CN109880746B

CN109880746B - 一种座坚壳属真菌菌株及其应用

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Publication number: CN109880746B
Application number: CN201711276671.0A
Authority: CN
Inventors: 齐欢; 滕云; 徐倩; 陶亮亮; 梁陈宏; 张辉; 王继栋; 白骅
Original assignee: Hisun Pharmaceutical Hangzhou Co ltd; Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hisun Pharmaceutical Hangzhou Co ltd; Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-12-06
Filing date: 2017-12-06
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2037-12-06
Also published as: CN109880746A

Abstract

本发明公开了一株座坚壳属真菌菌株及其应用，该菌株命名为座坚壳菌(Rosellinia sp.)HS‑NF‑1412Z，其保藏编号为CGMCC NO.13893。本发明的真菌菌株HS‑NF‑1412Z可产生一种24元环状缩肽化合物PF1022A，该化合物对于动物及人体内寄生的蛔虫、丝虫、绦虫、线虫、钩虫等具有良好的驱虫活性，显示出很好的商业开发前景。

Description

一种座坚壳属真菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株座坚壳属真菌及其在制备24元环状缩肽化合物PF1022A中的应用。

背景技术

寄生虫病是动物常见疾病种类，它危害畜禽健康，造成经济损失，阻碍畜牧养殖业的发展；另外，寄生虫也和宠物动物的健康息息相关，因为人类和它们的亲密关系，有些宠物的寄生虫病也威胁到其主人的健康。动物抗寄生虫药能有效杀灭或驱除畜禽体内外的寄生虫，在该类疾病的预防治疗方面发挥着很大的作用。1970年大环内酯作为抗寄生虫药物被发现，随后发现伊维菌素、阿维菌素、埃普菌素和塞拉菌素等，他们被广泛用于畜牧业。但之后学者发现牛、绵羊、山羊、马等出现了耐药性，在部分区域这些药对绵羊甚至没有了作用。环状缩肽则是在这个时候被发现的一类抗虫药物，如PF1022A、环六缩酚酸肽、环四缩酚酸肽和开链缩酚酸肽等。作为杀寄生虫药物防治动物体内的蠕虫、线虫、吸虫，其作用机制和大环内酯不同，是良好的替换产品。

24元环状缩肽化合物由于其特殊的作用机制和杀虫效果，从它之后缩肽类抗虫药物便成了研究热点。拜尔动物保健公司以PF1022A为前体研制出的Emodepside分别与吡喹酮(Profender)及妥曲珠利(Procox)的组合物用于猫和狗的驱肠虫药，已于2007年在美国上市。US5116815、CN1027288和EP382173公开了PF1022物质(PF1022A)及其产生菌PF1022(Agonomycetales(Mycelia sterilia)PF1022/FERM BP-2671/CCTCC M90003)。J.Antibiot1992，45(5)，692-697，报道的PF1022A产生菌PF1022与上述专利PF1022物质产生菌相同。菌PF1022产PF1022A物质效价低，不利于放大生产。因此，仍然有必要寻找新的PF1022A产生菌和新的制备PF1022A方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的座坚壳菌(Rosellinia sp.)HS-NF-1412Z，其具有产生24元环状缩肽化合物PF1022A的能力，其保藏编号为CGMCC NO.13893。

本发明的目的还在于提供座坚壳菌HS-NF-1412Z在制备24元环状缩肽化合物PF1022A中的应用，或生产含有PF1022A的药物组合物中的应用。

本发明还提供了一种采用座坚壳菌HS-NF-1412Z制备24元环状缩肽化合物PF1022A的方法。该方法包括采用座坚壳菌HS-NF-1412Z在含有可同化的碳源、氮源的培养基里进行液体深层发酵的步骤。

优选地，上述可同化的碳源选自淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、甘油、麦芽糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、棉子糖、果糖、工业糖蜜、豆油、菜籽油之一或者上述物质的组合。

优选地，上述可同化的氮源选自牛肉浸膏、酵母浸膏、玉米浆、酵母抽提物、麦芽抽提物、酵母粉、蛋白胨、麸质粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、小麦胚芽粉、大豆粉、脱脂奶粉、尿素、铵盐、硝酸盐之一或者上述物质的组合。

优选地，所述液体深层发酵的温度为15℃-30℃，优选20～28℃；pH为4.0-8.0，优选6.0，发酵时间为120-300小时。

优选地，所述发酵方式为好氧发酵，通气量为0.5-1.0vvm。

本发明还提供了24元环状缩肽化合物PF1022A的分离提取方法。该方法包括将发酵液通过浸提、萃取、柱层析、结晶等步骤制备该化合物。

本发明中，24元环状缩肽化合物PF1022A可通过以下条件进行HPLC检测：

色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5um)；

流动相：80％乙腈(V/V)；

洗脱方式：等度洗脱；

流速：1ml/ml；

检测波长：218nm；

进样量：20ul；

本发明所采用的24元环状缩肽化合物PF1022A产生菌为座坚壳菌HS-NF-1412Z。

本发明座坚壳菌HS-NF-1412Z的菌种于2017年5月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC NO.13893，分类命名为Rosellinia sp.，并登记入册，证明存活。

本发明座坚壳菌HS-NF-1412Z主要生物学特征为：

(1)本发明菌株在24-26℃时，在土豆葡萄糖琼脂(PDA)、燕麦琼脂(OA)培养基上可充分生长，生长7天时可形成直径40-70mm大小的菌落，气生菌丝丰富(白色)，无孢子，可产生大量黄色素，菌落背面为黄色至黄褐色，菌落正面中心部位呈黄色；在玉米粉琼脂(CMA)和YMS琼脂培养基上可充分生长，7天时可形成直径30-70mm大小的菌落，气生菌丝丰富(白色)，无孢子；

(2)本发明菌株24-26℃时，土豆胡萝卜琼脂(PCA)、察氏琼脂(CzA)、Miura琼脂(LCA)三种培养基上生长不良，7天时形成菌落大小30-40mm，气生菌丝极少(不形成白色)，无黄色素；在麦芽抽提物琼脂(MEA)琼脂培养基上生长不充分，7天时形成菌落大小40-50mm，气生菌丝少(不形成白色)，无黄色素；

(3)本发明菌株在14-30℃时生长，pH在4.0-8.0时生长；

(4)本发明菌株在24-26℃时，接种于用麦秆或香蕉叶或类似物质覆盖的普通琼脂上，30天仍不出现任何特殊的形态学特征；

本发明描述了座坚壳菌HS-NF-1412Z的形态学和分子水平上的特征，经过与已知产24元环状缩肽化合物PF1022A的菌株进行形态学和分子水平的比较，可以认定本发明座坚壳菌HS-NF-1412Z属于座坚壳属真菌，但它不同于已经报道的24元环状缩肽化合物PF1022A产生菌PF1022(Agonomycetales(Mycelia sterilia)PF1022/FERM BP-2671/CCTCCM90003)，而是一个全新的菌种。

本发明座坚壳菌HS-NF-1412Z提高了发酵单位。本发明座坚壳菌HS-NF-1412Z产生24元环状缩肽化合物PF1022A的产量较已报道菌株有了大幅提高，有利于实现工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例8制备得到的24元环状缩肽化合物PF1022A纯品的HPLC图谱；

图2为本发明实施例8制备得到的24元环状缩肽化合物PF1022A纯品的ESI/MS图谱；

图3为本发明实施例8制备得到的24元环状缩肽化合物PF1022A纯品的¹H-NMR图谱；

图4为本发明实施例8制备得到的24元环状缩肽化合物PF1022A纯品的¹³C-NMR图谱。

具体实施方式：

实施例1：菌株来源

座坚壳菌HS-NF-1412Z系从浙江丽水，遂昌南尖岩山树林中土壤样品中分离得到的。

在遂昌山中采集不同环境的土壤样品，分别采集了半坡树林中土壤、山顶树林中土壤、半坡竹林中土壤、半坡草丛中土壤、山中岩石缝隙中土壤等多处共10处的样品，样品为0-15cm深的土壤(含表层腐败物)，约100g。将得到的土壤样品取20g用研钵研细，加入含150ml无菌生理盐水的锥形瓶中，加入150ul的萘啶酮酸(浓度为50mg/ml)，室温振荡1h(150rpm)，使其形成悬浊液。将悬浊液用无菌的生理盐水梯度稀释为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4的浓度，取各浓度稀释液0.15ml涂布于加入了萘啶酮酸(浓度为50ug/ml)的PDA和察氏平板培养基上，每组样品涂2个平行组。将2个平行组分别置于24℃和28℃恒温培养箱培养。分别于4天、8天挑取真菌菌落，将挑取的每个真菌均点种于PDA平板和YMS平板两种培养基上，26℃培养7天，并对其进行纯化，共得到真菌400多株。对得到的菌株分别用PDA平板和YMS平板培养，然后在无菌条件下用接种铲将菌落刮下接种于250ml锥形瓶中(每瓶含25ml的种子培养基)，于25℃条件下振荡培养72h(250rpm)得到种子液。将种子液以10％—20％的接种量接种于不同的含发酵培养基的锥形瓶中(每瓶含25ml的发酵培养基)，与25℃条件下振荡培养7天(250rpm)，经HPLC检测所得发酵液中24元环状缩肽化合物PF1022A的含量，挑选得到最高产菌株即座坚壳菌HS-NF-1412Z。

实施例2：座坚壳菌HS-NF-1412Z的形态学和培养学特征

参照《中国真菌志》、《真菌鉴定手册》(魏景超版)及《中国药典》(2010版)等文献中的有关内容进行实验。菌株的形态学和培养学特征实验采用土豆葡萄糖琼脂(PDA)、察氏琼脂(CzA)、燕麦琼脂(OA)、土豆胡萝卜琼脂(PCA)、Miura琼脂(LCA)、玉米粉琼脂(CMA)、芽抽提物琼脂(MEA)和YMS琼脂共8种培养基上，25℃条件下培养7天后，观察其菌落、菌丝、孢子及色素产生情况。实验结果如下：

(1)菌株HS-NF-1412Z在土豆葡萄糖琼脂(PDA)、燕麦琼脂(OA)培养基上可充分生长，生长7天时可形成直径40-70mm大小的菌落，气生菌丝丰富(白色)，无孢子，可产生大量黄色素，菌落背面为黄色至黄褐色，菌落正面中心部位呈黄色；在玉米粉琼脂(CMA)和YMS琼脂培养基上可充分生长，7天时可形成直径30-70mm大小的菌落，气生菌丝丰富(白色)，无孢子；

(2)土豆胡萝卜琼脂(PCA)、察氏琼脂(CzA)、Miura琼脂(LCA)三种培养基上生长不良，7天时形成菌落大小30-40mm，气生菌丝极少(不形成白色)，无黄色素；在麦芽抽提物琼脂(MEA)琼脂培养基上生长不充分，7天时形成菌落大小40-50mm，气生菌丝少(不形成白色)，无黄色素；

将菌株HS-NF-1412Z接种于用麦秆或香蕉叶或类物覆盖的普通琼脂上，观察30天，仍无孢子等特殊形态学特征出现。

实施例3：座坚壳菌HS-NF-1412Z(CGMCC NO.13893)的培养条件

对真菌HS-NF-1412Z生长的pH、温度、NaCl浓度进行试验，采用PDA平板培养基，培养7～10天观察，结果如表1、表2、表3所示。

表1菌株生长pH实验结果

注：进行pH试验时，温度为26℃，无NaCl。

表2菌株生长温度实验结果

注：进行温度试验时，pH为培养基自然pH，无NaCl。

表3菌株对NaCl的耐受实验结果

备注：上述表1、表2、表3中，0表示无生长；1表示生长很弱；2表示能生长，有少量菌丝；3表示生长良好，有大量菌丝；4表示生长最好，有丰富的菌丝。

实施例4：座坚壳菌HS-NF-1412Z的5.8S rDNA的ITS1/4片段及18S rDNA序列分析及菌种鉴定

收集真菌菌丝体，液氮充分研磨，然后用CTAB法抽提总DNA。采用真菌ITS1/4通用引物(NS1/NS4)进行ITS1/4序列扩增，PCR产物进检测纯化后，进行序列测定；采用18S rDNA引物(NS1/NS8)进行基因扩增，PCR产物进检测纯化后，进行序列测定(由南京金斯瑞生物科技股份有限公司完成)。所测得到的ITS1/4片段序列及18S rDNA的序列与GenBank数据库中相关属、种的序列进行同源性BLAST比较，以确定该菌株的分类地位。

BLAST比较结果显示菌株HS-NF-1412Z与座坚壳属(Rosellinia sp.)菌株同源性最高。

座坚壳菌HS-NF-1412Z和已经报道的24元环状缩肽化合物PF1022A产生菌的比较如下：

据US5116815、CN1027288和EP382173报道，化合物PF1022A产生菌(Agonomycetales(Mycelia sterilia)PF1022/FERM BP-2671/CCTCC M90003)在25℃时，在玉米粉琼脂(CMA)上生长不良，在土豆葡萄糖琼脂(PDA)、土豆胡萝卜琼脂(PCA)、麦芽提取物琼脂(MEA)、燕麦粉琼脂(OA)上可充分生长且可溶色素的形成是微不足道的。而本发明座坚壳菌HS-NF-1412Z在玉米粉琼脂(CMA)生长良好，在土豆胡萝卜琼脂(PCA)上生长并不充分(菌落明显小于PDA和OA，气生菌丝明显少PDA和OA)；在麦芽提取物琼脂(MEA)上生长7天时，生长并不充分(气生菌丝明显少PDA和OA)；在土豆葡萄糖琼脂(PDA)和燕麦粉琼脂(OA)上，生长7天时，有明显的黄色素，在菌落中心部位尤其明显。

J.Antibiot 1992，45(5)，692-697与US5116815、CN1027288和EP382173所报道的为同一菌株。

综上，结合前述本发明中的座坚壳菌HS-NF-1412Z的其他特征，可知菌株HS-NF-1412Z属于座坚壳属真菌，但它不同于已知的化合物PF1022A产生菌(Agonomycetales(Mycelia sterilia)PF1022/FERM BP-2671/CCTCC M90003)，故座坚壳菌HS-NF-1412Z(CGMCC NO.13893)是一株全新的菌种。

实施例5：制备24元环状缩肽化合物PF1022A

(1)平板菌落的制备

平板采用土豆葡萄糖琼脂(PDA)培养基：土豆200g，切成小块，加纯化水1000ml煮沸30min，滤去土豆块，将滤液加纯化水补足至1000ml，加葡萄糖20g，琼脂18g，自然pH，121℃，灭菌20min，冷却至55℃左右时倒入平板，待冷却凝固后用灭菌的牙签点种接种，每个平板接种一个菌落，25℃培养6天。

(2)种子液的制备

种子培养基配方：葡萄糖20g，可溶性玉米淀粉20g，酵母抽提物15g，棉籽饼粉20g，MgSO₄·7H₂O 2g，NaCl 2g，CaCO₃ 2g，纯化水1000ml，消前pH 6.0；用三角摇瓶装量25ml/250ml，121℃，灭菌20min。刮取上述平板上生长6天的菌落1个(含菌丝的琼脂块)，压碎接入灭菌的种子培养基中，25℃，250rpm，振荡培养80小时，此时培养液pH6.5-7.5，菌丝体浓度20-30％(体积比)。

(3)发酵液的制备

发酵培养基配方：玉米可溶性淀粉20g，山梨醇50g，大豆油10g，黄豆饼粉10g，棉籽饼粉10g，酵母粉10g，MgSO₄·7H₂O 2g，NaCl 2g，(NH₄)₂SO₄ 2g，FeSO₄·7H₂O 0.2g，CaCO₃ 2g，纯化水1000ml，消前pH 6.0；用三角摇瓶装量25ml/250ml，121℃，灭菌20min。将种子液以10％(体积比)的接种量接入。在25℃，250rpm，振荡培养200小时，发酵结束。以前述的HPLC方法检测发酵液中的24元环状缩肽化合物PF1022A的含量，为2420ug/ml。

实施例6：制备24元环状缩肽化合物PF1022A

平板菌落的制备及种子液的制备见实施例5。

发酵培养基组成：玉米淀粉120g加淀粉酶0.024g预先糊化，大豆油10g，棉籽饼粉25g，酵母粉10g，MgSO₄·7H₂O 2g，NaCl 2g，(NH₄)₂SO₄ 2g，FeSO₄·7H₂O 0.2g，NiCl₂·6H₂O0.1g，CaCO₃ 2g，纯化水1000ml，消前pH 6.0；用三角摇瓶装量25ml/250ml，121℃，灭菌20min。将种子液以10％(体积比)的接种量接入。在25℃，250rpm，振荡培养240小时，发酵结束。以前述的HPLC方法检测发酵液中的24元环状缩肽化合物PF1022A的含量，为3060ug/ml。

实施例7：制备24元环状缩肽化合物PF1022A

(1)平板菌落的制备及一级种子液的制备见实施例5。

(2)种子罐种子液的制备

在10L的种子罐中投入6L的种子培养基(种子培养基同实施例5)，用蒸汽灭菌，12℃，20min，待冷却至25℃后接入一级的摇瓶种子液500ml。搅拌转速200rpm，通气量0.8vvm，25℃培养60小时，此时种子液pH6.2-6.8，菌丝浓度20-30％(体积比)。

(3)发酵罐发酵液的制备

发酵培养基的配方与实施例6相同，但还要再添加1％的消泡剂，发酵罐体积50L，投料体积30L，用蒸汽灭菌，12℃，20min，待冷却至25℃后接入种子罐种子液3L。搅拌转速200-500rpm(转速在前3天逐渐从200rpm升至500rpm，之后一直维持在500rpm)，通气量0.8-1.0vvm(通气量在前3天逐渐从0.8vvm升至1.0vvm，之后一直维持在1.0vvm)，25℃培养240小时，结束发酵，放罐。以前述的HPLC方法检测发酵液中的24元环状缩肽化合物PF1022A的含量，为3290ug/ml。

实施例8：从发酵液中提取24元环状缩肽化合物PF1022A

(1)按发酵液体积，向其中加入3-6％(w/v)硅藻土，搅拌均匀后，进行板框压滤。用水顶洗至基本无色，收集菌丝体。

(2)加入菌丝体3倍体积的甲醇(V/V)，搅拌浸提6-8小时。过滤，收集滤液。如收率较低，进行二次浸提。

(3)将滤液于50-55℃下减压浓缩，真空度≤-0.085Mpa，浓缩至滤液体积的5％。

(4)加入浓缩液1/2体积的乙酸乙酯，搅拌10min后，静置2-5h后分液，收集上层清液。如果萃取收率＜90％，按相同步骤进行二次萃取分液。向得到的有机相萃取液中加入一倍体积的5％碳酸氢钠，搅拌洗涤5-10min后，静置2-5h进行分液，收集上层清液。如有机层颜色较深，进行二次洗涤。将萃取液于50-55℃下减压浓缩，真空度≤-0.085Mpa，至膏状，停止浓缩。

(5)向浓缩膏状中加入一定量的硅胶，搅拌均匀后拌干。硅胶(100-200目)湿法装柱(称取硅胶，加入正庚烷，搅拌均匀，装柱)。上样量按照产品重量：硅胶重量＝1:30～1:40计算。上柱结束，用3BV正庚烷:乙酸乙酯＝5:1(V/V)预洗。预洗完毕后，改用体积比为正庚烷：乙酸乙酯＝3:1的冲柱，分段收集。

(6)将洗脱液于50-55℃下进行减压浓缩，控制真空度≤-0.08MPa，浓缩至膏状。

(7)向浓缩膏状中加入一定量的甲醇，溶解，浓度为100-200g/l，室温条件下搅拌30min后，降温至温度为0-4℃，搅拌结晶8-12h后，抽滤。抽滤时用少量冰冷甲醇淋洗至产品颜色为纯白色。如果产品纯度低于95％，进行二次结晶。

(8)控制温度30℃～35℃，真空度≤-0.09Mpa，干燥6～8h。

所得的纯品经MS分析确定其分子量为948.52，通过¹H-NMR及¹³C-NMR分析，确定其为24元环状缩肽化合物PF1022A，结构如下：

Claims

1.一种座坚壳菌(Rosellinia sp.)HS-NF-1412Z，其保藏编号为CGMCC NO.13893且具有产生24元环状缩肽化合物PF1022A的能力。

2.根据权利要求1所述的座坚壳菌HS-NF-1412Z在制备24元环状缩肽化合物PF1022A中的应用，或生产含有PF1022A的药物组合物中的应用。

3.一种发酵生产24元环状缩肽化合物PF1022A的方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的座坚壳菌HS-NF-1412Z在含有可同化的碳源和氮源的培养基里进行液体深层发酵的步骤。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述可同化的碳源选自淀粉、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、甘油、麦芽糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、棉子糖、果糖、工业糖蜜、豆油、菜籽油之一或者上述物质的组合。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述可同化的氮源选自牛肉浸膏、酵母浸膏、玉米浆、酵母抽提物、麦芽抽提物、酵母粉、蛋白胨、麸质粉、棉籽饼粉、花生饼粉、黄豆饼粉、小麦胚芽粉、大豆粉、脱脂奶粉、尿素、铵盐、硝酸盐之一或者上述物质的组合。

6.根据权利要求3～5任一项所述方法，其特征在于：所述液体深层发酵的温度为15～30℃；pH为4.0～8.0；发酵时间为120-300小时。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：所述液体深层发酵的温度为20～28℃。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于：所述pH为6.0。

9.根据权利要求3～5、7～8任一项所述方法，其特征在于：所述发酵的方式为好氧发酵；通气量为0.5-1.0vvm。