CN1242055C

CN1242055C - 万古霉素产生菌及其应用

Info

Publication number: CN1242055C
Application number: CN 200410067197
Authority: CN
Inventors: 陈代杰; 李继安; 戈梅; 刘垚
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Zhejiang Medicine Co Ltd Xinchang Pharmaceutical Factory
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; Zhejiang Medicine Co Ltd Xinchang Pharmaceutical Factory
Priority date: 2004-10-15
Filing date: 2004-10-15
Publication date: 2006-02-15
Anticipated expiration: 2024-10-15
Also published as: CN1616651A

Abstract

本发明涉及万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)CGMCC No.1183及其应用。该菌种可特异性提高万古霉素发酵单位，改善万古霉素的得率和质量。

Description

万古霉素产生菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及万古霉素产生菌及其应用。

背景技术

万古霉素是由Micormick等于1956年从一株东方链霉菌的发酵液中分离得到的一种糖肽类抗生素，1958年获美国FDA批准，由美国礼莱(Lilly)公司开发上市，用于治疗由革兰氏阳性菌引起的感染性疾病，特别对由β-内酰胺类抗生素引起的耐药金葡菌及难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)有较好的疗效。万古霉素问世后的前20年，由于青霉素和头孢菌素类抗生素的上市使用，万古霉素仅作为保留药物，治疗由少数金黄色葡萄球菌引起的严重感染性疾病，临床使用很少。后来随着β-内酰胺类抗生素的大量使用，导致由MRSA所引起的感染逐渐流行。至1982年，有报道称在美国大医院中，MRSA引起的感染已由原来的2％上升到20％。在这种情况下，万古霉素愈来愈引起人们的重视，并被国际抗生素专家誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道防线”。由于它在临床中的重要地位，使之具有“王牌抗生素”之称。另外，由于万古霉素的作用机制独特，且多肽类抗生素在体内容易分解，使其不仅在临床上而且在畜牧业上也得到了广泛的应用。

四十多年来，国外医药界学者对万古霉素进行了大量的研究。包括其化学性质、药理、毒理、临床应用、微生物、分析测定及制剂等各个方面。在七十年代及八十年代对其化学结构进行了反复论证并最终得以确定，同时对其化学稳定性进行了深入的研究。同时又对万古霉素的结构进行了改造，目的在于进一步提高其抗菌效果。近年来，万古霉素产品的质量也在不断的提高，由于纯度低而引起的毒副作用也在不断减少。万古霉素作为一种疗效独特的抗生素在临床应用上具有日益重要的地位。

对于微生物发酵产品尤其是次级代谢产物而言，菌种本身生成产物的能力是该产品工业化生产的首要限制因素。在我国，万古霉素虽已实现国内的产业化生产，但菌种的发酵单位仍有待提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于通过诱变处理等选育手段提供一株具有万古霉素高产特性的新菌株。

本发明公开的万古霉素高产菌株为东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)，微生物菌种保藏号为CGMCC No.1183。该菌株以东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)ATCC19795(美国菌种保藏中心保藏)为出发菌种，经自然选育、耐药筛选、化学物理诱变等步骤获得。具体筛选步骤包括：

1、出发菌株

东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)ATCC19795。

2、出发菌使用的培养基

斜面(分离)培养基(高氏1号合成培养基)(％)：可溶性淀粉2.0；NaCl 0.5；K₂HPO₄·3H₂O 0.5；KNO₃ 1.0 MgSO₄·7H₂O 0.5；FeSO₄·7H₂O 0.01；纯化琼脂粉2.0；pH7.2-7.4。

3、出发菌种的培养方式

斜面培养：冷冻管菌种经分离纯化后接种于高氏1号斜面培养基，28℃培养5天。

4、万古霉素HPLC分析方法

试样制备：发酵液用4mol/L的盐酸调pH至4.5，于3500r/min离心10分钟，去除菌丝体和固体残渣，吸取1.0ml上清液，在12000r/min条件下离心10分钟，供HPLC检测。

流动相配制：配制0.4％的三乙胺溶液，用磷酸调pH至3.3，然后与甲醇按85∶15(体积比)的比例混合，摇匀，超声波脱气20分钟，备用。

色谱条件：色谱柱：C₁₈，ODS，(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：40℃；检测器：DAD(HP1100)；检测波长：280nm；流动相：三乙胺-甲醇＝85∶15(体积比)；流速：0.8ml/min；进样量：1μl。

5、自然分离

取出发菌株的新鲜斜面加入无菌水10ml，用接种铲将斜面孢子轻轻刮下，倒入装有无菌玻璃珠的三角瓶中，充分振摇30分钟，用塞有脱脂棉的无菌漏斗过滤，得到单孢子悬液。将单孢子悬液梯度稀释后涂布于固体平板上，培养得到单个菌落。

6、筛选平板的制备

(1)卡那霉素或万古霉素浓度梯度耐药筛选

配制不同浓度的卡那霉素或万古霉素溶液，加入分离培养基中制得耐受用分离平板。将单孢子悬液梯度稀释后涂布于分离平板上，长出的菌落为卡那霉素或万古霉素的耐受菌株。

(2)利用甘油进行分离筛选

将甘油配制成不同浓度溶液，加入分离培养基中制得甘油分离平板，将单孢子悬液梯度稀释后取定量涂布于甘油平板上进行培养。

7、诱变处理

(1)紫外诱变处理

利用功率为30W的紫外灯在波长253.7nm、照射距离33cm下对菌种进行诱变处理。处理后梯度稀释并涂布于分离平板，于28℃避光培养7～8天。

(2)紫外光与激光复合处理

将制备好的单孢子悬液放于紫外灯下照射1分钟，然后用激光照射。将照射后的悬液梯度稀释并涂布于分离平板，28℃培养7天。

(3)NTG诱变处理

在由磷酸缓冲液制备的单孢子悬液系统中加入NTG于28℃摇床上培养处理，分别于不同时间(20分钟到60分钟不等)后取样梯度稀释涂布平板，28℃培养7～8天。

8、摇瓶筛选

将经选育处理得到的单菌落接种斜面28℃培养5-6天后进行摇瓶二级发酵，并用HPLC检测万古霉素效价。

根据HPLC检测结果，经过反复筛选最终得到一株东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)高产突变菌株，微生物菌种保藏号为CGMCC No.1183，菌种选育系谱见图1。

经上述选育过程获得的本发明的万古霉素产生菌，其生产万古霉素的能力比出发菌株提高20倍以上。该菌株在从250ml的摇瓶到10吨罐的发酵放大过程中，万古霉素发酵单位始终保持在2500μg/ml以上。

本发明根据采用的万古霉素高产菌株东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)CGMCC No.1183的特性，对万古霉素发酵培养基、发酵条件及万古霉素产品的分离纯化条件进行了考察。

1.证实该高产菌株可利用的种子及发酵培养基种类包括碳源：葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、淀粉、甘油、豆油、菜籽油等；氮源：黄豆饼粉、棉籽饼粉、各种氨基酸、各种硝酸盐、鱼粉、酵母粉等；以及各种磷酸盐、各种金属盐类包括镁盐、钠盐、钙盐、铁盐、锌盐、钴盐等。

较适合的斜面培养基为：可溶性淀粉0.5-3.0％，NaCl0.005-0.2％，KNO₃ 0.01-0.1％，MgSO₄ 0.01-0.2％，FeSO₄ 0.001-0.01％，KH₂PO₄ 0.01-0.2％，琼脂2.2％，消后pH6.5-8.0

较合适的种子培养基为：可溶性淀粉0.5-5.0％，葡萄糖0.2-4.0％，甘油0.1-4.0％，黄豆饼粉0.2-4.0％，KNO₃ 0.1-1.5％，KH₂PO₄0.01-0.2％，MgCl₂ 0.001-0.4％，泡敌0-0.1％，消前pH6.0-7.5

较合适的发酵培养基为：甘油1.0-10.0％，黄豆饼粉0.1-4.0％，KH₂PO₄ 0.01-0.2％，MgCl₂ 0.001-0.1％，KNO₃ 0.01-2.0％，CaCO₃0.01-3.0％，泡敌0-0.1％，消前pH6.5-8.0

2.可以采用一级或者多级培养以在小规模和大规模发酵中获得高产量。

适合于常用的二级发酵的步骤如下所述：东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183冻干管孢子接种于斜面培养基，于25-30℃培养5-8天。取成熟斜面接种于种子培养基，于25-30℃培养40-80hr，按5-15％接种量转种于发酵培养基，于25-30℃培养40-240hr得到产品发酵液。

在一级发酵中种子的培养过程可以省去，在多级发酵过程中种子的培养过程可根据发酵规模相应重复并逐级放大。

3.对发酵液的分离纯化方法进行考察后证实，较合适的纯化提取步骤包括：

1)发酵液的预处理

对发酵液进行酸化有助于进一步的纯化。可使用的酸化剂包括：草酸、盐酸等，其中盐酸是更为合适的酸化剂。

2)酸化液的分离

可以通过过滤和离心的办法将酸化液与菌丝及不溶性沉淀分离。

3)吸附、脱盐及脱色

万古霉素与水溶性杂质的分离可以采用大孔树脂吸附技术。合适的解析液是pH1.0-4.0的50-80％的酸性乙醇水溶液。

在进行吸附前，应首先将发酵滤液的酸度回调至弱酸性至中性。

脱盐过程可以使用钠滤脱盐技术。

脱色过程可以使用活性炭。在脱色过程中加入适量的黄血盐及硫酸锌有利于除去铁离子。

4)柱层纯化

使用柱层析方法可以获得高纯度的万古霉素产品。可以使用的层析介质包括Sephadex系列产品。较合适的层析介质为：Sephadex C15、Sephadex C25或Sephadex C50。可以采用正向或反向的洗脱方式，洗脱剂为弱碱到弱酸性的盐溶液，如0.01-1mol/L的NH₄HCO₃水溶液、0.01-2mol/L的(NH₄)₂CO₃水溶液。洗脱温度为4-30℃。

收集含有高纯度的万古霉素洗脱部分，再经脱色、除热原、干燥后可以得到万古霉素干粉。较好的干燥方式是冷冻干燥。

采用本发明菌种和优化工艺获得的万古霉素，产品质量符合USP质量标准，纯度高、色泽好，工艺成本低，三废少，易处理，适用于大规模工业化生产。

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

附图说明

图1东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)CGMCC No.1183菌种选育系谱

其中NS表示自然分离，KM表示卡那霉素，UV表示紫外，NTG表示亚硝基胍，Van表示万古霉素，Laser表示激光，Gly表示甘油

具体实施方式

实施例1东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183的形态和培养特征

东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183具有如下形态特征：在酵母燕麦粉培养基上呈圆形菌落，培养5-7天菌落直径在3-5mm之间，菌落中心呈丘状突起；菌落颜色呈乳白色到乳黄色，浅褐色孢囊丛；孢囊丰满，孢子丰富。基内菌丝呈淡棕色，分泌浅褐色水溶性色素；气生菌丝发育良好；基内菌丝具有明显分枝，一般无横隔；气生菌丝具有大量分枝，且具有间生孢囊；孢子丝直立，在孢囊中呈不规则排列；孢子表面光滑，不运动。

按照采用国际链霉菌计划(ISP)和Waksman所推荐的培养基，在28℃不同培养基上培养7天后的培养特征如下：

培养基	生长情况	气生菌丝	基内菌丝	水溶性色素
培养基	生长情况	气生菌丝	基内菌丝	水溶性色素	葡萄糖-天冬素琼脂	一般	乳白	浅黄	淡黄
燕麦粉琼脂(ISP₃)	良好	乳白	乳白	淡黄	葡萄糖-天冬素琼脂	一般	乳白	浅黄	淡黄
燕麦粉琼脂(ISP₃)	良好	乳白	乳白	淡黄	酪氨酸琼脂(ISP₇)	一般	浅灰白	浅黄	无
苹果酸乳糖琼脂	良好	乳白	浅黄	无	酪氨酸琼脂(ISP₇)	一般	浅灰白	浅黄	无
苹果酸乳糖琼脂	良好	乳白	浅黄	无	查氏蔗糖琼脂	生长不良	极少	浅黄	无
甘油-天冬素琼脂(ISP₅)	一般	淡灰	浅黄	无	查氏蔗糖琼脂	生长不良	极少	浅黄	无
甘油-天冬素琼脂(ISP₅)	一般	淡灰	浅黄	无	酵母麦芽浸汁琼脂(ISP₂)	良好，菌落中央凹陷	乳白	浅黄	浅褐

淀粉琼脂	良好	乳白	黄色	浅褐
淀粉琼脂	良好	乳白	黄色	浅褐	马铃薯浸汁琼脂	良好	白色	浅黄	浅褐
营养琼脂	一般	白色	浅黄	浅黄	马铃薯浸汁琼脂	良好	白色	浅黄	浅褐
营养琼脂	一般	白色	浅黄	浅黄	无机盐淀粉琼脂	良好至丰富	乳白	浅褐	浅褐
蛋白胨-酵母膏琼脂(ISP₆)	贫乏	浅灰	浅褐	浅褐	无机盐淀粉琼脂	良好至丰富	乳白	浅褐	浅褐

实施例2 250ml三角摇瓶的发酵

将东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183接种于含下列斜面培养基的斜面上：可溶性淀粉2.0％；NaCl 0.05％；KNO₃ 0.01％；MgSO₄ 0.05％；FeSO₄ 0.001％；KH₂PO₄ 0.05％；琼脂2.2％，消后pH7.2。斜面接种后，于25℃培养7天。

挖块法将斜面接种于含30ml种子培养液的250ml三角摇瓶中。种子培养基：可溶性淀粉4.0％；葡萄糖1.5％；甘油2.0％；黄豆饼粉2.0％；KNO₃ 0.6％；KH₂PO₄ 0.02％；MgCl₂ 0.02％；消前pH6.8。于28℃培养46hr，摇床转速220rpm。

将培养好的种子液按8％接种量转种于含30ml发酵培养液的250ml三角摇瓶中，于28℃，摇床转速220rpm，培养5天。发酵培养基配方：甘油4.3％；黄豆饼粉2.0％；KH₂PO₄ 0.02％；MgCl₂ 0.02％；KNO₃ 0.6％；CaCO₃ 0.3％；pH6.5。终点发酵单位2800ug/ml。

出发菌株的对照试验结果如下：

菌种	出发菌株SIPI43491	菌种CGMCCNo.1183
菌种	出发菌株SIPI43491	菌种CGMCCNo.1183	发酵单位(HPLC检测)	107μg/ml	2800μg/ml
相对发酵单位	100％	2617％	发酵单位(HPLC检测)	107μg/ml	2800μg/ml
相对发酵单位	100％	2617％	相对提高倍数	——	26.17倍

实施例3 10L玻璃罐万古霉素发酵生产

菌种为东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183，斜面培养方式和种子培养基同实施例1。种子培养基装量：使用750ml摇瓶装量为100ml；培养温度：25℃；培养时间：48hr。

将种子按转种量8％接种于含5L发酵培养基的10L玻璃发酵罐中。发酵培养基为甘油6.0％；黄豆饼粉2.0；KH₂PO₄ 0.02％；MgCl₂0.02％；KNO₃ 0.6％；CaCO₃ 0.3％；消前pH7.2

10L玻璃罐发酵参数：发酵温度25℃，通气量1∶1(vol∶vol)，搅拌转速500rpm，发酵周期为7天。放罐单位2500μg/ml。

实施例4 100L罐万古霉素生产

斜面和种子培养方式同实施例2。

发酵参数：培养基装量80L；接种量10％；通气量：1∶1(vol∶vol)；搅拌转速300rpm；发酵周期7天。放罐单位2700μg/ml。

实施例5 10吨罐万古霉素生产

斜面和种子培养基同实施例2。

冻干管孢子斜面接种，28℃培养7天；取成熟斜面接种于含有50ml种子培养基的750ml三角摇瓶，于28℃培养46hr；按5％接种量接种于含有80L种子培养基的500L种子罐，于25℃培养46hr；取一级种子按10％接种量接种于含有600L种子培养基的1吨种子罐，于25℃培养44hr；取二级种子按10％接种量接种于含7吨发酵培养基的10吨发酵罐。

发酵参数：通气量：1.2∶1(vol∶vol)；搅拌转速280rpm；发酵周期7天。放罐单位2800μg/ml。

实施例6 万古霉素发酵液分离纯化

1、取实施例2制得的发酵液用盐酸调节pH至3.5，过滤；

2、用2N NaOH调节pH至4.5左右，过D1300大孔树脂柱，用pH2.0的80％酸性乙醇水溶液洗脱；

3、洗脱液经纳滤膜纳滤，活性碳脱色，浓缩；

4、采用Sephadex C-25柱进行柱层析，用0.1M NH₄HCO₃水溶液梯度洗脱，收集HPLC检测积分面积比95％以上部分，活性炭脱色，0.22um微孔滤膜过滤除热原后，冷冻干燥即得万古霉素盐酸盐无菌原料干粉。该干粉的质量与标准规定对照如下：

	标准规定	干粉检测结果
	标准规定	干粉检测结果	性状	类白色或微红色，无臭，极易引湿	类白色，无臭，极易引湿
鉴别	色谱行为应与标准品一致	与标准品一致	性状	类白色或微红色，无臭，极易引湿	类白色，无臭，极易引湿
鉴别	色谱行为应与标准品一致	与标准品一致	酸度	2.5-4.5	3.0
溶液澄清度	应符合规定	符合规定	酸度	2.5-4.5	3.0
溶液澄清度	应符合规定	符合规定	水分	不超过5.0％	1.3％
炽灼残渣	不超过0.5％	小于0.5％	水分	不超过5.0％	1.3％
炽灼残渣	不超过0.5％	小于0.5％	万古霉素含量	不少于88％单个杂质不超过4.0％	94.4％1.0％

实施例7 万古霉素发酵液分离纯化

使用实施例6中1-3的纯化步骤，在脱色时加入黄血盐和硫酸锌，再经过纳滤。采用Sephadex C-50为介质进行柱层析，洗脱和后处理方式同实施例6。得到万古霉素盐酸盐的原料干粉。

Claims

1、东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)，微生物菌种保藏号为CGMCC No.1183。

2、根据权利要求1所述的东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183在制备万古霉素中的应用。

3、一种采用权利要求1所述东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183制备万古霉素的方法，其特征在于该方法包括：

1)菌种：东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183；

2)培养基：

斜面培养基：可溶性淀粉0.5-3.0％，NaCl 0.005-0.2％，KNO30.01-0.1％，MgSO4 0.01-0.2％，FeSO4 0.001-0.01％，KH2PO40.01-0.2％，琼脂2.2％，消后pH6.5-8.0

种子培养基：可溶性淀粉0.5-5.0％，葡萄糖0.2-4.0％，甘油0.1-4.0％，黄豆饼粉0.2-4.0％，KNO₃ 0.1-1.5％，KH₂PO₄ 0.01-0.2％，MgCl₂ 0.001-0.4％，泡敌0-0.1％，消前pH6.0-7.5

发酵培养基：甘油1.0-10.0％，黄豆饼粉0.1-4.0％，KH₂PO₄0.01-0.2％，MgCl₂ 0.001-0.1％，KNO₃ 0.01-2.0％，CaCO₃ 0.01-3.0％，泡敌0-0.1％，消前pH6.5-8.0；

3)发酵步骤：

取东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183冻干管孢子接种于斜面培养基，于25-30℃培养5-8天，取成熟斜面接种于种子培养基；种子的培养温度为25-30℃，培养时间40-80hr，按5-15％接种量转种于发酵培养基；

根据发酵规模使用多级种子培养，发酵培养温度为25-30℃，培养时间40-240hr；

4)发酵液分离纯化

a、取发酵液用草酸或盐酸调节pH至3.0-3.5，过滤或离心分离；

b、滤液用碱调节pH至4.5左右，用D1300大孔树脂吸附，用pH1.0-4.0的50-80％的酸性乙醇水溶液解析；

c、解析液用纳滤膜纳滤脱盐，活性碳脱色，浓缩；

d、采用层析介质为Sephadex C15、Sephadex C25或SephadexC50的层析柱层析，用0.1mol/L的NH₄HCO₃水溶液或0.1mol/L的(NH₄)₂CO₃水溶液梯度洗脱，洗脱温度为4-30℃，收集HPLC检测积分面积比95％以上部分，活性炭脱色，0.22um微孔滤膜过滤除热原后，冷冻干燥即得盐酸万古霉素无菌原料粉。

4、根据权利要求3所述东方拟无枝酸菌CGMCC No.1183制备万古霉素的方法，其特征在于在脱盐后脱色过程中加入黄血盐及硫酸锌。