环。测序引物浓度为3.2μM，稀释的上述纯化后DNA模板2μl。
5、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。将步骤4中测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。直接在PCR产物中加入1μL EDTA（0.125M）和25μl醋酸钠（3M）/无水乙醇（1：40）混合液，混匀，静置15分钟，3000g离心30min；去除上清，加入75%乙醇，3000g离心10min，去除上清，酒精挥发后加入10μl甲酰胺溶解，95°C变性3min，迅速在冰上冷却。将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行高通量测序，以Assign3.5或其他HLA专业软件分析。
6、将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行高通量分析，所测序列结果（图2-4）利用Assign3.5或其他HLA专业软件进行序列比对，按照IMGT/HLA Databasehttp://ebi.ac.uk/imgt/hla）数据库序列确定HLA-A、HLA-B和HLA-C的基因型，结果显示检测标本HLA座位结果为HLA-A*02:07:01(图2)，B*15:01:01（图3）,C*01:02:01（图4）。
所以，本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了HLA-A、B、C位点的准确分型鉴定问题，发挥PCR-SBT对HLA-A、B、C位点基因分型结果精确、高通量操作的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。特别是有利于提高造血干细胞移植供受者HLA配型的准确性，这对进一步提高器官移植的成功率和生存率具有重要的意义，有利于选择更合适的移植供者，降低移植过程中的排斥反应，从而提高器官移植水平。
Claims (4)
1.一种HLA基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于它对HLA-A位点1-7外显子、HLA-B位点1-7外显子、HLA-C位点1-7外显子进行基因分型，包括以下步骤：
（1）、制备人基因组DNA；
（2）、设计扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中HLA-A、HLA-C位点基因外显子1-8全长序列和HLA-B位点基因外显子1-7全长序列；
（3）、将步骤（2）得到的扩增产物进行双酶切纯化；
（4）、设计测序引物，将步骤（3）得到的纯化产物进行测序PCR反应；
（5）、将步骤（4）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；
（6）、将步骤（5）获得的序列通过软件分析，确定其基因型。
2.如权利要求1所述的一种HLA基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步骤（2）中的引物为：
HLA-A基因组全长扩增引物对HLA-AF1和HLA-AR或者HLA-AF2和HLA-AR，
HLA-AF1：5’-TGTCGGGTTTCCAGAGAAGC-3’
HLA-AF2：5’-GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’
HLA-AR：5’-TTGGGGAGGGAGCACAGGTCAGCGTGGGAAG-3’；
HLA-B基因组全长扩增引物对HLA-BF1和HLA-BR或者HLA-BF2和HLA-BR，
HLA-BF1：5’-GGCAGACAGTGTGACAAAGAGGC-3’
HLA-BF2：5’- GAGTTTCACTTCTTCTCCCAAC-3’
HLA-BR：5’- CTGGGGAGGAAACACAGGTCAGCATGGG-3’；
HLA-C基因组全长扩增引物对HLA-CF1和HLA-CR或者HLA-CF2和HLA-CR，
HLA-CF1：5’- TCAGGCACACAGTGTGACAAAGAT-3’
HLA-CF2：5’- CCAATTCCCACTCCCATTG-3’
HLA-CR：5’- TCGGGGAGGGAACACAGGTCAGTGTGGGGAC-3’；
所述步骤（4）中的引物为用于测序分析的36条寡核苷酸测序引物；
HLA-A外显子1-7的测序引物：
HLA-A1F：5’- GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’
HLA-A1R：5’- CMCGACCCCGCACTCACC-3’
HLA-A2F：5’- GCCTCTGYGGGGAGAAGC-3’
HLA-A2R：5’-GCCCGTCCGTGGGGGATGA-3’
HLA-A3F：5’- CCCACAGTCTCCGGGTCCGA-3’
HLA-A3R：5’- GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT-3’
HLA-A4F：5’- GGTGTSCTGTCCATTCTCAAG-3’
HLA-A4R：5’-GACACCCCCRTCTCCCTC -3’
HLA-A5F：5’- CCACAAGGAGGGGAGACAAT-3’
HLA-A5R：5’- CACCTGAGCTRTTCCTCCTC-3’
HLA-A67F：5’- CACATTTCTGGAAACTTCTCTG-3’
HLA-A67R：5’- CGCATGCTCAATACATCCAA-3’；
HLA-B外显子1-7的测序引物：
HLA-B1F：5’- GIGGTCCCAGTTCTAAAGTCC-3’
HLA-B1R：5’- ACTCACCRGCCCAGGTCT-3’
HLA-B2F：5’- GCCGCGCCGGKAGGAGGGTC-3’
HLA-B2R：5’- GACCCSGGCCGTMCGT-3’
HLA-B3F：5’- ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’
HLA-B3R：5’- GGCCATCCCCGSCGACCTAT-3’
HLA-B4F：5’- GGTCACATGGGTGGTCCTAG-3’
HLA-B4R：5’- GGGCTCCTGCTTTCCCTG-3’
HLA-B5F：5’- GTCRGGRCCCCTCRTCTTC-3’
HLA-B5R：5’- TTCATTGTCACATGTGCTG-3’
HLA-B67F：5’- GTCCAGGACCCACACTTGCT-3’
HLA-B67R：5’- CCCACTCTAGACCCCAAGAA-3’；
HLA-C外显子1-7的测序引物：
HLA-C1F：5’- CCAATTCCCACTCCCATTG-3’
HLA-C1R：5’- TCCYAACCYCGCACTCAC-3’
HLA-C2F：5’- GACCCGGGGAGCCGCGCA-3’
HLA-C2R：5’- CGACCCGGG CCGTCCGTG-3’
HLA-C3F：5’- ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’
HLA-C3R：5’-AGGCCATICCGGGAGATCTA -3’
HLA-C4F：5’- GGTGTCCTGTCCITTCTCA-3’
HLA-C4R：5’- GICTICTGCTTTCICTGA-3’
HLA-C5F：5’- GCCCTTCAGCYRGGTCAG-3’
HLA-C5R：5’- ACTTCTACCTGGGGCTTGAA-3’
HLA-C67F：5’- GGGTCCAAGACTAGGAGGTT-3’
HLA-C67R：5’- CACCACACATTCGAAACGTC-3’。
3.如权利要求1所述的一种HLA基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步骤（4）中纯化所需的两种酶为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
4.一种HLA基因分型的PCR-SBT方法所用的试剂，其特征在于它由用于扩增的引物和36条用于测序分析的寡核苷酸测序引物组成；
所述用于扩增的引物为：
HLA-A基因组全长扩增引物：HLA-AF1或HLA-AF2的其中一种以及HLA-AR，
HLA-AF1：5’-TGTCGGGTTTCCAGAGAAGC-3’
HLA-AF2：5’-GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’
HLA-AR：5’-TTGGGGAGGGAGCACAGGTCAGCGTGGGAAG-3’；
HLA-B基因组全长扩增引物：HLA-BF1或HLA-BF2的其中一种以及HLA-BR，
HLA-BF1：5’-GGCAGACAGTGTGACAAAGAGGC-3’
HLA-BF2：5’- GAGTTTCACTTCTTCTCCCAAC-3’
HLA-BR：5’- CTGGGGAGGAAACACAGGTCAGCATGGG-3’；
HLA-C基因组全长扩增引物：HLA-CF1或HLA-CF2的其中一种以及HLA-CR，
HLA-CF1：5’- TCAGGCACACAGTGTGACAAAGAT-3’
HLA-CF2：5’- CCAATTCCCACTCCCATTG-3’
HLA-CR：5’- TCGGGGAGGGAACACAGGTCAGTGTGGGGAC-3’；
所述36条寡核苷酸测序引物序列如下：
HLA-A外显子1-7的测序引物：
HLA-A1F：5’- GGGTTTCCAGAGAAGCCAAT-3’
HLA-A1R：5’- CMCGACCCCGCACTCACC-3’
HLA-A2F：5’- GCCTCTGYGGGGAGAAGC-3’
HLA-A2R：5’-GCCCGTCCGTGGGGGATGA-3’
HLA-A3F：5’- CCCACAGTCTCCGGGTCCGA-3’
HLA-A3R：5’- GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT-3’
HLA-A4F：5’- GGTGTSCTGTCCATTCTCAAG-3’
HLA-A4R：5’-GACACCCCCRTCTCCCTC -3’
HLA-A5F：5’- CCACAAGGAGGGGAGACAAT-3’
HLA-A5R：5’- CACCTGAGCTRTTCCTCCTC-3’
HLA-A67F：5’- CACATTTCTGGAAACTTCTCTG-3’
HLA-A67R：5’- CGCATGCTCAATACATCCAA-3’；
HLA-B外显子1-7的测序引物：
HLA-B1F：5’- GIGGTCCCAGTTCTAAAGTCC-3’
HLA-B1R：5’- ACTCACCRGCCCAGGTCT-3’
HLA-B2F：5’- GCCGCGCCGGKAGGAGGGTC-3’
HLA-B2R：5’- GACCCSGGCCGTMCGT-3’
HLA-B3F：5’- ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’
HLA-B3R：5’- GGCCATCCCCGSCGACCTAT-3’
HLA-B4F：5’- GGTCACATGGGTGGTCCTAG-3’
HLA-B4R：5’- GGGCTCCTGCTTTCCCTG-3’
HLA-B5F：5’- GTCRGGRCCCCTCRTCTTC-3’
HLA-B5R：5’- TTCATTGTCACATGTGCTG-3’
HLA-B67F：5’- GTCCAGGACCCACACTTGCT-3’
HLA-B67R：5’- CCCACTCTAGACCCCAAGAA-3’；
HLA-C外显子1-7的测序引物：
HLA-C1F：5’- CCAATTCCCACTCCCATTG-3’
HLA-C1R：5’- TCCYAACCYCGCACTCAC-3’
HLA-C2F：5’- GACCCGGGGAGCCGCGCA-3’
HLA-C2R：5’- CGACCCGGG CCGTCCGTG-3’
HLA-C3F：5’- ACCICGIGGICIGGGCCAG-3’
HLA-C3R：5’-AGGCCATICCGGGAGATCTA -3’
HLA-C4F：5’- GGTGTCCTGTCCITTCTCA-3’
HLA-C4R：5’- GICTICTGCTTTCICTGA-3’
HLA-C5F：5’- GCCCTTCAGCYRGGTCAG-3’
HLA-C5R：5’- ACTTCTACCTGGGGCTTGAA-3’
HLA-C67F：5’- GGGTCCAAGACTAGGAGGTT-3’
HLA-C67R：5’- CACCACACATTCGAAACGTC-3’。
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