CN104497079B - 高纯度闰年霉素a4的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高纯度闰年霉素A4的制备方法，该方法包括以下步骤：a、将闰年霉素A4发酵液过滤得到菌丝体，然后用极性溶剂浸泡菌丝体并进行固液分离，得闰年霉素A4浸提液；b、将闰年霉素A4浸提液浓缩后用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩干燥得到闰年霉素A4粗粉；c、将闰年霉素A4粗粉加入有机溶剂溶解，用0.45μm滤膜过滤，得到上样液；d、将上样液加入装有C18的中压层析柱中，加入洗脱溶剂，收集HPLC含量≥98.5％的洗脱液，浓缩，过滤，真空干燥得到高纯度闰年霉素A4产品。本发明所述化合物闰年霉素A4的制备方法操作简便，样品回收率高，适合高纯度抗耐药抗生素的生产。

Description

高纯度闰年霉素A4的制备方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种大环内酯类化合物的制备方法，更确切的说是涉及闰年霉素A4的制备方法。
背景技术
闰年霉素A4是通过指孢囊菌发酵产生的一种18元环结构的新型大环内酯类抗生素，属于窄谱型抗菌化合物，对革兰氏阳性需氧及厌氧菌具有优良的抗菌作用。其分子式为C51H72Cl2O18，分子量为1044.04，结构式如式I所示：
闰年霉素A4与非达霉素具有相同的抗菌谱，活性虽然略低于非达霉素(CN201210032395.4)，但与公开的S-Tiacumicin B和C-19酮相比，闰年霉素A4体外对艰难羧菌菌株的活性最好，仍然为较有潜力的用于治疗艰难梭菌感染引起腹泻的化合物。
目前，对闰年霉素A4的研究，主要集中在其抗菌活性研究领域，而关于闰年霉素A4的制备方法，则鲜有人对其进行深入的探讨和研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高纯度闰年霉素A4的制备方法，该方法工艺流程短、产品质量可控，适于工业化生产应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种高纯度闰年霉素A4的制备方法，该方法包括以下步骤：
a、常温下将闰年霉素A4发酵液过滤得到菌丝体，然后用极性溶剂浸提菌丝体并进行固液分离，得闰年霉素A4浸提液；
b、将闰年霉素A4浸提液减压浓缩，得到浓缩液，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩干燥后得到闰年霉素A4粗粉；
c、将闰年霉素A4粗粉加入有机溶剂溶解，用0.45μm滤膜过滤，得到上样液；
d、将上样液加入装有C18的中压层析柱中，加入洗脱溶剂，收集HPLC含量≥98.5％的洗脱液，然后减压浓缩、过滤、真空干燥后得到高纯度闰年霉素A4产品。
本发明a步骤所述的极性溶剂为体积百分浓度为80～95％的甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液，浸提时间为2～4h，极性溶剂的加入量为每千克菌丝中加入2～4升。
本发明c步骤所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中任意一种，有机溶剂的毫升数与闰年霉素粗粉克数的比例为3:1至5:1。
本发明d步骤所述洗脱溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中任意一种与有机酸和水的混合液，有机酸为三氟乙酸或乙酸，有机酸与水的体积比例为1:10000至5:10000。
本发明d步骤所述真空干燥，是将滤饼置于30～50℃、真空度≥0.08Mpa条件下，真空干燥4～12h。
本发明d步骤所述反相硅胶C18的粒径为30μm，用量为闰年霉素A4粗品质量的50～100倍。在此条件下，分离效果良好。
本发明b步骤所述乙酸乙酯萃取时，乙酸乙酯与浓缩液的体积比例为1:1至3:1，萃取时间为2～4小时。
本发明b步骤、d步骤所述减压浓缩，浓缩温度为35～50℃，真空度大于0.08Mpa，浓缩至有机溶剂浓度低于10％。
由于采用上述技术方案，本发明所产生的有益效果在于：
本发明所述闰年霉素A4是一种新型大环内酯类化合物，药理实验研究表明，它具有与非达霉素相似的抗菌谱，主要抗艰难梭菌，亦对肠球菌和葡萄球菌有良好的抗菌作用，其MIC值略低于非达霉素，但明显高于S-Tiacumicin B和C-19酮，可用于制备抗耐药菌类药物。
本发明所述高纯度闰年霉素A4的制备方法，首先利用固液分离与溶剂萃取技术得到闰年霉素A4粗品，有效排除了发酵次级代谢产物的干扰，再通过C18中压层析分离，得到高纯度闰年霉素A4产品。本发明中的4个提纯步骤紧密联系,它们的有效组合可以得到高纯度的闰年霉素A4产品。本发明所述方法工艺流程短，操作简单、可控性强，适宜于工业化生产。
附图说明
图1是闰年霉素A4的液相-质谱图；图2是闰年霉素A4的1HNMR谱图；图3是闰年霉素A4的13CNMR谱图；图4是闰年霉素A4的1H-1H COSY；图5是闰年霉素A4的HMBC；图6是闰年霉素A4的HSQC。
具体实施方式
下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不是对本发明进行限制。
本发明培养闰年霉素A4所使用的菌株是市场上已经使用的游动放线菌菌株N12W0304，游动放线菌菌株N12W0304保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.7043。闰年霉素A4发酵液也可以按照现有技术制得。C18购自华谱新创科技有限公司；甲醇、乙醇、乙酸乙酯等试剂均为市售。高效液相色谱仪器包括996型检测器、515泵(Waters公司生产)；INVOA 500型核磁共振波谱仪购自Varian公司；Acquity uplc system，PDA检测器，Xevo TQ MS/MS检测器均购自Waters公司。
实施例1
闰年霉素A4发酵液的制备：
将游动放线菌菌株N12W0304接种于种子培养基，在30℃、转速220rpm的条件下摇瓶培养48h，获得种子液。将种子液以体积百分比4％的接种量接种至装有发酵培养基的50L发酵罐，在罐温30℃、罐压0.05±0.01Mpa、通气量25L/min、转速400rpm的条件下发酵190h，获得闰年霉素A4发酵液。
其中所述种子培养基的制备方法为：牛肉膏4.0g，蛋白胨4.0g，NaCl 2.5g，酵母粉1.0g，豆粉10.0g，葡萄糖50.0g，CaCO3 5.0g，加自来水溶解、定容至1000ml，加碱调pH值至7.0～7.2，121℃灭菌30min。
所述发酵培养基的制备方法为：淀粉250g，葡萄糖500g，小麦胚芽粉200g，冷榨豆粉325g，牛肉膏100g，NaCl 250g，CaCO3 75g，加水溶解定容至25L，加碱调pH值至7.0～7.2，121℃灭菌30min。
闰年霉素A4的提纯方法包括以下步骤：
a、取闰年霉素A4发酵液10L，发酵单位为430μg/ml。将闰年霉素A4发酵液过滤，得到1.8kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为80％的甲醇水溶液7.2L，搅拌浸提2h后过滤，得到闰年霉素A4浸提液。
b、将浸提液在35℃、真空度大于0.08Mpa下减压浓缩至甲醇浓度小于10％，得到700ml浓缩液，加入2100ml乙酸乙酯萃取2h后，浓缩干燥得到闰年霉素A4粗品5.5g，HPLC含量为61.2％，粗提收率为78.3％。
c、取闰年霉素A4粗粉5.5g，加入20ml甲醇溶解，用0.45μm滤膜过滤，得到上样液。
d、将上样液注入装有550ml C18的中压层析柱中，加入甲醇:酸水的混合溶液进行洗脱，酸水中乙酸和水的比例为2:10000(v/v)，HPLC在线检测，收集含量≥98.5％的洗脱液，35℃减压浓缩、过滤，得到闰年霉素A4湿粉。将湿粉置于30℃、真空度≥0.08Mpa条件下真空干燥12h，得到闰年霉素A4产品1.8g，含量为98.9％，纯化收率为52.9％。
闰年霉素A4的1H NMR(500MHz，CD3CN)和13C NMR数据归属(125MHz，CD3CN)见表1，闰年霉素A4的液相-质谱图、1HNMR谱图、13CNMR谱图、1H-1H COSY谱图、HMBC谱图、HSQC谱图见附图1-6。
表1
C序号 C化学位移(ppm) H化学位移(ppm)
2 169.11
3 125.61
4 146.17 7.24,1H,d
5 128.49 6.62,1H,dd
6 143.66 5.98,1H,ddd
7 37.32 2.54,1H,m；2.71,1H,m
8 73.47 4.26,1H,dd
9 137.01
10 124.56 5.16,1H,br d
11 42.53 2.73,1H,m
12 94.27 3.73,1H,d
13 136.33
14 134.58 5.86,1H,br s
15 136.94
16 126.87 5.60,1H,br t
17 28.34 2.45,1H,m；2.74,1H,m
18 78.62 4.75,1H,m
19 68.26 4.06,1H,pentet
20 20.23 1.21,3H,d
21 63.88 4.45,1H,d；4.64,1H,d
22 15.41 1.68,3H,s
23 26.87 1.31,1H,m；2.03,1H,m
C序号 C化学位移(ppm) H化学位移(ppm)
24 11.32 0.91,3H,t
25 13.93 1.84,3H,s
26 17.52 1.80,3H,s
1' 102.21 4.67,1H,br s
2' 82.44 3.60,1H,m
2'-OCH3 62.18 3.59,3H,s
3' 72.69 3.79,1H,d
4' 77.05 5.12,1H,t
5' 71.54 3.59,1H,m
6' 18.09 1.35,3H,d
1" 97.14 4.74,1H,br s
2" 73.20 3.95,1H,br d
3" 70.53 3.76,1H,dd
4" 75.92 5.05,1H,d
5" 74.50
6" 28.69 1.15,3H,s
7" 18.69 1.17,3H,s
1'" 170.20
2'" 112.28
*3'" 154.01
4'" 108.54
*5'" 155.24
6'" 115.49
7'" 136.68
8'" 19.06 2.52,3H,s
1"" 178.35
2"" 35.37 2.62,1H,heptet
**3"" 19.12 1.19,3H,d
C序号 C化学位移(ppm) H化学位移(ppm)
**4"" 19.52 1.21,3H,d
实施例2
本实施例的闰年霉素A4发酵液培养与实施例1相同，本实施例与实施例1的区别主要在于提纯条件的改变，本实施例的闰年霉素A4的提纯方法如下：
a、取闰年霉素A4发酵液20L，发酵单位为506μg/ml。将闰年霉素A4发酵液过滤，得到4.0kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为95％的乙醇12.0L，搅拌浸提3h后过滤，得到闰年霉素A4浸提液。
b、将浸提液在40℃、真空度大于0.08Mpa下减压浓缩至乙醇浓度小于10％，得到1360ml浓缩液，加入2700ml乙酸乙酯萃取3h后，浓缩干燥得到闰年霉素A4粗品12.8g，HPLC含量为62.6％，粗提收率为79.2％。
c、取闰年霉素A4粗粉12.8g，加入64ml乙醇溶解，用0.45μm滤膜过滤，得到上样液。
d、将上样液注入装有1000ml C18的中压层析柱中，加入乙醇:酸水的混合溶液进行洗脱，酸水中三氟乙酸和水的比例为1:10000(v/v)，HPLC在线检测，收集含量≥98.5％的洗脱液，40℃减压浓缩、过滤，得到闰年霉素A4湿粉。将湿粉置于40℃、真空度≥0.08Mpa条件下真空干燥9h，得到闰年霉素A4产品4.6g，含量为98.5％，纯化收率为52.6％。
实施例3
本实施例的闰年霉素A4发酵液培养与实施例1相同，本实施例与实施例1的区别主要在于提纯条件的改变，本实施例的闰年霉素A4的提纯方法如下：
a、取闰年霉素A4发酵液15L，发酵单位482μg/ml。将闰年霉素A4发酵液过滤，得到3.2kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为90％的丙酮水溶液6.4L，搅拌浸提4h后过滤，得到闰年霉素A4浸提液。
b、将浸提液在50℃、真空度大于0.08Mpa下减压浓缩至丙酮浓度小于10％，得到1120ml浓缩液，加入1120ml乙酸乙酯萃取4h后，浓缩干燥得到闰年霉素A4粗品8.4g，HPLC含量为63.2％，粗提收率为73.4％。
c、取闰年霉素A4粗粉8.4g，加入30ml乙腈溶解，用0.45μm滤膜过滤，得到上样液。
d、将上样液注入装有700ml C18的中压层析柱中，加入乙腈：酸水的混合溶液进行洗脱，酸水中三氟乙酸和水的比例为5：10000(v/v)，HPLC在线检测，收集含量≥98.5％的洗脱液，50℃减压浓缩、过滤，得到闰年霉素A4湿粉。将湿粉置于50℃、真空度≥0.08Mpa条件下真空干燥4h，得到闰年霉素A4产品3.0g，含量为98.8％，纯化收率为55.7％。
实施例4
本实施例的闰年霉素A4发酵液培养与实施例1相同，本实施例与实施例1的区别主要在于提纯条件的改变，本实施例的闰年霉素A4的提纯方法如下：
a、取闰年霉素A4发酵液15L，发酵单位515μg/mL。将闰年霉素A4发酵液过滤，得到3.0kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为85％的甲醇水溶液9.0L，搅拌浸提3h后过滤，得到闰年霉素A4浸提液。
b、将浸提液在45℃、真空度大于0.08Mpa环境下减压浓缩至甲醇浓度小于10％，得到1080ml浓缩液，加入2200ml乙酸乙酯萃取3h后，浓缩干燥得到非达霉素粗品10.0g，HPLC含量为62.9％，粗提收率为81.4％。
c、取闰年霉素A4粗粉10.0g，加入30ml乙腈溶解，用0.45μm滤膜过滤，得到上样液。
d、将上样液注入装有1000ml C18的中压层析柱中，加入乙腈：酸水的混合溶液进行洗脱，酸水中三氟乙酸和水的比例为3:10000(v/v)，HPLC在线检测，收集含量≥98.5％的洗脱液，45℃减压浓缩、过滤，得到闰年霉素A4湿粉。将湿粉置于45℃，真空度≥0.08Mpa条件下真空干燥6h，得到闰年霉素A4产品3.4g，含量为98.7％，纯化收率为53.4％。
实施例5
本实施例的闰年霉素A4发酵液培养与实施例1相同，本实施例与实施例1的区别主要在于提纯条件的改变，本实施例的闰年霉素A4的提纯方法如下：
a、取闰年霉素A4发酵液10L，发酵单位503μg/mL。将闰年霉素A4发酵液过滤，得到2.1kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为85％的乙醇水溶液7L，搅拌浸提3.5h后过滤，得到闰年霉素A4浸提液。
b、将浸提液在35℃、真空度大于0.08Mpa环境下减压浓缩至乙醇浓度小于10％，得到810ml浓缩液，加入1500ml乙酸乙酯萃取2.5h后，浓缩干燥得到闰年霉素A4粗品6.4g，HPLC含量为62.8％，粗提收率为79.9％。
c、取闰年霉素A4粗粉6.4g，加入30ml乙腈溶解，0.45μm滤膜过滤，得到上样液。
d、将上样液注入装有320ml C18的中压层析柱中，加入乙腈：酸水的混合溶液进行洗脱，酸水中乙酸和水的比例为4:10000(v/v)，HPLC在线检测，收集含量≥98.5％的洗脱液，35℃减压浓缩、过滤，得到闰年霉素A4湿粉。将湿粉置于30℃，真空度≥0.08Mpa条件下真空干燥12h，得到闰年霉素A4产品2.2g，含量为99.1％，纯化收率为54.2％。
实施例6
本实施例的闰年霉素A4发酵液培养与实施例1相同，本实施例与实施例1的区别主要在于提纯条件的改变，本实施例的闰年霉素A4的提纯方法如下：
a、取闰年霉素A4发酵液20L，发酵单位509μg/mL。将闰年霉素A4发酵液过滤，得到4.2kg菌丝体。在上述菌丝体中加入体积比浓度为90％的丙酮水溶液14L，搅拌浸提2.5h后过滤，得到闰年霉素A4浸提液。
b、将浸提液在40℃、真空度大于0.08Mpa环境下减压浓缩至丙酮浓度小于10％，得到1500ml浓缩液，加入2000ml乙酸乙酯萃取3h后，浓缩干燥得到闰年霉素A4粗品13.0g，HPLC含量为63.3％，粗提收率为80.8％。
c、取闰年霉素A4粗粉13.0g，加入50ml乙腈溶解，0.45μm滤膜过滤，得到上样液。
d、将上样液注入装有1000ml C18的中压层析柱中，加入乙腈：酸水的混合溶液进行洗脱，酸水中三氟乙酸和水的比例为1:10000(v/v)，HPLC在线检测，收集含量≥98.5％的洗脱液，40℃减压浓缩、过滤，得到闰年霉素A4湿粉。将湿粉置于40℃，真空度≥0.08Mpa条件下真空干燥9h，得到闰年霉素A4产品4.5g，含量为98.7％，纯化收率为54.1％。

Claims (8)

1.一种高纯度闰年霉素A4的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
a、常温下将闰年霉素A4发酵液过滤得到菌丝体，然后用极性溶剂浸提菌丝体并进行固液分离，得闰年霉素A4浸提液；
b、将闰年霉素A4浸提液减压浓缩，得到浓缩液，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩干燥后得到闰年霉素A4粗粉；
c、将闰年霉素A4粗粉加入有机溶剂溶解，用0.45μm滤膜过滤，得到上样液；
d、将上样液加入装有C18的中压层析柱中，加入洗脱溶剂，收集HPLC含量≥98.5％的洗脱液，然后减压浓缩、过滤、真空干燥后得到高纯度闰年霉素A4产品；
其中，闰年霉素A4发酵液的制备：
将游动放线菌菌株N12W0304接种于种子培养基，在30℃、转速220rpm的条件下摇瓶培养48h，获得种子液。将种子液以体积百分比4％的接种量接种至装有发酵培养基的50L发酵罐，在罐温30℃、罐压0.05±0.01Mpa、通气量25L/min、转速400rpm的条件下发酵190h，获得闰年霉素A4发酵液；
其中所述种子培养基的制备方法为：牛肉膏4.0g，蛋白胨4.0g，NaCl 2.5g，酵母粉1.0g，豆粉10.0g，葡萄糖50.0g，CaCO3 5.0g，加自来水溶解、定容至1000ml，加碱调pH值至7.0～7.2，121℃灭菌30min；
所述发酵培养基的制备方法为：淀粉250g，葡萄糖500g，小麦胚芽粉200g，冷榨豆粉325g，牛肉膏100g，NaCl 250g，CaCO3 75g，加水溶解定容至25L，加碱调pH值至7.0～7.2，121℃灭菌30min；
其中a步骤所述的极性溶剂为体积百分浓度为80～95％的甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液；其中d步骤所述C18的粒径为30μm。
2.根据权利要求1所述高纯度闰年霉素A4的制备方法，其特征在于：a步骤所述的极性溶剂浸提时间为2～4h，极性溶剂的加入量为每千克菌丝中加入2～4升。
3.根据权利要求1或2任一项所述高纯度闰年霉素A4的制备方法，其特征在于：c步骤所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中任意一种，有机溶剂的毫升数与闰年霉素粗粉克数的比例为3∶1至5∶1。
4.根据权利要求1或2任一项所述高纯度闰年霉素的制备方法，其特征在于：d步骤所述洗脱溶剂为甲醇、乙醇、乙腈中任意一种与有机酸和水的混合液，有机酸为三氟乙酸或乙酸，有机酸与水的体积比例为1∶10000至5∶10000。
5.根据权利要求1或2任一项所述高纯度闰年霉素A4的制备方法，其特征在于：d步骤所述真空干燥，是将滤饼置于30～50℃、真空度≥0.08Mpa条件下，真空干燥4～12h。
6.根据权利要求1所述高纯度闰年霉素A4的制备方法，其特征在于：d步骤所述C18用量为闰年霉素A4粗品质量的50～100倍。
7.根据权利要求1所述高纯度闰年霉素A4的制备方法，其特征在于：b步骤所述乙酸乙酯萃取时，乙酸乙酯与浓缩液的体积比例为1∶1至3∶1，萃取时间为2～4小时。
8.根据权利要求1所述高纯度闰年霉素A4的制备方法，其特征在于：b步骤、d步骤所述减压浓缩，浓缩温度为35～50℃，真空度大于0.08Mpa，浓缩至有机溶剂浓度低于10％。
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