CN106749569B - 一种pf1022a的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种的分离纯化方法，具体采用溶剂萃取并结合结晶的方法进行分离纯化，本发明的技术方案不需要经过硅胶柱层析，也不用色谱柱（HPLC制备柱）进行分离，与现有技术相比，溶剂用量少，产生的废液少，对环境污染小，同时也降低了生产成本，非常适合工业化生产应用。

Description

一种PF1022A的分离纯化方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种PF1022A的分离纯化方法。

背景技术

寄生虫病是目前最为严重的人畜共患病之一，严重影响着畜牧业的健康发展与人类的生命安全。艾默德斯(Emodepside)，是一种环八缩酚酸肽类新型驱虫药物，对动物胃肠道线虫非常有效。当艾默德斯用到线虫，被证明能可抑制寄生线虫的肌肉蠕动，抑制线虫头部运动和咽部运动，除此之外还对其它组织有影响，如抑制产卵。

艾默德斯是PF1022A的半合成衍生物，PF1022A(结构式如式1所示)为半知菌无孢霉(Mycelia sterilia)产生的活性成分，是一个对动物低毒、防治谱广、效果好的驱虫剂。该24元环缩肽化合物最早由Sasaki等人从天然产物中分离得到，之后通过不同的方法进行了人工合成。最近的一系列科学研究表明，PF1022A可以与七螺旋状类latrophilin跨膜受体的氨基位点相结合，该受体分离自捻转血矛线虫(Haemonchus contortus Rudolphi)，其作用是诱导外部钙流入细胞。这种抗线虫药物的作用模式与已知的驱虫剂，如苯并咪唑类、咪唑并噻唑类、大环内酯类的作用机理大不相同。

目前，关于PF1022A提取分离的文献报道极少，中国专利CN1080932A公开了一种通过化学合成的方法制备PF1022A后，用硅胶层析分离纯化的方法。另外两篇专利CN1189159A和CN1232446A公开了采用不同的化学合成方法制备PF1022A后，同样也是通过硅胶层析得到产品的方法。专利CN1046940A公开了采用发酵培养方法制备PF1022A，以及分离纯化方法，其中分离纯化方法主要通过采用混合溶剂进行萃取，上柱HP20树脂进行粗提后，再通过硅胶或凝胶介质进行层析，最后通过高效液相制备柱(ODS柱)进行精制，以得到更高纯度的产品。

现有技术中，大多数纯化方法均需要用到硅胶柱层析或用到色谱柱(如高效液相色谱)分离，工业化生产过程中需要用到大量溶剂，导致大量废液需要处理，环境污染大，生产成本高，长期大量有机溶剂的接触对操作人员的身体健康构成威胁，面对日益提高的市场需求量和产品质量要求，本领域急需找到一种能提高产品收率和纯度的同时，降低生产成本、简化操作步的方法，以满足工业化生产的需求。

发明内容

为达到上述目的，本发明提供了一种环境污染小，纯化方法简单，生产成本低，适合工业化生产的PF1022A的分离纯化方法。

具体，本发明提供了一种PF1022A的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)向发酵液中加入助滤剂、搅拌，板框压滤得到菌丝渣；

2)用极性溶剂浸提菌丝渣，过滤，得到浸提液；

3)将浸提液浓缩至无极性溶剂流出，加入萃取溶剂进行萃取；

4)将得到的萃取有机相进行浓缩，得到浓缩浸膏粗品A；

5)将粗品A用极性溶剂结晶得到PF1022A晶体。

其中，步骤1)中所述的助滤剂为珍珠岩或硅藻土；更进一步的优选所述助滤剂的用量为每升发酵液使用30-60g，更优选为每升发酵液使用30-40g助滤剂；

步骤2)中所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯或其中任意混合溶剂，加入量为每千克菌丝渣使用2～5L极性溶剂；其中浸提时间可根据本领域常规的方法确定，优选浸提6～15小时。

步骤3)中所述的萃取溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或二氯甲烷；优选其加入量为浓缩液提交的50％～100％(v/v)；萃取所需要时间是本领域普通技术人员通过常规方法可以确定的，在本发明中，优选1～4小时。

步骤3)4)中所述的浓缩优选为减压旋转蒸发方式进行浓缩。

步骤5)所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇或其中任意的混合溶剂，优选，所述极性溶剂用量为每克粗品A使用1～60ml极性溶剂，优选每克粗品A使用2-30ml极性溶剂；优选，步骤5)的具体操作为，将合适用量的上述极性有机溶剂加入到粗品A种，于合适的温度(如30～45℃)下搅拌一定时间(如1～2小时)，然后自然降温结晶，优选结晶时的温度控制在2～10℃，更优选4～8℃，结晶时间为2～16h，优选8～12h。进一步的，优选将所得晶体用冰的结晶溶剂淋洗，其使用量优选为结晶母液的1％～50％(v/v)，优选10％(v/v)。其中结晶所用的极性溶剂优选含水量不超过20％(v/v)，更优选所述极性溶剂含水量不超过10％，最优选所述极性溶剂含水量不超过5％，或基本不含水。

上述方法中，优选，进一步还包括步骤6)：将步骤5)得到的晶体干燥，得到PF1022A精粉；所述的干燥为包括但不限于真空干燥，其中选择真空干燥时，优选温度控制在30～40℃，干燥时间为2～16h。

为达到特定或追求更高纯度，本领域技术人员可以选择将上述方法中步骤5)和步骤6)重复操作一次或多次。

本发明技术人员通过大量的实验研究发现，本发明技术方案步骤2)中浸提溶剂的选择对步骤5)的能否顺利实现结晶影响非常大；例如当步骤2)的浸提溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯或其中任意混合溶剂时，步骤5)结晶溶剂采用甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇或其中任意的混合溶剂时，均能够较好的完成结晶；而当步骤2)中采用其他溶剂，如丙酮作为浸提溶剂时，经过步骤4)浓缩得到浸膏粗品A，在下一步结晶过程中，发明人尝试了采用各种溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇或其中任意的混合溶剂以及调整结晶温度、溶剂用量等，均难以析出晶体。

虽然CN1189159A中也提到采用甲醇结晶的方法纯化PF1022A，但该专利公开的方法需要在甲醇中加入大量的水，而发明人通过多次重复该方法发现，该专利公开的方法无法实现PF1022A分离纯化的目的，实验过程中发现采用甲醇结晶PF1022A过程中，加入水30％或以上，甚至水含量超过20％时会直接产生固体沉淀，而非结晶。

与CN1189159A中公开的技术方案不同的是，本发明采用含水量不超过20％的极性有机溶剂进行结晶，特别优选的是基本不含水的极性有机溶剂进行结晶，结晶后通过冰的结晶溶剂淋洗晶体，纯化得到的PF1022A纯度好，收率高。

由于本发明的技术方案不需要经过硅胶柱层析，也不用色谱柱(HPLC制备柱)进行分离，与现有技术相比，溶剂用量少，产生的废液少，对环境污染小，同时也降低了生产成本，非常适合工业化生产应用。

附图说明

图1显示实施例1中PF1022A发酵浸提液的HPLC图谱；

图2显示为实施例1中PF1022A精粉的HPLC图谱。

具体实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制。

实施例1

PF1022A发酵液放罐32L，发酵单位为320ug/ml(10.24g)。向其中加入2000g硅藻土，搅拌均匀后进行板框压滤，得到9.3kg湿菌丝渣，将其置于45℃烘箱中烘干至水分含量为20％，得到6.5kg的块状干菌丝渣。将菌丝渣用20L乙酸乙酯浸提，搅拌10小时后过滤，得到21L浸提液(纯度：80.2％，HPLC的图谱见图1)，单位为454ug/ml(9.54g)。将浸提液于50℃下浓缩至无溶剂流出，加入与浓缩液体积相等的乙酸乙酯萃取液，室温下搅拌十分钟后静置1h，分液，得到萃取有机相3650ml，单位为2438ug/ml(8.90g)，向其中加入一定量的无水硫酸钠进行有机相脱水后浓缩至膏状，得到105g浓缩浸膏粗品A，向浸膏粗品A种，加入少量丙酮搅拌溶解完全后，置于4℃冰箱中搅拌结晶10h，抽滤并用少量的冰丙酮淋洗，得到白色的结晶体6.14g，含量为92％(5.65g)，最后将湿晶体在真空度-0.9MPa，30℃下，真空加热干燥8h，得到高纯度的白色PF1022A精粉6.00g，含量为94％(5.60g)，纯度为99.76％(HPLC的图谱见图2)。

PF1022A的HPLC检测方法：

反相HPLC分析采用的色谱柱为XB-C18(5um，4.6*250mm)，保持温度在40℃。以乙腈︰水＝80:20(v/v)作流动相，流速为1.0ml/min，并在220nm下UV检测，运行30min。样品用乙腈溶解成单位约500ug/ml，进样量为20ul。

实施例2

PF1022A发酵液放罐30L，发酵单位为404ug/ml(12.00g)。向其中加入1500g硅藻土，搅拌均匀后进行减压抽滤，得到9.1kg湿菌丝渣，向其中加入27L甲醇浸提，搅拌8小时后过滤，得到28L浸提液(HPLC的图谱与图1类似)，单位为401ug/ml(11.20g)。将浸提液于55℃下减压浓缩至无溶剂流出，加入与浓缩液体积相等的二氯甲烷萃取液，室温下搅拌十分钟后静置2h，分液，得到萃取有机相3730ml，单位为2560ug/ml(9.50g)，向其中加入一定量的无水硫酸钠进行有机相脱水后浓缩至膏状，得到96g浓缩浸膏粗品A，向浸膏粗品A中加入少量甲醇搅拌溶解完全后，置于4℃冰箱中搅拌结晶10h，抽滤并用少量的冰甲醇淋洗，得到白色的结晶体6.82g，含量为93％(6.35g)，最后将湿晶体在真空度-0.9MPa，30℃下，真空加热干燥6h，得到高纯度的白色PF1022A精粉6.67g，含量为94.5％(6.30g)，纯度为99.65％，总收率为52.50％。

实施例3

PF1022A发酵液放罐32L，发酵单位为368ug/ml(11.77g)。向其中加入1500g硅藻土，搅拌均匀后进行减压抽滤，得到8.8kg湿菌丝渣，向其中加入26L乙醇浸提，搅拌10小时后过滤，得到27L浸提液(HPLC的图谱与图1类似)，单位为405ug/ml(10.95g)。将浸提液于55℃下减压浓缩至无溶剂流出，加入与浓缩液体积相等的乙酸乙酯萃取液，室温下搅拌十分钟后静置2h，分液，得到萃取有机相4320ml，单位为2165ug/ml(9.34g)，向其中加入一定量的无水硫酸镁进行有机相脱水后浓缩至膏状，得到105g浓缩浸膏粗品A，向浸膏粗品A中，加入少量乙醇搅拌溶解完全后，置于4℃冰箱中搅拌结晶10h，抽滤并用少量的冰乙醇淋洗，得到白色的结晶体6.86g，含量为91％(6.25g)，最后将湿晶体在真空度-0.9MPa，30℃下，真空加热干燥6h，得到高纯度的白色PF1022A精粉6.59g，含量为94％(6.20g)，纯度为99.58％。

实施例4

PF1022A发酵液放罐33L，发酵单位为420ug/ml(13.86g)。按照实施例2的方法进行操作得到73g浓缩浸膏粗品A，向浸膏中加入20ml甲醇溶解完全后，置于4℃冰箱中搅拌结晶10h，抽滤并用少量的冰甲醇淋洗，得到12.10g白色的结晶体B，含量为80％(9.68g)，纯度为89.60％(其中RRT＝0.50杂质峰面积为5.60％，RRT＝0.60杂质峰面积为3.30％)。

称取晶体B各10份于结晶瓶中，每份0.5g，编号1-10，分别加入不同的极性溶剂，45℃下搅拌溶解，晶体溶解完全后自然降温，然后置于4℃冰箱中过夜搅拌结晶。最后过滤，用1-2ml冰甲醇淋洗，得到湿晶体C，检测各项纯度结果如下：

表1：不同极性溶剂对晶体B的结晶效果

实施例5结晶过程中极性溶剂中含水量对结晶纯度的影响

PF1022A发酵液放罐30L，发酵单位为404ug/ml(12.00g)。向其中加入1500g硅藻土，搅拌均匀后进行减压抽滤，得到9.1kg湿菌丝渣，向其中加入27L甲醇浸提，搅拌8小时后过滤，得到28L浸提液(HPLC的图谱与图1类似)，单位为401ug/ml(11.20g)。将浸提液于55℃下减压浓缩至无溶剂流出，加入与浓缩液体积相等的二氯甲烷萃取液，室温下搅拌十分钟后静置2h，分液，得到萃取有机相3730ml，单位为2560ug/ml(9.50g)，向其中加入一定量的无水硫酸钠进行有机相脱水后浓缩至膏状，得到96g浓缩浸膏粗品A；向浸膏粗品A中加入如下表2中不同结晶溶剂搅拌溶解后，置于4℃冰箱中搅拌结晶10h，抽滤并用少量的冰甲醇淋洗，得到结晶体B，最后将湿晶体B在真空度-0.9MPa，30℃下，真空加热干燥6h，得到高纯度的白色PF1022A精粉，其中所采用的结晶溶剂及得到的PF1022A精粉纯度如下表2所示：

表2，不同含水量的极性溶剂结晶时，对PF1022A纯度影响：

对比实施例1以丙酮作为浸提溶剂纯化PF1022A

PF1022A发酵液放罐33L，发酵单位为592ug/ml(19.50g)。向其中加入2000g硅藻土，搅拌均匀后进行减压抽滤，得到9.7kg湿菌丝渣，向其中加入30L丙酮浸提，搅拌8小时后过滤，得到32L浸提液，单位为532ug/ml(17.02g)。将浸提液于55℃下减压浓缩至无溶剂流出，加入与浓缩液体积相等的乙酸乙酯萃取液，室温下搅拌十分钟后静置2h，分液，得到萃取有机相4260ml，单位为3361ug/ml(14.32g)，向其中加入一定量的无水硫酸钠进行有机相脱水后浓缩至膏状，得到134g浓缩浸膏粗品A。

向浸膏粗品A中加入结晶溶剂(甲醇或丙酮或乙醇)搅拌溶解后，置于4℃冰箱中搅拌结晶10h，次日发现烧杯中出现凝结的块状，烧杯置于室温条件下，块状固体慢慢溶解，无晶体出现。

Claims (10)

1.一种PF1022A的分离纯化方法，包括以下步骤：

1）向发酵液中加入助滤剂、搅拌，板框压滤得到菌丝渣；

2）用极性溶剂浸提菌丝渣，过滤，得到浸提液；其中，所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯或其中任意混合溶剂；

3）将浸提液浓缩至无极性溶剂流出，加入萃取溶剂进行萃取；

4）将得到的萃取有机相进行浓缩，得到浓缩浸膏粗品A；

5）将粗品A用极性溶剂结晶得到PF1022A晶体；其中，所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇或其中任意的混合溶剂；所述极性溶剂用量为每克粗品A使用2-30ml极性溶剂。

2.根据权利要求1所述的方法 ，其特征在于步骤1）中所述的助滤剂为珍珠岩或硅藻土。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2）中所述的极性溶剂加入量为每千克菌丝渣使用2~5L极性溶剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）中所述的萃取溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯或二氯甲烷。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）和4）中所述的浓缩为减压旋转蒸发。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的结晶时的温度控制在2~10℃，结晶时间为2~16h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤5）还包括结晶后，用冰的结晶溶剂进行淋洗所得PF1022A晶体。

8.根据权利要求1~6任一项所述方法，其特征在于，还进一步包括步骤6）：将步骤5）得到的晶体干燥，得到PF1022A精粉。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于将步骤5）和/或步骤6）重复操作一次或多次。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于步骤6）所述的干燥为真空干燥，温度控制在30~40℃，干燥时间为2~16h。

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