CN117660200A - 一种利用菌藻共培养技术处理沼液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及废水处理技术领域，特别是涉及一种利用菌藻共培养技术处理沼液的方法。步骤为：将沼液离心或沉淀除杂，灭菌，得到预处理好的沼液；将真菌菌丝接入无菌的、装有液体培养基A和搅拌装置的反应瓶中，摇瓶培养直至反应瓶内长满菌丝球，用搅拌装置将菌丝球打散，形成菌丝片段，将菌丝片段接入液体培养基B中二次培养，形成菌丝球种子液；将绿藻接种到液体培养基C中，光照培养，得到藻类种子液；将菌丝球种子液和藻类种子液分别接种到预处理好的沼液中培养，实现沼液共培养菌藻，菌藻净化沼液。本发明利用粗毛革孔菌与微藻共培养，实现沼液的深度高效净化和微藻生物质的高附加值生产。

Description

一种利用菌藻共培养技术处理沼液的方法

技术领域

本发明涉及废水处理技术领域，特别是涉及一种利用菌藻共培养技术处理沼液的方法。

背景技术

目前，我国主要通过厌氧发酵的方式去除所产生的有机固体废物。近年来，随着沼气工程的快速发展，我国形成了农村户用沼气、养殖场大中型沼气工程、秸秆集中供气沼气工程等多种模式的建设格局。然而，随之而来也会产生数量庞大的沼液沼渣，沼液富含氮、磷、钾、腐殖酸、活性酶等养分，若没有得到妥善处理，氮、磷以及有机物等会导致诸如水体富营养化、地下水污染等环境问题，因此寻求沼液资源化利用新模式已成必然选择。

微藻与其他微生物的共培养具有强大的应用潜力。迄今为止，微藻共培养所用到的微生物有细菌、真菌以及微藻3种。其中，微藻与酵母菌共培养更为常见，尤其是生产生物量和脂质、辅助微藻絮凝等方面。目前，多数研究共培养体系的稳定性欠佳，共培养体系的应用场景较少，共培养体系的成本需要进一步降低，而且共培养体系的各种条件，如环境因素的改变、培养基成分的调控、培养体系的设置需要进一步优化，需要更深入了解微藻与其他微生物之间的生态关系。

微藻技术作为沼液资源化/无害化处理的一种新兴途径被广泛应用，但由于沼液浊度高，成分复杂，含有重金属、抗生素等有害物质，需要经过复杂的预处理(包括稀释、物理方法或化学方法等)才能用于微藻养殖。然而这些预处理手段会带来不利于环保、成本高、藻水分离困难等一系列问题。在发酵工业生产中产生的真菌菌丝体，具有生物吸附效果，是一种廉价的吸附剂来源。真菌细胞壁上存在的大量功能基团(包括羟基、羧基和磷酸盐基团等)，赋予了真菌强大的吸附功能，同时真菌菌丝体极易成球使其具有一定稳定性。尽管真菌作为吸附剂具有较大潜力，但尚还存在净化速度缓慢、单一真菌处理效果不明显等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，利用粗毛革孔菌与微藻共培养，优化培养条件，实现沼液的深度高效净化和微藻生物质的高附加值生产。

为实现以上目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，包括以下步骤：

沼液的预处理：将沼液进行离心或沉淀除杂，灭菌，得到预处理好的沼液；

菌丝球种子液的准备：将真菌菌丝接入无菌的、装有液体培养基A和搅拌装置的反应瓶中，摇瓶培养直至反应瓶内长满菌丝球，用搅拌装置将菌丝球打散，形成菌丝片段，将所述菌丝片段接入液体培养基B中二次培养，形成菌丝球种子液；

藻类种子液的准备：将绿藻接种到液体培养基C中，光照培养，得到藻类种子液；

沼液共培养菌藻：将所述菌丝球种子液和所述藻类种子液分别接种到所述预处理好的沼液中进行培养，得到沼液共培养菌藻；

处理沼液：将所述沼液共培养菌藻放入沼液中处理沼液，处理后检测净化效果。

采用上述技术方案，对沼液进行预处理后，预处理好的沼液可以作为液态培养基质，接种粗毛革孔菌种子液和小球藻种子液进行共培养，吸收碳氮源等营养成分从而达到沼液净化的效果。

优选的，在沼液的预处理中，所述沼液包括果蔬沼液和养猪沼液中的至少一种，离心或沉淀除杂包括离心，离心的条件为4000-5000rmp离心5-8min；灭菌条件为离心后，将上清液进行稀释后或不稀释，然后115-121℃高压灭菌15-20min，得到预处理好的沼液。

优选的，在菌丝球种子液的准备中，摇瓶培养条件为28-30℃、110-130rpm，形成菌丝球种子液的时间为48-72h，搅拌装置包括磁力搅拌子。

优选的，在藻类种子液的准备中，光照培养的条件为，控制温度为27-30℃，转速为110-130rpm，光照强度为1000-3500lux。

优选的，在沼液共培养菌藻中，所述菌丝球种子液的接种量为5.28-26.4g/L，所述藻类种子液的接种量为3-20％v/v，所述预处理好的沼液的浓度为5-30％v/v。

优选的，在沼液共培养菌藻中，培养温度为28-30℃，摇床转速为110-130rpm，光照强度为1000-3500lux，培养时间为5-8d。

优选的，所述液体培养基A包括液体PDB培养基、液体沙氏培养基中的至少一种；所述液体培养基C包括液体PDB培养基、BG11培养基中的至少一种；

所述液体培养基B包括液体PDB培养基、液体沙氏培养基中的至少一种。

优选的，所述真菌包括粗毛革孔菌，所述绿藻包括小球藻。

优选的，所述粗毛革孔菌的生物保藏号为CCTCC No.M2021731。

采用上述技术方案，本发明将真菌与微藻联合培养，协同共生，一方面利用真菌独特的空间结构吸附微藻达到促进微藻生长和收获的效果；另一方面利用真菌与微藻在呼吸代谢、物质代谢等方面的互利特性达到高效脱氮除磷和去除重金属的效果，最终实现沼液的深度高效净化和低成本高附加值微藻生物质的收获。

本发明的有益效果是：

(1)本发明以沼液作为培养基质，可实现沼液的深度净化和资源化利用，真正实现废弃物资源化利用，环境治理成本降低，生物质能源低成本高效发展；

(2)本发明利用真菌-小球藻共培养方式不仅能够增强环境治理效益，还有利于微藻生物质的积累和藻水分离，从而实现提高利用率和降低成本。

(3)利用特定的菌和藻，选择菌为真菌，藻为微藻中的绿藻，进一步地，本发明真菌选用粗毛革孔菌，粗毛革孔菌的生物保藏号为CCTCC No.M2021731；绿藻选用绿藻纲中的小球藻。现有技术通常只研究粗毛革孔菌的酶活力，对其结构研究甚少，本发明通过粗毛革孔菌和小球藻的共培养，发现小球藻可以吸附在粗毛革孔菌的多孔结构中，粗毛革孔菌还起到诱导作用，“诱导”小球藻的生长，粗毛革孔菌的菌丝周围布满小球藻，菌丝之间相互缠绕，将吸附的小球藻牢牢固定住，调控两者的感应强度，粗毛革孔菌的多孔结构不仅能够分散小球藻，还能为其提供生长“锚点”，进而为其提供生长空间，一定程度上能提高小球藻的生长可控度，配合本发明的条件优化实验能筛选到了更优的共生菌群。

和其他菌藻共培养系统相比，粗毛革孔菌的骨架菌丝支撑作用较强，粗毛革孔菌和小球藻的吸附强度和均匀度较佳，利用粗毛革孔菌的特殊菌丝结构，将小球藻更好的吸附和分散开来，生长速率快，能持续对污水进行治理。

综上，本发明利用粗毛革孔菌与微藻共培养，优化了培养条件，实现了沼液的深度高效净化和微藻生物质的高附加值生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的养猪沼液中实验条件1小球藻干重变化情况折线示意图；

图2为本发明的养猪沼液中实验条件2小球藻干重变化情况折线示意图；

图3为本发明的养猪沼液中实验条件3小球藻干重变化情况折线示意图；

图4为本发明的果蔬沼液中实验条件4小球藻干重变化情况折线示意图；

图5为本发明的果蔬沼液中实验条件5小球藻干重变化情况折线示意图；

图6为本发明的果蔬沼液中实验条件6小球藻干重变化情况折线示意图；

图7为本发明的养猪沼液水质中NH₄ ⁺-N变化情况折线示意图；

图8为本发明的养猪沼液水质中TP变化情况折线示意图；

图9为本发明的养猪沼液水质中COD变化情况折线示意图；

图10为本发明的果蔬沼液水质中NH₄+-N变化情况折线示意图；

图11为本发明的果蔬沼液水质中TP变化情况折线示意图；

图12为本发明的果蔬沼液水质中COD变化情况折线示意图；

图13为本发明的小球藻光学显微镜结构示意图；

图14为本发明的菌-藻共生颗粒光学显微镜结构示意图；

图15为本发明的粗毛革孔菌环境扫描电镜结构示意图；

图16为本发明的菌-藻共生颗粒环境扫描电镜结构示意图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

若如无特别说明，实施例中所使用的材料或仪器均可容易地从商业公司获取，其中：

粗毛革孔菌，分类命名：粗毛革孔菌NCULAC F1(Coriolopsis gallicaNCULACF1)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学内，保藏日期：2021年6月17日，保藏编号：CCTCCNo.M2021731。

小球藻，购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，型号：小球藻FACHB-032。

养猪沼液取自江西正合生态农业有限公司，果蔬沼液取自北京时代桃源环境科技股份有限公司。

实施例1

一种利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，本实施例中在不同培养条件下对小球藻的含量检测，探讨在不同沼液浓度、粗毛革孔菌接种量和小球藻接种量的条件下，小球藻生物质的积累情况，并与只接种了小球藻的实验组比较，得到最优化的沼液共培养菌藻。

包括如下步骤：

S1.沼液的预处理：将养猪沼液和果蔬沼液分别4000rpm离心5min，将上清液121℃高压灭菌20min，得到预处理好的沼液；

S2.菌丝球种子液的准备：从粗毛革孔菌保藏斜面挑取一环菌丝接入无菌的、装有50mL液体PDB培养基和磁力搅拌子的150mL三角瓶中，30℃、120rpm摇瓶培养直至三角瓶内长满菌丝球，采用磁力搅拌将菌丝球打散，形成菌丝片段，按照5％的接种量将菌丝片段接入PDB液体培养基中进行二次培养，48-72h形成大小均匀的菌丝球种子液；

S3.小球藻种子液的准备：将10mL小球藻接种到装有100mL PDB液体培养基中，光照培养，控制温度为28℃，转速为120rpm，光照强度为10000lux，得到小球藻种子液；

S4.沼液共培养菌藻：包括养猪沼液共培养菌藻和果蔬沼液共培养菌藻。

①养猪沼液共培养菌藻：

取上述步骤预处理好的养猪沼液在不同条件下进行条件优化实验：

实验条件1：只改变沼液浓度，沼液浓度为6种(5％、10％、15％、20％、25％、30％)，浓度单位为v/v，装液量为50mL。实验结果参照图1。

实验条件2：只改变小球藻接种量，小球藻接种量为5种(3％、5％、10％、15％、20％)，接种量单位为v/v。实验结果参照图2。

实验条件3：只改变菌丝球种子液接种量，3-4mm粗毛革孔菌菌丝球(约重0.264g)种子液接种量为6种(0颗、10颗、20颗、30颗、40颗、50颗)。实验结果参照图3。

上述实验条件1～3的培养组都置于28℃，10000lux光照环境中，120rpm摇床培养7d，并每天进行悬浮小球藻干重的数据测量，结果分别参照图1～3。

②果蔬沼液共培养菌藻：

取上述步骤预处理好的果蔬沼液在不同条件下进行条件优化实验：

实验条件4：只改变沼液浓度，沼液浓度为5种(5％、10％、15％、20％、25％)，浓度单位为v/v，装液量为50mL。实验结果参照图4。

实验条件5：只改变小球藻接种量，小球藻接种量为5种((v/v)3％、5％、10％、15％、20％)，浓度单位为v/v。实验结果参照图5。

实验条件6：只改变菌丝球种子液接种量，3-4mm粗毛革孔菌菌丝球(每颗约重0.264g)种子液接种量为5种(0颗、10颗、20颗、30颗、40颗)。实验结果参照图6。

上述实验条件4～6的培养组都置于28℃，10000lux光照环境中，120rpm摇床培养7d，并每天进行悬浮小球藻干重的数据测量，结果分别参照图4～6。

结果如图1～6所示①养猪沼液共培养菌藻：最优条件分别为：养猪沼液浓度为15％v/v，小球藻种子液接种量为20％v/v，3-4mm粗毛革孔菌菌丝球种子液接种量为20颗。培养过程中，生物量积累可达到1.2g/L，图3可看出，加入粗毛革孔菌的小球藻生物量能达到单藻组(即粗毛革孔菌接种量0颗时)的1.7倍。

②果蔬沼液共培养菌藻：最优条件分别为：果蔬沼液浓度为20％v/v，小球藻种子液接种量为15％v/v，3-4mm粗毛革孔菌菌丝球种子液接种量为20颗。培养过程中，生物量积累可达到1.0g/L。图6可看出，加入粗毛革孔菌的小球藻生物量能达到单藻组(即粗毛革孔菌接种量0颗时)的1.6倍。

实施例2

在本实施例中，将实施例1的最优化沼液共培养菌藻应用于处理沼液，包括如下步骤：

(1)将果蔬沼液和养猪沼液都置于4℃储存，使用前都经过4000r/min离心5min后121℃灭菌20min的预处理，预处理好的沼液的水质如表1所示。

表1沼液初始成分含量指标

(2)将实施例1的最优化沼液共培养菌藻放入预处理好的沼液中对沼液进行净化，利用水质分析仪对两种沼液(果蔬沼液和养猪沼液)进行关于TP、COD和NH₄ ⁺-N的检测，并与只接种了小球藻的实验组比较，结果如下述表2和表3，图7～12，还对两种沼液的菌和/或藻生物质进行了测试，结果参照下述表4。

表2养猪沼液第7天成分含量指标

表3果蔬沼液第7天成分含量指标

表4菌藻生物质的组成情况

结果参照表2～4，图7～12，结果分析：

(1)参照表2和图7～9，对于养猪沼液：

培养7d，单藻组氨氮去除率为96.57％，单藻组COD去除率为51.92％，真菌-微藻组氨氮去除率为97.80％，真菌-微藻组COD去除率为55.66％。

培养过程中，真菌-微藻组的氨氮/总磷/COD去除率都能高于单藻组的8％±2％，真菌-微藻组的氨氮/总磷/COD去除率趋势也基本一直高于单藻组的。真菌-微藻组去除效果更佳。

(2)参照表3和图10～12，对于果蔬沼液：

培养8d，单藻组总磷去除率为58.21％，氨氮去除率为88.78％，COD去除率为42.22％；真菌-微藻组总磷去除率为76.47％，氨氮去除率为90.84％，COD去除率为50.13％。

培养过程中，真菌-微藻组的氨氮/COD去除率都能高于单藻组的8％±2％，真菌-微藻组的总磷去除率能高于单藻组的20％，真菌-微藻组的氨氮/总磷/COD去除率趋势也基本一直高于单藻组的。真菌-微藻组去除效果更佳。

(3)参照表4，真菌、微藻和菌藻的生物质组成：蛋白质、多糖和油脂是小球藻的最主要的成分，小球藻的应用与其组成成分息息相关，将其开发成各种具有高附加值的产品，被广泛应用于包括食品、医药、饲料等众多领域。分析表6发现真菌、微藻和菌藻无论在何种沼液下产生的生物质，其蛋白质、多糖和油脂三者含量之和均≥54％。虽含量占比有一定差异，但蛋白质含量仍是最高的，说明微生物在净化废水过程中，吸收的碳、氮、磷等元素绝大部分用于自身代谢，并合成相关蛋白质。此外在养猪沼液环境下生长的小球藻多糖含量要高于果蔬沼液下生长的小球藻，而果蔬沼液环境下生长的小球藻油脂含量要显著高于养猪沼液环境中生长的小球藻。这为养猪沼液开发成饲料进一步提供理论基础，而果蔬沼液生物质在生物能源开发方面表现出一定潜力。

参照图13～图16，本发明发现：利用特定的菌和藻，选择菌为真菌，藻为微藻中的绿藻。进一步，本发明真菌选用粗毛革孔菌，粗毛革孔菌的生物保藏号为CCTCCNo.M2021731；绿藻选用绿藻纲中的小球藻。现有技术通常只研究粗毛革孔菌的酶活力，对其结构研究甚少，本发明通过粗毛革孔菌和小球藻的共培养，发现小球藻可以吸附在粗毛革孔菌的多孔结构中，粗毛革孔菌还起到诱导作用，“诱导”小球藻的生长，粗毛革孔菌的菌丝周围布满小球藻，菌丝之间相互缠绕，将吸附的小球藻牢牢固定住，调控两者的感应强度，粗毛革孔菌的多孔结构不仅能够分散小球藻，还能为其提供生长“锚点”，进而为其提供生长空间，一定程度上能提高小球藻的生长可控度，配合本发明的条件优化实验能筛选到了更优的共生菌群。

和其他菌藻共培养系统相比，粗毛革孔菌的骨架菌丝支撑作用较强，粗毛革孔菌和小球藻的吸附强度和均匀度较佳，利用粗毛革孔菌的特殊菌丝结构，将小球藻更好的吸附和分散开来，生长速率快，能持续对污水进行治理。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (9)

1.一种利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.沼液的预处理：将沼液进行离心或沉淀除杂，灭菌，得到预处理好的沼液；

S2.菌丝球种子液的准备：将真菌菌丝接入无菌的、装有液体培养基A和搅拌装置的反应瓶中，摇瓶培养直至反应瓶内长满菌丝球，用搅拌装置将菌丝球打散，形成菌丝片段，将所述菌丝片段接入液体培养基B中二次培养，形成菌丝球种子液；

S3.藻类种子液的准备：将绿藻接种到液体培养基C中，光照培养，得到藻类种子液；

S4.沼液共培养菌藻：将所述菌丝球种子液和所述藻类种子液分别接种到所述预处理好的沼液中进行培养，得到沼液共培养菌藻；

S5.处理沼液：将所述沼液共培养菌藻放入沼液中处理沼液，处理后检测净化效果。

2.根据权利要求1所述的利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，其特征在于，在沼液的预处理中，所述沼液包括果蔬沼液和养猪沼液中的至少一种，离心或沉淀除杂包括离心，离心的条件为4000-5000rmp离心5-8min；灭菌条件为离心后，将上清液进行稀释后或不稀释，然后115-121℃高压灭菌15-20min，得到预处理好的沼液。

3.根据权利要求1所述的利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，其特征在于，在菌丝球种子液的准备中，摇瓶培养条件为28-30℃、110-130rpm，形成菌丝球种子液的时间为48-72h，搅拌装置包括磁力搅拌子。

4.根据权利要求1所述的利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，其特征在于，在藻类种子液的准备中，光照培养的条件为，控制温度为27-30℃，转速为110-130rpm，光照强度为1000-3500lux。

5.根据权利要求1所述的利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，其特征在于，在沼液共培养菌藻中，所述菌丝球种子液的接种量为5.28-26.4g/L，所述藻类种子液的接种量为3-20％v/v，所述预处理好的沼液的浓度为5-30％v/v。

6.根据权利要求1所述的利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，其特征在于，在沼液共培养菌藻中，培养温度为28-30℃，摇床转速为110-130rpm，光照强度为1000-3500lux，培养时间为5-8d。

7.根据权利要求1所述的利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，其特征在于，所述液体培养基A包括液体PDB培养基、液体沙氏培养基中的至少一种；

所述液体培养基B包括液体PDB培养基、液体沙氏培养基中的至少一种；

所述液体培养基C包括液体PDB培养基、BG11培养基中的至少一种。

8.根据权利要求1～7任意一项所述的利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，其特征在于，所述真菌包括粗毛革孔菌，所述绿藻包括小球藻。

9.根据权利要求1～8任意一项所述的利用菌藻共培养技术处理沼液的方法，其特征在于，所述粗毛革孔菌的生物保藏号为CCTCC No.M2021731。