CN1212392C - 一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法 - Google Patents

一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，它主要是通过粘细菌液体菌种的制备、专用固体培养装置发酵培养、子实体洗提装置水洗提取等工艺环节来大量获得粘细菌子实体。该工艺方法降低了成本，提高了效率，大大提高了工业化生产的可行性和可放大性。

Description

一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法
(一)技术领域
本发明涉及粘细菌固体发酵制备子实体的工艺方法，具体地说涉及一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法。
(二)背景技术
粘细菌是一类具有特殊社会学行为特征和复杂的发育生活史的单细胞革兰氏阴性细菌。在固体培养基上，特别是贫瘠的培养基上，粘细菌细胞在一定条件下可以聚集并形成子实体结构——由坚硬度不同的分化的细胞和粘孢子组成的简单或复杂的休眠体。作为最高等的原核生物，粘细菌特殊的社会行为现象和多细胞形态发生在进化上不仅高于一般原核生物，而且与真核生物有着极大的相似性，被认为是原核生物和真核生物间界面上的微生物类群。此外，粘细菌子实体的提取物以及粘细菌丰富的次级代谢产物使粘细菌在新药开发中成为极有潜力的药用菌资源。研究表明，粘细菌多种生物活性代谢产物的产生均处于细胞生长和发育的中后期。在固体培养中则表现为伴随着子实体的发育和成熟，粘细菌的次级代谢产物也大量产生。并且，某些具有诱人前景的代谢产物的生成对子实体的形成是有依赖性的。同时，子实体形成后，许多大分子物质如多糖、蛋白等大量富集，这些分子所具有的独特的生物活性也越来越引起人们的重视。我们的研究发现，粘细菌的子实体具有显著的生物学活性，如抑制肿瘤细胞的生长，提高机体的免疫力等。因此，高效地制备粘细菌的子实体是进一步研究和开发的关键因素。
粘细菌是典型的有机化能营养菌，严格好氧，其生长发育一般分为两个阶段：第一个阶段是营养细胞生长期，细胞在适宜生长的培养基上经过一个潜伏期后能够以指数形式生长，也可分散生长，粘细菌的生长速率极慢，代时一般为4~12小时，而其中最具应用潜力的纤维堆囊菌的代时达16小时。营养细胞的生长停止后进入生活周期的第二阶段，即细胞发育期。细胞生长转换需要有三个条件：1)营养成分的耗尽，2)细胞位于固体表面，3)高细胞密度。在此条件下，成千上万的细胞向中心聚集，并形成具有种属特异性的多细胞结构，即子实体。因此，高效制备子实体应充分考虑这三个条件。由于大多数种的粘细菌适于在较贫瘠的培养基上生长，而在常用的细菌学培养基上不生长或生长慢，并且粘细菌的子实体也需要营养贫瘠或营养耗尽。目前粘细菌的固体发酵仅是在玻璃培养器皿中的琼脂固体培养基上完成的，很难得到大量的子实体，而且因为工作量太大，不具有工业化生产的可能性。
经过文献和专利的检索，国内外针对上述不足的相关技术和方法至今未见文献或专利报道。
(三)发明内容
本发明的主要目的是针对上述粘细菌固体发酵产生子实体的技术和方法上的不足，提供一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，它可以有效地克服现有生产工艺的缺陷，具有产生菌子实体的生长量大，得率高，操作简便易行和价格低廉等特点，并且可以进一步放大到工业规模，为工业生产粘细菌子实提供了理论支持和技术保障。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的，具体步骤顺序如下：
(1)发酵菌株的选择
降解纤维素的粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384，ATCC25531，ATCC25569菌株之一；
(2)粘细菌一级斜面种子的制备
取上述菌株接种于固体斜面培养基上，30℃培养4～7天。培养基成分为：大豆蛋白胨5～15g/L，马铃薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O 0.8～1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.7～1.4g/L，Fe-EDTA 5～10mg/L，琼脂粉13～17g/L；
(3)粘细菌二级种子液的制备
取上述一级种子，接种于液体发酵培养基中，30℃，120转/分摇床培养5～7天。液体发酵培养基的成分为：地瓜淀粉15～35g/L，水解乳蛋白8～20g/L，CaCl2.2H2O0.8～1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.7～1.4g/L，Fe-EDTA 5～10mg/L；
(4)粘细菌子实体的培养制备
将滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器(图2)内，由滤纸片为碳源和固体介质，形成粘细菌生长所需的碳源和耗氧所需的孔隙支撑，将制成的粘细菌二级种子悬液接种在滤纸片上，通过喷头喷洒营养液，30℃通气静置培养10～15天；
上述的滤纸片为灰份值0.1％～0.2％的定性滤纸和/或灰份值为0.01％～0.05％的定量滤纸；
上述的固体发酵器是可灭菌和供养的大型容器；
上述的培养是指在培养过程中用喷头向固体发酵器内以每小时喷洒pH为7.0～7.2的营养液5～10毫升的方法提供氮源、无机盐及微量元素，并保持滤纸片湿度；
上述的营养液组成为：KNO3 0.5～1.0g/L；Na2HPO4 0.25～0.5g/L；MgSO4·7H2O 1.0～2.0g/L；FeCl3 0.01～0.05g/L；琼脂0.5～2.0g/L；微量元素液1.0(V/V)；
上述的营养液pH在灭菌前用KOH或HCl调整；
(5)子实体的分离
待粘细菌在滤纸片上较均匀地生成子实体后，收集滤纸片，分批放入盛有无菌水的子实体洗提器(图3)中，升温至80℃保持30-90分钟，搅拌，通过沸水洗提的方法将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来，即得粘细菌子实体；
上述的搅拌是指整个过程中不停地缓慢搅拌，转速为3～10转/分；
上述的洗提过程可重复操作3～5遍。
本发明的创造性在于：1)通过二级制种，用合理的培养基配方，提高了种子的细胞密度，从而提高了单位滤纸片上的接种量，使子实体形成培养避免了长时间的生长培养，避免长时间培养可能带来的污染合资实体形成能力下降。2)设计了专门用于粘细菌子实体形成的固体培养装置，可以灭菌和供氧，结构简单，操作方便，不采用常规的固体培养基，而是将作为碳源的滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器中形成粘细菌耗氧所需的孔隙支撑，以喷洒营养液的方法提供氮源、无机盐及微量元素，提高了器皿的空间利用效率。3)设计了专门用于子实体分离的洗提器，将生长有子实体的滤纸片放入洗提器中，热水中缓慢搅拌洗提，将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来。
利用本发明可以有效地克服现有生产工艺的缺陷，具有产生菌子实体的生长量大，得率高，操作简便易行和价格低廉等特点，并且，开创了高效而经济的粘细菌固体发酵获得子实体的新技术，具备工业化生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。
(四)附图说明
图1扩大粘细菌固体发酵规模获得子实体的工艺流程图
图2粘细菌子实体固体发酵装置示意图
图3粘细菌子实体洗提装置示意图
其中：1.液体种子发酵培养基的配制；2.固体斜面菌种；3.收获液体种子菌团；4.在大发酵器中固体发酵；5.营养液的配制；6.收获固体发酵滤纸片；7.沸水洗提获得子实体；8.排污阀；9.环形气体分布器；10.筛板；11.固体发酵支撑物；12.旋转喷淋头；13.发酵罐体；14.塞子及法兰；15.气体过滤器；16.排气管；17.双金属温度计；18.湿度指示计；19.压力表；20.营养液进口；21.无菌空气进口；22.空气压缩机；23.空气净化器；24.营养液输送泵；25.营养液储存器；26.循环泵；27.三通阀；28.取样阀；29.视镜；30.过滤筛板；31.温度计；32.进水管；33.防尘筒；34.搅拌电机；35.进料口；36.罐体；37.搅拌桨；38.残渣出口；39.电加热管；40.阀门；41.沉淀出口。
(五)具体实施方式
实施例1
本实施例是提供一种高效而经济的扩大粘细菌固体发酵规模获得子实体的方法。也就是利用制备高浓度、均匀的种子液，滤纸片固体发酵培养，沸水洗提等手段获得高产量的子实体。具体步骤如下：
(1)发酵菌株的选择
能够降解纤维素的粘细菌——纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384菌株。
(2)粘细菌一级斜面种子的制备
取上述菌株接种固体斜面培养基上，30℃培养4天。培养基成分为：大豆蛋白胨5g/L，马铃薯淀粉15g/L，CaCl2.2H2O 0.8g/L，MgSO4.7H2O 0.7g/L，Fe-EDTA 5mg/L，琼脂粉13g/L。
(3)粘细菌二级种子的制备
取一级种子，接种液体发酵培养基中，30℃，120转/分摇床培养5天。液体发酵培养基的成分包括：地瓜淀粉15g/L，水解乳蛋白8g/L，CaCl2.2H2O 0.8g/L，MgSO4.7H2O0.7g/L，Fe-EDTA 5mg/L。
(4)粘细菌子实体的培养制备
以大滤纸片为碳源和固体介质，该滤纸片为灰份值0.1％～0.2％的定性滤纸，将滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器(图2)中形成粘细菌生长所需的碳源和耗氧所需的孔隙支撑，将制成的种子悬液接种在滤纸片上，30℃通气静置培养10天。在培养过程中用喷头向固体发酵器内以每小时喷洒营养液5毫升的方法提供氮源、无机盐及微量元素，并保持滤纸片湿度。营养液的组成包括：KNO3 0.5g/L；Na2HPO4 0.25g/L；MgSO4·7H2O 1.0g/L；FeCl3 0.01g/L；琼脂0.5g/L；微量元素液1.0(V/V)；灭菌前用KOH或HCl调pH为7.0。
(5)子实体的分离
待粘细菌在滤纸片上较均匀地生成子实体后，收集滤纸片，分批放入盛有无菌水的子实体洗提器(图3)中，升温至80℃保持30分钟，整个过程中不停地缓慢搅拌，转速为3转/分，通过沸水洗提的方法将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来，重复操作3遍，即得粘细菌子实体。
实施例2
本实施例提供了一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法。具体步骤如下：
(1)发酵菌株的选择
能够降解纤维素的粘细菌——纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC25531菌株。
(2)粘细菌一级斜面种子的制备
取上述菌株接种固体斜面培养基上，30℃培养7天。培养基成分为：大豆蛋白胨15g/L，马铃薯淀粉25g/L，CaCl2.2H2O 1.5g/L，MgSO4.7H2O 1.4g/L，Fe-EDTA 10mg/L，琼脂粉17g/L。
(3)粘细菌二级种子的制备
取一级种子，接种液体发酵培养基中，30℃，120转/分摇床培养7天。液体发酵培养基的成分包括：地瓜淀粉35g/L，水解乳蛋白20g/L，CaCl2.2H2O 1.5g/L，MgSO4.7H2O1.4g/L，Fe-EDTA 10mg/L。
(4)粘细菌子实体的培养制备
以大滤纸片为碳源和固体介质，该滤纸片为灰份值为0.01％～0.05％的定量滤纸，将滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器(图2)中形成粘细菌生长所需的碳源和耗氧所需的孔隙支撑，将制成的种子悬液接种在滤纸片上，30℃通气静置培养15天。在培养过程中用喷头向固体发酵器内以每小时喷洒营养液10毫升的方法提供氮源、无机盐及微量元素，并保持滤纸片湿度。营养液的组成包括：KNO3 1.0g/L；Na2HPO4 0.5g/L；MgSO4·7H2O2.0g/L；FeCl3 0.05g/L；琼脂2.0g/L；微量元素液1.0(V/V)；灭菌前用KOH或HCl调pH为7.2。
(5)子实体的分离
待粘细菌在滤纸片上较均匀地生成子实体后，收集滤纸片，分批放入盛有无菌水的子实体洗提器(图3)中，升温至80℃保持90分钟，整个过程中不停地缓慢搅拌，转速为6转/分，通过沸水洗提的方法将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来，重复操作4遍，即得粘细菌子实体。
实施例3
本实施例提供了一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法。具体步骤如下：
(1)发酵菌株的选择
能够降解纤维素的粘细菌——纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC25569菌株。
(2)粘细菌一级斜面种子的制备
取上述菌株接种固体斜面培养基上，30℃培养6天。培养基成分为：大豆蛋白胨10g/L，马铃薯淀粉20g/L，CaCl2.2H2O1.0g/L，MgSO4.7H2O 1.0g/L，Fe-EDTA 8mg/L，琼脂粉15g/L。
(3)粘细菌二级种子的制备
取一级种子，接种液体发酵培养基中，30℃，120转/分摇床培养6天。液体发酵培养基的成分包括：地瓜淀粉25g/L，水解乳蛋白15g/L，CaCl2.2H2O1.0g/L，MgSO4.7H2O1.0g/L，Fe-EDTA 8mg/L。
(4)粘细菌子实体的培养制备
以大滤纸片为碳源和固体介质，该滤纸片为灰份值0.1％～0.2％的定性滤纸，将滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器(图2)中形成粘细菌生长所需的碳源和耗氧所需的孔隙支撑，将制成的种子悬液接种在滤纸片上，30℃通气静置培养12天。在培养过程中用喷头向固体发酵器内以每小时喷洒营养液7毫升的方法提供氮源、无机盐及微量元素，并保持滤纸片湿度。营养液的组成包括：KNO3 0.8g/L；Na2HPO4 0.4g/L；MgSO4·7H2O 1.5g/L；FeCl30.03g/L；琼脂0.8g/L；微量元素液1.0(V/V)；灭菌前用KOH或HCl调pH为7.2。
(5)子实体的分离
待粘细菌在滤纸片上较均匀地生成子实体后，收集滤纸片，分批放入盛有无菌水的子实体洗提器(图3)中，升温至80℃保持60分钟，整个过程中不停地缓慢搅拌，转速为10转/分，通过沸水洗提的方法将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来，重复操作5遍，即得粘细菌子实体。

Claims (5)

1.一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，实施步骤顺序如下：
(1)发酵菌株的选择
降解纤维素的粘细菌菌株中纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)ATCC15384，ATCC25531，ATCC25569菌株之一；
(2)粘细菌一级斜面种子的制备
取上述菌株接种于固体斜面培养基上，30℃培养4～7天；培养基成分为：大豆蛋白胨5～15g/L，马铃薯淀粉15～25g/L，CaCl2.2H2O 0.8～1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.7～1.4g/L，Fe-EDTA 5～10mg/L，琼脂粉13～17g/L；
(3)粘细菌二级种子液的制备
取上述一级种子，接种于液体发酵培养基中，30℃，120转/分摇床培养5～7天；液体发酵培养基的成分为：地瓜淀粉15～35g/L，水解乳蛋白8～20g/L，CaCl2.2H2O0.8～1.5g/L，MgSO4.7H2O 0.7～1.4g/L，Fe-EDTA 5～10mg/L；
(4)粘细菌子实体的培养制备
将滤纸片弄皱褶后放入固体发酵器内，由滤纸片为碳源和固体介质，形成粘细菌生长所需的碳源和耗氧所需的孔隙支撑，将制成的粘细菌二级种子悬液接种在滤纸片上，通过喷头喷洒营养液，30℃通气静置培养10～15天；
上述的培养是指在培养过程中用喷头向固体发酵器内以每小时喷洒pH为7.0～7.2的营养液5～10毫升的方法提供氮源、无机盐及微量元素，并保持滤纸片湿度；
上述的营养液组成为：KNO3 0.5～1.0g/L；Na2HPO4 0.25～0.5g/L；MgSO4·7H2O 1.0～2.0g/L；FeCl3 0.01～0.05g/L；琼脂0.5～2.0g/L；微量元素液1.0(V/V)；
上述的营养液pH在灭菌前用KOH或HCl调整；
(5)子实体的分离
待粘细菌在滤纸片上较均匀地生成子实体后，收集滤纸片，分批放入盛有无菌水的子实体洗提器中，升温至80℃保持30-90分钟，搅拌，通过沸水洗提的方法将粘细菌形成的子实体从滤纸片上分离下来，即得粘细菌子实体。
2.如权利要求1所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的滤纸片为灰份值0.1％～0.2％的定性滤纸和/或灰份值为0.01％～0.05％的定量滤纸。
3.如权利要求1所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于：步骤(4)所述的固体发酵器是可灭菌和供养的大型容器。
4.如权利要求1所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于：步骤(5)所述的搅拌是指整个过程中不停地缓慢搅拌，转速为3～10转/分。
5.如权利要求1所述的一种以滤纸为唯一固体介质的粘细菌子实体规模制备方法，其特征在于：步骤(5)所述的洗提过程可重复操作3～5遍。
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