CN106544292B - 一株耐盐硝酸盐还原菌及其应用 - Google Patents

一株耐盐硝酸盐还原菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐盐硝酸盐还原菌及其应用，菌株分类命名为Roseovarius lacus，保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：60066，本发明所述菌株Roseovarius lacus能够在高盐环境下将硝态氮还原为亚硝酸盐，并进一步将亚硝酸盐还原为氮气，可实现硝酸盐的生物转化，并可广泛应用于废水生物脱氮。

Description

一株耐盐硝酸盐还原菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种新菌种及其在环境工程领域的应用，具体涉及一株耐盐硝酸盐还原菌及其应用。
背景技术
氮循环是重要的生物地球化学过程，是微生物和植物最重要的矿质无机营养。氮元素以无机盐形式被吸收，以氧化还原的方式循环。在农业系统中常年使用的含铵氮肥和饲养场的动物的日常排泄物会使土壤或地下水环境中的氮过量，在硝化细菌作用下氨氮转化成硝酸盐。硝酸盐作为稳定的最终氧化态产物，自然条件下在环境中积累，并对人类和动植物物的健康存在潜在的影响。
硝酸盐还原在微生物中是以硝酸盐为氮源加以利用和同化时的第一阶段反应，包括同化硝酸盐还原和异化硝酸还原，是一种氮循环的重要形式。与同化还原比较，硝酸盐异化还原速度较快，不受NH4 +和有机氮的抑制。硝酸盐异化还原过程依终产物不同可分为两类：(1)反硝化：NO3 -被还原成NO2 -、NO、N2O和N2。整个过程中伴有电子传递磷酸化，产能较多，细胞生长量亦较多。反硝化作用的效应是造成N的损失从而降低进行生物脱氮。(2)异化硝酸盐还原：NO3-还原成NO2 -和NH4 +，氨态氮在微生物同化作用下转化为氨基酸。一些微生物能够将NO2 -进一步还原为N2，在减少硝态氮同时减少总氮含量，进而实现生物脱氮。
发明内容
为了弥补现有微生物资源的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一株耐盐硝酸盐还原菌及其应用。
本发明的耐盐硝酸盐还原菌从山西运城盐湖底泥中进行分离、纯化所得，该菌株具有下述性质：耐盐硝酸盐还原菌Roseovarius lacus菌株为革兰氏阴性菌，棒状，菌体大小为0.5-0.7×0.9-3.0μm。在琼脂固体培养基平板上好氧培养2d后，菌落圆形，白色，中央突起，边缘半透明，菌落直径为1-1.5mm。生长温度为10-50℃，在盐浓度范围为0.5-16％条件下能生长与增殖。本发明的耐盐硝酸盐还原菌能够在高盐环境下将硝态氮还原为亚硝酸盐，并进一步还原为氮气。发明人于2016年8月25日将该耐盐硝酸盐还原菌送至位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏中心于2016年8月25日收到该微生物，保藏中心给予本发明耐盐硝酸盐还原菌的分类命名为Roseovariuslacus，保藏号为GDMCC No：60066。
本发明的耐盐硝酸盐还原菌可通过硝酸盐还原过程，实现硝酸盐的生物转化脱氮，可以广泛地应用于高盐废水的生物脱氮及水质净化。用本发明的耐盐硝酸盐还原菌制得的微生物制剂可用于废水生物脱氮。
与现有技术比较，本发明Roseovarius lacus GSS12能够在高盐环境下将硝酸盐还原为氨态氮及亚硝酸盐，氨态氮在微生物同化作用下转化为氨基酸，亚硝酸盐进一步还原为N2。在此生物转化过程中，硝态氮减少的同时可减少总氮含量。同时，Roseovariuslacus GSS12耐盐，不需要通过稀释、反渗透、离子交换、或者电渗透等方法，可直接应用于高盐废水的生物脱氮，具有操作简单和成本低廉等诸多优点。
附图说明
图1为耐盐硝酸盐还原菌Roseovarius lacus GSS12在20000倍下的扫描电镜照片。
图2为耐盐硝酸盐还原菌Roseovarius lacus GSS12的系统发育树。
具体实施方式
实施例1：硝酸盐还原菌Roseovarius lacus GSS12的培养、分离、筛选、鉴定及保存
1.1菌株的培养、分离
本发明的硝酸盐还原菌Roseovarius lacus GSS12是通过对山西运城盐湖底泥富集培养进行分离纯化得到的。
具体分离纯化方法包括以下步骤：
(1)取5.0g山西运城盐湖底泥接种于pH值为7.2的富集分离培养基中，30℃、200rpm/min震荡培养；当培养3d后，以10％的接种量将培养液转接至另一新鲜的富集分离培养基，30℃、200rpm/min震荡培养。如此富集培养四代。
(2)将第四代反应后的培养液采用稀释平板法稀释到10-5-10-6，将稀释后的培养液0.1mL均匀涂布于琼脂固体培养基上，置于30℃培养48h，挑取单菌落进行分离与纯化。
所述富集分离培养基为2216E培养基，培养基组分为：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，柠檬酸铁0.1g，NaCl 19.45g，MgCl2 5.98g，Na2SO4 3.24g，CaCl2 1.8g，KCl 0.55g，Na2CO30.16g，BrCl2 0.08g，SeCl2 0.034g，H3BO3 0.022g，Na2SiO3 0.004g，NaF 0.0024g，NH4NO30.0016g，Na2HPO4 0.008g，水1000mL，pH 7.2。。所述固体琼脂培养基是在上述富集分离培养基中加入琼脂粉20g。
1.2菌体形态特性
采用常规的细菌电子显微镜观察，扫描电镜图如图1所示，该菌株为革兰氏阴性菌，棒状，菌菌体大小为0.5-0.7×0.9-3.0μm。生长温度为10-50℃，在盐浓度范围为0.5-16％条件下能生长与增殖。
1.3菌落形态特性
在2216E固体培养基平板上好氧培养在琼脂固体培养基平板上好氧培养2d后，菌落圆形，白色，中央突起，边缘半透明，菌落直径为1-1.5mm。
1.4生理生化特征
对菌株R.lacus GSS12进行生理生化特征的鉴定，其结果见表1。
表1.菌株生理生化鉴定结果
(表中：+表示为阳性，W表示为弱阳性，-表示为阴性)
由鉴定结果(表1)可知：菌株R.lacus GSS12好氧，能在0.5-16％NaCl的培养液中生长，而最适NaCl为4.5％；生长温度为10-50℃，最适生长温度为37℃；pH值为6.5-7.0，最适pH为7.5；接触酶阳性，氧化酶阳性；具有明胶水解活性及硝酸盐还原活性。菌株R.lacusGSS12能够利用鼠李糖、辛二酸、对羟基苯甲酸、D-蜜二糖、D-葡萄糖、D-甘露醇作为唯一碳源；G+C含量为62.7％。
1.5分子生物学特征
采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇(体积比24：1)抽提，0.6体积异丙醇沉淀的方法提取细菌总DNA。采用16S rRNA通用引物F27和R1492R扩增细菌的16S rRNA，将PCR扩增产物回收后进行测序。测序结果见SEQ ID NO.KX417301。将得到的碱基序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(Blast search)，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。R.lacus GSS12的系统发育树结果见图2。
根据比对结果发现，该菌株与芽孢杆菌R.pacificus 81-2T和R.halotoleransHJ50T的16S rRNA序列具较高同源性，相似度为97.9，97.5and 96.7％；分子杂交结果显示，该菌株与R.pacificus 81-2T和R.halotolerans HJ50T DNA-DNA相关性为36％和29％。
综上所述，16S rRNA同源序列比对可以确定本发明菌株R.lacus GSS12属于Roseovarius属。但由于本发明菌株R.lacus GSS12具有许多与现有Roseovarius属菌显著不同的表型特征，加上DNA-DNA杂交和分子生物学分析结果表明本发明菌株不属于芽孢杆菌属的已有任何种。因此，根据现有数据，可以判定本发明菌株为Roseovarius属的一个新种。命名为Roseovarius lacus GSS12，简写为R.lacus GSS12，于2016年8月25日在广东省微生物菌种保藏中心保藏，编号为：GDMCC No：60066。
实施例2：微生物菌剂的制备
(1)摇瓶培养：从R.lacus GSS12斜面上挑取菌苔一环接入装有100mL 2216E液体培养基的锥形瓶中，37℃、200rpm/min摇床震荡培养24h。所述的述的2216E液体培养基配方为：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，柠檬酸铁0.1g，NaCl 19.45g，MgCl2 5.98g，Na2SO43.24g，CaCl2 1.8g，KCl 0.55g，Na2CO3 0.16g，BrCl2 0.08g，SeCl2 0.034g，H3BO3 0.022g，Na2SiO30.004g，NaF 0.0024g，NH4NO3 0.0016g，Na2HPO4 0.008g，水1000mL，pH 7.2。
(2)种子罐发酵：将上述培养好的R.lacus GSS12发酵液接入10L发酵罐中，37℃、200rpm/min发酵培养36h；所用发酵培养基配方为上述液体培养基。
(3)发酵罐发酵：将上述培养好的R.lacus GSS12发酵液接入发酵罐中，37℃、200rpm/min发酵培养48h；所用发酵培养基配方为上述液体培养基。
(4)菌剂制备：将上述发酵液加入固体辅料中，固体辅料与发酵液的质量比为1.5∶1，搅拌均匀，28℃烘干，粉碎，经40目过筛，包装装袋。固体辅料含有活性碳60％，硅藻土40％。制得的脱氮微生物菌剂成品经活菌计数，总菌数达到5亿/克以上。
实施例3：微生物菌剂的制备
(1)摇瓶培养：从R.lacus GSS12斜面上挑取菌苔一环接入装有LB液体培养基的锥形瓶中，50℃、240rpm/min摇床震荡培养24h。所述的述的2216E液体培养基配方为：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，柠檬酸铁0.1g，NaCl 19.45g，MgCl2 5.98g，Na2SO4 3.24g，CaCl2 1.8g，KCl 0.55g，Na2CO3 0.16g，BrCl2 0.08g，SeCl2 0.034g，H3BO3 0.022g，Na2SiO3 0.004g，NaF0.0024g，NH4NO3 0.0016g，Na2HPO4 0.008g，水1000mL，pH 7.2。
(2)种子罐发酵：将上述培养好的R.lacus GSS12发酵液接入10L发酵罐中，30℃、200rpm/min发酵培养24h；所用发酵培养基配方为上述液体培养基。
(3)发酵罐发酵：将上述培养好的R.lacus GSS12发酵液接入发酵罐中，30℃、200rpm/min发酵培养48h；所用发酵培养基配方为上述液体培养基。
(4)菌剂制备：将上述发酵液加入固体辅料中，固体辅料与发酵液的质量比为2∶1，搅拌均匀，28℃烘干，粉碎，经40目过筛，包装装袋。固体辅料含有活性碳50％，硅藻土50％。制得的微生物菌剂成品经活菌计数，总菌数达到5亿/克以上。
实施例4：微生物R.lacus GSS12硝酸盐还原效果
从R.lacus GSS12斜面上挑取菌苔一环接入装有LB液体培养基的锥形瓶中，37℃、240rpm/min摇床震荡培养24h，制得的发酵液即为种子液。所述的述的2216E液体培养基配方为：酵母粉1.0g，蛋白胨5.0g，柠檬酸铁0.1g，NaCl 19.45g，MgCl2 5.98g，Na2SO4 3.24g，CaCl2 1.8g，KCl 0.55g，Na2CO3 0.16g，BrCl2 0.08g，SeCl2 0.034g，H3BO3 0.022g，Na2SiO30.004g，NaF 0.0024g，NH4NO3 0.0016g，Na2HPO4 0.008g，水1000mL，pH 7.2。
在Giltay基础培养中分别加入葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钾钠等不同碳源，调节培养液中C/N比为5:1。所用Giltay基础培养液组分为：KNO3 1.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O，FeCl3·2H2O 0.1g，CaCl2·6H2O 0.1g，蒸馏水1L。将上述培养液分装入500mL锥形瓶中，每瓶200mL，接种R.lacus GSS12接种液2mL，37℃、200rpm/min摇床中序批式培养72h，检测培养液中硝态氮氮、亚硝态氮和氨态氮及氮气的含量。产氨率＝(NH4-N含量/NO3-N初浓度)/NO3-N初浓度×100％。结果显示，在Giltay基础液中接种R.lacus GSS1272h后，培养液中产氨率分别为59％、62％、35％、42％，同时释放部分氮气，说明R.lacus GSS12能够利用葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸钠、酒石酸钾钠为唯一碳源，将硝酸盐还原为氨态氮及亚硝态氮,并将亚硝态氮进一步还原为氮气。
实施例5：微生物菌剂在城市污水处理中的生物脱氮效果
选用经活性污泥厌氧与爆气处理后的城市生活污水，处理前COD为156mg/L，氨氮为55mg/L，硝态氮为500mg/L，总氮585mg/L。试验使用二级沉降池的有效容积为50L，温度25℃，投入实施例3制备的微生物菌剂3.0g，连续运行6h，测定COD、氨氮、总氮浓度。以不添加微生物制剂的处理作为对照。结果表明，添加实施例4的微生物菌剂后，COD平均去除率为21.5％，硝态氮去除率为70.8％，总氮去除率为50％，而对照处理COD平均去除率仅为3.8％，硝态氮去除率为12.5％，总氮去除率为13.6％。结果表明微生物制剂R.lacus GSS12生物脱氮效果显著。
实施例6：微生物菌剂在污水处理中的水质净化效果
在城市生活污水工艺中，按1％比例投加实施例4制备的微生物菌剂，经序批式活性污泥法处理后，测定水中氨态氮及硝态氮含量。以常规污水处理工艺、不添加微生物制剂作为对照。结果表明，在处理后，添加微生物制剂R.lacus GSS12后，城市生活污水中COD平均去除率为95.3％，硝态氮去除率为85.7％，总氮去除率58.9％。而对照COD去除率为78％，总氮去除率为69.7％，说明微生物制剂R.lacus GSS12能够促进污水中COD及总氮去除。

Claims (4)

1.一种耐盐硝酸盐还原菌Roseovarius lacus GSS12在制备废水生物脱氮微生物制剂中的应用，所述耐盐硝酸盐还原菌保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60066。
2.权利要求1所述的耐盐硝酸盐还原菌Roseovarius lacus GSS12在制备硝酸盐还原微生物制剂中的应用。
3.一种废水生物脱氮的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的耐盐硝酸盐还原菌Roseovarius lacus GSS12接种到废水中的步骤。
4.一种废水生物脱氮的方法，其特征在于，包括将含有权利要求1所述的耐盐硝酸盐还原菌Roseovarius lacus GSS12的微生物制剂投入废水中的步骤。
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