CN106749569B - 一种pf1022a的分离纯化方法 - Google Patents
一种pf1022a的分离纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种的分离纯化方法,具体采用溶剂萃取并结合结晶的方法进行分离纯化,本发明的技术方案不需要经过硅胶柱层析,也不用色谱柱(HPLC制备柱)进行分离,与现有技术相比,溶剂用量少,产生的废液少,对环境污染小,同时也降低了生产成本,非常适合工业化生产应用。
Description
技术领域
本发明属于工业微生物技术领域,具体涉及一种PF1022A的分离纯化方法。
背景技术
寄生虫病是目前最为严重的人畜共患病之一,严重影响着畜牧业的健康发展与人类的生命安全。艾默德斯(Emodepside),是一种环八缩酚酸肽类新型驱虫药物,对动物胃肠道线虫非常有效。当艾默德斯用到线虫,被证明能可抑制寄生线虫的肌肉蠕动,抑制线虫头部运动和咽部运动,除此之外还对其它组织有影响,如抑制产卵。
艾默德斯是PF1022A的半合成衍生物,PF1022A(结构式如式1所示)为半知菌无孢霉(Mycelia sterilia)产生的活性成分,是一个对动物低毒、防治谱广、效果好的驱虫剂。该24元环缩肽化合物最早由Sasaki等人从天然产物中分离得到,之后通过不同的方法进行了人工合成。最近的一系列科学研究表明,PF1022A可以与七螺旋状类latrophilin跨膜受体的氨基位点相结合,该受体分离自捻转血矛线虫(Haemonchus contortus Rudolphi),其作用是诱导外部钙流入细胞。这种抗线虫药物的作用模式与已知的驱虫剂,如苯并咪唑类、咪唑并噻唑类、大环内酯类的作用机理大不相同。
目前,关于PF1022A提取分离的文献报道极少,中国专利CN1080932A公开了一种通过化学合成的方法制备PF1022A后,用硅胶层析分离纯化的方法。另外两篇专利CN1189159A和CN1232446A公开了采用不同的化学合成方法制备PF1022A后,同样也是通过硅胶层析得到产品的方法。专利CN1046940A公开了采用发酵培养方法制备PF1022A,以及分离纯化方法,其中分离纯化方法主要通过采用混合溶剂进行萃取,上柱HP20树脂进行粗提后,再通过硅胶或凝胶介质进行层析,最后通过高效液相制备柱(ODS柱)进行精制,以得到更高纯度的产品。
现有技术中,大多数纯化方法均需要用到硅胶柱层析或用到色谱柱(如高效液相色谱)分离,工业化生产过程中需要用到大量溶剂,导致大量废液需要处理,环境污染大,生产成本高,长期大量有机溶剂的接触对操作人员的身体健康构成威胁,面对日益提高的市场需求量和产品质量要求,本领域急需找到一种能提高产品收率和纯度的同时,降低生产成本、简化操作步的方法,以满足工业化生产的需求。
发明内容
为达到上述目的,本发明提供了一种环境污染小,纯化方法简单,生产成本低,适合工业化生产的PF1022A的分离纯化方法。
具体,本发明提供了一种PF1022A的分离纯化方法,包括以下步骤:
1)向发酵液中加入助滤剂、搅拌,板框压滤得到菌丝渣;
2)用极性溶剂浸提菌丝渣,过滤,得到浸提液;
3)将浸提液浓缩至无极性溶剂流出,加入萃取溶剂进行萃取;
4)将得到的萃取有机相进行浓缩,得到浓缩浸膏粗品A;
5)将粗品A用极性溶剂结晶得到PF1022A晶体。
其中,步骤1)中所述的助滤剂为珍珠岩或硅藻土;更进一步的优选所述助滤剂的用量为每升发酵液使用30-60g,更优选为每升发酵液使用30-40g助滤剂;
步骤2)中所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯或其中任意混合溶剂,加入量为每千克菌丝渣使用2~5L极性溶剂;其中浸提时间可根据本领域常规的方法确定,优选浸提6~15小时。
步骤3)中所述的萃取溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或二氯甲烷;优选其加入量为浓缩液提交的50%~100%(v/v);萃取所需要时间是本领域普通技术人员通过常规方法可以确定的,在本发明中,优选1~4小时。
步骤3)4)中所述的浓缩优选为减压旋转蒸发方式进行浓缩。
步骤5)所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇或其中任意的混合溶剂,优选,所述极性溶剂用量为每克粗品A使用1~60ml极性溶剂,优选每克粗品A使用2-30ml极性溶剂;优选,步骤5)的具体操作为,将合适用量的上述极性有机溶剂加入到粗品A种,于合适的温度(如30~45℃)下搅拌一定时间(如1~2小时),然后自然降温结晶,优选结晶时的温度控制在2~10℃,更优选4~8℃,结晶时间为2~16h,优选8~12h。进一步的,优选将所得晶体用冰的结晶溶剂淋洗,其使用量优选为结晶母液的1%~50%(v/v),优选10%(v/v)。其中结晶所用的极性溶剂优选含水量不超过20%(v/v),更优选所述极性溶剂含水量不超过10%,最优选所述极性溶剂含水量不超过5%,或基本不含水。
上述方法中,优选,进一步还包括步骤6):将步骤5)得到的晶体干燥,得到PF1022A精粉;所述的干燥为包括但不限于真空干燥,其中选择真空干燥时,优选温度控制在30~40℃,干燥时间为2~16h。
为达到特定或追求更高纯度,本领域技术人员可以选择将上述方法中步骤5)和步骤6)重复操作一次或多次。
本发明技术人员通过大量的实验研究发现,本发明技术方案步骤2)中浸提溶剂的选择对步骤5)的能否顺利实现结晶影响非常大;例如当步骤2)的浸提溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯或其中任意混合溶剂时,步骤5)结晶溶剂采用甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇或其中任意的混合溶剂时,均能够较好的完成结晶;而当步骤2)中采用其他溶剂,如丙酮作为浸提溶剂时,经过步骤4)浓缩得到浸膏粗品A,在下一步结晶过程中,发明人尝试了采用各种溶剂,如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇或其中任意的混合溶剂以及调整结晶温度、溶剂用量等,均难以析出晶体。
虽然CN1189159A中也提到采用甲醇结晶的方法纯化PF1022A,但该专利公开的方法需要在甲醇中加入大量的水,而发明人通过多次重复该方法发现,该专利公开的方法无法实现PF1022A分离纯化的目的,实验过程中发现采用甲醇结晶PF1022A过程中,加入水30%或以上,甚至水含量超过20%时会直接产生固体沉淀,而非结晶。
与CN1189159A中公开的技术方案不同的是,本发明采用含水量不超过20%的极性有机溶剂进行结晶,特别优选的是基本不含水的极性有机溶剂进行结晶,结晶后通过冰的结晶溶剂淋洗晶体,纯化得到的PF1022A纯度好,收率高。
由于本发明的技术方案不需要经过硅胶柱层析,也不用色谱柱(HPLC制备柱)进行分离,与现有技术相比,溶剂用量少,产生的废液少,对环境污染小,同时也降低了生产成本,非常适合工业化生产应用。
附图说明
图1显示实施例1中PF1022A发酵浸提液的HPLC图谱;
图2显示为实施例1中PF1022A精粉的HPLC图谱。
具体实施例
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制。
实施例1
PF1022A发酵液放罐32L,发酵单位为320ug/ml(10.24g)。向其中加入2000g硅藻土,搅拌均匀后进行板框压滤,得到9.3kg湿菌丝渣,将其置于45℃烘箱中烘干至水分含量为20%,得到6.5kg的块状干菌丝渣。将菌丝渣用20L乙酸乙酯浸提,搅拌10小时后过滤,得到21L浸提液(纯度:80.2%,HPLC的图谱见图1),单位为454ug/ml(9.54g)。将浸提液于50℃下浓缩至无溶剂流出,加入与浓缩液体积相等的乙酸乙酯萃取液,室温下搅拌十分钟后静置1h,分液,得到萃取有机相3650ml,单位为2438ug/ml(8.90g),向其中加入一定量的无水硫酸钠进行有机相脱水后浓缩至膏状,得到105g浓缩浸膏粗品A,向浸膏粗品A种,加入少量丙酮搅拌溶解完全后,置于4℃冰箱中搅拌结晶10h,抽滤并用少量的冰丙酮淋洗,得到白色的结晶体6.14g,含量为92%(5.65g),最后将湿晶体在真空度-0.9MPa,30℃下,真空加热干燥8h,得到高纯度的白色PF1022A精粉6.00g,含量为94%(5.60g),纯度为99.76%(HPLC的图谱见图2)。
PF1022A的HPLC检测方法:
反相HPLC分析采用的色谱柱为XB-C18(5um,4.6*250mm),保持温度在40℃。以乙腈︰水=80:20(v/v)作流动相,流速为1.0ml/min,并在220nm下UV检测,运行30min。样品用乙腈溶解成单位约500ug/ml,进样量为20ul。
实施例2
PF1022A发酵液放罐30L,发酵单位为404ug/ml(12.00g)。向其中加入1500g硅藻土,搅拌均匀后进行减压抽滤,得到9.1kg湿菌丝渣,向其中加入27L甲醇浸提,搅拌8小时后过滤,得到28L浸提液(HPLC的图谱与图1类似),单位为401ug/ml(11.20g)。将浸提液于55℃下减压浓缩至无溶剂流出,加入与浓缩液体积相等的二氯甲烷萃取液,室温下搅拌十分钟后静置2h,分液,得到萃取有机相3730ml,单位为2560ug/ml(9.50g),向其中加入一定量的无水硫酸钠进行有机相脱水后浓缩至膏状,得到96g浓缩浸膏粗品A,向浸膏粗品A中加入少量甲醇搅拌溶解完全后,置于4℃冰箱中搅拌结晶10h,抽滤并用少量的冰甲醇淋洗,得到白色的结晶体6.82g,含量为93%(6.35g),最后将湿晶体在真空度-0.9MPa,30℃下,真空加热干燥6h,得到高纯度的白色PF1022A精粉6.67g,含量为94.5%(6.30g),纯度为99.65%,总收率为52.50%。
实施例3
PF1022A发酵液放罐32L,发酵单位为368ug/ml(11.77g)。向其中加入1500g硅藻土,搅拌均匀后进行减压抽滤,得到8.8kg湿菌丝渣,向其中加入26L乙醇浸提,搅拌10小时后过滤,得到27L浸提液(HPLC的图谱与图1类似),单位为405ug/ml(10.95g)。将浸提液于55℃下减压浓缩至无溶剂流出,加入与浓缩液体积相等的乙酸乙酯萃取液,室温下搅拌十分钟后静置2h,分液,得到萃取有机相4320ml,单位为2165ug/ml(9.34g),向其中加入一定量的无水硫酸镁进行有机相脱水后浓缩至膏状,得到105g浓缩浸膏粗品A,向浸膏粗品A中,加入少量乙醇搅拌溶解完全后,置于4℃冰箱中搅拌结晶10h,抽滤并用少量的冰乙醇淋洗,得到白色的结晶体6.86g,含量为91%(6.25g),最后将湿晶体在真空度-0.9MPa,30℃下,真空加热干燥6h,得到高纯度的白色PF1022A精粉6.59g,含量为94%(6.20g),纯度为99.58%。
实施例4
PF1022A发酵液放罐33L,发酵单位为420ug/ml(13.86g)。按照实施例2的方法进行操作得到73g浓缩浸膏粗品A,向浸膏中加入20ml甲醇溶解完全后,置于4℃冰箱中搅拌结晶10h,抽滤并用少量的冰甲醇淋洗,得到12.10g白色的结晶体B,含量为80%(9.68g),纯度为89.60%(其中RRT=0.50杂质峰面积为5.60%,RRT=0.60杂质峰面积为3.30%)。
称取晶体B各10份于结晶瓶中,每份0.5g,编号1-10,分别加入不同的极性溶剂,45℃下搅拌溶解,晶体溶解完全后自然降温,然后置于4℃冰箱中过夜搅拌结晶。最后过滤,用1-2ml冰甲醇淋洗,得到湿晶体C,检测各项纯度结果如下:
表1:不同极性溶剂对晶体B的结晶效果
实施例5结晶过程中极性溶剂中含水量对结晶纯度的影响
PF1022A发酵液放罐30L,发酵单位为404ug/ml(12.00g)。向其中加入1500g硅藻土,搅拌均匀后进行减压抽滤,得到9.1kg湿菌丝渣,向其中加入27L甲醇浸提,搅拌8小时后过滤,得到28L浸提液(HPLC的图谱与图1类似),单位为401ug/ml(11.20g)。将浸提液于55℃下减压浓缩至无溶剂流出,加入与浓缩液体积相等的二氯甲烷萃取液,室温下搅拌十分钟后静置2h,分液,得到萃取有机相3730ml,单位为2560ug/ml(9.50g),向其中加入一定量的无水硫酸钠进行有机相脱水后浓缩至膏状,得到96g浓缩浸膏粗品A;向浸膏粗品A中加入如下表2中不同结晶溶剂搅拌溶解后,置于4℃冰箱中搅拌结晶10h,抽滤并用少量的冰甲醇淋洗,得到结晶体B,最后将湿晶体B在真空度-0.9MPa,30℃下,真空加热干燥6h,得到高纯度的白色PF1022A精粉,其中所采用的结晶溶剂及得到的PF1022A精粉纯度如下表2所示:
表2,不同含水量的极性溶剂结晶时,对PF1022A纯度影响:
对比实施例1以丙酮作为浸提溶剂纯化PF1022A
PF1022A发酵液放罐33L,发酵单位为592ug/ml(19.50g)。向其中加入2000g硅藻土,搅拌均匀后进行减压抽滤,得到9.7kg湿菌丝渣,向其中加入30L丙酮浸提,搅拌8小时后过滤,得到32L浸提液,单位为532ug/ml(17.02g)。将浸提液于55℃下减压浓缩至无溶剂流出,加入与浓缩液体积相等的乙酸乙酯萃取液,室温下搅拌十分钟后静置2h,分液,得到萃取有机相4260ml,单位为3361ug/ml(14.32g),向其中加入一定量的无水硫酸钠进行有机相脱水后浓缩至膏状,得到134g浓缩浸膏粗品A。
向浸膏粗品A中加入结晶溶剂(甲醇或丙酮或乙醇)搅拌溶解后,置于4℃冰箱中搅拌结晶10h,次日发现烧杯中出现凝结的块状,烧杯置于室温条件下,块状固体慢慢溶解,无晶体出现。
Claims (10)
1.一种PF1022A的分离纯化方法,包括以下步骤:
1)向发酵液中加入助滤剂、搅拌,板框压滤得到菌丝渣;
2)用极性溶剂浸提菌丝渣,过滤,得到浸提液;其中,所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯或其中任意混合溶剂;
3)将浸提液浓缩至无极性溶剂流出,加入萃取溶剂进行萃取;
4)将得到的萃取有机相进行浓缩,得到浓缩浸膏粗品A;
5)将粗品A用极性溶剂结晶得到PF1022A晶体;其中,所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇或其中任意的混合溶剂;所述极性溶剂用量为每克粗品A使用2-30ml极性溶剂。
2.根据权利要求1所述的方法 ,其特征在于步骤1)中所述的助滤剂为珍珠岩或硅藻土。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤2)中所述的极性溶剂加入量为每千克菌丝渣使用2~5L极性溶剂。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤3)中所述的萃取溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或二氯甲烷。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤3)和4)中所述的浓缩为减压旋转蒸发。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的结晶时的温度控制在2~10℃,结晶时间为2~16h。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤5)还包括结晶后,用冰的结晶溶剂进行淋洗所得PF1022A晶体。
8.根据权利要求1~6任一项所述方法,其特征在于,还进一步包括步骤6):将步骤5)得到的晶体干燥,得到PF1022A精粉。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于将步骤5)和/或步骤6)重复操作一次或多次。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于步骤6)所述的干燥为真空干燥,温度控制在30~40℃,干燥时间为2~16h。
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