CN112708638B - 具有抑制线虫作用的提取物以及链霉菌以及它们的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有抑制线虫作用的提取物以及链霉菌以及它们的应用。本发明提供了一种制备灰略红链霉菌的发酵物的方法，包括如下步骤：将灰略红链霉菌MS180023进行发酵，得到发酵物。本发明还提供了一种制备灰略红链霉菌的提取物的方法，包括如下步骤：取所述发酵物的上清液，采用有机试剂进行提取，收集提取液；将所述提取液进行减压蒸馏以去除有机溶剂，得到提取物。本发明还保护灰略红链霉菌MS180023。本发明还保护灰略红链霉菌MS180023、所述发酵物、所述发酵物的上清液或所述提取物的应用：在制备线虫抑制剂中的应用；(b)在抑制线虫中的应用。

Description

具有抑制线虫作用的提取物以及链霉菌以及它们的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及具有抑制线虫作用的提取物以及链霉菌以及它们的应用。
背景技术
根结线虫是一类植物寄生性线虫，会引起植物根形成根结，植物更容易感染其他真菌和细菌性病害。线虫可寄生于超过2000种植物上。
根结线虫主要以卵和2龄幼虫随根瘤在土壤中，或直接在土壤中越冬，在土壤无寄主植物的情况下可存活3年之久。2龄幼虫为根结线虫的侵染龄，通常由根尖侵入。 线虫在寄主根结或根瘤内生长发育至4龄，雄虫与雌虫交尾，交尾后雌虫在根结内产 卵，雄虫钻出寄主组织进入土中自然死亡。根结内的卵孵化成2龄幼虫，离开寄主进 入土中，生活一段时间重新侵入寄主或留在土壤中越冬。
土温达10℃以上时，卵可孵化，幼虫多在土层1-20厘米处活动。土温高于40℃ 或低于10℃很少活动，温度55℃，10分钟致死。适宜土壤相对湿度40-70％。在干燥 或过湿土壤中，其活动受到抑制。适宜土壤pH4-8。土壤质地疏松、盐分低的条件适 宜线虫活动，有利发病，一般砂土较粘土发病重，连作地发病重。
根结线虫直接危害蔬菜根部，受害作物根部瘤状突起、生长不良、沤根腐烂。由 于根系受到影响，大多数受害植株初期地上部分生长迟缓，叶片变小、变黄，呈点片 缺肥状，不结实或结实不良，严重时生长停滞，节间缩短，植株矮小甚至萎蔫。根结 线虫破坏了根组织的正常分化和生理活动，水分和养料的运输受到阻碍，光合作用下 降，果实常发生畸形或着色不均匀，造成产量下降，品质降低。
由于药物的广泛使用，根结线虫随之发生了耐药现象，因此需要筛选新的药物，用于农业线虫防治。
发明内容
本发明的目的是提供具有抑制线虫作用的提取物以及链霉菌以及它们的应用。
本发明提供了一种制备灰略红链霉菌的发酵物的方法，包括如下步骤：将灰略红链霉菌MS180023进行发酵，得到发酵物。
所述发酵的条件具体可为：28℃、200rpm振荡培养10天。
所述发酵采用发酵培养基；每升发酵培养基中加入的原料如下：5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5 克MgSO4·7H2O和2克碳酸钙，余量为水。
所述发酵培养基的制备方法具体可为：取5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、 2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5克MgSO4·7H2O和2克 碳酸钙溶于水，调pH至7.0-7.5，用水定容至1L，115℃灭菌30分钟。
所述发酵具体可为：将5ml种子液加入100ml发酵培养基中，28℃、200rpm振荡 培养10天。
所述种子液具体可为OD600nm＝1.2-1.4的种子液。
所述种子液的制备方法具体可为：将斜面菌种挖块接种至100ml种子培养基， 28℃、200rpm振荡培养5天，得到OD600nm＝1.2-1.4的种子液。
种子培养基的制备方法具体可为：将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物和4克葡 萄糖溶于水，调pH至7.0-7.2，用水定容至1L，115℃灭菌30分钟。
发酵容器中的内容物即为发酵物。
所述方法制备得到的发酵物也属于本发明的保护范围。
所述发酵物的上清液也属于本发明的保护范围。发酵物的上清液的制备方法具体如下：将所述发酵物20℃、10000rpm离心10分钟，收集上清液。
本发明还提供了一种制备灰略红链霉菌的提取物的方法，包括如下步骤：
将灰略红链霉菌MS180023进行发酵，得到发酵物；
取所述发酵物的上清液，采用有机试剂进行提取，收集提取液；
将所述提取液进行减压蒸馏以去除有机溶剂，得到提取物。
所述发酵的条件具体可为：28℃、200rpm振荡培养10天。
所述发酵采用发酵培养基；每升发酵培养基中加入的原料如下：5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5 克MgSO4·7H2O和2克碳酸钙，余量为水。
所述发酵培养基的制备方法具体可为：取5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、 2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5克MgSO4·7H2O和2克 碳酸钙溶于水，调pH至7.0-7.5，用水定容至1L，115℃灭菌30分钟。
所述发酵具体可为：将5ml种子液加入100ml发酵培养基中，28℃、200rpm振荡 培养10天。
所述种子液具体可为OD600nm＝1.2-1.4的种子液。
所述种子液的制备方法具体可为：将斜面菌种挖块接种至100ml种子培养基， 28℃、200rpm振荡培养5天，得到OD600nm＝1.2-1.4的种子液。
种子培养基的制备方法具体可为：将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物和4克葡 萄糖溶于水，调pH至7.0-7.2，用水定容至1L，115℃灭菌30分钟。
发酵容器中的内容物即为发酵物。
发酵物的上清液的制备方法具体如下：将所述发酵物20℃、10000rpm离心10分钟，收集上清液。
所述有机试剂具体可为乙酸乙酯。
采用有机试剂进行提取具体可为：取发酵物的上清液，用等体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集位于上层的乙酸乙酯相；剩余的水相再次 用等体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集位于上层的乙酸 乙酯相；剩余的水相再次用等体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层 后，收集位于上层的乙酸乙酯相；合并三次萃取得到的乙酸乙酯相，减压蒸馏以除去 有机溶剂，得到的产物即为提取物。
所述减压蒸馏的温度具体可为40℃。
所述方法制备得到的提取物也属于本发明的保护范围。
本发明还保护灰略红链霉菌MS180023。
灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)MS180023，已于2020年12月02 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21279。
本发明还保护灰略红链霉菌MS180023、所述发酵物、所述发酵物的上清液或所述提取物的应用，为如下(a)或(b)：
(a)在制备线虫抑制剂中的应用；
(b)在抑制线虫中的应用。
以上任一所述线虫具体可为根结线虫。
以上任一所述线虫具体可为南方根结线虫。
本发明提供的灰略红链霉菌MS180023的发酵提取物具有很高的抗根线虫的活性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域 普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等， 如无特殊说明，均可从商业途径得到。DMSO全称为二甲基亚砜。
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、菌株的分离、鉴定和保藏
一、菌株MS180023的采集
2018年8月从南海海泥中分离到一株菌，命名为菌株MS180023。
二、菌株MS180023的鉴定
形态特征：菌落凸起，菌丝生长旺盛，基内菌丝为浅黄色，气生菌丝显现为白色，并有白色孢子，无水溶性色素产生。
16S rRNA基因部分序列见序列表的序列1，与GENBANK ACCESSION NO.KY783422.1的序列相似性最高，相似性为99.93％。
根据鉴定结果，菌株MS180023属于灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)。
三、菌株MS180023的保藏
灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)MS180023，已于2020年12月02 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.21279。
实施例2、制备灰略红链霉菌MS180023的粗提物并检测其对根结线虫的抑制作用一、制备灰略红链霉菌MS180023的粗提物
1、将灰略红链霉菌MS180023划线接种于斜面培养基，28℃静置培养5天(使气 生菌丝生长丰满)，得到斜面菌种。
斜面培养基的制备方法：将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物、4克葡萄糖和20 克琼脂粉溶于水，调pH至7.0-7.2，用水定容至1L，115℃灭菌30分钟。
2、将种子培养基分装于500ml三角瓶中(100ml/瓶)，将斜面菌种挖块接种至种 子培养基，28℃、200rpm振荡培养5天，得到OD600nm＝1.2-1.4的种子液。
种子培养基的制备方法：将4克酵母浸提物、10克麦芽浸提物和4克葡萄糖溶于水，调pH至7.0-7.2，用水定容至1L，115℃灭菌30分钟。
3、将5ml种子液加入100ml发酵培养基中，28℃、200rpm振荡培养10天。
发酵培养基的制备方法：取5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、 2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5克MgSO4·7H2O和2克碳酸钙溶于水， 调pH至7.0-7.5，用水定容至1L，115℃灭菌30分钟。
完成本步骤后，发酵容器中的内容物即为发酵产物。
4、完成步骤3后，20℃、10000rpm离心10分钟，收集上清液。
5、取步骤4得到的上清液，用等体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集位于上层的乙酸乙酯相；剩余的水相再次用等体积乙酸乙酯进行萃取， 静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集位于上层的乙酸乙酯相；剩余的水相再次用等 体积乙酸乙酯进行萃取，静置待水相与乙酸乙酯相分层后，收集位于上层的乙酸乙酯 相；合并三次萃取得到的乙酸乙酯相，40℃减压蒸馏以除去有机溶剂，得到的产物即 为粗提物。
平均每个三角瓶得到0.2-0.5g粗提物。
二、检测粗提物对根结线虫的抑制作用
取步骤一制备的粗提物，用DMSO溶解，使粗提物浓度为1000μg/μL，即为粗提 物溶液。
取南方根结线虫卵囊，洗净，放置到0.5％次氯酸钠水溶液中消毒3min，再用无 菌水反复冲洗3次以洗去次氯酸钠，然后进行孵化，每隔两天观察并收集二龄幼虫。 取二龄幼虫，用无菌水悬浮，得到线虫悬液，每50μL线虫悬液中含100条二龄幼虫。
取24孔板，每孔加入50μL线虫悬液、200μL粗提物溶液和150μL无菌水，用 移液器轻轻吹打混匀，然后28℃静置12h，然后统计线虫死亡率。
用等体积DMSO代替代替粗提物溶液作为阴性对照。
进行三次重复试验，每次重复试验至少设置3个重复处理，结果取平均值。
阴性对照组线虫死亡率为6.5％。粗提物处理组线虫死亡率为86.1％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨 和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发 明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本 发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的 改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 具有抑制线虫作用的提取物以及链霉菌以及它们的应用
<130> GNCYX203182
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1429
<212> DNA
<213> Streptomyces griseorubens
<400> 1
ggccggggcg cgtgcttacc atgcagtcga cgatgaacct ccttcgggag gggattagtg 60
gcgaacgggt gagtaacacg tgggcaatct gccctgcact ctgggacaag ccctggaaac 120
ggggtctaat accggatact gacccgcttg ggcatccaag cggttcgaaa gctccggcgg 180
tgcaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtgaggt aatggctcac caaggcgacg 240
acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga aagcctgatg cagcgacgcc 360
gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcagggaaga agcgaaagtg 420
acggtacctg cagaagaagc gccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480
gcgcgagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggctt gtcacgtcgg 540
ttgtgaaagc ccggggctta accccgggtc tgcagtcgat acgggcaggc tagagttcgg 600
taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg 660
gtggcgaagg cggatctctg ggccgatact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggcactaggt gtgggcgaca 780
ttccacgtcg tccgtgccgc agctaacgca ttaagtgccc cgcctgggga gtacggccgc 840
aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgtggcttaa 900
ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttgacatac accggaaagc atcagagatg 960
gtgcccccct tgtggtcggt gtacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtccc gtgttgccag caggcccttg 1080
tggtgctggg gactcacggg agaccgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt 1140
caagtcatca tgccccttat gtcttgggct gcacacgtgc tacaatggcc ggtacaatga 1200
gctgcgatac cgcgaggtgg agcgaatctc aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc 1260
tgcaactcga ccccatgaag tcggagtcgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga 1380
agccggtggc ccaacccctt gtgggaggga gcttcgaagg tgacgccgc 1429

Claims (9)

1.一种制备灰略红链霉菌的发酵物的方法，包括如下步骤：将灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens) MS180023进行发酵，得到发酵物；灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens) MS180023，其保藏登记号为CGMCC No.21279。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述发酵的条件为：28℃、200rpm振荡培养10天。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述发酵采用发酵培养基；每升发酵培养基中加入的原料如下：5克淀粉、20克葡萄糖、10克大豆粉、2克蛋白胨、2克酵母浸提物、4克氯化钠、0.5克K2HPO4、0.5克MgSO4•7H2O和2克碳酸钙，余量为水。
4.权利要求1至3中任一所述方法制备得到的发酵物。
5.权利要求4所述发酵物的上清液。
6.一种制备灰略红链霉菌的提取物的方法，包括如下步骤：
取权利要求5所述发酵物的上清液，采用乙酸乙酯进行提取，收集提取液；
将所述提取液进行减压蒸馏以去除乙酸乙酯，得到提取物。
7.权利要求6所述方法制备得到的提取物。
8.灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens) MS180023，其保藏登记号为CGMCCNo.21279。
9.权利要求8所述灰略红链霉菌、权利要求4所述发酵物、权利要求5所述发酵物的上清液或权利要求7所述提取物的应用，为如下（a）或（b）：
（a）在制备线虫抑制剂中的应用；
（b）在抑制线虫中的应用。
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