CN115558684B - 一种酰胺化合物的生物制备方法以及生物法制备的丙烯酰胺 - Google Patents

Abstract

本申请涉及微生物催化技术领域，具体公开了一种酰胺化合物的生物制备方法以及生物法制备的丙烯酰胺，酰胺化合物的生物制备方法包括菌种驯化阶段和生产精制阶段。在菌种驯化阶段，本申请驯化得到的二次驯化菌株对水溶性脂肪腈和酰胺化合物均具有良好的耐受能力，因此水合液中的腈类化合物和酰胺化合物对二次驯化菌株的活力影响均相对较小，有助于提高生产酰胺化合物的效率。

Description

一种酰胺化合物的生物制备方法以及生物法制备的丙烯酰胺

技术领域

本申请涉及微生物催化技术领域，更具体地说，它涉及一种酰胺化合物的生物制备方法以及生物法制备的丙烯酰胺。

背景技术

丙烯酰胺是丙烯腈经过水合反应后得到的化合物，是一种重要的工业原料，目前国内已经广泛使用生物法来生产丙烯酰胺，该方法中丙烯腈的转化率可达99％以上。丙烯酰胺具有毒性，在生物法的生产过程中，随着丙烯酰胺的积累，反应体系中的产酶菌会逐渐死亡。因此在生物法制备的丙烯酰胺产品中，丙烯酰胺的浓度普遍不高，不利于丙烯酰胺的应用。为了进一步提高产品中丙烯酰胺的浓度，需要增强产酶菌对丙烯酰胺毒性的抵抗能力。

相关技术中有一种高丙烯酰胺耐受性菌株及水合结晶工艺，记载了提高产酶菌对产物(丙烯酰胺)耐受性的方法，包括以下步骤：(1)在种子培养基中对RS菌株(Nocardiasp.RS)进行活化培养，然后将生长出的菌苔添加到含有二价钴离子的发酵培养基中，继续培养后得到发酵液；(2)间歇向发酵液中加入丙烯腈，并定时取出发酵液，在种子培养基中对取出的发酵液进行稀释培养，将本步骤的种子培养基中最后生长出的菌株编号为RS-1菌株。之后，该技术将RS-1菌株和RS菌株分别应用于丙烯腈水合反应实验，并且成功提高了产品中丙烯酰胺的浓度。

针对上述中的相关技术，发明人认为，丙烯腈同样对产酶菌具有毒性，在丙烯酰胺的工业生产过程中，产酶菌对丙烯腈的耐受能力会影响产酶菌的活力，进而影响生产丙烯酰胺的效率。而相关技术中虽然驯化出了耐丙烯酰胺毒性的产酶菌，但是在驯化产酶菌的过程中，产酶菌始终在对丙烯腈进行消耗，发酵液中难以形成丙烯腈大量积累的环境，不利于提高产酶菌对丙烯腈的耐受能力。因此在实际生产过程中，丙烯腈的毒性会限制驯化出的产酶菌的活力，影响生产丙烯酰胺的效率。

发明内容

相关技术中的驯化过程不利于提高产酶菌对丙烯腈的耐受能力，因此在实际生产过程中，丙烯腈的毒性会限制产酶菌的活力，进而影响生产丙烯酰胺的效率。为了改善这一缺陷，本申请提供一种酰胺化合物的生物制备方法以及生物法制备的丙烯酰胺。

第一方面，本申请提供一种酰胺化合物的生物制备方法，采用如下的技术方案：一种酰胺化合物的生物制备方法，包括菌种驯化阶段和生产精制阶段，所述菌种驯化阶段包括以下步骤：

(1)向种子培养基中接种菌株，在光照条件下培养60-80h，得到发酵种子，将发酵种子接种到发酵培养基中，然后继续在光照条件下培养120-140h；本步骤中，所述菌株产生的胞内酶包括铁型腈水合酶，所述发酵培养基中含有亚铁离子；

(2)步骤(1)的培养结束后，得到原始发酵液，在遮光条件下先培养20-24h，然后以每6-10min一次的频率抽取原始发酵液样本，每次抽取完成后都向原始发酵液中添加水溶性脂肪腈，然后在种子培养基中对抽取的原始发酵液样本进行单独培养，种子培养基中最后长出的菌株即为一次驯化菌株；

(3)按照步骤(1)的培养方法对一次驯化菌株进行培养，得到一次驯化发酵液，在光照条件下以每4-6h一次的频率抽取一次驯化发酵液样本，每次抽取完成后都向所述一次驯化发酵液中添加水溶性脂肪腈，然后在种子培养基中对抽取的一次驯化发酵液样本进行单独培养，种子培养基中最后长出的菌株即为二次驯化菌株；

所述生产精制阶段包括以下步骤：

(1)按照菌株驯化阶段的步骤(1)中的培养方法对二次驯化菌株进行培养，得到二次驯化发酵液；

(2)将二次驯化发酵液、菌株固化载体中的一种与纯水混合并流加丙烯腈，得到反应液，反应液在温度为20-30℃、搅拌速度为50-300rpm的条件下进行水合反应，得到水合液，水合液经过离心和超滤膜过滤后得到酰胺粗品液，酰胺粗品液经过脱盐后得到酰胺水溶液；本步骤中，所述菌株固化载体为储存有二次驯化菌株的载体颗粒，所述菌株固化载体中含有渗透助剂，所述渗透助剂为内壁接枝有酰胺基团的埃洛石纳米管。

通过采用上述技术方案，本申请对产生铁型腈水合酶的原始菌株进行了分段驯化，首先在遮光条件下通过提高原始发酵液腈浓度的条件下逐步淘汰对水溶性脂肪腈耐受性差的产酶菌细胞，最终在丙烯腈大量积累的条件下筛选得了到对丙烯腈耐受性较强的一次驯化菌株。在驯化得到一次驯化菌株的过程中，遮光条件会令菌体中的铁型腈水合酶暂时失去活性，因而水溶性脂肪腈难以被有效消耗，从而为形成丙烯腈大量积累的环境创造了有利条件。然后，本申请继续对一次驯化菌株进行培养，并在光照条件下继续采用添加水溶性脂肪腈的方式进行驯化，此时光照条件会令铁型腈水合酶的活性恢复，因而水溶性脂肪腈会逐渐被转化为对应的酰胺化合物，并在一次驯化发酵液中形成高酰胺浓度的环境，在此环境下通过筛选最后存活的菌株，得到了对水溶性脂肪腈和酰胺化合物均具有更好耐受性的二次驯化菌株。

在得到二次驯化菌株之后，本申请对二次驯化菌株进行培养，得到了二次驯化发酵液，并利用二次驯化发酵液或菌株固化载体进行了酰胺化合物的生产，在经过超滤膜过滤、脱盐等步骤后得到了酰胺水溶液。由于二次驯化菌株对水溶性脂肪腈和酰胺化合物均具有良好的耐受能力，因此水合液中的腈类化合物和酰胺化合物对二次驯化菌株的活力影响相对较小，提高了生产酰胺化合物的效率。

另外，在本申请的菌株固化载体中，渗透助剂的酰胺基团使得渗透助剂与产酶菌细胞产生的酰胺化合物具有良好的相容性，因此酰胺化合物容易在埃洛石纳米管的内壁中发生扩散，从而加快了菌株固化载体对酰胺化合物的排除，减小了酰胺化合物的积累对产酶菌细胞的生命活动造成抑制的可能。

作为优选，所述渗透助剂按照如下方法制备：

(1)将乙醇、水、酰胺化硅烷偶联剂混合，得到改性液；本步骤中，所述酰胺化硅烷偶联剂为分子中带有酰胺基团的硅烷偶联剂；

(2)将埃洛石纳米管与改性液混合，静置30-40min后再进行烘干，将烘干所得物洗涤后再次烘干，得到渗透助剂。

通过采用上述技术方案，埃洛石纳米管的内壁上具有大量的铝羟基，硅烷偶联剂水解产生的硅羟基能够与铝羟基发生脱水缩合，并将带有酰胺基团的链段接枝到埃洛石纳米管的内壁上，经过烘干脱水处理后即可得到渗透助剂。

作为优选，所述酰胺化硅烷偶联剂按照如下方法制备：

将γ-氨丙基三乙氧基硅烷、β-氰基丙氨酸、缩合剂和有机溶剂混合，在0-4℃搅拌24-26h，然后进行减压过滤，弃去沉淀后将剩余的液体减压蒸发，得到酰胺化硅烷偶联剂粗品，将酰胺化硅烷偶联剂粗品溶于四氢呋喃中，使用石油醚重结晶后得到酰胺化硅烷偶联剂。

通过采用上述技术方案，在缩合剂的作用下，γ-氨丙基三乙氧基硅烷中的氨基和β-氰基丙氨酸中的羧基能够发生缩合，在缩合反应产生酰胺化硅烷偶联剂的同时，还向硅烷偶联剂的分子中引入了氰基。当使用此方法得到的酰胺化硅烷偶联剂处理埃洛石纳米管之后，能够同时在埃洛石纳米管的内壁接枝氰基和酰胺基，从而同时提高了渗透助剂对酰胺化合物和腈类化合物的相容性，促进了酰胺化合物与腈类化合物的双向渗透，促进了酰胺化合物在反应液中的积累。

作为优选，所述菌株固化载体按照如下方法制备：

(1)将二次驯化发酵液离心后弃去上清液，得到浓缩菌液，将硅藻土加入浓缩菌液中，得到前体浆料；

(2)将前体浆料持续搅拌2-3h后再与海藻酸钠溶液以及渗透助剂混合，得到第一混合液，将第一混合液加入水溶性钙盐的水溶液中，得到第二混合液；

(3)在3-6℃静置第二混合液1-2h后，对第二混合液进行过滤，然后洗涤过滤得到的固体，得到菌株固化载体。

通过采用上述技术方案，在浓缩菌液中，硅藻土对浓缩菌液进行了吸附。在第一混合液中，硅藻土颗粒又对海藻酸钠进行了吸附。当第一混合液中滤出的固体进入水溶性钙盐中之后，钙离子与海藻酸钠反应形成海藻酸钙，从而在硅藻土表面产生了凝胶膜，凝胶膜实现了对产酶菌细胞的包覆，并对渗透助剂进行固定。当第二混合液经过静置、过滤和洗涤后，即可得到菌株固定化载体。

作为优选，在制备所述菌株固化载体的步骤(1)中，将葡萄糖和硅藻土共同加入浓缩菌液中。

通过采用上述技术方案，在将葡萄糖和硅藻土共同加入浓缩菌液中后，硅藻土能够同时吸附浓缩菌液和葡萄糖，葡萄糖能够为浓缩菌液中的产酶菌细胞提供能量，有助于维持产酶菌细胞的生命活动。当海藻酸钠与钙离子在硅藻土表面反应时，一部分葡萄糖能够给从硅藻土中渗出，从而为产酶菌细胞在菌株固定化载体内增殖留出了更多空间，有助于提高菌株固定化载体内的细胞密度。

作为优选，在制备所述菌株固定化载体的步骤(3)中，使用腈类化合物的水溶液对过滤第二混合液后得到的固体进行洗涤，所述腈类化合物与生产精制阶段的步骤(2)中选用的腈类化合物相同。

通过采用上述技术方案，使用腈类化合物的水溶液进行洗涤能够使得一部分腈类化合物渗透进菌株固定化载体，并被硅藻土吸附。腈类化合物的毒性能够使其在菌株固定化载体中抑制杂菌的生命活动，减少了杂菌中的好氧菌对氧气、碳源、氮源的消耗，有利于产酶菌保持活性。同时，腈类化合物对杂菌的抑制作用也降低了菌株固定化载体对储存环境清洁度的要求，有利于对本申请的技术进行推广。

作为优选，在制备所述菌株固化载体的步骤(1)中，将填充粉体和硅藻土共同加入浓缩菌液中，所述填充粉体的组分包括腈纶纤维粉，所述腈纶纤维粉由腈纶纤维经过粉碎和研磨后得到。

通过采用上述技术方案，在前体浆料中，填充粉体能够吸附到硅藻土的表面，而海藻酸钠和钙离子反应产生的凝胶膜能够对硅藻土表面的填充粉体进行固定。腈纶纤维粉中的腈基能够容易吸附腈类化合物，从而提高了腈类化合物在菌株固化载体中的储量，增强了对杂菌生命活动的抑制效果，有利于产酶菌保持活性。

另外，腈纶纤维耐磨性差，但是利用这一点对腈纶纤维进行研磨后，得到的产物粉碎较为彻底，因此腈纶纤维粉容易在前体浆料中悬浮，有利于硅藻土对腈纶纤维的吸附。

作为优选，所述填充粉体的组分还包括改性活性炭粉，所述改性活性炭粉按照如下方法制备：

(1)在负压条件下使用硝酸亚铁溶液浸渍聚丙烯腈基活性炭纤维，浸渍一段时间后将聚丙烯腈基活性炭纤维取出，再将聚丙烯腈基活性炭纤维浸浸渍在半胱氨酸溶液中，浸渍一段时间后再将聚丙烯腈基活性炭纤维取出；

(2)对取出的聚丙烯腈活性炭纤维进行洗涤和干燥，得到络合物改性纤维，对络合物改性纤维进行研磨后得到改性活性炭粉。

通过采用上述技术方案，在负压条件下，聚丙烯腈基活性炭纤维中的孔结构能够吸附硝酸亚铁，孔结构中的硝酸亚铁和半胱氨酸反应后得到具有吸附一氧化氮能力的半胱氨酸亚铁络合物，使得最终制成的改性活性炭粉具有吸附一氧化氮的能力。在菌株固化载体内部的弱光条件下，铁型腈水合酶失去活性的主要原因是酶中的铁原子与产酶菌代谢生成的一氧化氮发生了结合。改性活性炭粉能够在菌株固化载体中吸附一氧化氮，从而降低了一氧化氮对铁型腈水合酶活性的影响，有助于提高产酶菌的催化效率。

作为优选，在制备所述改性活性炭粉的步骤(2)中，使用硝酸亚铁溶液对取出的聚丙烯腈活性炭纤维进行洗涤。

通过采用上述技术方案，使用硝酸亚铁溶液洗涤能够令一部分硝酸亚铁吸附在聚丙烯腈活性炭纤维表面。由于步骤(1)的硝酸亚铁是在负压条件下发生吸附，因此步骤(1)的硝酸亚铁以及半胱氨酸亚铁络合物与聚丙烯腈活性炭纤维之间的吸附相对紧密，而步骤(2)洗涤时发生吸附的硝酸亚铁与聚丙烯腈活性炭纤维之间的结合相对较弱。

当菌株固化载体中的产酶菌合成铁型腈水合酶时，菌株固化载体内的亚铁离子浓度下降。此时，洗涤过程中吸附的亚铁离子在浓度差的作用下会发生脱落，并向菌株固化载体内部渗透，维持了铁型腈水合酶合成的进行，增加了产酶菌细胞内铁型腈水合酶的储量，有助于提高酰胺化合物的生产效率。

第二方面，本申请提供一种生物法制备的丙烯酰胺，采用如下的技术方案。

一种生物法制备的丙烯酰胺，由以上任一所述的酰胺化合物的生物制备方法制成，在所述酰胺化合物的生物制备方法中，生产精制阶段的步骤(2)选用的腈类化合物为丙烯腈。

通过采用上述技术方案，本申请采用上述方法，利用二次驯化菌株催化了丙烯腈的水合反应，得到了丙烯酰胺。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、本申请驯化得到的二次驯化菌株对水溶性脂肪腈和酰胺化合物均具有良好的耐受能力，因此水合液中的腈类化合物和酰胺化合物对二次驯化菌株的活力影响均相对较小，从而提高了生产酰胺化合物的效率。

2、本申请中优选将葡萄糖和硅藻土共同加入浓缩菌液中，葡萄糖能够为产酶菌细胞提供能量，有助于维持产酶菌细胞的生命活动。当海藻酸钠与钙离子在硅藻土表面反应时，一部分葡萄糖能够给从硅藻土中渗出，从而为产酶菌细胞在菌株固定化载体内增殖留出了更多空间，有助于提高菌株固定化载体内的细胞密度。

3、本申请的方法，利用二次驯化菌株催化了丙烯腈的水合反应，得到了丙烯酰胺。

具体实施方式

以下结合实施例、制备例和对比例对本申请作进一步详细说明，本申请涉及的原料均可通过市售获得。

实施例

以下以实施例1为例进行说明。

实施例1

本实施例中，所用的种子培养基按重量百分比计包括如下组分：葡萄糖0.6％，磷酸氢二钾0.05％、磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，酵母膏0.4％，余量为水，种子培养基的pH为7.2。

本实施例中，所用的发酵培养基按重量百分比计包括如下组分：葡萄糖2.1％、酵母膏0.4％、尿素0.9％、磷酸氢二钾0.05％、磷酸二氢钾0.05％、磷酸镁0.1％、硫酸亚铁0.1％、谷氨酸钠0.075％，余量为水，发酵培养基的PH为7.5。

本实施例中，选用的菌种为P.putida F1(德国菌种微生物菌种保藏中心，编号DSMNo.6899)。

本实施例中，酰胺化合物的生物制备方法，包括菌种驯化阶段和生产精制阶段，菌种驯化阶段包括以下步骤：

(1)向种子培养基中接种菌株，在60mW/cm²的白光照射条件下培养70h，得到发酵种子，将发酵种子接种到发酵培养基中，然后继续在光照条件下培养130h；本步骤中，种子培养基的通气量为1:0.3，发酵培养基的通气量为1:0.5，培养过程中种子培养基和发酵培养基的搅拌速度均为100rpm，罐压均为0.05MPa，温度均为28℃；

(2)步骤(1)的培养结束后，得到原始发酵液，在遮光条件下先培养22h，然后以每8min一次的频率抽取原始发酵液样本，每次抽取完成后向原始发酵液中添加相当于原始发酵液初始重量0.5％的丙烯腈，然后在种子培养基中对每次抽取的原始发酵液样本进行单独培养，种子培养基中最后长出的菌株即为一次驯化菌株；

(3)按照步骤(1)的培养方法对一次驯化菌株进行培养，得到一次驯化发酵液，在60mW/cm²的白光照射条件下继续培养，并以每5h一次的频率抽取一次驯化发酵液样本，抽取完成后向一次驯化发酵液中添加相当于一次驯化发酵液初始重量0.5％的丙烯腈，然后在种子培养基中对每次抽取的一次驯化发酵液样本进行单独培养，种子培养基中最后长出的菌株即为二次驯化菌株；

生产精制阶段包括以下步骤：

(1)按照菌株驯化阶段的步骤(1)中的培养方法对二次驯化菌株进行培养，得到二次驯化发酵液；

(2)将650kg二次驯化发酵液和7500kg纯水混合，并按照800kg/h的速率流加丙烯腈，得到反应液，反应液在温度为25℃、搅拌速度为150rpm的条件下进行水合反应，得到水合液，水合液经过离心和超滤膜过滤后得到酰胺粗品液，酰胺粗品液经过脱盐后得到酰胺水溶液。

本实施例还提供一种生物法制备的丙烯酰胺，以丙烯腈为原料，采用以上方法制备而成。

实施例2

本实施例中用到的酰胺化硅烷偶联剂按照如下方法制备：

将γ-氨丙基三乙氧基硅烷、丙氨酸、缩合剂和四氢呋喃按照1:1.2:0.4:20的重量比混合，在2℃搅拌25h，然后进行减压过滤，弃去沉淀后将剩余的液体在0.03MPa下减压蒸发，得到酰胺化硅烷偶联剂粗品，将酰胺化硅烷偶联剂粗品溶于四氢呋喃中，使用石油醚重结晶后得到酰胺化硅烷偶联剂，制备过程中使用的缩合剂为N,N’-二环己基碳二亚胺。

本实施例中用到的渗透助剂按照如下方法制备：

(1)将乙醇、水、酰胺化硅烷偶联剂按照5:5:2的重量比混合，得到改性液；本步骤中，酰胺化硅烷偶联剂为分子中带有酰胺基团的硅烷偶联剂；

(2)将埃洛石纳米管与改性液按照1:3的重量比混合，静置35min后再进行烘干，将烘干所得物使用去离子水洗涤后再次烘干，得到渗透助剂。

本实施例与实施例1的不同之处在于，使用菌株固化载体代替生产精制阶段步骤(1)中的二次驯化发酵液，菌株固化载体按照如下方法制备：

(1)将650kg二次驯化发酵液在Fr＝3500的条件下离心，然后弃去上清液，得到固含量30mg/mL的浓缩菌液，将硅藻土加入浓缩菌液中，得到前体浆料；本步骤中，硅藻土与浓缩菌液的重量比为1.4:3；

(2)将前体浆料持续搅拌2.5h后，再按照1:1:0.2的重量比将前体浆料、质量浓度3％的海藻酸钠溶液以及渗透助剂混合，得到第一混合液，将第一混合液滴加到质量浓度5％的氯化钙的水溶液中，得到第二混合液；本步骤中，消耗的第一混合液与氯化钙水溶液的重量比为1:5；

(3)在4℃静置第二混合液1.5h后，对第二混合液进行过滤，然后使用去离子水洗涤过滤得到的固体，得到菌株固化载体。

实施例3

本实施例与实施例2的不同之处在于，在制备酰胺化硅烷偶联剂时，使用等摩尔量的β-氰基丙氨酸代替丙氨酸。

实施例4

本实施例与实施例2的不同之处在于，在制备菌株固化载体的步骤(1)中，将葡萄糖和硅藻土共同加入浓缩菌液中，葡萄糖、硅藻土与浓缩菌液的重量比为0.1:1.4:3。

实施例5

本实施例与实施例4的不同之处在于，在制备菌株固化载体的步骤(3)中，使用溶质质量分数为8％的丙烯腈水溶液代替去离子水对过滤第二混合液后得到的固体进行洗涤。

实施例6

本实施例中，填充粉体的平均粒径为5μm。

本实施例与实施例5的不同之处在于，在制备菌株固化载体的步骤(1)中，将填充粉体与浓缩菌液、硅藻土共同混合，填充粉体为腈纶纤维粉；填充粉体、葡萄糖、硅藻土与浓缩菌液的重量比为0.1:0.1:1.4:3。

实施例7

本实施例与实施例6的不同之处在于，填充粉体由腈纶纤维粉和改性活性炭粉按照1:1的重量比混合而成，填充粉体、葡萄糖、硅藻土与浓缩菌液的重量比为0.2:0.1:1.4:3。

本实施例中，改性活性炭粉按照如下方法制备：

(1)在真空度100mbar的条件下使用0.2mol/L的硝酸亚铁溶液浸渍聚丙烯腈基活性炭纤维，浸渍1h后将聚丙烯腈基活性炭纤维取出，再在真空度100mbar的条件下将取出的聚丙烯腈基活性炭纤维浸浸渍在0.5mol/L的半胱氨酸溶液中，浸渍1h后再将聚丙烯腈基活性炭纤维取出；

(2)使用去离子水对取出的聚丙烯腈活性炭纤维进行洗涤，然后再在75℃干燥2h，得到络合物改性纤维，对络合物改性纤维进行研磨后得到改性活性炭粉。

实施例8

本实施例与实施例7的不同之处在于，使用溶质质量分数5％的硝酸亚铁溶液代替去离子水对取出的聚丙烯腈活性炭纤维进行洗涤。

对比例

对比例1

本对比例与实施例1的不同之处在于，在菌种驯化阶段的步骤(2)中，全程施加光照，光照条件与菌种驯化阶段的步骤(3)相同。

对比例2

本对比例与实施例2的不同之处在于，制备菌株固化载体时不添加渗透助剂。

性能检测试验方法

一、游离细胞催化速率的表征

记录实施例1对应的水合液中丙烯酰胺质量分数到达10％、20％、30％的时间(依次记为t1、t2、t3)，然后记录对比例1对应的水合液中丙烯酰胺质量分数到达10％、20％、30％的时间(依次记为T1、T2、T3)，计算得到t1/T1、t2/T2、t3/T3的值依次为0.82、0.84和0.87。

二、菌株固化载体催化性能的表征

记录实施例2-8的水合液中水合液中丙烯酰胺质量分数到达30％的时间(t3)，然后计算各实施例的t3与实施例2的t3之间的比值K(以百分比表示)，结果见表1。

三、菌株固定化载体抗杂菌性能的测试

在无菌条件下，将实施例2—8的菌株固化载体破碎后与发酵液按照1:3的重量比充分混合，并将混合物涂布于培养皿内固态培养基表面，在温度28℃、环境湿度75％的条件下，观察培养皿中开始出现杂菌菌落的时间D(结果四舍五入保留至小时)，结果见表1。

表1

结合实施例1和对比例1可以看出，在实施例1的水合过程中，测得的丙烯酰胺质量分数到达10％、20％、30％的时间均比对比例1测得的结果更短，说明本申请的菌种驯化阶段提高了产酶菌对丙烯腈的耐受性，因此减小了丙烯腈对产酶菌细胞的毒害，使得反应液中的产酶菌细胞具有了更高的催化活性。而对比例1由于光照条件下铁型腈水合酶较难失活，因此丙烯腈难以发生积累，驯化过程中底物耐受驯化作用微弱，不利于提高产酶菌细胞对腈类化合物的耐受性。

结合实施例2和对比例2并结合表1可以看出，实施例2测得的K值小于对比例2，说明当菌株固定化载体内不含渗透助剂时，丙烯腈和丙烯酰胺的渗透效果均相对较差，一方面丙烯酰胺在菌株固化载体中的积累影响了腈水合酶的活性，另一方面丙烯腈也难以及时进入菌株固化载体中，因此影响了丙烯酰胺的的生成速率。

结合实施例2、实施例3并结合表1可以看出，实施例3测得的K值小于实施例2，说明使用β-氰基丙氨酸代替丙氨酸制成的酰胺化硅烷偶联剂能够向埃洛石纳米管中同时接枝腈基和酰胺基，改善了埃洛石纳米管的中空结构对丙烯腈的运输效果，得到了对丙烯腈和丙烯酰胺具有双向运输作用的渗透助剂，提高了丙烯酰胺的生产效率。

结合实施例2、实施例4并结合表1可以看出，实施例4测得的K值小于实施例2，说明实施例4在将葡萄糖和硅藻土共同加入浓缩菌液中后，提高了菌株固定化载体内的细胞密度，增大了丙烯酰胺的生成速率。

结合实施例4、实施例5并结合表1可以看出,实施例5测得的D值大于实施例4，说明丙烯腈水溶液的洗涤增强了菌株固定化载体的抗菌效果，减少了杂菌在菌株固定化载体周围的生长繁殖。

结合实施例5、实施例6并结合表1可以看出，实施例6测得的D值大于实施例5，说明腈纶纤维粉中的腈基能够容易吸附腈类化合物，从而提高了腈类化合物在菌株固化载体中的储量，增强了对杂菌生命活动的抑制效果。

结合实施例6、实施例7并结合表1可以看出，实施例7测得的K值小于实施例6，说明实施例7中，由络合物改性纤维制成的改性活性炭粉能够在菌株固化载体中吸附一氧化氮，从而降低了产酶菌细胞产生的一氧化氮对铁型腈水合酶活性造成的影响，有助于提高产酶菌的催化效率。

结合实施例7、实施例8并结合表1可以看出，实施例8测得的K值小于实施例7，说明聚丙烯腈活性炭纤维释放的亚铁离子维持了铁型腈水合酶合成的进行，增加了产酶菌细胞内铁型腈水合酶的储量，有助于提高丙烯酰胺的生产效率。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种酰胺化合物的生物制备方法，其特征在于，包括菌种驯化阶段和生产精制阶段，所述菌种驯化阶段包括以下步骤：

（1）向种子培养基中接种菌株，在光照条件下培养60-80h，得到发酵种子，将发酵种子接种到发酵培养基中，然后继续在光照条件下培养120-140h；本步骤中，所述菌株产生的胞内酶包括铁型腈水合酶，所述发酵培养基中含有亚铁离子；本步骤中，向种子培养基中接种的菌株为P.putida F1；

（2）步骤（1）的培养结束后，得到原始发酵液，在遮光条件下先培养20-24h，然后以每6-10min一次的频率抽取原始发酵液样本，每次抽取完成后都向原始发酵液中添加水溶性脂肪腈，然后在种子培养基中对抽取的原始发酵液样本进行单独培养，种子培养基中最后长出的菌株即为一次驯化菌株；

（3）按照步骤（1）的培养方法对一次驯化菌株进行培养，得到一次驯化发酵液，在光照条件下以每4-6h一次的频率抽取一次驯化发酵液样本，每次抽取完成后都向所述一次驯化发酵液中添加水溶性脂肪腈，然后在种子培养基中对抽取的一次驯化发酵液样本进行单独培养，种子培养基中最后长出的菌株即为二次驯化菌株；

所述生产精制阶段包括以下步骤：

（1）按照菌株驯化阶段的步骤（1）中的培养方法对二次驯化菌株进行培养，得到二次驯化发酵液；

（2）将二次驯化发酵液、菌株固化载体中的一种与纯水混合并流加丙烯腈，得到反应液，反应液在温度为20-30℃、搅拌速度为50-300rpm的条件下进行水合反应，得到水合液，水合液经过离心和超滤膜过滤后得到酰胺粗品液，酰胺粗品液经过脱盐后得到酰胺水溶液；本步骤中，所述菌株固化载体为储存有二次驯化菌株的载体颗粒，所述菌株固化载体中含有渗透助剂，所述渗透助剂为内壁接枝有酰胺基团的埃洛石纳米管。

2.根据权利要求1所述的酰胺化合物的生物制备方法，其特征在于，所述渗透助剂按照如下方法制备：

（1）将乙醇、水、酰胺化硅烷偶联剂混合，得到改性液；本步骤中，所述酰胺化硅烷偶联剂为分子中带有酰胺基团的硅烷偶联剂；

（2）将埃洛石纳米管与改性液混合，静置30-40min后再进行烘干，将烘干所得物洗涤后再次烘干，得到渗透助剂。

3.根据权利要求2所述的酰胺化合物的生物制备方法，其特征在于，所述酰胺化硅烷偶联剂按照如下方法制备：

将γ-氨丙基三乙氧基硅烷、β-氰基丙氨酸、缩合剂和有机溶剂混合，在0-4℃搅拌24-26h，然后进行减压过滤，弃去沉淀后将剩余的液体减压蒸发，得到酰胺化硅烷偶联剂粗品，将酰胺化硅烷偶联剂粗品溶于四氢呋喃中，使用石油醚重结晶后得到酰胺化硅烷偶联剂。

4.根据权利要求1所述的酰胺化合物的生物制备方法，其特征在于，所述菌株固化载体按照如下方法制备：

（1）将二次驯化发酵液离心后弃去上清液，得到浓缩菌液，将硅藻土加入浓缩菌液中，得到前体浆料；

（2）将前体浆料持续搅拌2-3h后再与海藻酸钠溶液以及渗透助剂混合，得到第一混合液，将第一混合液加入水溶性钙盐的水溶液中，得到第二混合液；

（3）在3-6℃静置第二混合液1-2h后，对第二混合液进行过滤，然后洗涤过滤得到的固体，得到菌株固化载体。

5.根据权利要求4所述的酰胺化合物的生物制备方法，其特征在于，在制备所述菌株固化载体的步骤（1）中，将葡萄糖和硅藻土共同加入浓缩菌液中。

6.根据权利要求5所述的酰胺化合物的生物制备方法，其特征在于，在制备所述菌株固定化载体的步骤（3）中，使用腈类化合物的水溶液对过滤第二混合液后得到的固体进行洗涤，所述腈类化合物与生产精制阶段的步骤（2）中选用的腈类化合物相同。

7.根据权利要求6所述的酰胺化合物的生物制备方法，其特征在于，在制备所述菌株固化载体的步骤（1）中，将填充粉体和硅藻土共同加入浓缩菌液中，所述填充粉体的组分包括腈纶纤维粉，所述腈纶纤维粉由腈纶纤维经过粉碎和研磨后得到。

8.根据权利要求7所述的酰胺化合物的生物制备方法，其特征在于，所述填充粉体的组分还包括改性活性炭粉，所述改性活性炭粉按照如下方法制备：

（1）在负压条件下使用硝酸亚铁溶液浸渍聚丙烯腈基活性炭纤维，浸渍一段时间后将聚丙烯腈基活性炭纤维取出，再将聚丙烯腈基活性炭纤维浸渍在半胱氨酸溶液中，浸渍一段时间后再将聚丙烯腈基活性炭纤维取出；

（2）对取出的聚丙烯腈活性炭纤维进行洗涤和干燥，得到络合物改性纤维，对络合物改性纤维进行研磨后得到改性活性炭粉。

9.根据权利要求8所述的酰胺化合物的生物制备方法，其特征在于，在制备所述改性活性炭粉的步骤（2）中，使用硝酸亚铁溶液对取出的聚丙烯腈活性炭纤维进行洗涤。