CN1038770C - 霉病霉素的生产方法 - Google Patents

Abstract

霉病霉素，在农业和园艺中用作抗菌剂，杀菌剂或杀螨剂，通过在培养基中培养属于链轮丝菌属(Streptovertioillium)，并且对丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸有抗性的产霉病霉素菌株，可以工业上便利地生产霉病霉素。上述培养基最好至少含有3毫摩尔的N-甲基化合物或/和含有5-羟甲基胞嘧啶，以促使所说菌株的合成积累霉病霉素，并从所得培养液中回收霉病霉素。

Description

霉病霉素的生产方法

本发明与生产霉病霉素的发酵方法有关。

霉病霉素是一具有结构式〔I〕的化合物；通过培养属于链轮丝菌

属产霉病霉素的菌株，它作为抗菌素首次被发现并命名为“抗菌素B-98891”。我们把注意力集中在它的活性上，特别是它作为多种植物的一种预防和治疗白粉病药或作为杀螨剂的作用。因此，希望提高霉病霉素的产量，包括在至少含3毫摩尔(毫摩尔/升)N-甲基化合物培养基上或含5-羟甲基胞嘧啶的培养基上培养产霉病霉素的菌株的发酵方法。〔U·S·P·4007267；U·S·P·4334022；U·S·P·4296107；英国专利号1507193；“抗菌素杂志”31卷，6期511-518页，519-524页(1978)；“杀虫剂科学杂志”4卷3期，349-353页(1979)；“四面体化学”37卷，1317-1327页(1981)；等等〕。

然而，就目前所知的生产霉病霉素的发酵方法，所采用的产霉病霉素菌株生产霉病霉素的能力是有限的，因而通过改进培养基中含有的物质来提高霉病霉素的产率也是限制的，因此这些方法已不能满足工业化大规模地生产霉病霉素的需要。

本项发明的发明者经过对提高菌株产霉病霉素能力勤奋研究，结果发现；当把产霉病霉素的菌株对具有结构式 〔II〕的丝氨酸氧肟酸盐或对具有结构式〔III〕的刀豆氨酸有抗性时，即便使用普通培养基，菌株生产霉病霉素的能力也得到意想不到地提高，从而使霉病霉素的生产效率变得更高。根据这一发现，完成了本项发明。

更准确地说，本发明是关于：

(1)一种生产霉病霉素的方法，其特征在于通过在培养基上培养属于链轮丝菌属，产霉病霉素的菌株，由于此菌株抗培养基中的丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸，从而引起所说菌株合成和积累霉病霉素，并从最后培养物液中回收霉病霉素。

(2)上述申请专利(1)所述的生产霉病霉素的方法，其特征在于培养基中至少含有3毫摩尔的N-甲基化合物。

(3)申请专利(1)或(2)所述的生产霉病霉素的方法，其特征在于培养基中含有5-羟甲基胞嘧啶。

(4)裂生链轮丝菌(Streptoverticillium rimofaciens)能抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸并能产生霉病霉素。

在本发明制备霉病霉素的方法中，应用的是属于链轮丝菌属，有抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸特性的产霉病霉素的菌株(这里或以后称“本发明菌株”)。举例来说，本发明菌株有如下特性：〔1〕形态学特性：

在各种不同的常规培养基上，本发明菌株形成气生菌丝，虽轮状具二级轮枝。在合成琼脂培养基如，葡萄糖、天冬酰胺琼脂上虽然很少但也能发现孢子丝环和钩状孢子丝。孢子形状为卵形到园筒形，大小为0.6～0.8×0.7～1.3微米。一般孢子产生呈链状，含3到16个，每个孢子表面光滑或瘤状。在常规培养基上，没有观察到孢子囊、鞭毛、菌核等等。〔2〕培养特性：

本发明菌株的培养特性如表1所示。如无特殊说明，描述的是在28℃下经21天培养后的结果。表中用括号()表明的颜色名称是根据《色谱手册》，第4版，Container Corporation ofAmerica。〔3〕生理特性：

(1)生长温度范围

在15～38℃范围内生长，更好地生长和产生气生菌丝的温度为28～36℃。

(2)明胶液化(24℃培养28天)

不液化。

(3)淀粉水解：阳性

(4)硝酸盐还原：在细菌硝酸盐培养液(ISP-No.8)和查氏培养液(Czapek′s solution)中阴性。

表1

(5)脱脂乳凝固反应：阳性

蛋白胨化：阳性

(6)黑色素的产生：

阳性(蛋白胨、酵母液、铁离子琼脂培养基)

阴性(酪氨酸琼脂培养基)

(7)碳源的利用(在Pridbam.Gottlieb琼脂培养基上)

i)利用相当好的碳源：

肌醇、D-半乳糖、D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露糖、

淀粉、甘油、醋酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠。

ii)一般利用的碳源：

D-果糖、海藻糖。

iii)不利用的碳源：

赤藓醇、核糖醇、D-山梨醇、D-甘露醇、半乳糖醇、

D-木糖、L-阿拉伯糖、L-山梨糖、鼠李糖、蔗糖、

乳糖、蜜二糖、棉子糖、水杨苷、七叶苷、菊粉。

(8)在蛋白质培养基上的色素生成：弱

(9)内汤-琼脂培养基上的裂化：无

(10)对丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸的抗性：

抑制菌丝生长的最低浓度；抗丝氨酸氧肟酸盐至少是40微克/毫升，抗刀豆氨酸至少是100微克/毫升。〔4〕其它特性：

按照“发酵工程杂志”63卷，1期，17-21页(1985)上描述的酶学方法，产生5-羟甲基胞嘧啶的比活力为0.18毫微摩尔/分/毫克蛋白或更大。

具有上述特性的这个菌株是裂生链轮丝菌，例如裂生链轮丝菌C₃ ^R-182(抗丝氨酸氧肟酸盐)，裂生链轮丝菌CV^R-48(抗丝氨酸氧肟酸盐和刀豆氨酸)和裂生链轮丝菌CV^R-16(抗刀豆氨酸)。上述裂生链轮丝菌已分别于1985年6月28日保藏于大阪发酵研究所(IFO)，于1985年7月8日保藏于工业科学和技术局的发酵研究所(FRI)，于1986年8月6日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号分别为，裂生链轮丝菌C₃ ^R-182：IFO-1448，FERM P-8334，CCTCC 86-101；裂生链轮丝菌CV^R-48：IFO-14449，FERM P-8333，CCTCC 86-102；裂生链轮丝菌CV^R-16：IFO-14527，FERM P-8874，CCTCC 86-103；此外裂生链轮丝菌E5-24-5也于1986年8月6日在中国典型培养保藏中心保藏，保藏号为CCTCC 86-100。

在生产霉病霉素这个方法的菌株培养中，可利用通常微生物可吸收的碳源，易消化的氮源和无机盐等等组成的培养基。如需要时，培养基中可加入微量营养物，生长促进剂，前体和其它少量就能起作用的物质。通常可同化的碳源包括，如淀粉、糊精、葡萄糖、麦芽糖。蔗糖、糖蜜、玉米浆、谷子凝胶，以及有机酸如醋酸、琥珀酸等等或脂肪和油或多羟基醇如甘油，这些物质可单独用或联合应用。易消化的氮源包括无机硝酸盐如各种铵盐、硝酸盐和尿素以及有机的天然物质如酵母浸出液，酪素，肉汁、棉籽粉、玉米浆、豆粉等等，它们既可单用也可以联合使用。当需要时培养基还包含有无机盐、铁、镁、锰、钴、铜、钠、钾、钙、锌等金属盐。此外如果有必要用微生物的话，则培养基中应含有适量的特殊营养物，如氨基酸、维生素、核酸碱基等等物质。只要能达到本发明的目的这些外加物的浓度没有特别限定，可从常规发酵过程一般使用的范围中适当选出合适浓度。

为了获得霉病霉素较高的产量，最好使N-甲基化合物组合在培养基中。这种N-甲基化合物可包括在其分子中具有不少于1个可被1个到4个甲基取代氮原子。较好是在分子中有1个被1个或多个甲基取代的那些化合物，特别是具有三甲基氨基基团(其中氮原子被3个甲基取代，即

的季铵盐最好。另外，在培养基中具有一个基团能转化成N-CH₃基团的化合物，如，N，N-亚甲双丙烯酰胺，也能用作为所说的N-甲基化合物。N-甲基化合物通常分子量在50-1000范围内，最好在90-130范围内。 N-甲基化合物可以是水溶性或水不溶的，但易水溶性的N-甲基化合物应用较为有利。这种N-甲基化合物的实例有；N-甲基酸酰胺，N-甲基氨基化合物、N-甲基胺、N-甲基铵化合物、N，N-亚甲双丙烯酰胺等等。N-甲基酸酰胺类有，例如：N，N-二甲基乙酰胺，N-甲基-丙烯酰胺等等，N-甲基氨基化合物有，例如，N-甲基尿素，1，1，3，3-四甲基尿素，2-二甲基氨基乙醇等等；N-甲基胺有例如，三甲基胺，二甲基胺等等；N-甲基铵化合物有，例如，卵磷脂，胆碱，甜菜碱，四甲基铵，等等，以上物质都能有利地使用。使用N-甲基铵化合物，特别是胆碱、甜菜碱或四甲基铵可获得满意的结果。这些N-甲基化合物既可单独使用也可以两种、数种混合使用。在上述范围内，为了使培养基中含有多于3毫摩尔的N-甲基化合物，本发明也包括一种方法，即：在培养基中加入大量的含N-甲基化合物的物质，如：含有甜菜碱的甜菜糖蜜，含有卵磷脂的豆浆或含有胆碱和卵磷脂的鸡蛋等等。培养基中N-甲基化合物的浓度在不抑制所用微生物的生长范围内进行择优选择，而且也可调整到大于3毫摩尔。合适的浓度为4毫摩尔到200毫摩尔，最适浓度为7到50毫摩尔，在超过200毫摩尔的更高浓度下，加入N-甲基化合物所获得的效果与低于200毫摩尔浓度下N-甲基化合物获得的效果比较，趋向不明显。含有N-甲基化合物的天然物质用量的选择，要使其N-甲基化合物浓度达到上述要求，但这种浓度需要用比常规培养所用的天然物质量要大，由此微生物的生长相反受到天然物质中N-甲基化合物以外成份的影响，从而阻止霉病霉素的产生。这时，最好把N-甲基化合物与天然物质联合使用。考虑到操作方便和有效性，培养基中加入N-甲基化合物的时间。最好是在接种微生物到培养基中以前，但N-甲基化合物也可以在培养过程中的适当时间加入。

此外，在本发明的方法中，为了获得更多的霉病霉素，培养基中可加入5-羟甲基胞嘧啶或一种能在培养基中生成5-羟甲基胞嘧啶的物质。5-羟甲基胞嘧啶或在培养基中能生成5-羟甲基胞嘧啶物质的浓度，以5-羟甲基胞嘧啶表示的适量为0.01～1.0％(重量/体积)，最适为0.03～0.5％(重量/体积)。培养基中加入这些物质的时间最好在有效的培养开始以前，但也可在培养过程中的适当时期加入。

虽然表面培养是可行的，但通气的深层培养通常更适用。在进行通气深层培养时，培养基的PH适宜在微酸到微碱的范围内，培养温度最好保持在15-40℃，特别在24-34℃。这些培养条件当然可以按所应用的微生物的特殊菌株，外部条件和内部因素进行控制和选择，以得到满意的结果。不管怎样，一般在开始培养后4～14天能获得含有大量霉病霉素的培养液。为了从培养液中回收霉病霉素，最好使用从培养液中分离微生物代谢物的常规方法。例如，由于霉病霉素是一种水溶性碱，其大部分存在于培养液的液体部分，通过过滤或离心可先把细胞从培养液中除去。然后把这样得到的液体部分加入适当的吸附剂如活性炭、吸附树脂、阳离子交换树脂、活性氧化铝或硅胶，或者用分子筛，使活性部分吸附在其上面的。然后，用水溶性的有机溶剂水溶液如丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等等，以及酸性、碱性缓冲液作成水溶液和无机或有机盐的水溶液作为溶剂去洗脱活性部分。这些分离步骤也可以适当地配合进行，活性部分可浓缩并粉碎以得到单体或盐形式的霉病霉素。

在本发明生产霉病霉素的方法中所使用的属于链轮丝菌属抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸产霉病霉素的菌株，可通过把属于链轮丝菌属的产霉病霉素菌株诱导突变成抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸菌株而获得。进行诱导突变的属于链轮丝菌属产霉病霉素的菌株，常用的是裂生链轮丝菌E5-24-5(这里或以后都称为“亲本菌株”)或裂生链轮丝菌IFO 13529，即菌株B-98891。E5-24-5菌株已于1981年6月12日保藏于IFO，于1981年6月24日保藏于FRI，于1986年8月6日保藏于CCTCC，保藏号分别为IFO 14125，FERM P-6052CCTCC 86-100。为了引起菌株突变产生抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸的菌株，应用的突变方法例如，应用属于链轮丝菌属产霉病霉素菌株的孢子或菌丝进行紫外线照射，或应用属于链轮丝菌属产霉病霉素的菌株与具有结构式为

的N-甲基病霉素的菌株生长在含有其结构式为

〔V〕的D-4-氨基-3-异噁唑酮(俗名“环丝氨酸”)的培养基上的方法，或者把这些方法适当地结合使用。

例如，当采取用属于链轮丝菌属产霉病霉素菌株的孢子或菌丝用紫外线照射的方法进行突变时，亲本菌株的孢子或菌丝用10～100瓦，最好是30～60瓦的紫外灯进行紫外线照射。紫外线波长通常是130～350毫微米，最好为190～290毫微米。照射时间通常30秒到5分钟，最好为60秒到90秒。应当把亲本菌株的孢子和菌丝悬浮在无菌水中后再进行照射。例如，将亲本菌株的孢子悬浮在无菌水中，置30瓦紫外灯下方30厘米处，搅拌下照射90秒

(波长2537A)以引起突变。

在采用把属于链轮丝菌属产霉病霉素的菌株与N-甲基-N′-硝基-N一亚硝基胍(IV)接触的方法进行突变时，最好把菌株的孢子或单个细胞与化合物〔IV〕接触。接触可用任何一种方式进行，通常是用相互混合。进行接触时的温度范围从0℃到50℃，最好为10℃到40℃，所需时间范围常从10秒到3小时，最好是10分钟到2小时。产霉病霉素菌株的孢子或单细胞可分散在适当的分散培养基中，此培养基由，1到9％(重量/体积)蔗糖、1到6％(重量/体积)谷氨酸钠、0.001～0.1％(重量/体积)吐温-80(由Kao Atlas Co.，Ltd.生产)和无菌水组成，培养基事先在110～130℃高压蒸汽灭菌10～30分钟。化合物〔IV〕可溶解在缓冲液如三氨基甲烷-盐酸缓冲液(PH7.5)中后使用，其浓度为1.0到5000微克/毫升，最好为100到200微克/毫升。另外，在采用让属于链轮丝菌属产霉病霉素菌株生长在含有环状丝氨酸〔V〕的培养基上的方法进行突变时，最好把产霉病霉素菌株培养在合环状丝氨酸〔V〕量为10～100微克/毫升的培养基上，最适为20～60微克/毫升。其它的培养条件可从前述的与培养抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸产霉病霉素菌株有关的培养条件中适当地选择。

从用上述引起突变的方法获得的突变体中选择抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸产霉病霉素的菌株。也可按照在放线菌领域中通常使用的筛选力法进行选择。例如把孢子悬浮液、孢子混合液或经突变处理获得的生长菌株涂布或移种到含有丝氨酸氧肟酸盐(40到200微克/毫升，最好为60到120微克/毫升)或刀豆氨酸(100到300微克/毫升，最好为110到240微克/毫升)的量足以阻止亲本菌株生长的培养基上，然后，分离生长在培养基上的菌株。或者，把悬浮液，混合液或经突变处理获得的生长菌株涂布在含有5-羟甲基胞嘧啶生物合成的抑制剂一氨基蝶呤(2到50微克/毫升，最好为5到20微克/毫升)的培养基上，然后让菌株生长，接着切下一块琼脂，用常规方法测定这块琼脂的抗菌活力(测定菌：红色酵母)，筛选那些表现抗菌活力强的菌株，从而确定筛选出有丝氨酸氧肟酸盐抗性优良的产霉病霉素菌株。通过重复上述获得导产霉病霉素菌株抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸盐方法，抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸产霉病霉素菌株的性能得到进一步提高。经上述的产霉病霉素菌株对丝氨酸氧肟酸盐或对刀豆氨酸的抗性突变，产霉病霉素菌株也能同时获得抗丝氨酸氧肟酸盐和刀豆氨酸的抗性。这些菌株也包括在本发明属于链轮丝菌属抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸菌株的类型中。

通过上述本发明的方法，制得的霉病霉素能安全地在植物上用作防止和治疗白粉病制剂的有效成份，或作为杀菌或杀螨剂的有效成份。(U·S·P·4007267，英国专利号1507193)

本发明中属于链轮丝菌属，抗丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸的产霉病霉素菌株，除了具有对丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸高抗性外，在5-羟甲基胞嘧啶生物合成中有高的活力。

试验实例1

在由2％蔗糖，0.5％可溶性淀粉，0.12％硝酸铵，0.25％磷酸二氢钾、0.005％硫酸镁、0.0025％酪蛋白氨基酸、0.0025％酵母浸出液和2.0％琼脂粉(％指重量/体积)组成的琼脂培养基(PH7.0)中加入各种不同浓度的丝氨酸氧肟酸盐和刀豆氨酸。这样配制成的培养基经120℃高压蒸汽灭菌15分钟后，倒入培养皿中，每皿20毫升。冷却后，每皿培养基上涂布如下试验菌株的孢子。培养皿放在28℃下培养10天，确定了MIC即最小抑制生长浓度如表2所示。试验菌株：

(1)裂生链轮丝菌E5-24-5

(2)裂生链轮丝菌C₃ ^R-182

(3)裂生链轮丝菌CV^R-48

(4)裂生链轮丝菌CV^R-16

                    表2菌株        最小抑制生长浓度(微克/毫升)

    丝氨酸氧肟酸盐            刀豆氨酸(1)        40                        100(2)        70                        120(3)        100                       200(4)        40                        400试验实例2

配制由2.5％葡萄糖、2.0％玉米浆、1.0％棉籽粉(商品名：Proflo，Trader Oil Mill Co.)、0.3％硫酸铵、0.05％硫酸镁和0.3％碳酸钙(％指重量/体积)组成的培养基，向其中滴加20％(重量/体积)苛性钠水溶液以调节PH为7.0°这样制得的培养基倒入200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中，每瓶2.5毫升，接着在120℃高压蒸汽灭菌15分钟。这些培养基上分别接种裂生链轮丝菌E5-24-5，C₃ ^R-182、CV^R-48和CV^R-16菌种的孢子，在28℃200rpm下旋摇培养20小时以得到种子培养液。然后配制由11％葡萄糖、3.0％山梨醇、3.0％酪素、0.5％玉米浆、2.0％Preflo、0.5％硫酸铵、0.5％硝酸铵、0.1％氯化胆碱、0.005％硫酸镁、0.005％硫酸铁和0.003％硫酸铜(％指重量/体积)组成的培养基，向其中滴加20％(重量/体积)苛性钠水溶液以调节PH为7.0。培养基中加入碳酸钙使其浓度达1％(重量/体积)接着充分混合。这样制得的培养基倒入200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中，每瓶25毫升，随之在120℃高压蒸汽灭菌20分钟。每瓶培养基(25毫升)中加入上述的种子培养液2毫升，在28℃以200转摇动培养3～5天。然后，按照(1985)“发酵工业月刊”63卷17页所述的步骤制备无细胞提取液，进行酶反应和5-羟甲基胞嘧啶的测定，获得结果如表3所示的产5-羟甲基胞嘧啶的活力。

               表3菌株       产5-羟甲基胞嘧啶的活力*

      (毫微摩尔/分/毫克蛋白)E5-24-5       0.17C₃ ^R-182     0.24CV^R-48       0.27CV^R-16       0.19

^*3天，4天，5天培养后的平均值。实例1

(1)在裂生链轮丝菌E5-24-5(FERM P-6052，IFO-14125)的斜面培养基上前面收集孢子和气生菌丝，并放在由3％蔗糖、2％谷氨酸钠和0.01％吐温-80组成的分散培养基上(经120℃高压蒸汽灭菌15分钟)。混合液用陶瓷匀浆器充分研磨，研磨液用Toyo 101号滤纸(由Toyo FilterPaper Co.，Ltd.生产)过滤得到滤液为孢子和气生菌丝碎片的悬浮液(25毫升)。

(2)在由(1)制得的悬浮液中加入等体积的溶解在三氨基甲烷-盐酸缓冲液(0.1M，PH7.5)中的N-甲基N′-硝基-N-亚硝基胍，使其浓度达2毫克/毫升。混合液在28℃摇动90分钟。把这样得到的混合液涂布在含有浓度为30微克/毫升环状丝氨酸的琼脂平板培养基(PH7.0)上，在28℃静止培养14天，该平板培养基的其他成份为：2％蔗糖、0.5％可溶性淀粉、0.2％硝酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.05％氯化钾、0.05％硫酸镁、0.0015％硫酸铁和2.0％琼脂粉(％指重量/体积)。在长出的菌落中，分离出100个形态正常具有气生菌丝的菌落。这些菌落分别用无菌玻璃棒研磨，每个被研磨菌落中加入10毫升无菌水，然后用Toyo 101号滤纸过滤得滤液。把滤液涂布在不合环状丝氨酸的琼脂平板培养基上，28℃静止培养10天。把获得的菌落分别转接到琼脂斜面上(培养基成份与上述的琼脂平板培养基成份相同)。在28℃静止培养10天。从斜面培养基表面刮面收集气生菌丝和孢子，接着通过上述(1)中所述的悬浮、研磨、用滤纸过滤等步骤，制得100个悬浮液样品。

(3)取第(2涉制备的100个悬浮液样品(活菌量：约1×10⁵)分别涂布在100个对应编号的各含有10微克/毫升氨基蝶呤的琼脂平板培养基的整个表面上，28℃下静止培养10天。利用钻孔器在琼脂平板培养基上打出一个圆柱状块(直径6毫米，高约4毫米)，并转移到测定其抗菌活力的培养基上(测试菌：红色酵母，肉汁琼脂培养基，PH7.0)。把这样处理过的培养基在30℃放置过夜。其中有5个悬浮液样品显示较大的(直径：14毫米或更大)抑菌圈(抑制生长圈)。

 (4)第(2)步得到的100个悬浮液样品分别用无菌水稀释使每个样品含活菌数为1×10⁵/毫升。每个样品取20微升稀释后的悬浮液涂布在各含有40微克/毫升丝氨酸氧肟酸盐的相应编号琼脂平板培养基上，28℃下静止培养14天。在100个培养基中，观察到有在7个培养基上的生长，其中有5个样品都显示如上第(3)涉的那样较大抑菌圈。在5个样品中有一个突变菌株形成如上第(3)步所述的最大抑菌圈，分离后标为裂生链轮丝菌C₁ ^R-18。实例2

用实例1中获得的C₁ ^R-18菌株代替裂生链轮丝菌E5-24-5，按实例1的第(1)和(2)步的相同方法制备这菌株的150个悬浮液样品。按照实例1中第(3)和(4)步方法，从这些样品中分离出裂生链轮丝菌C₃ ^R-125〔只要在第(4)步使用含浓度为50微克/毫升的丝氨酸氧肟酸盐的琼脂平板培养基〕实例3

用实例2制得的C₃ ^R-125菌株代替裂生链轮丝菌E5-24-5，按实例1中的第(1)和(2)步相同方法制备这菌株200个悬浮液样品。按实例1中的第(3)和(4)涉方法从这些样品中分离出裂生链轮丝菌C₃ ^R-182(FERM P-8334，IFO-14448)〔只要在第(4)步使用含浓度为60微克/毫升丝氨酸氧肟酸盐的琼脂平板培养基〕。实例4

用实例3获得的C₃ ^R-182菌株代替裂生链轮丝菌E5-24-5，按实例1中的第(1)和(2)步相同方法从这菌株制备300个悬浮液样品。按实例1中的第(3)和(4)步方法从这些样品中分离出裂生链轮丝菌C₄ ^R-257〔只要在第(4)步使用含浓度为80微克/毫升丝氨酸氧肟酸盐的琼脂平板培养基〕。实例5

用实例4获得的C₄ ^R-257菌株代替裂生链轮丝菌E5-24-5，按实例1中的第(1)和(2)步相同方法从这菌株制备100个悬浮液样品。把每个悬浮液样品涂布在含有浓度为190微克/毫升刀豆氨酸的琼脂平板培养基上。100个样品在28℃下静止培养14天。把只一个样品中出现的菌落移接到由2.0％蔗糖，0.5％可溶性淀粉、0.12％硝酸铵、0.25％磷酸二氢钾、0.005％硫酸镁、0.0025％酪蛋白氨基酸、0.0025％酵母浸出液和2.0％琼脂(％指重量/体积)组成的琼脂斜面培养基上(PH7.0)，在28℃下静止培养10天获得具有抗丝氨酸氧肟酸盐和刀豆氨酸特性的突变菌株CV^R-48(FERM P-8333 IFO-14449)。实例6

在成份由2.5％葡萄糖、2％玉米浆、1.0％棉籽粉(商品名：Proflo，由Trader Oil Mill Co.盐产)。0.3％硫酸铵、0.05％硫酸镁和0.3％碳酸钙(％指重量/体积)组成的培养基中滴加20％(重量/体积)苛性钠水溶液使PH达7.0。200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中加入25毫升培养基，120℃下高压蒸汽灭菌15分钟。把裂生链轮丝菌E5-24-5、C₃ ^R-182和CV^R-48菌株的孢子分别接种到培养基上，并在28℃，每分钟200转转速下培养20小时，得到所需的各个种子培养液。然后，制备含11％(重量/体积)葡萄糖、3.0％山梨醇、3.0％干酪素、0.5％玉米浆、2.0％Proflo、0.5％硫酸铵、0.5％硝酸铵、0.1％氯化胆碱、0.005％硫酸锰、0.005％硫酸铁和0.003％硫酸铜(％指重量/体积)的培养基，在其中滴加20％(重量/体积)的苛性钠水溶液以使PH达7.0。在这培养基中加入碳酸钙使其浓度达1％(重量/体积)，把混合液充分摇动，接着在每个200毫升三角瓶(用氨基甲酸乙酯瓶塞)中加入25毫升培养基，于120℃高压蒸汽灭菌20分钟制得发酵培养基。每瓶这样制得的培养基中接入2毫升上述的种子培养液。在28℃每分钟200转摇动发酵培养10天。培养完后，按照“发酵工程杂志”62卷537页(1984)上描述的高效液相色谱方法定量测定霉病霉素按上述方法进行的霉病霉素生产试验，所得试验结果如表4所列。

                        表4菌株    产生霉病霉素的数量(微克/毫升)E5-24-5        3887C₃ ^R-182      5755CV^R-48        8000实例7

在与实例6相同的条件下，把裂生链轮丝菌CV^R-48进行发酵。收集发酵液，把1升发酵液经离心获得的上清液，然后通过由2.5升离子交换树脂Amberlite IRC-50(H⁺型)(Robm &Haas Co.)装成的柱。柱用水洗，再用2.5升0.5％(重量/体积)氨水进行洗脱。活性部分(按实例6的定量测定方法)让其流到由250毫升层析用活性炭(由Takeda Chemical In-dustries，Ltd.生产)装成的柱中，使之吸附。用1.25升丙酮-水(3∶7)混合液洗脱。收集和浓缩洗脱的活性部分。在浓缩液中滴加500毫升甲醇促使粗的霉病霉素沉淀。过滤收集粉状霉病霉素粗制品。用水溶解6.5克这样的粉末，并使其流过由125毫升Amberlite CG-50(H⁺型)(由Rohm & Haas Co.生产)装成的柱。柱用50毫升水清洗，接着用1.25升0.5％(重量/体积)氨才洗脱。收集活性部分并上由250毫升活性碳装成的吸附柱。用1.25升丙酮-0.1当量浓度甲酸(2∶8)进行分部洗脱，浓缩活性部分。在浓缩液中加入甲醇使霉病霉素沉淀，用离心法收集沉淀，在减压下干燥获得5.5克霉病霉素甲酸盐。在这甲酸盐的物化性质中，熔点，比旋度(〔α〕_D ²⁴水中浓度1.0，在0.1当量HCl中浓度1.0)和271毫微米和280毫微米处紫外吸收值完全符合“抗菌素杂志”1978年31卷6期第523页所报道的。实例8

在按实例1第(1)步使用裂生链轮丝菌E5-24-5制得的悬浮液中，加入等体积的溶解在三氨基甲烷-盐酸缓冲液(0.1摩尔，PH7.5)中的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍溶液，使其浓度达2毫克/毫升。混合液28℃下摇动90分钟。把这样得到的上述混合液涂布在含300微克/毫升L-刀豆氨酸的琼脂平板培养基上，28℃静止培养14天。所得菌落分别移接到斜面琼脂培养基上(培养基成份与上述的琼脂平板培养基相同)。28℃下静止培养10天获得14个具有抗刀豆氨酸特性的突变菌株。

在与实例6相同的条件下，这些抗刀豆氨酸的突变菌株和亲本菌株(E5-24-5)进行发酵，比较它们霉病霉素的产率。在它们中分离到表现最高产率的一个突变菌株，并编为裂生链轮丝菌CV^R-16(FERM P-8874，IFO-14527)。亲本菌株和突变菌株CV^R-16按上述方法产生霉病霉素的量如表5所示。

                                  表5

菌株E5-24-5CVR-16

产生霉病霉素的数量(微克/毫升)39004680

从上表很明显看出突变菌株CV^R-16生产霉病霉素能力要比亲本菌株高得多。实例9

在与实例6相同的条件下，把裂生链轮丝菌CV^R-16进行发酵。收集发酵液(1升)，按实例7相同的步骤处理发酵液并分离和纯化霉病霉素。通过这些步骤得到3.1克霉病霉素甲酸盐。在这甲酸盐的物化性质中，熔点、比旋度和271毫微米和280毫微米处的紫外吸收值与文献报道的完全符合(文献在实例7中已讲过)。

本发明生产霉病霉素的方法，包括属于链轮丝菌属对丝氨酸氧肟酸盐或刀豆氨酸有抗性的产霉病霉素的菌株的培养，高效能的生产霉病霉素，因此是一个大量生产霉病霉素的在工业上优越的发酵方法。

Claims (3)

1.一种生产结构式〔I〕所示的霉病霉素的方法，

其特征在于在培养基中培养一种裂生链轮丝菌的菌株CCTCC86-101、CTCC86-102或CCTCC86-103，从而使该菌株合成和积累霉病霉素，然后从所得的培养液中回收霉病霉素。

2.如权利要求1中所述的生产霉病霉素的方法，其特征在于培养基中含有至少3毫摩尔的甜菜碱、氯化胆碱、N，N-二甲基乙酰胺、四甲基氯化铵或乙基三甲基碘化铵。

3.如权利要求1所述的生产霉病霉素的方法，其特征在于培养基中含有5-羟甲基胞嘧啶。