CN101591618B - 一种细小炭角菌菌株及其液体发酵培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离自白蚁废弃蚁巢的细小炭角菌[(Xylaria gracillima)(Fr.)Fr.]菌株CGMCC No.2449，及其液体发酵培养方法和菌丝体提取物的应用。

Description

一种细小炭角菌菌株及其液体发酵培养方法和应用

技术领域

本发明涉及一种珍稀的药用真菌细小炭角菌[(Xylaria gracillima)(Fr.)Fr.]的菌株CGMCC No.2449，及其液体发酵培养方法。采用适当的培养基对菌种进行液体深层发酵培养，并对发酵产物进行了抗氧化活性鉴定。

背景技术

细小炭角菌(Xylaria gracillima)的菌种由中国科学院微生物研究所于2005年6月2日在白蚁废巢中分离和检测鉴定，并且菌种的中文名称由中国科学院微生物研究所命名。其于2008年4月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏登记号为：CGMCC No.2449。细小炭角菌属于子囊菌亚门(Ascomycotina)，炭角菌目(Xylariales)，炭角菌科(Xylariaceae)，炭角菌属(Xylaria)。

细小炭角菌是一种珍贵的药用菌。是土白蚁废巢上生长出的一种真菌，子座细长，灰褐色至黑褐色，单根和分枝。菌核由菌丝缠绕，菌丝近白色、绒毛状，野生资源极少。其子实体提取物与其它中药材制成的复合胶囊，具有很好的抗癌活性。能促进小鼠NK细胞活性和增强巨噬细胞的吞噬功能；提高机体内的SOD和GSH-PX的活性，减少或抑制LPO和脂褐质生成；有明显的抗疲劳、抗衰老作用和提高机体应激能力；同时还有增进食欲、恢复体力、护肝和调节内分泌的作用。

目前，还未发现有对细小炭角菌进行人工发酵培养从而利用产物的报道。因此，为发掘利用这一珍稀重要的药用菌，需进行人工培养。利用先进发酵工程技术，通过液体深层发酵的方法对细小炭角菌进行培养得到大量菌丝体和其它发酵产物，以满足人类防癌、抗衰老、增强免疫力的保健需要，显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于对采集得到的天然细小炭角菌子实体进行分离纯化，分离得到一株可在特定的人工培养基上生长繁殖的菌株----细小炭角菌[(Xylaria gracillima)(Fr.)Fr.]的菌株CGMCC No.2449，并且运用先进发酵工程技术，通过液体深层发酵的方法，研制出能使细小炭角菌菌丝体高产的培养基配方。该发酵工艺可实现菌种的工业化快速生产，并且菌种无杂菌污染，菌种质量高，代谢产物活性强。具体内容如下：

一、细小炭角菌[(Xylaria gracillima)(Fr.)Fr.]的菌株CGMCC No.2449

细小炭角菌属于子囊菌亚门(Ascomycotina)，炭角菌目(Xylariales)，炭角菌科(Xylariaceae)，炭角菌属(Xylaria)。本发明的菌株由中国科学院微生物研究所于2005年6月2日在白蚁废巢中分离和检测鉴定，并且菌种的中文名称由中国科学院微生物研究所命名。其于2008年4月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏登记号为：CGMCCNo.2449。

1.形态特征：

子座单生，不分枝；质地较为坚韧；上部呈细长状、圆柱状；无毛；黑色，匍匐和顶端着生；外面由子囊壳包裹，埋生。气生菌丝白色，显微镜下观察菌丝无色、细长，直径0.8μm-3.3μm，无分枝，菌丝有隔膜。

2.在PDA固体培养基上的生长特征：

菌丝体近白色，绒毛状，后期培养基背面上可观察到棕色色素。

3.生理生化特征：

平板培养有棕色至黑色色素产生，液体发酵培养发酵液呈淡棕色。

4.碳源利用：

细小炭角菌对麦芽糊精，果糖，甘露糖，葡萄糖，麦芽糖的利用最好。

对蔗糖，半乳糖，玉米粉的利用效果一般。

细小炭角菌是炭角菌属的一种，在国内是新纪录种，预实验表明其发酵产物具有抗氧化活性。

二、菌株的分离培养及保存技术

本发明涉及的细小炭角菌的菌种分离纯化技术包括：采集天然白蚁废巢中的菌索，用75％的酒精表面灭菌3次，用无菌水清洗表面的酒精，备用。平板培养、分离纯化，得到细小炭角菌菌落。应该注意到，最初分离得到菌丝生长旺盛，菌索相互缠绕。

所述的细小炭角菌的分离培养技术包括：菌种在15-30℃条件下进行振荡培养，经过8-20天的时间，形成圆形、近圆形的菌落，表面生长气生菌丝，呈白色或污白色，菌落背面棕色。镜检无污染。

所述细小炭角菌的斜面培养和保存技术包括：取4℃条件保存的菌种，15-30℃条件下复苏30分钟，在超净工作台中用接种刀切割2毫米方块，接入新鲜的斜面培养基上。斜面培养基配方为：葡萄糖(购自北京现代东方精细化学品有限公司，目录号2007322)20-50克，土豆(市售)200克，琼脂(北京化学试剂有限公司，目录号10000594)15-20克，水1000mL，pH值6-7，15-30℃温箱中静置暗培养10-15天，待菌丝长满斜面后放入4℃冰箱保存。

三、细小炭角菌的液体发酵培养方法

本发明所提供的液体发酵培养基包括：碳源10.0-80.0克，氮源5.0-60.0克，复合维生素0-30.0克，无机盐0-8.0克，用水定容到1000mL。所述碳源为蔗糖，葡萄糖，麦芽糖，麦芽糊精，果糖，甘露醇，甘露糖，或淀粉，或它们的组合。所述氮源为麦麸，黄豆粉，玉米粉，蛋白胨，或奶粉，或它们的组合。所述无机盐为磷酸二氢钾，硫酸镁，或氯化钙，或它们的组合。所述复合维生素为酵母提取物。

所述细小炭角菌的液体培养基配方优选为：麦芽糊精、葡萄糖、或二者的组合20.0-60.0克，黄豆粉、蛋白胨、奶粉、或它们的组合5.0-40.0克，酵母提取物0-10.0克，硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾、或它们的组合0-6.0克，用水定容至1000mL。

所述细小炭角菌的优选固体培养基是在上述培养基中再添加土豆(市售)200克及质量为1.5-2.0％的琼脂(北京化学试剂有限公司，目录号：10000594)。

上述细小炭角菌的优选培养基可用常规方法进行配制，如将复合氮源煮汁，过滤离心后，取上清液与其它成分混合，加热溶解，使各种成分混合均匀，灭菌即可。

本发明同时提供了一种细小炭角菌的培养方法，但是本发明对其培养方法并无严格的限制，以适于使用菌的生长为准，并以选择细小炭角菌产量最高的条件为优选。

本发明所提供的细小炭角菌的培养方法，是在起始pH 6-7下，按4-20％(v/v)的接种量，将细小炭角菌菌种接种于上述液体培养基中，然后在15-30℃条件下，转速100-180r/min，黑暗条件下进行振荡培养，得到细小炭角菌菌丝体，所述液体培养基装液量为容器的1/5-3/5(v/v)。

本发明所提供的细小炭角菌的培养方法，所述pH值6-7，所述接种量优选为5-15％(v/v)，所述培养温度优选为18-28℃，转速优选为150r/min，所述液体培养基装液量为容器的1/5-3/5(v/v)。

采用上述培养方法，7-10天即可达到发酵终点。

四、发酵产物处理

菌丝体处理：用纱布过滤得到菌丝体和发酵液，菌丝体用蒸馏水洗涤2-3次，冷冻真空干燥，磨成粉，备用。避光、干燥、常温条件下保存。

发酵液处理：发酵液含有大量的代谢产物包括胞外多糖，维生素，氨基酸等，闻之有特殊的香味。将发酵液在低温40-50℃条件下真空浓缩，以保持代谢产物活性，冻干成粉末，备用。避光、干燥、常温条件下保存。

五、水溶性发酵产物的抗氧化活性检测

检测样品为细小炭角菌在所述液体培养基上发酵所得的水溶性发酵产物，包括菌丝体水提物、发酵液、胞外多糖、和胞内多糖，检测了它们的亚铁离子螯合能力，羟基自由基清除能力，超氧阴离子清除能力以及还原能力。实验表明，利用所述液体培养基发酵所得的细小炭角菌水溶性发酵产物，具有强抗氧化活性。抗氧化能力平均在70-90％之间。

综上所述，本发明提供了一种细小炭角菌的菌株及其液体发酵培养方法。根据所述分离纯化方法得到纯的细小炭角菌菌种，活力强，性质稳定，可进行深入的研究开发。所述细小炭角菌的培养基原料简单，易得，成本低廉。利用该培养基及本发明提供的液体发酵培养方法对发酵生产细小炭角菌菌丝体具有生长速度快，周期短，产率高，工艺简单，成本低等优点，适于细小炭角菌的工业化发酵生产。

活性实验证明，利用本发明分离得到的细小炭角菌菌株，在其优选培养基上发酵培养后，得到的菌丝体具有很强的抗氧化活性，可开发成相应的产品满足市场需求。基于上述优点，本发明可产生较好的经济效益和社会效益，市场前景广阔。

附图说明

图1显示本发明的技术路线图，从天然子实体分离纯化获得细小炭角菌[(Xylaria gracillima)(Fr.)Fr.]的菌株CGMCC No.2449，优化适于其发酵的培养基，进一步液体发酵培养获得菌丝提取物，可用于各保健产品的开发。

图2A-2D显示细小炭角菌水溶性发酵产物的抗氧化活性检测的结果。图2A显示样品对游离羟基自由基清除率曲线；图2B显示样品对超氧阴离子自由基清除率曲线；图2C显示样品对亚铁离子螯合率曲线；图2D显示样品还原能力测定曲线；在图2A，2B和2D中，(▲)细小炭角菌菌丝体水提物，简称水提物；(■)发酵液；(◆)胞外多糖；(×)胞内多糖；(*)黑柄炭角菌水提物；(-)商业抗氧化剂BHT，作为阳性对照。在图2C中，(▲)细小炭角菌菌丝体水提物，简称水提物；(■)发酵液；(◆)胞外多糖；(×)胞内多糖；(*)黑柄炭角菌水提物；(○)EDTA，作为阳性对照。

具体实施方式

下面通过参考实施例来举例说明本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，本发明的精神和范围由后附的权利要求所限定。

下述实施例中所用培养及均按常规方法配制，如将上述质量配比的原料放入容器，加热溶解，混合均匀，在121℃灭菌30分钟，冷却即可。

实施例1、细小炭角菌菌丝体的生产

在最适合细小炭角菌生长的培养条件下，本发明经过对培养基配方的筛选和比较，获得适合细小炭角菌生长，并且菌丝体产量较高的培养基配方(以下称为细小炭角菌优选培养基)。

细小炭角菌优选培养基1：黄豆粉20.0克(市售)，麦芽糊精50.0克(山东保龄宝生物技术有限公司)，酵母提取物5.0克(上海棱光酵母制品有限公司，目录号：000112)，硫酸镁3.0克(广东汕头市西陇化工厂)，用水定容至1000mL。

细小炭角菌优选培养基2：黄豆粉10.0克，葡萄糖50.0克(北京现代东方精细化学品有限公司)，蛋白胨5.0克(北京双旋微生物培养基制品厂)，酵母提取物5.0克，硫酸镁3.0克，用水定容至1000mL。

细小炭角菌优选培养基3：蛋白胨15.0克，麦芽糊精60.0克，酵母提取物5.0克，硫酸镁3.0克，磷酸二氢钾3.0克(北京化学试剂公司)，用水定容至1000mL。

细小炭角菌优选培养基4：黄豆粉20.0克，葡萄糖50.0克(北京现代东方精细化学品有限公司)，蛋白胨5.0克(北京双旋微生物培养基制品厂)，酵母提取物5.0克，硫酸镁3.0克，用水定容至1000mL。

细小炭角菌优选培养基5：蛋白胨15.0克，麦芽糊精50.0克，酵母提取物5.0克，硫酸镁3.0克，磷酸二氢钾3.0克(北京化学试剂公司)，用水定容至1000mL。

细小炭角菌优选培养基6：奶粉20.0克(市售)，葡萄糖50.0克，蛋白胨5.0克，硫酸镁3.0克，氯化钙3.0克(天津市塘沽邓中化工厂)，用水定容至1000mL。

细小炭角菌优选培养基7：蛋白胨5.0g，麦芽糊精80.0g，酵母提取物0g，硫酸镁8.0g，用水定容至1000ml。

对照培养基：土豆200.0g(市售)，葡萄糖20.0g，用水定容至1000mL。

在自然pH 6-7下，使用适当的培养容器(见下表1)，培养基装液量为培养容器的2/5体积(v/v)。按8％(v/v)的接种量将细小炭角菌菌种接种于上述培养基中，在25℃、转速150r/min条件下，振荡培养7天，得到细小炭角菌菌丝体，冻干，称重，计算使用上述各种优选培养基和对照培养基获得的干菌丝体产率(g/L培养液)，如下表1所示。

表1：细小炭角菌菌丝体在各种培养基中的产率

培养基	培养容器	干菌丝体产率(g/L)
			优选培养基1	250mL三角瓶	20.5

优选培养基2	250mL三角瓶	15.4
			优选培养基3	250mL三角瓶	17.3
优选培养基4	500mL三角瓶	18.5
			优选培养基5	500mL三角瓶	17.0
优选培养基6	3000mL三角瓶	17.6
			优选培养基7	250mL三角瓶	19.87
对照培养基	250ml三角瓶	8.6

实施例2、发酵产物的处理和菌丝体提取

发酵液处理：发酵液含有大量的代谢产物包括胞外多糖，维生素，氨基酸等，闻之有特殊的香味。将发酵液在低温40-50℃条件下真空浓缩，以保持代谢产物活性，冻干成粉末，备用。避光、干燥、常温条件下保存。

菌丝体处理：用纱布过滤得到菌丝体和发酵液，菌丝体用蒸馏水洗涤2-3次，冷冻真空干燥，磨成粉，备用。避光、干燥、常温条件下保存。

实施例3、菌丝体提取物的抗氧化活性检测

氧自由基及其衍生物H₂O₂、脂质过氧化物(LOOH)及单线态氧等统称为活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)(Mathew & Abraha，2006)。它是指氧的某些产物和一些反应的含氧产物，它的特点是含有氧，化学性质较氧活泼。ROS对生物机体可产生一系列的有害作用(Willcox JK，Ash SL，Catignani GL.Antioxidants and prevention of chronic disease.Crit Rev FoodSci.，2004，44：275-295)。氧化危害与许多疾病的发生密切相关(Jacob，R.S.，& Burri，B.J.Oxidative damage and defense.American Journal of ClinicalNutrition，1996，63：985S-990S)，由于自由基即活性氧的危害可产生神经性病变(Floyd，R.A.Neuroinammatory processes are important inneurodegenerative diseases： an hypothesis to explain the increased formationof reactive oxygen and nitrogen species as major fac

抗氧化剂由于能清除这些活性氧自由基，因此它的使用日益受到亲睐。但是由于化学合成的抗氧化剂都存在潜在的危害(Liu F，Ooi VEC，Chang ST.Free radical scavenging activities of mushroom polysaccharideextracts.Life Science，1997，60：763-771)；如商业抗氧化剂BHT和BHA的使用安全性都受到一定的质疑(Witschi HP.Enhanced tumour development bybutylated hydroxytoluene(BHT)in the liver，lung and gastro-intestinal tract.Food Chem Toxicol，1986，24：1127-1130；Thompson D，Moldeus P.Cytotoxicity of butylated hydroxya-nisole and butylated hydroxytoluene inisolated rat hepatocytes.Biochem Pharmacol，1988，37：2201-2207)。因此，寻找新的天然无毒害的抗氧化活性物质成为研究热点，在这方面已有很多相关的报道(Ronge Xing，Song Liu，Zhanyong Guo，Huahua Yu，Cuiping Li，Xia Ji，Jinhua Feng，and Pengcheng Li，The antioxidant activity ofglucosamine hydrochloride in vitro.Bioorganic & Medicinal Chemistry，2006，14：1706-1709；P.Siddhuraju，Antioxidant activity of polyphenolic compoundsextracted from defatted raw and dry heated Tamarindus indica seed coat.LWT，2007，40：982-990；Silke C.Jaehrig，Sascha Rohn，Lother W.Kroh，Franz X.Wi nauer，Fred Lisdat，Lutz-Guenther Fleischer and Tomas Kurz，Antioxidative activity(1→3)，(1→6)-d-glucan from Saccharomyces cerevisiaegrown on different media.LWT-Food Science and Technology，2007doi：10.1016/j.lwt.2007.06.004；A.Y.Loo，K.Jain，I.Darah.Antioxidantactivity of compounds isolated from the pyroligneous acid，Rhizophoraapiculata.Food Chemistry，2008，107：1151-1160)，其中一种天然抗氧化剂的材料来源就是大型真菌。

黑柄炭角菌(Xylaria nigripes(Klotzsch)Sacc.)，又名乌灵参，也是采集自白蚁废巢上，与细小炭角菌具有相似的生长环境。目前黑柄炭角菌已被大规模工业化生产，开发成各种保健产品。如乌灵肾宝，乌灵参胶囊等，主要是因为它的药用价值和保健功能，其中一个功能就是抗氧化防衰老作用。

本实施例着重介绍了细小炭角菌水溶性发酵产物对所选各种自由基的清除能力，包括清除羟基自由基、超氧阴离子自由基等。还考察了代谢产物的亚铁离子螯合能力以及还原能力。所述细小炭角菌的水溶性发酵产物包括菌丝体的水提物、发酵液、胞外多糖、和胞内多糖。将细小炭角菌水提物、发酵液、胞外多糖、和胞内多糖与市售黑柄炭角菌菌粉的水提取物和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT，商业抗氧化剂，作为阳性对照)的抗氧化活性进行比较研究，以此反映本研究培养的细小炭角菌的抗氧化能力。具体研究内容如下。

一.实验方法

制备下列各项：

菌丝体水提物：取冻干的菌丝体粉末，以1∶20体积加蒸馏水100℃水浴(电热恒温水浴锅，北京西城区医疗器械厂)提取，每次2小时，重复3次。将水提物浓缩，冻干成粉，备用。使用前，溶于95％乙醇(购自北京北化精细化学品有限公司)，配制成指定浓度备用。

发酵液：过滤得到的发酵液，真空浓缩，冻干成粉，备用。使用前，溶于蒸馏水，配制成指定浓度备用。

胞外多糖：发酵液浓缩到原来体积的1/10，加4倍体积的95％的乙醇沉淀多糖，4℃静置过夜，高速冷冻离心(高速冷冻离心机，J2-HS型，Bechman公司，美国)得到多糖，冻干成粉，备用。使用前，溶于蒸馏水，配制成指定浓度备用。

胞内多糖：菌丝体水提物浓缩到原来体积的1/10，加4倍体积的95％的乙醇(购自北京北化精细化学品有限公司)沉淀多糖，4℃静置过夜，高速冷冻离心(高速冷冻离心机，J2-HS型，Bechman公司，美国)得到多糖，冻干成粉，备用。使用前，溶于蒸馏水，配制成指定浓度备用。

黑柄炭角菌菌粉水提取物：市售黑柄炭角菌菌粉，以1∶20体积蒸馏水100℃水浴(电热恒温水浴锅，北京西城区医疗器械厂)提取，一次2小时，重复3次。将水提物浓缩，冻干成粉，备用。使用前，溶于蒸馏水，配制成指定浓度备用。

以下实验中用到下列试剂：Ferrozine(Sigma-Aldrich)磷酸氢二钾(北京化学试剂公司)、磷酸二氢钾(北京化学试剂公司)、氢氧化钾(北京化学试剂公司)、乙二胺四乙酸(EDTA)(上海生工生物工程有限公司)、三氯化铁(北京化学试剂公司)、H₂O₂(国药集团化学试剂有限公司)、2-脱氧-D-核糖(Sigma-Aldrich)、抗坏血酸(北京化学试剂公司)、三氯乙酸(北京化学试剂公司)、TBA(Acros organics公司(比利时)，北京世纪银丰科技发展有限公司分装)、正丁醇(北京北化精细化学品有限公司)、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)(国药集团化学试剂有限公司)，均为分析纯试剂。

1.清除游离羟基能力测定

羟基自由基是活性氧自由基中化学性质最活泼的自由基，它几乎能与活细胞中任何生物大分子发生反应，而且反应速度极快，是对机体危害最大的自由基(董彩虹，冬虫夏草的深层培养及代谢产物研究，北京：中国科学院研究生院博士学位论文，2006，94)。在存在EDTA、FeCl₃、H₂O₂、抗坏血酸的体系里，产生游离羟基·OH，与2-脱氧-D-核糖发生系列反应，生成有色物质MDA-TBA，在532nm下有最大吸收值，具体反应如下(Barry H，John M，Okezie I.The deoxyribose method：A simple“Test tube”assay fordetermination of rate constants for reactions of hydroxyl radicals.AnalyticalBiochemistry，1987，165：215-219.)：

MDA-丙二醛(malonaldehyde)

TBA-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid)

2O₂+2H⁺→H₂O₂+O₂

Fe²⁺-EDTA+H₂O₂→Fe³⁺-EDTA+OH^-+·OH

·OH+2-脱氧-D-核糖→片段+TBA→MDA

2TBA+MDA→发色团Fe³⁺-EDTA+抗坏血酸→Fe²⁺-EDTA+氧化的抗坏血酸

在10ml试管中加入0.4ml磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲液(20mmol/L，pH值7.4)，然后加入一定浓度样品溶液0.1ml。依次加入EDTA(1.04mmol/L)，FeCl₃(1mmol/L)，H₂O₂(12mmol/L)，2-脱氧-D-核糖(60mmol/L)，抗坏血酸(2mmol/L)各0.1ml。将试管置于37℃恒温水浴1小时，取出，迅速冷却。加入2.8％三氯乙酸(TCA)及1％TBA各1ml，100℃水浴15分钟，取出，冷却。若有混浊，加入3ml正丁醇萃取。使用紫外可见光分光光度计(4050型，LKB，瑞典)于532nm处测定吸光值(Barry H，John M，Okezie I.Thedeoxyribose method：A simple“Test tube”assay for determination of rateconstants for reactions of hydroxyl radicals.Analytical Biochemistry，1987，165：215-219；和Hagerman A E，Riedl K M，Jones G A，Sovik K N，RitchardN T，Hartzfeld P W，Riechel T L.High molecular weight plant ployphenolics(Tannins)as biological antioxidants.Journal of Agricultural and FoodChemistry，1998，46：1887-1892.)。以同浓度BHT作为阳性对照，相同体积蒸馏水做空白。

羟基清除率按如下公式计算：

清除率(％)＝[空白吸光值-(加入清除剂后吸光值-样品本身吸光值(不加2-脱氧-D-核糖))]/空白吸光值×100％

2.清除超氧阴离子自由基(O^2.-)测定

超氧阴离子是分子氧接受一个电子后的还原状态，它是线粒体电子传递系统最初产生的自由基，能形成其它的自由基如氢过氧化物(HOO·)、羟基自由基(·OH)、以及单线态氧等，因此它对机体的危害非常大(Halliwell，B & Gutteridge，JMC.In Free radicals，ageing，and disease，free radicals inbiology and medicine.Clarendron Press，Oxford，1985，279-315；Lee J，KooN，Min DB.Reactive oxygen species，aging，and antioxidative nutraceuticals.Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2004，3：21-33.)。

模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，黄嘌呤氧化酶作用底物黄嘌呤可产生O^2·，加入电子传递物质及gress氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，以抗坏血酸(Vc)为对照进行比色。当样品含有抗超氧阴离子的物质，例如：血清、组织等可抑制该反应使O^2·减少，故比色时颜色变浅；而产生超氧阴离子的物质，例如：白细胞等样本可增加此反应，使O^2·增加，故比色时颜色变深。依据形成物的颜色深浅计算出抑制或产生O^2·的能力强弱(Yunfeng Li，Changjiang Guo，Jijun Yang，Jingyu Wei，Jing Xu，Shuang Cheng.Evaluation of antioxidant properties of pomegranate peelextract in comparison with pomegranate pulp extract.Food Chemistry，2006，96：254-260)。

采用南京建成生物工程研究所的抗超氧阴离子自由基试剂盒(批号：20080108)，严格按照说明书操作。

3.亚铁离子螯合能力测定

一些金属离子如铁离子在脂质过氧化中起催化作用，它们能分解脂质过氧化物成过氧化氢和烷氧基自由基，从而推进脂质过氧化链进程(Halliwell B.Reactive oxygen species in living systems：Source，biochemistry，and role in human disease.American Journal of Medicine，1991，91：14-22.)。据报道，具有亚铁离子螯合能力的螯合剂，能通过与之形成ó键从而阻止其氧化催化作用(Gordon MH.The mechanism of the antioxidant action invitro.In B.J.F.Hudson(Ed.)，Food antioxidants Elsevier Applied Science，London，1990，1-18.)。因此具有金属螯合作用的物质可以间接起到抗氧化作用。Ferrozine与Fe²⁺形成紫红色的络合物，当有竞争力的络合剂存在时，紫红色会变浅，因此通过络合物颜色的变化评价抗氧化剂对Fe²⁺的络合能力。

取不同浓度样品溶液1ml，加入去离子水3.7ml，加入2mmol/L FeCl₂溶液0.1ml，30秒后再加入0.2ml 5mmol/L Ferrozine溶液，静置10分钟。于562nm处测定吸光值，吸光值越低表示样品螯合亚铁离子的能力越强(Boyer R F，McCleary C J.Superoxide ion as a primary reductant inascorbate-mediated ferritin iron release.Free Radical & Biology Medicine，1987，3：389-395.；Chang-Hwa Jung，Ho-Moon Seog，In-Wook Choi，Mee-Weon Park，Hong-Yon Cho.Antioxidant properties of various solventextracts from wild ginseng leaves.LWT，2006，39：26-274)。以相同浓度EDTA溶液做阳性对照，以同体积去离子水作空白对照。对亚铁离子的螯合能力按如下公式计算：

螯合率(％)＝(空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值×100％

4.还原能力测定

铁氰化钾[K₃Fe(CN)₆]被还原生成黄血盐[K₄Fe(CN)₆]，黄血盐再利用Fe³⁺形成普鲁士蓝[Fe₄(Fe(CN)₆)₃]，以普鲁士蓝生成量作为指标，使用紫外可见光分光光度计(4050型，LKB，瑞典)在700nm处测定吸光值大小，吸光值越高，则还原力越强。

取1ml不同浓度样品溶液，加入2.5ml(0.2mol/L，pH 6.6)磷酸钠缓冲溶液及2.5ml 1％铁氰化钾溶液。将混合物于50℃恒温水浴20分钟。快速冷却后，加入1ml 10％三氯乙酸。离心(4℃，4000r/分钟，10分钟)。取上清液2.5ml，加入蒸馏水2.5ml和0.5ml 0.1％新鲜配制的三氯化铁，混合反应10分钟。在波长700nm处测定吸光值，吸光值越高表示样品的还原力越强(Oyaizu M.Antioxidantive activities of browning produces ofglucosamine fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography.Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi，1986，35：771-775；和Yen G C，Chen H Y.Antioxidant activity of various tea extract in relation to their antimutagenicity.Journal of Agriculture and Food Chemistry，1995，43：27-32)。用相同浓度的BHT作为阳性对照，以蒸馏水为空白。

二.实验结果与讨论

1.清除游离羟基能力

实验结果见图2A，在检测的浓度范围内(0-16.0mg/ml)，细小炭角菌菌丝体水提物、发酵液、胞外多糖、胞内多糖、以及黑柄炭角菌菌粉水提物均显示出浓度依赖性的清除羟基自由基能力，在低浓度范围内(0-2mg/ml)，其清除率随浓度增加比较缓慢，在稍高的浓度范围内(2-16ng/ml)内，随着浓度增加清除率也急剧增加，但总体的清除能力均低于对照BHT。发酵液在所有的样品中显示出最高的羟基自由基清除能力，在16mg/ml时，其最高清除率达到70.9％。黑柄炭角菌菌粉水提物表现出与细小炭角菌菌粉水提物相近的羟基自由基清除能力。

2.清除超氧阴离子自由基(O^2.-)

细小炭角菌水溶性发酵产物的清除超氧阴离子自由基清除能力如图2B所示，在检测浓度范围内，细小炭角菌的水提物、发酵液、胞外多糖以及胞内多糖的最高清除能力分别达到63.97％、77.46％、70.95％以及50.32％。胞外多糖以及发酵液的清除羟基自由基能力显著高于黑柄炭角菌水提物(p＜0.05)，随着浓度增加，胞外多糖清除能力增加趋势与对照BHT接近平行。

3.亚铁离子螯合能力

在本实验中，EDTA在所有检测的浓度均显示了极好的铁离子螯合能力(结果在图2C中以(○)表示)，表明了本体系的可靠性。根据图2C所示，细小炭角菌四个样品以及黑柄炭角菌水提物的亚铁离子螯合能力均随着样品浓度的增加而增加，在检测浓度范围内，其螯合率曲线呈现出“S”型。根据曲线特征可知，在1.0-4.0mg/mL范围内，螯合率随浓度增加急剧变化，说明为最佳螯合浓度。在这个浓度范围内，螯合率比较为胞内多糖＞发酵液＞胞外多糖＞黑柄炭角菌水提物＞细小炭角菌菌丝水提物(p＜0.05)。细小炭角菌四个样品的最高螯合率分别为：菌丝水提物79.92％。发酵液89.47％，胞外多糖81.54％，胞内多糖89.72％。

4.还原能力

还原能力一般与还原酮的存在有关，具有还原能力的物质能够通过提供一个氢原子打断自由基链，从而破坏自由基的氧化过程(Ronge Xing，LiuS，Guo ZY，Yu HH，Zhong ZM，Ji X，Li PC.Relevance of molecular weightof chitosan-N-2-hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride and theirantioxidant activities.European Journal of Medicinal Chemistry，2007，1-5)。根据图2D所示，细小炭角菌四个样品均具有较好的还原能力，在高浓度(8.0mg/ml)时，胞外多糖及菌丝水提物具有与对照BHT相近的还原能力。并且在所有检测范围内，胞外多糖和菌丝水提物的还原能力显著高于胞内多糖和发酵液(p＜0.05)，但前两者和后两者之间的还原能力没有显著性差异，还原曲线几乎重合，猜测可能样品之间具有相同含量的还原酮，这需要进行进一步的研究确定。在低浓度范围内(＜1.0mg/mL)，与其它四个样品相比，黑柄炭角菌菌粉水提物显示出了最高的还原能力，而在浓度为1-8mg/mL时，胞外多糖和菌丝提取物的还原能力均高于黑柄炭角菌提取物。

综上所述，细小炭角菌的水溶性发酵产物的抗氧化能力包括清除游离羟基自由基、超氧阴离子自由基、螯合亚铁离子、以及还原能力。

尽管参考上述实施例，对本发明进行了详细地描述，但是，本领域的技术人员应该理解，在不背离本发明的精神和范围的条件下，可以对本发明进行适当的修改和改进。

Claims (4)

1.一种细小炭角菌菌株(Xylaria gracillima)，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年4月14日，保藏登记号为：CGMCC No.2449。

2.权利要求1的细小炭角菌的水溶性发酵产物的应用，其用于抗氧化作用和还原作用。

3.按照权利要求2所述的应用，其中所述抗氧化作用包括清除羟基自由基、清除超氧阴离子自由基、或螯合亚铁离子。

4.按照权利要求2或3所述的应用，其中所述水溶性发酵产物包括细小炭角菌菌丝体的水提物、发酵液、胞外多糖、或胞内多糖。

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