CN1230182A - 制备环状缩肽化合物的方法和新的环状缩肽 - Google Patents

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Abstract

已知的环状缩肽(PF1022F物质和PF1022H物质)以及新的环状缩肽(PF1022G物质),现在可通过培养能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的真菌菌株同时制备,其代表性真菌菌株是已知的PF1022菌株(以FERMBP－2671保藏),该菌株是一种属于无孢子半知菌(无孢目)或者可假定属于炭角菌科炭角菌属或者座坚壳属的真菌。该PF1022G物质具有上式。

Description

制备环状缩肽化合物的方法和新的环状缩肽
发明所属技术领域
本发明涉及制备PF1022F物质和已知为环状缩肽的PF1022H物质的发酵方法，以及制备属于新缩肽的PF1022G物质的方法。本发明还涉及作为新的缩肽的PF1022G物质。
背景技术
迄今为止，已知一些具有抗蠕虫活性的化合物。在这样的化合物中，越霉素A、潮霉素B、除虫菌素和其它药物可以作为这样的已知化合物的例子，它们是微生物的产物并具有抗蠕虫活性，但是它们在已知有抗蠕虫活性的化合物中只占很小的一部分。Takagi等早期进行调查以搜寻具有抗生活在家禽体内的蛔虫的抗蠕虫活性物质，结果发现了作为微生物产物的PF1022物质(也可以称为PF1022A物质)，PF1022物质可分类为具有抗蠕虫活性的环状缩肽(参照，日本专利申请第一次公开Kokai Hei3-35796，日本专利号2608479，美国专利号5,116,815，和欧洲专利申请第一次公开号0382173A2)。这一PF1022物质是由下式(A)表示的环状缩肽：
Figure A9719790500051
其中Me表示甲基，Me在下文给出的说明中有相同的意义。
PF1022物质是由L-N-甲基亮氨酸[(CH3)2CHCH2CH(NHCH3)COOH](代码：H-L-MeLeu-OH)、D-乳酸[CH3CH(OH)-COOH](代码：H-D-Lac-OH)和D-苯基乳酸[C6H5CH2CH(OH)COOH](代码：H-D-PhLac-OH)构成的环状缩肽，该物质通过酯键和酰胺键而相互键合。PF1022物质也可以由下式(B)表示。式(B)：
环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac)(B)
本发明者还发现了作为微生物产物的PF1022B物质、PF1022C物质和PF1022D物质，并且这些物质是具有抗蠕虫活性的与PF1022有关的化合物(参照，日本专利申请第一次公开Kokai Hei5-170749)。此外，还发现了作为微生物产物的PF1022E物质(参照，日本专利申请第一次公开Kokai Hei6-184126)。这里所利用的微生物是下文描述的PF1022菌株。在PCT申请PCT/JP94/00252的国际公开说明书WO94/19334(1994年9月1日公开)，以及在欧洲专利申请第一次公开说明书号0685469A1中，给出了PF1022B-E物质的结构式。
在日本专利申请第一次公开Kokai Hei5-320148和日本专利申请第一次公开Kokai Hei6-340694中，也在上述的PCT国际公开说明书WO94/19334中，描述了一系列由本发明者通过化学合成方法产生的环状缩肽衍生物以及制备它们的方法。此外，在日本专利申请第一次公开Kokai Hei5-229997、PCT申请PCT/JP93/00286的国际公开说明书WO93/19053、美国专利号5,514,773和PCT申请PCT/JP94/01446的国际公开说明书WO95/07272中，给出了由Nishiyama等通过化学合成制备的另一系列的环状缩肽以及它们的制备方法。
此外，上述PCT国际公开说明书WO94/19334的实施例3和8分别描述了PF1022-002物质和PF 1022-202物质，这些物质都是由本发明者通过化学合成得到的。在PCT申请PCT/JP96/02730(国际申请日期：1996年9月20日)的PCT国际公开说明书WO97/11064(1997年3月27日公开)中，以另一个名称PF1022F物质报道PF 1022-002物质，以另一个名称PF1022H物质报道PF1022-202物质。提交的PCT申请PCT/JP96/02730要求了日本专利申请Hei7-244051(1995年9月22日申请)的优先权，并且要求了一系列这样的由本发明者最近合成的PF1022物质的新衍生物。
顺便提一句，在PCT申请PCT/EP96/05190(国际申请日期：1996年11月25日)的PCT国际公开说明书WO97/20945(1997年6月12日公开)中，Jeschke等提出了一种制备包含作为环缩肽的成分之一的芳基乳酸的环缩伏的方法，该方法包含在Mycellia sterilia(其是不能形成分生孢子的真菌的属名)的微生物菌株(以DSM10345保藏)存在时，或者在自所说的微生物菌株中提取的酶存在时，转化氨基酸(如4-硝基苯基丙氨酸)或者2-羟基羧酸(如4-硝基苯基乳酸)。
一般认为所谓的寄生虫病可以引起严重的伤害，不仅有害于人类和动物的健康，而且也有害于在农业上栽培的有用植物。在这一方面来说，总是十分需要提供一些具有抗蠕虫活性的新而有用的物质，也确实需要提供一些能够有利地产生这样的新物质的方法。
考虑到上述要求，我们(本发明者)在早期进行了一系列调查，基于该调查，我们已经成功地提供了一种制备一系列上述的已知或者新的环状缩肽及其衍生物的新发酵方法和新的化学合成方法，其中环状缩肽和它们的衍生物具有抗蠕虫活性，并因此可用作为寄生虫病的治疗和预防药物。
上述PF1022H物质是由本发明者通过化学合成获得的环状缩肽，并且我们还发现：如果PF1022H物质的官能团(一个或者多个)可进一步得到化学修饰，那么这一PF1022H物质也可用作为制备一系列具有改善的抗蠕虫活性的缩肽衍生物的原材料。
作为制备具有如以上结构式(A)所示的复合环状骨架的环状缩肽的措施，有两条途径，即一条途径为化学合成途径，而另一条途径为微生物培养途径。由微生物培养制备环状缩肽的发酵方法是经过所利用的微生物的作用产生具有复杂结构的所需物质。与化学合成方法相比，考虑到所需的全部时间、劳力和费用及其它方面，发酵方法在实践上一般是有利的，并且可以用更容易和更便利的方式实施发酵方法。
基于上述几个理由，要求由微生物培养而非化学合成途径以更便利的方式制备PF1022F物质和PF1022H物质。也要求通过微生物培养由这样便利的发酵方法制备这样的目前还没有在文献中公开的新环状缩肽，因为这样的新环状缩肽将具有如下的可能性：它们具有抗蠕虫活性或者其它一些药学上有用的活性，并且它们可用作为化学合成其它一些具有某些有用活性的衍生物的中间材料。
因此，本发明的目的之一是提供一种由微生物培养制备PF1022F物质和PF1022H物质的新方法。本发明的另一个目的是提供了由微生物培养制备的新的、有用的环状缩肽。
发明的公开
为了实现上述目的，我们进行了各种微生物的培养，并研究了所获得的这些微生物的代谢产物。作为这些研究的一部分，我们还详细地调查了这些在丝状真菌PF1022菌株(按照布达佩斯条约作为FERMBP-2671保藏)的培养肉汤中产生的物质，其中据判断上述菌株属于无孢目，并且以前没有在制备具有上述式(A)的PF1022A物质的发酵方法中使用过(参照，日本专利号2608479和美国专利号5,116,815)，也没有在制备PF1022B、C、D和E物质的发酵方法中使用过。结果是，现在我们发现：在所说的PF1022菌株的培养肉汤中，同时产生和积累PF1022F物质和PF1022H物质。
我们还发现在相同的PF1022菌株的培养肉汤中也产生新的环状缩肽，并且我们已指定这一新物质为PF1022G物质。此外，我们成功地从所产生的PF1022菌株的培养物中回收了PF1022F物质、PF1022H物质和PF1022G物质，然后分别纯化和分离了这些物质。进一步说，我们检测了PF1022G物质的物理化学性质，并且确定了其化学结构式，并由此确认了PF1022G物质是新的环状缩肽。
PF1022F物质是由下式(B)表示的环状缩肽：
Figure A9719790500091
其中Me表示甲基，Me与下文所给出的下列说明中的Me具有相同的意义。
PF1022H物质是由下式(C)表示的环状缩肽：
现在由本发明者获得的新PF 1022G物质是由下式(D)表示的环状缩肽：
Figure A9719790500101
我们还研究了上述PF1022菌株(以FERM BP-2671保藏)的分类学差异，但是我们目前还不能完全说明PF1022菌株的分类学位置，因为PF1022菌株是这样一种不造成任何分生孢子形成的真菌。然而，按照我们的用于分析PF1022菌株的18S rDNA的碱基序列的系统分析法，可以肯定地认为它属于炭角菌科，并且现在假定它接近于炭角菌科的炭角菌属或者座坚壳属。
因此，在本发明中，一般假设或者暂时地认为PF1022菌株是属于炭角菌属或者座坚壳属的菌株。
因此，按照本发明的第一方面，提供了制备PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的方法，这些物质都可由下列的通式(Ⅰ)表示
Figure A9719790500102
其中R1和R2之每个都表示PF1022F物质的甲基基团，但R1表示甲基而R2则表示PF1022G物质的对羟苄基基团，并且R1和R2之每个都表示PF1022H物质的对羟苄基基团，该方法包括：在包含碳和氮源的培养基中培养真菌菌株(该菌株能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质并属于炭角菌属或者座坚壳属)，由此在所产生的培养物中产生和积累PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质，从所说的培养物中回收PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质，然后使PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质彼此之间单独地分离。
能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的真菌菌株(其将要用于本发明的第一方面的方法中)，可以是那些能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的菌株之任一种，只要它属于炭角菌科的炭角菌属或者座坚壳属。能够产生PF1022F物质、PF022G物质和PF1022H物质的真菌菌株的一个优选例子是上述的PF1022菌株，该菌株是一种无孢子的半知菌，并且分离自在日本的Ibaraki Prefecture收集到的植物样品。
PF1022菌株已按照布达佩斯条约保藏在生物科学和人类技术国家研究所，工业科学和技术代理机构(位于No.1-3,1-chome,Higashi,Tsukuba-shi,Ibaraki Prefecture，日本)，自1989年1月24日起以保藏号FERM P-10504保藏，然后自1989年12月4日起以保藏号FERM BP-2671保藏。
在日本专利申请Kokai号Hei3-35796的说明书、美国专利号5,116,815的说明书和抗生素杂志，Vol.45,692页～(1992)中详尽地描述了PF1022菌株的真菌学性质。
象其它的无孢子半知菌菌株(无孢目)一样,PF1022菌株在其性质方面是易变的。因此，例如，PF1022菌株本身或得自该菌株的任何突变体、表型缀合物(自然产生或者人工诱导的)或所说的菌株的基因重组体都可以用于实践本发明方法，只要它们能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质。
在按照本发明的第一方面的方法中，按照下列培养方法培养能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的真菌菌株。
因此，在按照本发明的第一方面的方法中，在包含这样的普通碳源和氮源(一般能被微生物利用作为营养物)的培养基中，培养产生上述PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的菌株。作为这样的营养物，可以利用那些已知用于真菌培养的营养物。例如，可用作为碳源的是常用的碳源，如葡萄糖、蔗糖、淀粉糖浆、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动物油、植物油等等。可用作为氮源的是常用的氮源，如大豆粉、麦胚、玉米浆、棉籽油、肉膏、蛋白胨、酵母抽提物、硫酸铵、硝酸钠、尿素等等。如果需要，则可以在培养基中有效地加入能够产生钾、钙、镁、钴、氯化物、磷酸盐、硫酸盐以及其它离子的无机盐。此外，也可以加入适当量的能够促进真菌菌株生长并因此促进PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质产生的有机和无机物质。
对于所说的菌株的培养方法，在需氧条件下实施培养方法是合适的，尤其是在浸没条件下实施培养方法是最合适的。15-30℃的温度范围是适合于培养的，但是在大多数情况中，优选的是在大约26℃温度下进行培养。在摇瓶培养或者罐式培养中，PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的产生通常将在2至10天之后达到最大积累量，虽然所需要的培养时间可以变化(取决于培养基的组成和所使用的培养条件)。当PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的积累量达到它们的最大值时，终止培养步骤。然后由过滤或离心操作分离所产生的培养物，以给出包含培养细胞和其它固相材料的固相部分，并给出肉汤滤液。可以利用助滤剂(如硅藻土等等)进行过滤操作。
用下列方式可以回收通过上述的微生物菌株培养产生的PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质。因此，一般可以由通常的利用其物理化学性质的分离方法(例如，由单独的或适当地结合在一起的溶剂萃取或者吸附、离子交换树脂处理、分配柱色谱法、凝胶过滤、透析、沉淀等等)实现从所产生的培养物中回收PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质。
由于PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质不溶于水，因此这些物质主要存在于培养细胞中而非肉汤滤液中。因此，具体地说，可以用有机溶剂或含水有机溶剂(例如甲醇或乙酸乙酯、或者丙酮-水、乙腈-水等)从培养细胞中提取PF1022F、G和H物质。此外，为了使PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质彼此间分离，以及然后纯化它们之每种，可以利用以硅胶(例如Wako凝胶C-200，由Wako Junyaku K.K.生产)、氧化铝或等等作为吸附剂的层析方法，或者有诸如葡聚糖凝胶LH-20(Pharmacia公司的产品)、Toyopal HW-40(Toso有限公司的产品)之类的凝胶过滤剂的层析方法。对于进一步纯化，可以由单一溶剂(如甲醇、乙酸乙酯等)或混合溶剂(如甲醇-水、乙酸乙酯-正己烷、二乙醚-正己烷等)结晶PF1022F物质、PF1022G物质或PF1022H物质之每种。
通过采用单独的或任一适当结合的上述分离和纯化方法，可以彼此分离得到高纯度的PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质。
此外，理想的是按照本发明的第一方面的方法包括以下步骤：从所产生的培养物中分离出能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的菌株的培养细胞，提取用有机溶剂或含水有机溶剂分离的培养细胞以获得包含PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的抽提物，浓缩所说的抽提物使包含PF1022G物质和PF1022H物质的结晶得以沉淀于其中，过滤所产生的浓缩溶液以分离所说的结晶和包含PF1022F物质的滤液，并从结晶中分别分离出PF1022G物质和PF1022H物质，以及也从所说的滤液中分离出PF1022F物质。
此外，按照我们的进一步研究，本发明者现在已经发现：当以可以在培养基(包含普通碳与氮源)中进行PF1022菌株培养(存在以基于培养基重量的0.1-5％重量强制加入的对羟苯基乳酸或其钠或钾盐)的这样一种方法进行上述PF1022菌株(用作为能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的菌株)的培养时，结果是，与当在缺少加入的对羟苯基乳酸的条件下进行所说的菌株的培养时的情况相比，在所说的培养基中产生的PF1022H物质的浓度可以增加高达大约3倍或以上，并且还发现：然后可以从产生的以提高的产量形成的培养物中回收PF1022H物质。在这种情况下，也存在增加PF1022G物质的产量的可能性。
因此，按照本发明的第二方面，提供了制备PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质并伴有PF1022H物质的高效产生的方法，该方法包括：在包含碳和氮源的培养基中以及在存在对羟苯基乳酸或者其钠或钾盐(以基于培养基重量的0.1-5％量加入培养基中)的条件下，在15-30℃的培养温度下，培养作为能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的真菌菌株的PF1022菌株(以FERMBP-2671保藏)，继续培养PF1022菌株直到PF1022H物质的浓度在所产生的培养物中达到或接近其最大值，由此在所产生的培养物中产生和积累PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质以及PF1022A物质、PF1022B物质、PF1022C物质、PF1022D物质PF1022E物质，然后从培养物中回收PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质，此后使PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质彼此分离。
在按照本发明的第二方面的方法中，也以与按照本发明第一方面相同的方法进行PF1022菌株的培养和PF1022F、G和H物质从培养物中的回收。
然而，在按照本发明的第二方面的方法中，优选的是这一方法包括以下步骤：从由PF1022菌株产生的培养物中分离出PF1022菌株的培养细胞，用甲醇提取所分离的培养细胞以获得包含PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质以及PF1022A物质、PF1022B物质、PF1022C物质、PF1022D物质和PF1022E物质的甲醇溶液，然后从所说的甲醇溶液中蒸馏出甲醇以给出浓缩液，在室温或者更低温度下搅拌浓缩液以使包含PF1022A物质、PF1022B物质、PF1022C物质、PF1022D物质和PF1022E物质以及PF1022G物质和PF1022H物质的混合物的结晶得以沉淀，从包含仍然溶于其中的PF1022F物质的母液中过滤出结晶，然后通过由重结晶结合层析方法使PF1022G物质和PF1022H物质彼此分离来从所说的结晶中回收PF1022G物质和PF1022H物质，从过滤上述结晶之后余下的母液中进一步回收和分离PF1022F物质。
此外，按照本发明的第三方面，提供了新的环状缩肽，该物质是由下式表示的PF1022G物质：
Figure A9719790500151
PF1022G物质为熔点是138.1-139.4℃的无色晶状粉末形式，其具有下文给出的实施例1-2所详尽描述的物理化学性质。PF1022G物质具有抗家禽蛔虫的抗蠕虫活性。
按照本发明产生的PF1022F、G和H物质，可以用作为合成抗蠕虫活性的环状缩肽衍生物的原料。例如，PF1022G物质和PF1022H物质之每种都可以用于制备各种其它的环状缩肽衍生物，该制备通过利用化学反应(可用于正常酚羟基基团)的化学修饰和转化由处理在PF1022G或H物质的苄基上的羟基实现。典型地，PF1022G物质可以用作为合成在上文所述的WO95/07272的说明书中公开的化合物的中间体，并且PF1022H物质可以用作为合成在WO93/19053或WO97/11064的说明书中公开的化合物的中间体。对于制备PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的工业方法(其中所有PF1022F、G和H物质可以同时由包括按照本发明的微生物培养的发酵方法产生)来说，它是特别有利的。此外，本发明的方法具有高的工业价值，其中这些方法可以通过便利过程提供PF1022F-H物质，这些物质可用作为由化学转变合成其它环状缩肽衍生物的中间体。
附图的简要描述
图1显示在含氘氯仿溶液中在270MHz处测定的PF1022F物质的质子核磁共振光谱，其中横坐标表示化学位移(ppm:δ)。
图2显示在含氘氯仿溶液中在270MHz处测定的PF1022G物质的质子核磁共振光谱，其中横坐标表示化学位移(ppm:δ)。
图3显示在含氘氯仿-含氘甲醇的混合溶液中在270MHz处测定的PF1022H物质的质子核磁共振光谱，其中横坐标表示化学位移(ppm:δ)。
实施本发明的最佳方式
现在给出本发明的实施例。由于PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的性质已经在本发明中得到描述，因此可以在本发明的范围之内，按照PF1022F、G和H物质的这些性质，以各种方式改进由微生物培养制备PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的方法。因此，本发明并不限制于下列实施例，但是包括对下文给出的实施例的可能改进。实施例1
(a)包含2.0％可溶淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％多胨、0.6％麦胚、0.3％酵母抽提物、0.2％豆饼、0.2％碳酸钙和平衡水的培养基用作为种子培养基。培养基包含2.0％葡萄糖、1.0％淀粉、0.8％麦胚、1.3％豆饼、0.38％肉膏、0.13％氯化钠、0.15％碳酸钙和平衡水的培养基。通过在灭菌之前调整pH值至7.0来利用所有这些培养基。
按照下述方法进行PF1022菌株的培养：
将40ml上述种子培养基放置到200ml容量三角瓶中。然后在三角瓶中在120℃下将种子培养基灭菌15分钟，然后用每个三角瓶2-3铂环量的PF1022菌株(以FERM BP-2671保藏)的斜面培养物接种之。在26℃下进行48小时的摇瓶培养，以给出初级种子培养物。然后，将500ml的如上所述的具有相同组成的种子培养基放置到2升容量的三角瓶中，在120℃下灭菌15分钟，并用含有所说的初级种子培养物的两个三角瓶中的内容物接种之，其后在26℃下摇动培养PF1022菌株48小时。此外，将如上所述的种子培养基(500升)装填在1升容量的发酵罐中，在120℃下灭菌25分钟，然后用含有所说的初级种子培养物的5个三角瓶中的内容物接种之，其后在26℃下搅拌培养48小时以给出罐种子培养物。
然后，将如上的生产培养基(5千升)装入容量为10千升的发酵罐，在120℃下灭菌25分钟。以上述获得的0.5千升罐装种子培养物接种这样灭菌的生产培养基，然后在26℃时在通气、搅拌条件下培养7天。完成培养之后，以加入的硅藻土作为助滤剂过滤所获得的培养肉汤，以产生PF1022菌株的培养细胞(大约2700千克)。
(b)按照下述步骤进行从培养细胞回收1022F-H物质：
因此，加入甲醇(14.4千升)至以上获得的培养细胞(大约2700千克)中，搅拌所产生的混合物3小时。此后，过滤出细胞以产生细胞的甲醇提取物。在减压条件下从甲醇提取物中蒸馏出甲醇，以给出浓缩溶液(960升)。在室温条件下搅拌浓缩溶液一天一夜，通过过滤收集所产生的沉淀的晶体(初级晶体)。
这样获得的初级晶体(大约60千克)由以下物质混合组成：PF1022A物质、PF1022B物质、PF1022C物质、PF1022D物质、PF1022E物质、PF1022F物质、PF1022G物质、PF1022H物质和其它细胞组分。滤液也包含上述的PF1022A物质、PF1022B物质、PF1022C物质、PF1022D物质、PF1022E物质、PF1022F物质、PF1022G物质、PF1022H物质以及其它细胞组分，但这些组分在滤液中所占比例不同于其在初级晶体中所占比例，而PF1022F物质在滤液中的比例要相对高些。存储所获得的初级母液用于以后从其中回收PF1022F物质。
用N-庚烷(200升)洗涤上述的初级晶体两次。洗涤之后将留下的晶体溶解在甲醇(500升)中，并往溶液中加入活性炭(12千克)。搅拌得到的混合物1小时。过滤之后，在减压条件下浓缩得到的滤液至170升体积。在室温下搅拌这样获得的浓缩溶液24小时，并通过过滤收集沉淀得到的晶体(二级晶体)。
二级晶体(大约35千克)由主要组分PF1022A物质和以下物质混合组成：PF1022C物质、PF1022D物质、PF1022E物质和PF1022G物质。
用N-庚烷(每次240升)洗涤二级晶体两次，然后将其溶解在甲醇(350升)中，在减压条件下浓缩甲醇溶液至100升体积。室温下搅拌所获得的浓缩溶液24小时，通过过滤收集这样获得的晶体(三级晶体)。
这样获得的三级晶体(大约31千克)包含高纯度的PF1022A物质。
(c)过滤出二级晶体时保留的滤液(母液)包含PF1022A、B、C、D、E、F、G和H物质。另一方面，过滤出三级晶体时余下的滤液(母液)包含PF1022A、C、D、E和G物质。在减压条件下混合和浓缩这两种滤液至65升体积。以N-庚烷洗涤这样沉淀获得的晶体两次(分别为25升和23升)，然后在减压条件下干燥以获得晶体(8.2千克)。
这样获得的晶体由以下物质混合组成：PF1022A物质、PF1022B物质、PF1022C物质、PF1022D物质、PF1022E物质、PF1022G物质和PF1022H物质。将一半量(4.1kg)的这种晶体溶解在氯仿(10升)中，并用硅胶柱色谱法(Wako凝胶C-300,20千克)分析获得的氯仿溶液。硅胶柱首先用氯仿-乙酸乙酯(6∶1)组成的展开剂(380升)洗脱，然后再用氯仿-乙酸乙酯(1∶1)组成的展开剂(140升)洗脱。将洗脱物收集在50升组分中。洗脱物的8-10号组分包含主要成分PF1022E物质、PF1022G物质和PF1022H物质，并将它们混合在一起，然后在减压条件下浓缩之。
这样获得的粉末(158g)由PF1022E物质、PF1022G物质和PF1022H物质混合组成。从乙酸乙酯(800升)中结晶粉末(158g)，通过过滤收集晶体。将这样获得的晶体(121.6g)的一部分(22.5g)溶解在甲苯(10ml)中，甲苯溶液用于硅胶柱色谱法(Wako凝胶C-200,100g)。用包含乙酸乙酯-正己烷(1∶1)的展开剂进行洗脱，并将洗脱物收集在20ml组分中。在减压条件下混合洗脱物的38-42号组分并将其浓缩至干，以提供PF1022G物质(34.7mg)。在减压条件下混合洗脱物的44-48号组分并将其浓缩至干，以提供PF1022H物质(26.5mg)。
(d)另一方面，在减压条件下浓缩在上述过滤初级晶体操作中余下的存储滤液(初级晶体母液)至干，形成粉末。将所说粉末的一部分(2.35kg)溶于氯仿(10升)中，所得溶液用于硅胶柱色谱法(Wako凝胶C-300,20千克)。硅胶柱首先用氯仿-乙酸乙酯(6∶1)组成的展开剂(420升)洗脱，然后用由氯仿-乙酸乙酯(1∶1)组成的展开剂(120升)洗脱。将洗脱物收集在50升组分中。洗脱物的10号组分包含PF1022E物质、PF1022F物质、PF1022G物质和这样洗脱的其它物质，并在减压条件下浓缩10号组分。
这样获得的粉末(45.0g)用于硅胶柱色谱法(Wako凝胶C-300,550g)。用氯仿-乙酸乙酯(3∶1)组成的展开剂(4升)进行洗脱，洗脱物收集在500ml组分中。在减压条件下混合并浓缩包含PF1022F物质的3-7号组分，以提供包含PF1022E物质，PF1022F物质和其它物质的粉末(9.19g)。
将这一粉末溶解在60％含水乙腈中，所得的溶液用于反相柱色谱法(Cosmosil 75C180PN,100g)。首先用60％含水乙腈(500ml)，然后用70％的含水乙腈(400ml)，最后用80％的含水乙腈(900ml)进行洗脱。将所获得的洗脱物收集在200ml组分中。在减压条件下混合并浓缩包含PF1022E物质的2-8号组分，以提供PF1022F物质的粗制粉末(6.53g)。
将这一粗制粉末溶解在甲苯(30ml)中，所获得的溶液用于硅胶柱色谱法(Wako凝胶C-200,260g)。先用由正己烷-乙酸乙酯(55∶45)组成的展开剂(1升)洗脱，然后用正己烷-乙酸乙酯(1∶1)组成的展开剂(2升)洗脱，最后用正己烷-乙酸乙酯(45∶55)组成的展开剂(1升)洗脱。将洗脱物收集在200ml组分中。在减压条件下混合并浓缩仅包含PF1022F物质的洗脱物的20～21号组分，以提供PF1022F物质(143mg)。实施例2
(a)在每个250ml的三角瓶中，放置具有与如上描述的实施例1相同的组成的种子培养基(50ml)。在120℃条件下消毒三角瓶15分钟后，用2-3铂环量的PF1022菌株的斜面培养物接种之，然后在26℃下培养3天。将得到的培养肉汤分为两部分。其中一部分加入重量含量为0.3％(基于所说的一部分中存在的培养基重量)的对羟苯基乳酸。再在26℃下单独培养这两部分各3天。用甲醇提取得自两部分培养肉汤的培养细胞的方法类似于实施例1(b)中所公开的方法。由液相柱色谱法分析所得的两种甲醇提取物中的PF1022H物质的浓度(μg/ml)(柱：GL科学公司产品，Inertsil ODS-2:4.6mmφX250mm；温度40℃，流速1ml/min；测定在210nm处的UV，流动相包括80％乙腈+0.1％三氟乙酸；保留时间5.0分钟)。然后，进行比较以评估两种情况(当培养细胞得自对羟苯基乳酸存在情况下的PF1022菌株培养物以及得自无对羟苯乳酸情况下的PF1022菌株的培养物时)下，在所得的培养细胞的甲醇提取物中的PF1022H物质的产量的差别。结果发现，在对羟苯基乳酸存在情况下，培养细胞的甲醇提取物中的PF1022H物质的浓度为132μg/ml，而在无对羟苯基乳酸存在情况下，培养细胞的甲醇提取物中的PF1022H物质的浓度为35μg/ml。
(b)在一百个250ml的三角瓶之每个中，放置具有与实施例1(a)中描述相同的组成的培养基(50ml)。上述一百个三角瓶中的种子培养基在120℃下灭菌15分钟。此后，一百个三角瓶之每一个中的培养基(种子培养基总体积：5升)，以2-3铂环量的PF1022菌株(以FERMBP-2671保藏)接种之，然后在26℃下培养3天。
然后，向每个三角瓶中的所得培养物中加入对羟苯基乳酸，以便所说的酸基于存在于每一三角瓶中的培养基重量的重量含量为0.3％。在通气和搅拌条件下在26℃下继续培养PF1022菌株另3天。培养完成之后，以加入的硅藻土为助滤剂过滤所得的培养肉汤，由此获得PF1022菌株的培养细胞(大约2.5千克)。
(c)在这样获得的培养细胞(2.5千克)中加入甲醇(13升)并搅拌3小时。此后，将细胞过滤出去以便给出培养细胞的甲醇提取物。从甲醇提取物蒸馏出甲醇以产生浓缩溶液(870ml)。当初级晶体沉淀时，在室温下搅拌浓缩溶液24小时。通过过滤收集初级晶体，这样获得的初级晶体(55g)用N-庚烷洗涤，然后将其再一次溶解于甲醇(450ml)中。所得的甲醇溶液用类似于实施例1(b)的方法处理，即用活性碳处理以及随后的浓缩和结晶处理。由此获得二级晶体(32g)以及通过过滤二级晶体得到滤液(二级晶体的母液)。将得到的二级晶体再一次溶解于如实施例1(b)的甲醇(320ml)中，再一次浓缩和结晶处理这样获得的甲醇溶液，由此产生三级晶体(28g)以及通过过滤三级晶体得到滤液(三级晶体的母液)。
(d)混合和浓缩以上所获得的二级晶体的母液和三级晶体的母液至60ml体积。得到的晶体用N-庚烷洗涤两次，并在减压条件下干燥以产生晶体(7.5g)。
将以上所获得的晶体溶解在氯仿中，得到的氯仿溶液用于类似于实施例1(c)中的硅胶柱色谱法。在减压条件下收集和浓缩这样洗脱的包含PF1022E物质、PF1022G物质和PF1022H物质的洗脱物组分，给出一种包含PF1022E物质、PE1022G物质和PF1022H物质的粗制粉末，然后由乙酸乙酯重结晶。
再一次将这种重结晶的晶体溶解于甲苯中，所得的甲苯溶液用于如实施例1(c)中的硅胶柱色谱法(以乙酸乙酯-正己烷，1∶1展开)，这样可提供包含PF1022G物质的洗脱物组分以及包含PF1022H物质的洗脱物组分。
在减压条件下单独浓缩包含PF1022G物质的组分和包含PF1022H物质的组分至干，分别提供PF1022G物质(11.5mg)和PF1022H物质(8.8mg)。
这样获得的PF1022G物质、PF1022F物质和PF1022H物质的物理化学性质如下：
(ⅰ)PF1022F物质的物理-化学性质：
(1)颜色和外观：无色针状晶体；
(2)熔点：168-170℃；
(3)分子式：C40H68N4O12
(4)质谱(FAB-MS):m/z 797(M+H)+；
(5)比旋：[α]D 25-680(C 0.15，甲醇)；
(6)紫外吸收光谱(在甲醇溶液中)：
    λmax nm(E1cm 1％)262(3.6)；
(7)红外吸收光谱(IR-Card)：
   ν(cm-1)2957、2361、1744、1663、1468、1414、1281、1202、
   1152、1080、1030、583；
(8)1H-核磁共振光谱(δ:ppm)：
    图1中显示的是利用TMS(四甲基硅烷)作为内标用含氘氯仿
    测定的PF1022F物质在270MHz处的1H-核磁共振光谱。
(9)溶解性：溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇以及二甲基亚砜；
   不溶于水和正己烷；
(10)在硅胶稀薄层层析(TLC)上的Rf值：
   当在硅胶平板60F254(厚度0.25mm,Merck公司产品)上
   利用氯仿-乙酸乙酯(1∶2)的洗脱液时，Rf值是0.34；
(11)碱性、酸性或中性分类：中性物质；
(ⅱ)PF1022G物质的物理化学性质：
(1)颜色和外观：无色晶状粉末；
(2)熔点：138.1-139.4℃；
(3)分子式：C46H72N4O13
(4)质谱(FAB-MS):m/z 889(M+H)+；
(5)比旋：[α]D 25-760(C 0.10，甲醇)；
(6)紫外吸收光谱(在甲醇溶液中)：
   λmax nm(E1cm 1％)278(6.3)；
(7)红外吸收光谱(在KBr颗粒中)：
   ν(cm1)3424、2959、2872、2363、2342、1744、1665、1518、
   1468、1416、1372、1327、1271、1198、1127、1080、1030、
   833、507、422；
(8)1H-核磁共振光谱(δ:ppm)：
   图2中显示的是利用TMS(四甲基硅烷)作为内标用含氘氯仿
   测定的PF1022G物质在270MHz处的1H-核磁共振光谱。
(9)溶解性：溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇以及二甲基亚砜；
   不溶于水和正己烷；
(10)在硅胶薄层层析(TLC)上的Rf值：
   当在硅胶平板60F254(厚度0.25mm，Merck公司产品)上
   利用氯仿-乙酸乙酯(1∶2)的洗脱液时，Rf值是0.32；
(11)碱性、酸性或中性分类：中性物质；
(ⅲ)PF1022H物质的物理化学性质
(1)颜色和外观：无色晶状粉末；
(2)熔点：224.2-225.4℃；
(3)分子式：C52H76N4O14
(4)质谱(FAB-MS):m/z 981(M+H)+；
(5)比旋：[α]D 25-970(C 0.10，甲醇)；
(6)紫外吸收光谱(在甲醇溶液中)：
   λmax nm(E1cm 1％)278(6.3)；
(7)红外吸收光谱(IR-Card)：
   ν(cm-1)2959、2363、1744、1657、1518、1468、1273、
   1209、1155、478；
(8)1H-核磁共振光谱(δ:ppm)：
   图3中显示的是利用TMS(四甲基硅烷)作为内标用含氘氯仿
   测定的PF1022H物质在270MHz处的1H-核磁共振光谱。
(9)溶解性：溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯、甲醇以及二甲基亚砜；
   不溶于水和正己烷；
(10)在硅胶稀薄层层析(TLC)上的Rf值：
(10)在硅胶稀薄层层析(TLC)上的Rf值：
    当在硅胶平板60F254(厚度0.25mm,Merck公司产品)上利
    用氯仿-乙酸乙酯(1∶2)的洗脱液时，Rf值是0.25；
(11)碱性、酸性或中性分类：中性物质；
工业适用性
如上所述，现在可由按照本发明的方法通过便利的途径产生PF1022F物质和PF1022H物质以及新的环状缩肽(PF1022G物质)，其中该方法包括培养能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的真菌菌株，这些菌株属于炭角菌科的炭角菌属或者座坚壳属。
这样产生的PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质是有抗蠕虫活性的环状缩肽，并且其可用作为原料用来化学合成有更高抗蠕虫活性的已知或者新的PF1022物质的衍生物。

Claims (7)

1．一种制备PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的方法，其中这些物质可由下列的通式(Ⅰ)表示：
Figure A9719790500021
其中R1和R2之每个都表示PF1022F物质的甲基基团，但R1表示PF1022G物质的甲基而R2则表示对羟苄基基团，并且R1和R2之每个都表示PF1022H物质的对羟苄基基团，该方法包含：在包含碳和氮源的培养基中培养能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质并属于炭角菌属或者座坚壳属的真菌菌株，由此在所产生的培养物中产生和积累PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质，从所说的培养物中回收PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质，然后使PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质彼此之间单独地分离。
2．按照权利要求1的方法，其中已按照布达佩斯条约以保藏号FERM BP-2671保藏在日本的工业科学和技术代理机构的生物科学和人类技术国家研究所的PF1022菌株用作为能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的菌株。
3．按照权利要求1的方法，其中在15-30℃温度下培养能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的菌株。
4．按照权利要求1的方法，该方法包括以下步骤：从所产生的培养物中分离出能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的菌株的培养细胞，提取用有机溶剂或含水有机溶剂分离的培养细胞以获得包含PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的抽提物，浓缩所说的抽提物使包含PF1022G物质和PF1022H物质的结晶得以沉淀于其中，过滤所产生的浓缩溶液以分离和回收所说的结晶和包含PF1022F物质的滤液，并从结晶中分别分离出PF1022G物质和PF1022H物质，以及也从所说的滤液中分离出PF1022F物质。
5．一种伴有高度有效地产生PF1022H物质的制备PF1022F物质，PF1022G物质和PF1022H物质的方法，该方法包括：在包含碳和氮源的培养基中以及在存在对羟苯基乳酸或者其钠或钾盐(以基于培养基重量的0.1-5％量加入培养基中)的条件下，在15-30℃的培养温度下，培养作为能够产生PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质的真菌菌株的PF1022菌株(以FERM BP-2671保藏)，继续培养PF1022菌株直到PF1022H物质的浓度在所产生的培养物中达到或接近其最大值，由此在所产生的培养物中产生和积累PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质以及PF1022A物质、PF1022B物质、PF1022C物质、PF1022D物质PF1022E物质，然后从培养物中回收PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质，此后使PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质彼此分离。
6．按照权利要求5的方法，该方法包括以下步骤：从由PF1022菌株产生的培养物中分离出PF1022菌株的培养细胞，用甲醇提取所分离的培养细胞以获得包含PF1022F物质、PF1022G物质和PF1022H物质以及PF1022A物质、PF1022B物质、PF1022C物质、PF1022D物质和PF1022E物质的甲醇溶液，然后从所说的甲醇溶液中蒸馏出甲醇以给出浓缩液，在室温或者更低温度下搅拌浓缩液以使包含PF1022A物质、PF1022B物质、PF1022C物质、PF1022D物质和PF1022E物质以及PF1022G物质和PF1022H物质的混合物的结晶得以沉淀，从包含仍然溶于其中的PF1022F物质的母液中过滤出结晶，然后通过由重结晶结合层析方法使PF1022G物质和PF1022H物质彼此分离来从所说的结晶中回收PF1022G物质和PF1022H物质，从过滤上述结晶之后余下的母液中进一步回收和分离PF1022F物质。
7．一种新的环状缩肽，该物质是由下式表示的PF1022G物质：
Figure A9719790500041
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