CN1563397A - 有效霉烯胺和有效霉胺的微生物制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种有效霉烯胺和有效霉胺的微生物制备方法，涉及的微生物为寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltrophilia)，CCTCC No.M 204024，通过利用这种微生物发酵分解、或这种微生物的细胞或酶等分解底物有效霉素或有效霉亚胺，生产有效霉烯胺和有效霉胺两种环醇类物质，培养基组成为(重量/体积)：有效霉素0.5％～20.0％,(NH4) 2SO4 0.5％～10.0，KCl 0.5％～5.0％，Na2HPO4·12H2O0.1％～10.0％,NaH2PO4·2H2O 0.1％～5.0％，MgSO4 0.01％～1.0％，用自来水配制，培养条件：发酵温度在20℃～40℃，初始pH为6.0～8.0，培养时间为1 h～180 h，发酵产物经离子交换、层析方法分离、纯化得到有效霉烯胺和有效霉胺。

Description

有效霉烯胺和有效霉胺的微生物制备方法
                     技术领域
本发明涉及从土壤中筛选到的新的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltrophilia)，还涉及利用该新菌株分解有效霉素(又称井冈霉素)或有效霉亚基胺(又称井冈霉亚基胺或井冈羟胺)生产有效霉烯胺和有效霉胺的方法。
                     背景技术
有关有效霉烯胺和有效霉胺的制造方法的研究已经有30多年的历史，日本人龟田等人曾经采用过脱硝假单孢菌的菌体降解有效霉素A或有效霉亚基胺A，再进行分离得到有效霉烯胺和有效霉胺，可是不能在仅以有效霉素类物质为唯一碳源的培养基上生长；而且对有效霉素的分解能力很弱，不适用于有效霉烯胺和有效霉胺的大量生产。
日本人龟田等在土壤中分离到一株能将有效霉素分解为有效霉烯胺和有效霉胺的菌株嗜糖黄杆菌(Flavobacterium saccharophilum)IFO13948(公开特许：JP57-54593)。
日本人龟田等采用噬细胞菌属产酶微生物(Cytophaga heparina)IFO12017(ATCC13125)和IFO14087株降解有效霉素或有效霉亚基胺生产有效霉烯胺和有效霉胺[特许公报(B2)：平2-26957]。
日本人龟田等发现了土壤菌属(Agrobacterium)或者气单胞菌属(Aeromonas)的微生物以及它们的变异株能有效分解有效霉素或有效霉亚基胺生产有效霉烯胺和有效霉胺。比如土壤菌属(Agrobacterium)微生物，有Agrobacterum Radiobacter IFO 12664(ATCC 4718)株，IFO 13258(ATCC 13332)株，IFO 13259(ATCC 13333)株，IFO 13532(ATCC 19358)株，IFO 13533(ATCC 25235)株，以及Agrobacterium tumefaciens IFO 3058株等；气单胞菌属(Aeromonas)微生物，有Aeromonas hydrophila subsp.Anaerogenes IFO 13282，同亚种subsp.hydrophila IFO 13286，subsp.proteolytica IFO 13287，aeromonas punctata subsp.cavice IFO 13288，以及aeromonas salmonicida subsp.salmonicida IFO 12659等[特许公报(B2)：平6-69380]。
本发明所用到的原料是一种广泛应用的农用抗生素——有效霉素，即井冈霉素，它是一种高效、安全的农用抗生素，不污染环境，对人畜无害，目前已经成为我国使用面积较广、亩用成本最低的安全、无公害农药，是农药工业的一个重要品种。有效霉素是氨基糖苷类农用抗生素，主要组分有A、B、C、D、E、F等，从有效霉素的结构中可以发现，有效霉素是由有效霉烯胺、有效霉胺和β-D-葡萄糖等结构组成。
有效霉素糖苷键经过水解，分解为有效霉亚基胺，有效霉亚基胺有A、B两种，有效霉亚基胺再经过分解，生成有效霉烯胺(valienamine)和有效霉胺(validamine)。
本发明涉及的有效霉烯胺，英文名为valienamine。其结构式如图1(Chem.Rev.2003，103：1955-1977)。
Figure A20041001751600051
            图1  有效霉烯胺(valienamine)的化学结构
有效霉烯胺，又称井冈胺或井冈霉烯胺，(1S，2S，3S，4R)-1-氨基-5-(羟甲基)环己-5-烯-2，3，4-三元醇；分子式为C7H13NO4，重要的基团有：一个伯氨基(-NH2)，一个碳碳双键(C＝C)，一个羟甲基(-CH2OH)，三个羟基(-OH)。其盐酸盐(C7H13NO4·HCl)的[α]D 23为+68.6°(1N-HCl)，五乙酸盐(C17H23NO9)的熔点为95℃，[α]D 23为+30.2°(CHCl3)，遇茚三酮显色反应。由于有效霉烯胺含有一个伯氨基(-NH2)，在水溶液中发生一级解离。
本发明涉及的有效霉胺，英文名为validamine，其结构式如图2(Chem.Rev.2003，103：1955-1977)。
Figure A20041001751600061
            图2  有效霉胺(validamine)的化学结构
有效霉胺，又称井冈霉胺，分子式为C7H15NO4，一个伯氨基(-NH2)，一个羟甲基(-CH2OH)，三个羟基(-OH)，其盐酸盐(C7H13NO4·HCl)的[α]D 23为+57.4°，熔点为229℃-232℃，(1N-HCl)的[α]D 23为+60.6°，遇茚三酮显色反应。有效霉胺也含有一个伯氨基(-NH2)，在水溶液中发生一级解离。
有效霉烯胺、有效霉胺等环醇类物质是糖苷酶抑制剂的核心结构，同时也是一种较强的糖苷酶抑制剂。
糖苷酶是糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪酶，对糖蛋白中的寡糖链的形成极为重要。糖链的组成与结构是糖蛋白特异生物功能的识别部位，影响蛋白质的折叠、溶解度、修饰、抗原性及生物活性等。糖苷酶活性对糖蛋白生物合成起着十分关键的作用，研究糖苷酶抑制剂，具有广泛的应用前景。
由于有效霉烯胺和有效霉胺的生物活性，人们对它的兴趣与日剧增。这些年，是活跃的研究领域之一，尤其在日本和德国，而在我国，这方面的研究几乎是空白。
                      发明内容
本发明的任务是有目的的从土壤中筛选到将有效霉素或有效霉亚基胺分解为有效霉烯胺和有效霉胺的新的微生物菌株；其次是提供一种利用该新微生物发酵分解或该新微生物的细胞或酶分解抗生素有效霉素、有效霉亚基胺生产有效霉烯胺和有效霉胺的方法。
本发明提供的微生物是寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)，为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltrophilia)，该菌株已于2004年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC No.M 204024。
根据文献及专利查阅结果，已报道的能降解有效霉素的专利菌种包括假单胞菌属(Pseudomonas，1个种，Pseudomonas denitrificans，反硝化假单胞菌)、黄杆菌属(Flavobacterium，3个种)、嗜纤维菌属(Cytophaga1个种，3个菌株)、土壤菌属(Agrobacterium，2个种，其中Agrobacteriumradiobacter有5个菌株，Agrobacterium tumefaciens，1个种)、气单胞菌属(Aeromonas，5个种)。具体结果见附表1。
            表1  降解有效霉素专利[特许公报(B2)]菌种汇总
 菌  种 专    利
 Pseudomonas denitrificans 平2-26957(1982)、平2-2598
 Flavobacterium saccharophilum IFO13984 平2-26957、平2-2598
 Flavobacterium heparinum 平2-26957
 Flavobacterium keratolyticus 平2-26957
 Cytophaga heparina IFO 12017 平2-26957
 Cytophaga heparina ATCC 13125 平2-26957
 Cytophaga heparina IFO 14087 平2-26957
 Flavobacterium saccharophilum n.sp. 平2-2598
 Flavobacterium    saccharophilumFERM-P 平2-2598
 Flavobacterium     saccharophilumNO.5707 平2-2598
 Agrobacterium Radiobacter IFO 12664(ATCC 4718) 平6-69380
 Agrobacterium Radiobacter IFO 13258(ATCC 13332) 平6-69380
 Agrobacterium Radiobacter IFO 13259(ATCC 13333) 平6-69380
 Agrobacterium Radiobacter IFO 13532(ATCC 19358) 平6-69380
 Agrobacterium Radiobacter IFO 13533 平6-69380
(ATCC 25235)
Agrobacterium tumefaciens IFO 3058 平6-69380
Aeromonas hydrophila     subsp.anaerogenes IFO 13282 平6-69380
Aeromonas hydrophila     subsp.hydrophila IFO 13286 平6-69380
Aeromonas hydrophila     subsp.proteolytica IFO13287 平6-69380
Aeromonas punctata subsp.cavice IFO13288 平6-69380
Aeromonas  salmonicida   subsp.salmonicida IFO 12659 平6-69380
各属生理生化特征如下：
假单胞菌属(Pseudomonas)：反硝化假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)为革兰氏阴性无芽孢杆菌，极生鞭毛运动，氧化型代谢，通常氧化酶阳性，有机化能营养。好氧菌，能进行反硝化作用。
土壤菌属(Agrobacterium)：短小杆菌，大小为1.5～0.3μm×0.6～1.0μm，单个成对排列，稀周毛，革兰氏反应阴性，不产生芽孢，菌落凸起，全缘光滑，无色素至浅灰黄色。在含糖培养基中产生大量多糖黏液，不固定大气氮，多数种可利用无机氮，放射土壤杆菌能从乳糖产生3-酮基乳糖，分解蛋白质的能力弱或无，可广泛利用碳水化合物、有机酸盐和氨基酸为碳源，不能利用纤维素、淀粉、琼脂糖、半乳糖及其他糖类。
气单胞菌属(Aeromonas)：细胞挺直，具圆端杆状，常以单极毛运动，发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖和海藻糖，碳水化合物分解成酸，有的产气，水解淀粉和糊精，水解酪蛋白，液化明胶，产生DNA酶，精氨酸脱氨酶，少数种不运动。革兰氏反应阴性，有呼吸和发酵两种代谢类型，氧化酶和过氧化氢酶阳性，兼性厌氧菌。
嗜纤维菌属(Cytophaga)：不形成子实体，细胞杆状，往往形成很长的细胞链，好氧，能利用碳水化合物，代谢过程中需要大量CO2，能彻底分解纤维素、水解几丁质和琼脂等多糖类物质，可以在界面上滑行。
黄杆菌属(Flavobacterium)：直杆状，端圆，大小0.5μm×1.0～3.0μm。细胞内不含PHB盐，不形成内生孢子，革兰氏阴性，不运动，无滑动或泳动，严格好氧，在固体培养基上生长，产生典型的黄色或橙色色素，有些菌株不产生色素，菌落半透明，圆形，隆起或微隆起，光滑且又光泽，全缘，接触酶、氧化酶、磷酸酶均阳性，不消化琼脂，有机化能营养。在低浓度蛋白胨培养基中不产气。
综合以上结果，本发明筛选到的新的菌株不属于上述专利菌种的任何一种。
该新的菌株特征为：
菌落形态：光滑，有光泽，边缘整齐，白、灰或淡黄色，培养18h～36h的菌落直径1mm～2mm左右；斜面菌苔白色，粘稠。
细胞形态：细胞内不形成PHB颗粒，不运动，杆状，菌体平均大小为：0.4～0.5μm×1.3～1.4μm。革兰氏阴性，无芽孢。
生理生化特征：液化明胶，卵黄反应阳性，脂酶(土温80)反应阳性，氧化酶阴性，接触酶阳性，吲哚反应阴性，甲基红阴性，V-P反应阴性，产生H2S，不氧化分解葡萄糖，氧化型产酸，利用丙二酸盐，利用柠檬酸盐，不还原硝酸盐，不能反硝化，不能利用淀粉，脲酶反应阳性，水解酪蛋白，不能分解乳糖产生3-酮基乳糖。
需生长因子，产赖氨酸脱羧酶，水解几丁质；以天门冬酰胺作碳、氮源。
根据以上细菌学特征，这个新的菌株被鉴定属于寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)的菌株，为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltrophilia)。
用于本发明菌种CCTCC No.M 204024的培养基是一些含有可以被上述菌株利用营养物质，液体、固体均可，但是大量工业化生产时，液体培养基较为合适。培养基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、无机盐等。作为碳源的有：有效霉素、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山犁醇、油脂类(豆油、猪油等)；作为氮源的有：肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、氨盐(硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸胺等)，肽类(二肽、三肽等)；无机盐类有：Na、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Co、Ni等金属盐类和磷酸盐、醋酸盐等有机酸盐类；另可加有：氨基酸类(如谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸等)、微生素(VB1、VB2、VB12、VC、VE、烟酸等)、核酸类(如嘌呤、嘧啶及其衍生物等)。用无机酸或有机酸、碱类调节培养基的pH值，还可加入适量的消泡剂，如泡敌等。
可采用培养方式有：静置培养、摇动培养、或通风搅拌培养等，大量生产有效霉胺和有效霉烯胺时宜采用深层通风搅拌培养。
本发明的另一个重要特征是利用该新的微生物发酵或该新的微生物细胞或其酶分解底物有效霉素或有效霉素的中间产物有效霉亚基胺生产有效霉烯胺和有效霉胺。
本发明的新的微生物寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltrophilia)，CCTCC No.M 204024，与含碳源、氮源、无机盐的培养基，底物为抗生素有效霉素，进行发酵，然后对分解发酵液进行分离有效霉胺和有效霉烯胺，并进行提纯。
本发明的培养基组成为(w/v，％)：有效霉素：0.5％～20％，(NH4)2SO4：0.5％～10％，KCl：0.5％～5.0％，Na2HPO4·12H2O：0.1％～10.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％～5.0％，MgSO4：0.01％～1.0％，以自来水配制，pH值6.0～8.0。
用本发明的新的菌株嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltrophilia)CCTCC No.M 20402)生产效霉烯胺和有效霉胺，其方法有：
(1)上述配制的培养基经过灭菌，接入经培养后的菌种CCTCC No.M 204024，斜面或用种子液接种，进行培养，通常选择温度在20℃～40℃，以28℃～35℃较好，初始pH为6.0～8.0，以接近中性较好，培养时间为100h～180h较好，其中以150h左右为最好，此外反应可在静置下进行，但在搅拌、通风、振荡条件下进行为佳。在发酵过程中，pH值用无机酸或有机酸、碱类调节控制。该方法中培养基组成中的有效霉素既是微生物利用的碳源，又是被微生物分解的底物；底物有效霉素被分解为有效霉亚基胺，有效霉亚基胺有A、B两种，有效霉亚基胺再经过分解，生成有效霉烯胺(valienamine)和有效霉胺(validamine)。
(2)上述配制的培养基经过灭菌，接入经培养后菌种CCTCC No.M204024，用斜面或种子液接种，培养菌体，培养条件：通常选择温度在20℃～40℃，以28℃～35℃较好，初始pH为6.0～8.0，以接近中性较好；在培养的过程中流加微生物分解的底物——有效霉素或有效霉亚基胺溶液，可以在菌体刚开始生长的时候流加，也可以在菌体生长了一段时间后再进行流加，流加入培养物中的底物有效霉素或有效霉亚基胺的浓度为1.0％～50.0％，流加的速度可以根据有效霉素或有效霉亚基胺的浓度进行调节，培养时间为100h～180h较好，其中以160h左右为最好，此外反应可在静置下进行，但在搅拌、通风、振荡条件下进行为佳；在发酵过程中，pH值的变化用无机酸或有机酸、碱类调节控制，制得发酵产物。
(3)上述配制的培养基经过灭菌，接入经培养后菌种CCTCC No.M204024，用斜面或种子液接种，培养菌体，培养条件：通常选择温度在20℃～40℃，以28℃～35℃较好，初始pH为6.0～8.0，以接近中性较好；培养菌体到对数生长期，进行离心分离，得到菌体；将得到的菌体加入底物有效霉素或底物有效霉亚基胺溶液中，利用菌体分解底物有效霉素或有效霉亚基胺，有效霉素或有效霉亚基胺的浓度为1.0％～20.0％，反应时间为1h～100h较好，其中以70h左右为最好，此外反应可在静置下进行，但在搅拌、通风、振荡条件下进行为佳；在发酵过程中，pH值的变化用无机酸或有机酸、碱类调节控制，制得发酵产物。
(4)上述配制的培养基经过灭菌，接入经培养后菌种CCTCC No.M204024，用斜面或种子液接种，培养菌体，培养条件：通常选择温度在20℃～40℃，以28℃～35℃较好，初始pH为6.0～8.0，以接近中性较好；培养菌体到对数生长期，进行离心分离，得到菌体，然后将菌体破碎，提取出裂解酶；将提取的裂解酶加入到底物有效霉素或底物有效霉亚基胺溶液中，利用酶反应分解底物有效霉素或有效霉亚基胺，有效霉素或有效霉亚基胺溶液的浓度为1.0％～20.0％，酶反应时间为1h～100h较好，其中以10h左右为最好，此外反应可在静置下进行，但在搅拌、通风、振荡条件下进行为佳；在发酵过程中，pH值的变化用无机酸或有机酸、碱类调节控制，制得发酵产物。
将含有效霉烯胺和有效霉胺的分解发酵液进行分离、纯化，具体做法是：
从发酵液提取目标产物时，可采用常规的发酵产物提取法。如：过滤、离心、沉淀、结晶、重结晶、浓缩、干燥、冷冻干燥，吸附、离子交换、层析等。此外，有效霉烯胺和有效霉胺易溶于水、难溶于一般溶剂的碱性物质，因而可以采用水溶性碱性物质的分离、精制方法，例如离子交换树脂、活性炭、多孔高聚物，葡聚糖凝胶、离子交换剂等进行吸附后解吸或层析。
完整的提取过程可分为预处理、中期纯化和精制三个阶段：(1)预处理阶段，这一阶段的目标是以尽可能少的操作步骤和尽可能简单的设计，从复杂的料液中分离出目标产物、除去固体颗粒、浓缩。(2)中期纯化阶段，一般先采用非特异性和低分辨率的纯化技术，随后再采用高分辨率的层析法等技术主要是除去理化性质和产物理化性质相似的的杂质。(3)精制阶段，这是最后的加工程序，目的是进一步除去杂质，纯化产物，其方法取决于产品的应用目的，最常用的方法是结晶法，并结合干燥，获得所需纯度和一定形状的产品。
用薄层层析和气相分析的方法对发酵生产的有效霉烯胺和有效霉胺进行分析，操作过程和实验条件按文献[J.Antibiot，1984，37：1301～1305]和专利[EP0063456]的方法进行，所得到的结果与它们完全一致。由此可见，利用本发明的微生物菌株嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltrophilia)CCTCC No.M 204024可以将有效霉素、有效霉亚基胺裂解为有效霉烯胺和有效霉胺。
本发明的微生物菌株嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltrophilia)CCTCC No.M 204024，不仅能在以有效霉素类物质为唯一碳源的培养基上生长，而且对有效霉素的分解能力较强；利用CCTCC No.M 204024生产有效霉烯胺和有效霉胺，在较佳工艺条件下，有效霉素的分解率达到70％～90％，有效霉素A转化为有效霉烯胺的摩尔转化率达到40％～80％(即1摩尔的有效霉素A能转化为0.40～0.80摩尔的有效霉烯胺)，有效霉亚基胺转化为有效霉烯胺的摩尔转化率达到35％～75％，同时得到有效霉胺；本发明的微生物菌株嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltrophilia)CCTCC No.M 204024适用于有效霉烯胺和有效霉胺的生产。
                      具体实施方案
下面实施例旨在举例说明而不是限制本发明的范围。
实施例1：
培养基配方(重量/体积百分比，以下同)：有效霉素：1.0％，(NH4)2SO4：1.0％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：1.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.01％，用自来水配制，用HCl溶液将pH调到6.0。
取100mL上述培养基，平均分装在2个250mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养72小时作为种子液，备用。
取2L上述培养基，平均分装入20个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为2％(v/v)，进行培养，培养温度为20℃，培养时间为160h，摇床转速200r/min。
收集上述发酵液1.8L，离心分离除去菌体，上清液上柱吸附(1L大孔弱酸性树脂D113，NH4 +)，用蒸馏水洗后，再用0.5mol/L的氨水洗脱，减压浓缩，再将浓缩液上柱层析(500mL强碱层析树脂Dowex 1×2，OH-)，用蒸馏水洗脱，分段收集洗出液，收集先流出来的含有效霉胺和后流出来的有效霉烯胺的部分，用薄层层析方法和气相分析的方法进行分析，然后进行真空冷冻干燥，得到0.31克有效霉胺和0.74克有效霉烯胺。
实施例2：
培养基配方  有效霉素：17.0％，(NH4)2SO4：8.0％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：1.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.01％，用自来水配制，用NaOH溶液将pH调到7.0。
取500mL培养基，平均分装在5个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，进行培养，培养温度为28℃，培养时间为150h，反应在搅拌、通风、振荡条件下进行，摇床转速200r/min。
收集上述发酵液400mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到0.56克有效霉胺和0.85克有效霉烯胺。
实施例3：
发酵培养基配方有效霉素：8.0％，(NH4)2SO4：6％，KCl：0.1％，Na2HPO4·12H2O：1.0％，NaH2PO4·2H2O：0.16％，MgSO4：0.02％，用自来水配制，用NaOH溶液将pH调到7.5。
种子培养基配方有效霉素：1.0％，(NH4)2SO4：1％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：1.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.5％，用自来水配制，用NaOH溶液将pH调到7.5。
取500mL种子培养基，平均分装在5个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体，摇床转速200r/min，在30℃摇床培养72小时作为种子液，备用。
取8L发酵培养基，平均分装在80个500mL的摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为5％(v/v)，进行培养，培养温度为30℃，培养时间为180h，反应在搅拌、通风、振荡条件下进行，摇床转速200r/min。
收集上述发酵液7.5L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到3.19克有效霉胺和7.77克有效霉烯胺。
实施例4：
培养基配方  有效霉素：2.0％，(NH4)2SO4：1.0％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：2.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.1％，用自来水配制，用NaOH溶液将pH调到7.0。
取500mL培养基，平均分装在5个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养72小时作为种子液，备用。
取8L培养基，平均分装在80个500mL的摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为5％(v/v)，进行培养，培养温度为28℃，培养时间为100h，反应在搅拌、通风、振荡条件下进行，摇床转速200r/min。
收集上述发酵液7.5升，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到2.11克有效霉胺和5.63克有效霉烯胺。
实施例5：
培养基配方  有效霉素：1.5％，(NH4)2SO4：0.75％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：2.0％，NaH2PO4·2H2O：1.0％，MgSO4：0.01％，用自来水配制，自然pH。
取200mL上述培养基，平均分装在4个250mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养72小时作为种子液，备用。
在10L发酵罐中加入上述培养基5L，灭菌，接入种子液200mL，进行发酵。
在接种后，开始流加浓度为10％的底物有效霉素溶液1L，流加速度0.2mL/min；培养温度30℃，培养时间为160h左右，通气量2.5L/min，搅拌速度200r/min。
收集上述发酵液6L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到3.67克有效霉胺和6.53克有效霉烯胺。
实施例6：
培养基配方  有效霉素：1.0％，(NH4)2SO4：0.7％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：0.1％，NaH2PO4·2H2O：4.0％，MgSO4：0.01％，用自来水配制，自然pH。
取500mL上述培养基，平均分装在5个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养72小时作为种子液，备用。
在10L发酵罐中加入上述培养基5L，灭菌，接入种子液200mL，进行发酵。
在菌体生长到对数期时进行流加浓度为2％的底物有效霉素溶液3L，流加速度0.5mL/min；培养温度35℃，培养时间为180h左右，通气量2.5L/min，搅拌速度200r/min。
收集上述发酵液8L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到3.08克有效霉胺和5.82克有效霉烯胺。
实施例7：
培养基配方  有效霉素：1.0％，(NH4)2SO4：0.7％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：6.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.7％，用自来水配制，自然pH。
取500mL培养基，平均分装在5个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养72小时作为种子液，备用。
在10L发酵罐中加入上述培养基6L作为发酵液，灭菌。接入种子液500mL。
在菌体生长到对数期时流加浓度为50％的有效霉亚基胺溶液100mL，流加速度0.05mL/min；培养条件：温度为30℃，培养时间为120h，通气量3.5L/min，搅拌速度200r/min。
收集上述发酵液6L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到3.26克有效霉胺和7.01克有效霉烯胺。
实施例8：
培养基配方  有效霉素：2.0％，(NH4)2SO4：1.2％，KCl：4.0％，Na2HPO4·12H2O：4.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.01％，用自来水配制，用HCl调节pH为6.5。
取1000mL培养基，平均分装在10个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，将这些菌体加入到500mL浓度为5％的底物有效霉素溶液中，利用菌体分解有效霉素；反应条件：温度30℃，初始pH为6.5，培养时间为100h左右，摇床转速150r/min。
收集上述反应液480mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到0.45克有效霉胺和1.21克有效霉烯胺。
实施例9：
培养基配方  有效霉素：2.0％，(NH4)2SO4：1.2％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：1.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.01％，用自来水配制，用NaOH溶液调节pH为7.5。
取1000mL培养基，平均分装在10个500mL三角瓶中，灭菌，接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，将这些菌体加入到500mL浓度为15％的底物有效霉亚基胺溶液中，利用菌体分解有效霉亚基胺；培养条件：温度32℃，初始pH为7.5，培养时间为40h左右，摇床转速200r/min。
收集上述反应液580mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到1.03克有效霉胺和2.77克有效霉烯胺。
实施例10：
培养基配方  有效霉素：2.0％，(NH4)2SO4：1.2％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：3.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.01％，用自来水配制，用NaOH溶液调节pH为7.5。
取1000mL培养基，平均分装在10个500mL三角瓶中，灭菌，接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，将菌体加入到500mL浓度为3％的底物有效霉亚基胺溶液中，利用菌体分解有效霉亚基胺；培养条件：温度34℃，初始pH为7.5，培养时间为20h左右，摇床转速150r/min。
收集上述反应液580mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到0.53克有效霉胺和1.06克有效霉烯胺。
实施例11：
培养基配方  有效霉素：2.0％，(NH4)2SO4：1.2％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：0.2％，NaH2PO4·2H2O：1.5％，MgSO4：0.01％，用HCl溶液调节pH为6.0。
取2000mL上述培养基，平均分装在20个500mL三角瓶中，灭菌，接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，用超声波将菌体破碎，再进行离心、盐析、透析、层析，提取出裂解酶，将上述提取出的裂解酶加入200mL浓度为8％的底物有效霉素溶液中，利用酶反应分解有效霉素生产有效霉胺和有效霉烯胺。培养条件：温度25℃，初始pH为6.0，培养时间为10h左右，反应可在静置下进行。
收集上述反应液200mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到0.15克有效霉胺和0.34克有效霉烯胺。
实施例12：
培养基配方  有效霉素：2.0％，(NH4)2SO4：1.2％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：1.5％，NaH2PO4·2H2O：0.8％，MgSO4：0.01％，用NaOH溶液调节pH为8.0。
取2000mL培养基，平均分装在20个500mL三角瓶中，灭菌，接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，用超声波将菌体破碎，再进行离心、盐析、透析、层析，提取出裂解酶，将上述提取出的裂解酶，加入100mL浓度为20％的底物有效霉素溶液中，利用酶反应分解有效霉素。反应条件：温度32℃，初始pH为8.0，培养时间为80h左右，反应可在静置下进行。
收集上述反应液100mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到0.21克有效霉胺和0.39克有效霉烯胺。
实施例13：
培养基配方  有效霉素：2.0％，(NH4)2SO4：1.2％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：1.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.01％，用NaOH调节pH为7.8。
取2000mL培养基，平均分装在20个500mL三角瓶中，灭菌，接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，用超声波将菌体破碎，再进行离心、盐析、透析、层析，提取出裂解酶，将上述提取出的裂解酶，加入100mL浓度为10％的底物有效霉亚基胺溶液中，利用酶反应分解有效霉亚基胺生产有效霉胺和有效霉烯胺。反应条件：温度30℃，初始pH为7.0，培养时间为30h左右，摇床转速100r/min。
收集上述反应液100mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到0.10克有效霉胺和0.31克有效霉烯胺。
实施例14：
培养基配方  有效霉素：2.0％，(NH4)2SO4：1.2％，KCl：0.5％，Na2HPO4·12H2O：1.0％，NaH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.01％，用NaOH调节pH为7.0。
取2000mL上述培养基，平均分装在20个500mL三角瓶中，灭菌，接入斜面菌种CCTCC No.M 204024，培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，用超声波将菌体破碎，再进行离心、盐析、透析、层析，提取出裂解酶，将上述提取出的裂解酶，加入到100mL浓度为18％的底物有效霉亚基胺溶液中，利用酶反应分解有效霉亚基胺。反应条件：温度30℃，初始pH为7.0，培养时间为50h左右，摇床转速100r/min。
收集上述反应液100mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到0.33克有效霉胺和0.59克有效霉烯胺。

Claims (12)

1.一种有效霉烯胺和有效霉胺的微生物制备方法，其特征是所述的微生物是寡氧单胞菌属(Stenotrophomonas)嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltrophilia)，CCTCC No.M 204024，嗜麦芽寡养单胞菌与含碳源、氮源、无机盐的培养基，底物为抗生素有效霉素，进行发酵，对分解发酵液进行分离有效霉胺和有效霉烯胺，并进行提纯。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的培养基组成为(重量/体积)：有效霉素0.5％～20.0％，(NH4)2SO4 0.5％～10.0％，KCl0.5％～5.0％，Na2HPO4·12H2O 0.1％～10.0％，NaH2PO4·2H2O 0.1％～5.0％，MgSO4 0.01％～1.0％，用自来水配制，调节pH值6.0～8.0。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的发酵液的分离、提纯步骤为：反应液离心，除去菌体，上清液上柱吸附(大孔弱酸性树脂D113，NH4 +)，用蒸馏水洗后，再用0.5mol/L的氨水洗脱，减压浓缩，再将浓缩液上柱层析(强碱层析树脂，Dowex1×2，OH-)，用蒸馏水洗脱，分段收集洗出液，用薄层层析方法进行分析，收集先流出来的含有效霉胺和后流出来的有效霉烯胺的部分，分别进行真空冷冻干燥，得到有效霉胺和有效霉烯胺。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是在接入CCTCC No.M 204024后的发酵培养基进行发酵，培养基中有效霉素的浓度0.5％～20.0％，培养条件：温度20℃～40℃，初始pH为6.0～8.0，培养时间为100h～180h，在静置下进行发酵。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是发酵培养基中有效霉素的浓度为1.0％～10.0％，发酵温度28℃～35℃，初始pH为6.8～7.2，培养时间为150h，在搅拌、通风、振荡条件下进行发酵。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是在培养基中接入菌种CCTCC No.M 204024后，在培养过程中流加入底物有效霉素，在菌体刚开始生长的时候开始流加，培养条件：温度在20℃～40℃，初始pH为6.0～8.0，培养时间为100h～180h，在静置下进行发酵。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是在菌体生长对数期后再进行流加底物有效霉素，培养条件：28℃～35℃，初始pH为6.5～7.5，培养时间150h，在搅拌、通风、振荡条件下进行发酵。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是在培养基中接入菌种CCTCC No.M 204024后并培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，将菌体加入到底物有效霉素溶液中，利用菌体分解底物有效霉素，培养条件：温度在20℃～40℃，初始pH为6.0～8.0，培养时间为1h～100h，在静置下进行发酵。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征是将菌体加入到底物有效霉素溶液中，培养条件：温度28℃～35℃，初始pH为6.5～7.5，培养时间为70h，在搅拌、通风、振荡条件下进行发酵。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是在培养基中接入菌种CCTCC No.M 204024后培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，再用超声波法将菌体破碎，提取出裂解酶，将裂解酶加入到有效霉素溶液中，培养条件：温度20℃～40℃，初始pH为6.0～8.0，培养时间为1h～100h，在静置下进行。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征是将裂解酶加入到底物有效霉素溶液中，培养条件：温度28℃～35℃，初始pH为6.5～7.5，培养时间为10h，在搅拌、通风、振荡条件下进行。
12.根据权利要求1或6～11所述的制备方法，其特征是底物可以为有效霉亚基胺。
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Granted publication date: 20060906