CN104693254A - 一种高纯度多拉菌素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多拉菌素的分离方法，该方法将发酵液经过浸提、浓缩、打浆、结晶等步骤，得到高纯度的多拉菌素。本发明的优点在于采用打浆结晶工艺提取多拉菌素，工艺简单易行，收率高，产品质量高、生产成本低，适宜于工业化生产。

Description

一种高纯度多拉菌素的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种高纯度的多拉菌素的制备方法。

背景技术

寄生虫病是目前最为严重的人畜共患病之一，严重影响着畜牧业的健康发展与人类的生命安全。在众多抗动物体内外寄生虫药物中，阿维菌素类药物(Avermectins)是目前最为优良的一类广谱高效兽用类抗寄生虫药，已商品化的有阿维菌素，伊维菌素(Ivermectin)，多拉菌素(Doramectin)和埃普利诺菌素(Eprinomectin)。其中，多拉菌素为20世纪90年代由美国辉瑞公司研制开发出的新一代大环内酯类抗寄生虫药，是被认为目前阿维菌素类药物中最优秀的药物之一。多拉菌素是由基因重组的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)新菌株通过添加环已甲酸为前体物质发酵而成的一种十六元大环内酯类半合成抗生素，属于第三代阿维菌类药物，其结构式如式1所示：

式1

与其它市售的阿维菌素类产品相比，多拉菌素抗寄生虫范围更广泛，效果更好，而且预防寄生虫再感染的有效时间更长，是目前最具有开发潜力的兽用抗寄生虫药物之一。

目前，关于多拉菌素提取分离的文献报道较少，专利CN98103956.1公开了通过化学法制备多拉菌素的改进方法，及用发酵过程中的副产物进行半合成也可以制备出多拉菌素，但是没有涉及到对发酵液中的多拉菌素的提纯分离。文献《多拉菌素的分离纯化工艺及其微胶囊剂型的初步研究》（邹泽先.多拉菌素的分离纯化工艺及其微胶囊剂型的初步研究[D].武汉,武汉工业学院，2011：14~40）以多拉菌素的提取效果为指标，考察了提取试剂、提取次数、温度、pH、放置时间对发酵液稳定性的影响 ；研究了用国产大孔吸附树脂DM11对浸提液进行分离纯化，纯度由4%升至45%；再通过进行硅胶柱层析精制，可以使纯度达到92.2 %。面对日益提高的市场需求量和产品质量要求，现有分离技术难以达到，主要有如下缺点：1）得到的精品纯度为92.2%，纯度较低，不能满足药品的质量标准(按无水物计算，含多拉菌素不得少于95.0%)；2）进行树脂吸附后再进行硅胶层析分离，产品收率降低，并且增加了操作步骤和生产成本；3）树脂层析解吸过程中需要大量的有机溶剂，对操作人员的身体健康构成威胁，且对环境造成污染，不适合工业化大规模生产。

因此，本领域急需找到一种提高产品的收率和纯度的同时，降低生产成本、操作步骤简单的纯化方法，以克服上述现有技术中存在的缺陷，满足工业化生产的需求。

发明内容

本发明的目的在提供一种产品的收率和纯度高，工艺简单易行，适宜于工业化生产制备高纯度的多拉菌素产品的方法。

本发明提供了一种多拉菌素的纯化方法，所述的方法包括如下步骤：

1）向发酵液中加入助滤剂并搅拌，板框压滤，得到菌丝渣；

所述的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，其用量为每升发酵液使用15~45g助滤剂，优选为每升发酵液使用20~35g助滤剂。

优选地，将得到的菌丝渣烘干至水分含量20%以下。

2）用极性溶剂对菌丝渣进行浸提，过滤，得到浸提液；

所述的极性溶剂为甲醇、乙醇或乙酸丁酯或其中任意混合溶剂，加入量为每千克菌丝渣使用2~5L极性溶剂，优选3~4L极性溶剂；浸提时间为6~15h，优选8~12h。

3）将浸提液浓缩成浸膏，对浸膏进行打浆处理，静置过滤，得到粗品A；

所述的浓缩为旋转蒸发，温度为45~60℃。

所述的打浆处理是指，室温下将浸膏置于打浆液中，搅拌2~8h，优选3~4h。

所述的打浆液为甲基叔丁基醚和乙醇体积比1:2~2:1混合的混合液；优选为1.5:1混合的混合液；用量为与浸膏等质量。

4）用极性溶剂对粗品A进行结晶，并用淋洗溶剂进行淋洗，得到湿晶体；

所述的对粗品A进行结晶、淋洗得到湿晶体步骤，可重复操作一次或多次。

所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、异丁醇、异丙醇或其中任意的混合溶剂，优选体积比为异丁醇:丙酮=9:1~3:7的混合溶剂，更优选为异丁醇:丙酮=5:4；用量为每克粗品A使用5~8ml极性溶剂，40~55℃下边溶解边搅拌1~2h，后自然降温结晶；所述的结晶时的温度控制在2~10℃，结晶时间为2~16h。

所述的淋洗溶剂为冰乙醇或冰丙酮，使用量为与步骤4）中极性溶剂的使用量体积比为0.2~0.3。

所述的淋洗溶剂优选为80%的冰乙醇或60%的冰丙酮。

5）将湿晶体干燥得到多拉菌素精粉。

所述的干燥为真空干燥，温度控制在40~50℃，干燥时间为4~16h。

本申请技术方案和现有技术相比，主要优点在于本技术方法中经过打浆处理，并且打浆液选择为甲基叔丁基醚和乙醇体积比1:2~2:1混合的混合液，充分除去产品中的杂质；其次，用极性溶剂对粗品A进行结晶，极性溶剂的选择为醇或酮或其混合溶剂，优选体积比为丙酮:异丁醇=5:4的混合溶剂，并且溶剂的使用量很小；更进一步地，在步骤4）中采用冰乙醇或冰丙酮溶剂对结晶体进行淋洗，淋洗溶剂优选为80%的冰乙醇或60%的冰丙酮，除去晶体中残留的极性溶剂。申请人意外的发现根据本申请所提供的分离方法，目标产品纯度达到96.6%，含量达到90%，同时分离步骤少，不需要经过硅胶柱或树脂层析，产品收率达到60%左右。

另一方面，现有分离方法中普遍使用树脂和硅胶柱层析，该步骤需要用到大量溶剂，并且硅胶通常不可回收重复再利用，导致生产成本增加，产品价格昂贵。

因此与现有技术相比，本申请提供的分离方法不仅提高了产品质量，而且在较大程度上减轻了工艺操作和对设备的要求，降低了生产成本，而且对环境友好，特别适合工业化生产。

附图说明

图1  为实施例1中多拉菌素发酵浸提液的HPLC图谱，多拉菌素的保留时间约为9.921分钟。

图2   为实施例1中多拉菌素粗品A的HPLC图谱，多拉菌素的保留时间约为14.362分钟。

图3   为实施例1中多拉菌素湿晶体的HPLC图谱，多拉菌素的保留时间约为14.802分钟。

图4   为实施例1中多拉菌素精粉的HPLC图谱，多拉菌素的保留时间约为14.624分钟。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不意味着对本发明有任何限制。中国专利CN88100649公开了一种多拉菌素发酵液的制备方法。

实施例1

多拉菌素发酵液放罐32.7L，发酵单位为1257ug/ml（41.1g）。向其中加入490g硅藻土，搅拌半小时，均匀后进行板框压滤，得到4.2kg湿菌丝渣，将其置于45℃烘箱中烘干至水分含量为20%，得到3.0kg的块状干菌丝渣。将菌丝渣研磨成粉状后用9L乙酸丁酯浸提，搅拌12小时后过滤，得到约9L浸提液（HPLC的图谱见图1和其数据见表1），单位为3633ug/ml（32.7g）。将浸提液于55℃下浓缩至浸膏状，加入与浸膏质量相等的打浆液(甲基叔丁基醚:乙醇=1.5:1(v/v))，室温下搅拌3h后静置过夜，过滤，得到淡黄色粗品A（HPLC的图谱见图2和其数据见表2）87.3g，含量为33.9%（29.6g），纯度为88.5%。

向粗品A中加入370 ml结晶液（异丁醇:丙酮=5:4 (v/v)），50℃下搅拌至粗品A刚好完全溶解，趁热过滤除去少量不溶物，滤液于50℃下搅拌1h后自然降温，然后置于4℃冰箱中过夜搅拌结晶。最后过滤，用75ml80%的冰乙醇淋洗，得到湿晶体（HPLC的图谱见图3和其数据见表3）46.3g，含量为53.4%（24.7g），纯度为95.03%。重复结晶工艺，得到二次湿晶体37.8g，含量为60.3%（22.8g）。最后将二次湿晶体在真空度-0.9MPa，45℃下，真空加热干燥12h，得到高纯度的白色多拉菌素精粉（HPLC的图谱见图4和其数据见表4）23.8g，含量为90%(21.5g)，纯度为96.6%，总收率为59.9% 。

多拉菌素 HPLC检测方法：

反相HPLC分析采用的色谱柱为ZORBAX ECLIPSE PLUS C18（3.5um，4.6*100mm，Agilent），保持在40℃。以甲醇:乙腈:水=67:15:18(v/v)作流动相，流速为1.0ml/min，并在245nm下UV检测，运行25min。

表1：多拉菌素发酵浸提液

峰	保留时间	面积	峰高	%面积
					1	1.068	897282	121565	2.453
2	1.413	135679	10516	0.371
					3	2.047	457948	39082	1.252
4	2.502	797432	88579	2.180
					5	2.887	192703	12396	0.527
6	3.270	252870	28007	0.691
					7	3.675	143099	16749	0.391
8	3.927	42983	6203	0.118
					9	4.302	769688	80639	2.104
10	4.727	301424	41342	0.824
					11	5.002	1680968	167598	4.596
12	5.568	938463	74407	2.566
					13	6.241	142711	5863	0.390
14	7.113	570699	26480	1.560
					15	7.974	1090101	65460	2.980
16	8.626	229412	13045	0.627
					17	9.109	472642	19976	1.292
18	9.921	25931629	1349199	70.896
					19	11.042	22747	1807	0.062
20	11.484	456778	20628	1.249
					21	12.282	586601	21099	1.604
22	13.077	53398	4023	0.146
					23	13.218	44526	5559	0.122
24	13.529	5421	600	0.015
					25	13.813	12485	806	0.034
26	14.432	163203	6679	0.446
					27	15.313	44439	1767	0.121
28	16.022	50164	1755	0.137
					29	18.242	6199	275	0.017
30	21.176	83099	2059	0.227
					总计		36576791	2234163	100.000

表2：多拉菌素打浆后粗品

峰	保留时间	面积	峰高	%面积
					1	3.041	28366	3038	0.175
2	3.715	28338	1456	0.175
					3	4.165	13572	1067	0.084
4	4.616	2815	344	0.017
					5	5.055	5909	612	0.036
6	5.628	52487	3254	0.323
					7	6.220	74465	3724	0.459
8	6.685	367619	24707	2.265
					9	7.525	470928	26629	2.901
10	8.472	12707	637	0.078
					11	9.180	7595	462	0.047
12	9.924	183023	8483	1.128
					13	11.188	135273	5386	0.833
14	12.184	90440	2109	0.557
					15	12.963	141172	4942	0.870
16	14.362	14364858	565662	88.504
					17	15.946	4850	254	0.030
18	16.630	54966	2201	0.339
					19	18.034	161562	3014	0.995
20	19.977	5070	111	0.031
					21	21.366	6679	238	0.041
22	22.988	7708	296	0.047
					23	23.915	10312	325	0.064
总计		16230714	658953	100.000

表3：多拉菌素一次结晶潮品

峰	保留时间	面积	峰高	%面积
					1	3.002	35167	4036	0.235
2	5.137	4850	240	0.032
					3	5.768	8465	663	0.057
4	6.843	44982	3034	0.301
					5	7.719	266690	13351	1.783
6	9.417	5221	280	0.035
					7	10.214	148715	7124	0.994
8	11.649	50272	2005	0.336
					9	12.177	5925	370	0.040
10	13.330	51682	2511	0.346
					11	14.802	14211821	553662	95.026
12	17.118	10631	445	0.071
					13	19.163	111299	1922	0.744
总计		14955721	589644	100.000

表4：多拉菌素二次结晶精粉

峰	保留时间	面积	峰高	%面积
					1	4.935	1631	100	0.012
2	5.706	3400	276	0.025
					3	6.746	33673	2114	0.251
4	7.584	130375	6098	0.973
					5	9.292	3794	195	0.028
6	10.077	74055	3496	0.553
					7	11.515	47774	2136	0.357
8	13.517	34559	1644	0.258
					9	14.624	12941248	507483	96.603
10	16.922	16173	663	0.121
					11	18.845	109621	1942	0.818
总计		13396303	526148	100.000

实施例2

多拉菌素发酵液放罐35L，发酵单位为1000ug/ml（35g）。向其中加入1.5kg硅藻土，搅拌半小时，均匀后进行板框压滤，得到4.5kg湿菌丝渣。将菌丝渣研磨成粉状后用13.5L乙醇浸提，搅拌8小时后过滤，得到约13.5L浸提液，单位为2145ug/ml（29g）。将浸提液于50℃下浓缩至浸膏状，加入与浸膏质量相等的打浆液(甲基叔丁基醚:乙醇=2:1(v/v))，室温下搅拌3h后静置过夜，过滤，得到淡黄色粗品A 78.6g，含量为36.5%（28.7g），纯度为84.1%。

向粗品A中加入700 ml结晶液（异丁醇:丙酮=9:1(v/v)），50℃下搅拌至粗品A刚好完全溶解，趁热过滤除去少量不溶物，滤液于50℃下搅拌1h后自然降温，然后置于4℃冰箱中过夜搅拌结晶。最后过滤，用210 ml60%的冰丙酮淋洗，得到湿晶体42.5g，含量为59.5%（25.3g），纯度为95.24%。最后将湿晶体在真空度-0.9MPa，45℃下，真空加热干燥12h，得到高纯度的白色多拉菌素精粉23.5g，含量为89.3%(21g)，纯度为96.0%，总收率为60% 。

实施例3

多拉菌素发酵液放罐31.2L，发酵单位为1100ug/ml（34.3g）。向其中加入690g硅藻土，搅拌半小时，均匀后进行板框压滤，得到4.6kg湿菌丝渣，将其置于45℃烘箱中烘干至水分含量18%，得到3.2kg的块状干菌丝渣，研磨成粉状后用13L甲醇浸提，搅拌15小时后过滤，得到约13L浸提液，单位为2110ug/ml（27.4g）。将浸提液于55℃下浓缩至浸膏状，加入与浸膏质量相等的打浆液(甲基叔丁基醚:乙醇=1:1(v/v))，室温下搅拌3h后静置过夜，过滤，得到淡黄色粗品A 77.4g，含量为32.8%（25.4g），纯度为83.5%。

向粗品A中加入470ml结晶液（乙醇溶液），50℃下搅拌至粗品刚好完全溶解，趁热过滤除去少量不溶物，滤液于50℃下搅拌1h后自然降温，然后置于4℃冰箱中过夜搅拌结晶。最后过滤，用117ml 80%的冰乙醇淋洗，得到湿晶体39.6g，含量为58.1%（23.0g），纯度为95.27%。最后将湿晶体在真空度-0.9MPa，45℃下，真空加热干燥12h，得到高纯度的白色多拉菌素精粉22.5g，含量为90%（20.2g)，纯度为96.3%，总收率为59.1% 。

实施例4

多拉菌素发酵液放罐25.5L，发酵单位为950ug/ml（24.2g）。向其中加入480g硅藻土，搅拌半小时，均匀后进行板框压滤，得到5.2kg湿菌丝渣，用20L乙醇浸提，搅拌6小时后过滤，得到约10L浸提液，单位为2023ug/ml（20.5g）。将浸提液于50℃下浓缩至浸膏状，加入与浸膏质量等质量的打浆液(甲基叔丁基醚:乙醇=1:1.5(v/v))，室温下搅拌4h后静置过夜，过滤，得到淡黄色粗品A 32.7g，含量为51.2%（16.7g），纯度为84.0%。

向粗品A中加入230ml结晶液（异丁醇:甲醇=1:1(v/v)），50℃下搅拌至粗品刚好完全溶解，趁热过滤除去少量不溶物，滤液于50℃下搅拌1h后自然降温，然后置于4℃冰箱中过夜搅拌结晶。最后过滤，用60ml 80%的冰乙醇淋洗，得到湿晶体23.8g，含量为67.0%（15.9g），纯度为95.3%。最后将湿晶体在真空度-0.9MPa，45℃下，真空加热干燥12h，得到高纯度的白色多拉菌素精粉15.3g，含量为90%(13.8g)，纯度为96.1%，总收率为56.9% 。

实施例5

多拉菌素发酵液放罐26.2L，发酵单位为528ug/ml（13.8g）。向其中加入950g硅藻土，搅拌半小时，均匀后进行板框压滤，得到5.4kg湿菌丝渣，用15L丙酮浸提，搅拌15小时后过滤，得到约15L浸提液，单位为815ug/ml（12.2g）。将浸提液于50℃下浓缩至浸膏状，加入与浸膏质量相等的打浆液(甲基叔丁基醚:乙醇=1.5:1(v/v))，室温下搅拌3h后静置过夜，过滤，得到淡黄色粗品A 26.5g，含量为41.2%（10.9g），纯度为82.3%。

向粗品A中加入185ml结晶液（异丁醇:丙酮=3:7），50℃下搅拌至粗品刚好完全溶解，趁热过滤除去少量不溶物，滤液于50℃下搅拌1h后自然降温，然后置于4℃冰箱中过夜搅拌结晶。最后过滤，用48ml 60%冰丙酮淋洗，得到湿晶体14.1g，含量为63.2%（8.9g），纯度为96.3%。最后将湿晶体在真空度-0.9MPa，45℃下，真空加热干燥12h，得到高纯度的白色多拉菌素精粉9.3g，含量为90%(8.4g)，纯度为96.3%，总收率为61% 。

实施例6

     将多拉菌素发酵液放罐30.5L，发酵单位为985ug/ml（30.0g），按照实施例1的方法进行操作，得到3.2 kg的块状干菌丝渣，研磨成粉状后用9L乙酸丁酯浸提，搅拌过夜后过滤，得到约9L浸提液，单位为3277ug/ml（29.5g）。将浸提液搅拌均匀，于55℃下浓缩至浸膏状，将浸膏等质量分成5份（每份约0.6kg），标记1-5号，分别加入打浆液，室温下搅拌3h后静置过夜，过滤，得到淡黄色粗品A，检测各项纯度结果如下：

表5：不同打浆液过滤后得到的粗品A 

序号	打浆液	加入质量	粗品A纯度
				1	甲基叔丁基醚︰乙醇=1︰2(v/v)	0.6kg	82.31%
2	甲基叔丁基醚︰乙醇=1︰1.5(v/v)	0.6kg	83.24%
				3	甲基叔丁基醚︰乙醇=1︰1(v/v)	0.6kg	84.16%
4	甲基叔丁基醚︰乙醇=1.5︰1(v/v)	0.6kg	84.71%
				5	甲基叔丁基醚︰乙醇=2︰1(v/v)	0.6kg	83.49%

实施例7

将多拉菌素发酵液放罐32.8L，发酵单位为1523ug/ml（49.9g），按照实施例1的方法进行操作，得到淡黄色粗品A 72.4g，含量为35.2%（25.5g），纯度为83.9%。

将粗品A分成等质量的5份（每份约14.4g），标记1-5号，分别加极性溶剂，50℃下搅拌溶解，趁热过滤掉少量不溶物，于50℃下搅拌1h后自然降温，然后置于4℃冰箱中过夜搅拌结晶。最后过滤，用48 ml60%冰丙酮淋洗，得到湿晶体，检测各项纯度及结晶收率结果如下：

表6：不同极性溶剂对粗品A的结晶效果

序号	不同极性溶剂或混合溶剂	加入体积	潮晶纯度	结晶收率
					1	正丁醇	85ml	94.41%	60%
2	异丁醇	85ml	94.74%	73%
					3	异丙醇	85ml	93.54%	80%
4	甲醇异︰丁醇=1︰1	85ml	93.20%	85%
					5	异丁醇︰丙酮=5︰4	85ml	95.74%	93%

Claims (10)

1.一种高纯度多拉菌素的制备方法，包括以下步骤：

1）向发酵液中加入助滤剂、搅拌，板框压滤得到菌丝渣；

2）用极性溶剂对菌丝渣进行浸提，过滤，得到浸提液；

3）将浸提液浓缩成浸膏，对浸膏进行打浆处理，静置过滤，得到粗品A；

4）用极性溶剂对粗品A进行结晶，并用淋洗溶剂进行淋洗，得到湿晶体；

5）将湿晶体干燥得到多拉菌素精粉。

2.根据权利要求1所述的方法 ，其特征在于步骤1）中所述的助滤剂为珍珠岩或硅藻土，其用量为每升发酵液使用15~45g助滤剂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2）中所述的极性溶剂为甲醇、乙醇或乙酸丁酯或其中任意混合溶剂，加入量为每千克菌丝渣使用2~5L极性溶剂，浸提时间为6~15h。

4.根据利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）中所述的浓缩为旋转蒸发，温度为45~60℃。

5.根据利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）中所述的打浆处理中打浆液为甲基叔丁基醚和乙醇体积比1:2~2:1混合的混合液，用量为与浸膏等质量。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将步骤4）对粗品A进行结晶、淋洗得到湿晶体步骤，重复操作一次或多次。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4）所述的极性溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、异丁醇、异丙醇或其中任意的混合溶剂，用量为每克粗品A使用5-8ml极性溶剂；所述的结晶时的温度控制在2~10℃，结晶时间为2~16h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4）所述的淋洗溶剂为冰乙醇或冰丙酮，使用量为与步骤4）中极性溶剂的使用量体积比为0.2~0.3。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的淋洗溶剂为80%的冰乙醇或60%的冰丙酮。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤5）所述的干燥为真空干燥，温度控制在40~50℃，干燥时间为4~16h。