CN114438140A - Pet的降解方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种PET的降解方法，该方法包括用角质酶对PET进行降解反应；其中，所述角质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或编码所述角质酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的酶降解方法在高温下降解PET的效率高。

Description

PET的降解方法
技术领域
本发明涉及塑料降解领域，特别是涉及一种PET的降解方法。
背景技术
根据近期WWF(世界自然基金会)发布的报告显示2016年每个人产出的塑料垃圾总量约等于93个篮球的重量；如果塑料这个产业发展态势持续不变，到2030年，海洋中的塑料污染将翻一番，将达到3亿多吨。目前已经在超过240种物种体内发现塑料颗粒，如果不加重视，必然会危及人类自身的生存。
聚酯是由多元醇和多元酸缩聚而得的聚合物总称，一般为线型热塑性树脂。PET(聚对苯二甲酸乙二酯)占聚酯产量的90％以上，全球每年生产约7000万吨用于纺织和包装。但消费后的PET中只有14％得以回收循环利用，有14％用于焚烧发电，32％作为垃圾埋在地下，40％未能收集到而分散在环境中。传统PET的回收方法一般为物理化学法，如高温重塑，醇解氨解等，存在成本高的问题。同时，由于PET诞生才70多年，加之PET高度稳定的分子结构，自然界尚未进化出能够高效降解PET的微生物。这使得寻找一种可以高效降解PET的方法具有十分重要的意义。
2016年日本科学家从垃圾场里已经发生自然侵蚀的PET上分离并鉴定了一种对PET有一定降解能力的细菌(Ideonella sakaiensis)，并且重组表达了该菌降解PET的关键水解酶，将其命名为PETase，这是首个以PETase命名的PET水解酶(之前的研究一般是用酯酶、脂肪酶、角质酶等水解酶来降解PET)。该研究成果在SCIENCE上发表以后引起了很多争议，因为该酶只能够水解非结晶PET，而难以水解商用结晶PET瓶(结晶度30～40％)。
水解PET往往需要在60℃以上的高温下进行反应，因此在PET的酶降解中，对PET水解酶的温度耐受性要求特别高。在2020年ACS Sustainable Chemistry&Engineering的一篇综述中，以酶对PET降解效率为区分标准，将有PET水解能力的酶分为PET表面修饰酶(仅能水解PET表面的末端酯键)和PETase(对PET膜整体发生明显侵蚀)。并且认为PETase应具有两个主要特点：(1)温度耐受性大于65℃(最好大于70℃)；(2)催化口袋能够容纳至少一个PET单体(如MHET)。依照此标准，能够实现高效降解PET的酶十分稀有。因此，仍有待进一步探索更多的PET的高效酶降解方法。
目前，限制PET酶法水解的关键因素主要有以下三个：1.反应温度：PET作为一种典型的高聚物，其在空气中的玻璃化转变温度(Tg)为70～75℃左右，在水溶液中PET的Tg值会有所降低，为60-65℃(因为水分子进入聚合物链间，会削弱分子间氢键)。聚合物链在高于玻璃化转变温度(Tg)的温度下会转变为高弹态，聚合物链的移动性增加，从而增加酶对分子内酯键的可及性。因此，更高的反应温度将显著增加PET的降解速度。2.PET本身的结晶度：大多数商用PET(瓶和纺织品)具有30-40％的高结晶度。用于包装的APET膜(AmorphousPolyethylene Terephthalate)结晶度约为8％。市售低结晶度PET(PET-GF)的结晶度约为6～7％。结晶度的增加限制了聚合物链的移动，降低了酶攻击聚合物链的可能性。3.PET复杂的表面拓扑结构：PET瓶和纺织品在加工的过程中，必须要经历拉伸的过程以有序地定向聚合物链，形成需要的形状，导致额外的拉伸诱导结晶。因此，PET材料的表面拓扑结构与加工过程有关，PET瓶的不同部位，其聚合物链的取向也各不相同。由于以上因素的限制，目前还没有发现任何一种PET水解酶可直接用于商用PET瓶、纺织品和双向拉伸薄膜等结晶PET的降解。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种PET的酶降解方法，该降解方法实现了对PET的高效降解。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种PET的降解方法，包括用角质酶(即HRC酶)对PET进行降解反应；
其中，所述角质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或编码所述角质酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在其中一些实施例中，所述PET为结晶PET。
在其中一些实施例中，所述结晶PET的结晶度大于5％，进一步地，所述结晶PET的结晶度大于10％或大于20％；进一步地，所述结晶PET的结晶度为20～50％，进一步地，所述结晶PET的结晶度为30～40％。
在其中一些实施例中，所述降解反应的反应温度为50～100℃，进一步优选为65～85℃，进一步优选为70～85℃，进一步优选为70～80℃。
在其中一些实施例中，所述降解反应的pH为6～10，进一步优选为8～10。
在其中一些实施例中，所述降解反应的温度为75±3℃，所述降解反应的pH为pH 9±0.5。
在其中一些实施例中，所述降解方法包括以下步骤：将PET、角质酶和溶剂混合，进行降解反应。
在其中一些实施例中，所述角质酶在反应体系中的浓度为0.005～0.5mg/mL。
在其中一些实施例中，所述角质酶在反应体系中的浓度为0.01～0.1mg/mL，进一步地，所述角质酶在反应体系中的浓度为0.01～0.05mg/mL。
在其中一些实施例中，所述PET与角质酶的质量比为10～2000：1。
在其中一些实施例中，所述溶剂为缓冲液，或者为缓冲液和DMSO的混合液。
在其中一些实施例中，所述缓冲液和DMSO的体积比为5～12:1，进一步为5～9:1。
在其中一些实施例中，所述缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；进一步地，所述缓冲液为含氯化钠的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；进一步地，所述含氯化钠的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中氯化钠的浓度为200～400mM。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人在研究中首次发现，角质酶HRC的Tm值为95.6℃，高于其他已知的角质酶，具有非常好的高温耐受性。特别是，角质酶HRC可以水解结晶PET，这也是目前已知的唯一一个可直接水解商用结晶PET的聚酯水解酶。本发明方法中选择角质酶HRC对结晶PET进行降解，结合合适的反应体系，最终实现了非常好的降解效果。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳对纯化的重组蛋白进行纯度鉴定的电泳图；
图2为HRC在不同温度下的相对活力；
图3为HRC在不同pH下的相对活力；
图4为HRC的Tm值测定结果(0.3mg/ml的Tm＝95.6℃)；
图5为HRC的温度耐受性能测定结果；
图6为实施例1中使用HRC对PET进行降解反应的效果图；
图7为实施例2中转速与酶相对活力的关系；
图8为实施例3中使用HRC对PET进行降解反应的效果图；
图9为实施例4中HRC对PET进行降解反应的效果图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本实施方式提供一种PET的降解方法，其包括用角质酶对PET进行降解反应；
其中，所述角质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或编码所述角质酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在其中一些实施方式中，所述PET为结晶PET。该结晶PET是指所有具有结晶度的PET，包括商用PET瓶和纺织品等。
在其中一些实施方式中，所述结晶PET的结晶度大于5％，10％，20％或30％；进一步地，所述结晶PET的结晶度为20～50％，进一步地，所述结晶PET的结晶度为30％～40％。
在一些优选的实施方式中，所述降解反应的反应温度为50～100℃，进一步优选为65～85℃，70～85℃，或70～80℃。
在一些优选的实施方式中，所述降解反应的pH为6～10，优选为8～10。
在一些优选的实施方式中，所述降解反应的温度为75±3℃，所述降解反应的pH为pH 9±0.5。在此温度和pH范围内，所述角质的降解活力十分好。
在一些实施方式中，所述降解方法包括以下步骤：将PET、角质酶和溶剂混合，进行降解反应。
在一些优选的实施方式中，所述角质酶在反应体系中的浓度为0.005～0.1mg/mL；优选地，所述角质酶在反应体系中的浓度为0.01～0.1mg/mL。
在一些优选的实施方式中，所述PET与角质酶的质量比为10～2000：1。
在一些优选的实施方式中，所述溶剂为缓冲液，或者为缓冲液和DMSO的混合液。进一步地，所述缓冲液和DMSO的体积比为5～12:1，进一步为5～9:1。进一步地，所述缓冲液为磷酸钾缓冲液。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
一、HRC的制备过程
角质酶HRC氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：
SNPYQRGPNPTRSALTTDGPFSVATYSVSRLSVSGFGGGVIYYPTGTTLTFGGIAMSPGYTADASSLAWLGRRLASHGFVVIVINTNSRLDFPDSRASQLSAALNYLRTSSPSAVRARLDANRLAVAGHSMGGGATLRISEQIPTLKAGVPLTPWHTDKTFNTPVPQLIVGAEADTVAPVSQHAIPFYQNLPSTTPKVYVELDNATHFAPNSPNAAISVYTISWMKLWVDNDTRYRQFLCNVNDPALSDFRSNNRHCQ。
编码HRC的核酸序列(SEQ ID NO.2)：
CATATGTCTAACCCGTACCAGCGTGGCCCGAACCCGACCCGTAGCGCGCTGACCACCGACGGCCCGTTCTCTGTTGCGACCTACTCTGTTAGCCGTCTGAGCGTGAGCGGCTTCGGCGGCGGTGTTATCTACTACCCGACCGGCACCACCCTGACCTTCGGCGGCATCGCGATGTCTCCGGGCTACACCGCGGATGCGTCCAGCCTGGCGTGGCTGGGTCGTCGTCTGGCGTCCCACGGCTTCGTTGTTATCGTGATCAACACCAACAGCCGTCTGGATTTCCCGGATAGCCGCGCGAGCCAGCTGTCTGCGGCGCTGAACTACCTGCGTACCTCTTCCCCGAGCGCGGTTCGTGCGCGTCTGGATGCGAACCGTCTGGCGGTGGCAGGCCACTCTATGGGCGGTGGCGCGACCCTGCGTATCAGCGAACAGATCCCGACCCTGAAAGCGGGCGTTCCGCTGACCCCGTGGCACACCGACAAAACCTTCAACACCCCGGTTCCGCAGCTGATCGTTGGTGCGGAAGCGGATACCGTTGCGCCGGTTAGCCAGCACGCGATCCCGTTCTACCAGAACCTGCCGAGCACCACCCCGAAAGTTTACGTTGAACTGGATAACGCGACCCACTTCGCGCCGAACTCTCCGAACGCGGCGATCAGCGTTTACACCATCTCTTGGATGAAACTGTGGGTTGATAACGATACCCGTTACCGTCAGTTCCTGTGCAACGTTAACGATCCGGCGCTGAGCGATTTCCGTAGCAACAACCGTCACTGCCAGCTCGAG。
利用常规的全基因合成方法获取的角质酶HRC的编码基因，并克隆到表达载体pET-30a(+)(委托生工生物公司全基因合成该目的基因并连接到pET-30a(+)载体上)上获得重组表达载体，利用热激转化法，将含有角质酶HRC编码基因的表达质粒转入BL-21(DE3)菌种(购自生工生物公司)中，获得基因工程菌，将角质酶HRC的菌种接到含Kana(卡那霉素)(购自生工生物公司)50μg/ml的LB种子培养基中扩大培养，当OD值达到0.6～0.8时，将菌液按照1:100的比例接种到含Kana(卡那霉素)50μg/ml的LB发酵培养基中，摇至OD值为0.6～0.8时加入10mmol/L的IPTG诱导剂(购自生工生物公司)进行诱导表达，18～24h后收菌，将菌液在12000rpm/min条件下离心10min后收集管壁细胞，用20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液(含300mM NaCl，20mM咪唑)重悬，随后进行超声破碎，以12000rpm/min条件离心10min后取上清液，即得到粗酶液。
将HRC的粗酶液上样到镍金属螯合亲和层析柱(HisTrap HP column,GEHealthcare)，流速1mL/min，随后用20mM pH 8.0Tris-HCl缓冲液(含300mM NaCl，300mM咪唑)洗脱，最后将目的蛋白换盐至pH 7.5的20mM Tris-HCl缓冲液，得到纯度大于90％的目的蛋白(通过生工生物公司的质谱检测结果确认28与56kDa位置的条带都与HRC的序列相吻合，可能是电泳过程中形成了特殊的二聚体结构)。利用SDS-PAGE电泳对纯化的重组蛋白进行纯度鉴定(如图1所示，其中M代表：中分子量蛋白marker；诱导前代表：IPTG诱导前总菌；诱导后代表：收菌时总菌；粗酶代表：超声破碎后上清液；沉淀代表：超声破碎后离心的沉淀；纯化代表：Ni柱纯化后Buffer B洗脱液；穿过：上样到Ni柱时的流穿液)。
目的蛋白浓度测定方法为：10μL待测蛋白溶液和200μL Bradfold试剂混合，37℃静置5min后测定其A595，结合标准曲线求得蛋白浓度，后续使用时根据需要进行适当稀释。
二、HRC酶学性质测定
1.HRC水解PET的酶活力检测方法：
底物预处理：将废弃的怡宝矿泉水瓶(结晶度30～40％)清洗干净，切除瓶口与瓶底等部分，保留瓶身，于70℃下烘干。随后将其剪成长5mm，宽2mm的长条，于液氮中速冻，然后用装配有500μm滤网的超速研磨机进行研磨，经过筛选，最终得到粒径小于500μm的PET粉末备用。
称取10mg所述PET粉末于2mL的离心管，加入pH 9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(含300mM NaCl)700μL、纯酶液200μL(由上述得到的高纯度HRC目的蛋白制备得到，浓度为0.1mg/ml)、DMSO 100μL，总体积为1mL。在一定温度下，静置反应0.5h后，取上清液测定A260。
由于PET的水解产物为MHET(单(2-羟乙基)对苯二甲酸)和TPA(对苯二甲酸)，这两者均在260nm处有吸光值，建立不同浓度MHET和TPA和A260的标准曲线，即可求得PET的水解效率。酶活定义为每分钟水解底物产生1μmol产物所需的酶量定义为1个酶活单位(U)，即1U。
2.温度对HRC酶活的影响：
在不同温度(60-85℃)条件下，采用上述方式测定HRC酶活。反应体系为50mM pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(含300mM NaCl)700μL、酶液200μL(浓度0.1mg/mL)、DMSO100μL，总体积为1mL。分别在60，65，70，75，80，85℃下，静置反应，反应0.5h后，取上清液测定A260。温度对HRC酶活的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100％。所有实验重复三次。结果如图2所示，表明HRC的最适反应温度是75℃。
3.pH对HRC酶活的影响：
在pH(6-10)条件下，采用上述方式测定HRC酶活。反应体系分别是50mM pH 6，7，8的磷酸钾缓冲液，pH 9，10的甘氨酸-NaOH缓冲液(含300mM NaCl)700μL，酶液200μL(浓度0.1mg/mL)、DMSO 100μL，总体积为1mL。在75℃下，静置反应，反应0.5h后，取上清液测定A260。pH对HRC酶活的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100％。所有实验重复三次。结果如图3所示，表明HRC的最适反应pH是9。
4.HRC的Tm值测定：
将染料Sypro Orange dye(5000X)与缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，300mMNaCl)按照1：100的体积比进行稀释，同时将纯化后的HRC用该缓冲液稀释到0.3mg/ml，将5μL稀释好的染料与20μL稀释好的酶液进行混合，并置于八联PCR管中，室温下2000rpm离心1min，随后使用Bio-Rad-CFX96实时荧光PCR检测。将系统设置在FRET通道上，使用450/490激发和560/580发射滤光片，将样品以0.3℃/s的速率从25℃加热到100℃，每隔0.03s测一次荧光，最后使用Bio-Rad CFX Manager从解链曲线的一阶导数的峰确定Tm值(测定重复三次)。
结果如图4所示，图4显示HRC的Tm值为95.6℃，为目前最高的Tm，高于其他所有角质酶，说明HRC具有非常好的耐热性能。
5.HRC的热稳定性测定：
将纯化后的HRC(即纯度大于90％的目的蛋白)用pH 7.5的20mM Tris-HCl缓冲液稀释到0.003mg/mL，得酶液，分装后置于PCR仪，80℃孵育，每隔一段时间取样，冰上放置5min后用人工底物pNP-C4(对硝基苯酚丁酸酯)为底物测定其水解活力。以未孵育时的活力为100％，测定实验重复三次。
pNP-C4测活力的反应体系为10μL 10mM pNP-C4、10μL酶液、80μL pH7.0 50mM磷酸钾缓冲液。反应在37℃的酶标仪中进行，每隔10s测定一次A405，反应持续5min，每分钟水解底物产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活单位(U)，即1U。
测定结果如图5所示，表明HRC在80℃下的半衰期为10小时左右，说明该酶的热稳定性非常好，具有很好的耐热性。
三、PET的降解
实施例1
将纯化后的HRC浓缩到1mg/mL，得酶液，称取100mg前面用怡宝矿泉水瓶(结晶度30～40％)制备的PET粉末于100mL的三角瓶，加入50mM pH 9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(含300mM NaCl)49mL、酶液1mL，总体积为50mL。75℃下，静置反应，每隔一段时间取一次样，测定A260。
测定结果如图6所示，测定结果表明，HRC不断水解PET粉末，在12小时左右反应达到平衡，反应起始的一小时内可视为反应初速度，测得HRC水解PET的活力为0.069U/mg，空白对照为等量不含酶的缓冲液。最终反映得到平衡时产物积累量(MHET和TPA的总和)为0.66μmol。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，反应转速不同。
将纯化后的HRC酶稀释到0.1mg/mL，得酶液，称取10mg PET粉末于2mL的离心管，加入50mM pH 9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(含300mM NaCl)700μL、酶液200μL、DMSO 100μL，总体积为1mL。75℃下，于震荡反应器中，以不同转速进行反应，0.5h后取上清液测定A260，分别计算不同转速下的初始活力，同时以最大活力为100％计算相对活力。
测定结果表明，HRC水解PET粉末时，随着转速的提高，反应效率会有所下降，这可能是由于PET为不溶于水的粉末，需要酶与PET表面充分接触才能进行催化反应，因此较低转速下，转速的提高不利于酶解反应的进行。而转速提高到一定程度时，PET链的运动性大大增强，从而有利于酶进入到分子链间进行催化反应，因而反应效率又会有所提升(图7)。
实施例3
将纯化后的HRC浓缩到1mg/mL，得酶液，反应底物购自Goodfellow的无定形PET(Amorphous Polyethylene Terephthalate)(250μm，product number ES301445)(其结晶度约为6％)，将其剪成长5mm，宽2mm的长条，于液氮中速冻，然后用装配有500μm滤网的超速研磨机进行研磨，经过筛选，最终得到粒径小于500μm的APET粉末。称取100mg APET粉末于100mL的三角瓶，加入50mM pH 9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(含300mM NaCl)49mL、酶液1mL，总体积为50mL。75℃下，静置反应，每隔一段时间取一次样，适当稀释后测定A260。
测定结果表明，HRC不断水解PET切片，在12小时左右反应接近平衡，测得HRC水解APET的活力为10.19U/mg，最终的产物释放量为61.79μmol(如图8所示)，HRC对无结晶PET的水解效果也高于其他的同类酶。
实施例4
将纯化后的HRC分别稀释到0.005，0.01，0.02，0.04，0.05，0.075，0.1，0.15，0.2，0.25mg/mL，作为酶液，称取10mg前面用怡宝矿泉水瓶(结晶度30～40％)制备的PET粉末于2mL的离心管，加入50mM pH 9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(含300mM NaCl)700μL、酶液200μL、DMSO 100μL，总体积为1mL。75℃下静置反应，0.5h后取上清液测定A260，分别计算不同蛋白浓度下的初始活力，同时以最大活力为100％计算相对活力。
测定结果如图9所示，表明HRC水解PET粉末时，随着蛋白浓度的提高，反应效率会随之提高，但是蛋白浓度达到一定程度时，酶与底物之间形成饱和状态，反应效率逐渐平衡。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 华南理工大学；
<120> PET的降解方法
<130> 2020-12-4
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 258
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Ser Asn Pro Tyr Gln Arg Gly Pro Asn Pro Thr Arg Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Thr Asp Gly Pro Phe Ser Val Ala Thr Tyr Ser Val Ser Arg Leu Ser
20 25 30
Val Ser Gly Phe Gly Gly Gly Val Ile Tyr Tyr Pro Thr Gly Thr Thr
35 40 45
Leu Thr Phe Gly Gly Ile Ala Met Ser Pro Gly Tyr Thr Ala Asp Ala
50 55 60
Ser Ser Leu Ala Trp Leu Gly Arg Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val
65 70 75 80
Val Ile Val Ile Asn Thr Asn Ser Arg Leu Asp Phe Pro Asp Ser Arg
85 90 95
Ala Ser Gln Leu Ser Ala Ala Leu Asn Tyr Leu Arg Thr Ser Ser Pro
100 105 110
Ser Ala Val Arg Ala Arg Leu Asp Ala Asn Arg Leu Ala Val Ala Gly
115 120 125
His Ser Met Gly Gly Gly Ala Thr Leu Arg Ile Ser Glu Gln Ile Pro
130 135 140
Thr Leu Lys Ala Gly Val Pro Leu Thr Pro Trp His Thr Asp Lys Thr
145 150 155 160
Phe Asn Thr Pro Val Pro Gln Leu Ile Val Gly Ala Glu Ala Asp Thr
165 170 175
Val Ala Pro Val Ser Gln His Ala Ile Pro Phe Tyr Gln Asn Leu Pro
180 185 190
Ser Thr Thr Pro Lys Val Tyr Val Glu Leu Asp Asn Ala Thr His Phe
195 200 205
Ala Pro Asn Ser Pro Asn Ala Ala Ile Ser Val Tyr Thr Ile Ser Trp
210 215 220
Met Lys Leu Trp Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Arg Gln Phe Leu Cys
225 230 235 240
Asn Val Asn Asp Pro Ala Leu Ser Asp Phe Arg Ser Asn Asn Arg His
245 250 255
Cys Gln
<210> 2
<211> 786
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
catatgtcta acccgtacca gcgtggcccg aacccgaccc gtagcgcgct gaccaccgac 60
ggcccgttct ctgttgcgac ctactctgtt agccgtctga gcgtgagcgg cttcggcggc 120
ggtgttatct actacccgac cggcaccacc ctgaccttcg gcggcatcgc gatgtctccg 180
ggctacaccg cggatgcgtc cagcctggcg tggctgggtc gtcgtctggc gtcccacggc 240
ttcgttgtta tcgtgatcaa caccaacagc cgtctggatt tcccggatag ccgcgcgagc 300
cagctgtctg cggcgctgaa ctacctgcgt acctcttccc cgagcgcggt tcgtgcgcgt 360
ctggatgcga accgtctggc ggtggcaggc cactctatgg gcggtggcgc gaccctgcgt 420
atcagcgaac agatcccgac cctgaaagcg ggcgttccgc tgaccccgtg gcacaccgac 480
aaaaccttca acaccccggt tccgcagctg atcgttggtg cggaagcgga taccgttgcg 540
ccggttagcc agcacgcgat cccgttctac cagaacctgc cgagcaccac cccgaaagtt 600
tacgttgaac tggataacgc gacccacttc gcgccgaact ctccgaacgc ggcgatcagc 660
gtttacacca tctcttggat gaaactgtgg gttgataacg atacccgtta ccgtcagttc 720
ctgtgcaacg ttaacgatcc ggcgctgagc gatttccgta gcaacaaccg tcactgccag 780
ctcgag 786

Claims (10)

1.一种PET的降解方法，其特征在于，包括用角质酶对PET进行降解反应；其中，所述角质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或编码所述角质酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的降解方法，其特征在于，所述PET为结晶PET。
3.根据权利要求2所述的降解方法，其特征在于，所述结晶PET的结晶度大于5％，进一步地，所述结晶PET的结晶度为20～50％。
4.根据权利要求1所述的降解方法，其特征在于，所述降解反应的反应温度为65～85℃，优选为70～80℃；和/或，所述降解反应的pH为6～10，优选为8～10。
5.根据权利要求4所述的降解方法，其特征在于，所述降解反应的温度为75±3℃，所述降解反应的pH为9±0.5。
6.根据权利要求1～5任一项所述的降解方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述PET、角质酶和溶剂混合，进行降解反应；
其中，所述角质酶在反应体系中的浓度为0.005～0.5mg/mL；优选地，所述角质酶在反应体系中的浓度为0.01～0.1mg/mL。
7.根据权利要求6所述的降解方法，其特征在于，所述PET与角质酶的质量比为10～2000：1。
8.根据权利要求6所述的降解方法，其特征在于，所述溶剂为缓冲液，或者为缓冲液和DMSO的混合液。
9.根据权利要求8所述的降解方法，其特征在于，所述缓冲液和DMSO的体积比为5～9:1。
10.根据权利要求8所述的降解方法，其特征在于，所述缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；进一步地，所述缓冲液为含氯化钠的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891767A (zh) * 2022-05-19 2022-08-12 华南理工大学 角质酶-酯酶融合蛋白及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017198786A1 (en) * 2016-05-19 2017-11-23 Carbios A process for degrading plastic products
CN109563494A (zh) * 2016-07-12 2019-04-02 卡比奥斯公司 新酯酶及其用途
CN110241097A (zh) * 2019-05-24 2019-09-17 山东大学 Pet降解酶及其突变体和应用
WO2020021116A1 (en) * 2018-07-27 2020-01-30 Carbios Novel esterases and uses thereof
WO2020169633A1 (en) * 2019-02-21 2020-08-27 Evoxx Technologies Gmbh Polyester compositions treatment agent and method for treatment of a polyester composition

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017198786A1 (en) * 2016-05-19 2017-11-23 Carbios A process for degrading plastic products
CN109563494A (zh) * 2016-07-12 2019-04-02 卡比奥斯公司 新酯酶及其用途
US20190233803A1 (en) * 2016-07-12 2019-08-01 Carbios Novel esterases and uses thereof
WO2020021116A1 (en) * 2018-07-27 2020-01-30 Carbios Novel esterases and uses thereof
WO2020169633A1 (en) * 2019-02-21 2020-08-27 Evoxx Technologies Gmbh Polyester compositions treatment agent and method for treatment of a polyester composition
CN110241097A (zh) * 2019-05-24 2019-09-17 山东大学 Pet降解酶及其突变体和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
药用高分子材料学: "药用高分子材料学", 上海：华南理工大学出版社, pages: 29 - 30 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891767A (zh) * 2022-05-19 2022-08-12 华南理工大学 角质酶-酯酶融合蛋白及其应用
CN114891767B (zh) * 2022-05-19 2023-04-28 华南理工大学 角质酶-酯酶融合蛋白及其应用

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