JP2003531564A - 新規シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ変異体 - Google Patents
新規シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ変異体Info
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Abstract
Description
ランスフェラーゼの変異体に関する。
グリコシルトランスフェラーゼとも呼ばれているシクロマルトデキストリン グ
ルカノトランスフェラーゼ(CGTアーゼ)(E.C.2.4.1.19 )は、分子内トランス
グリコシル化反応を通してスターチ及び類似する基質のシクロマルトデキストリ
ンへの転換を触媒し、それにより、種々のサイズのシクロマルトデキストリン(
シクロデキストリン、又はCDと称する)を形成する。それぞれα−、β−及びγ
−シクロデキストリンと称する、6,7及び8個のグルコース単位のシクロデキ
ストリンは、商業的に最も重要である。
1個のグルコース単位のシクロデキストリンは、商業的にあまり重要ではない。
従って、シクロデキストリンは、疎水性内部腔を有する環状グルコースオリゴマ
ーである。それらは、水溶液において多くの小さな疎水性分子を有する封入複合
体を形成することができ、物性の変化、たとえば高められた溶解性及び安定性、
及び低められた化学反応及び揮発性をもたらす。シクロデキストリンは、食品、
化粧品、化学及び医薬産業に特に適用できる。
の両者を有する。いくつかのCGTアーゼは主にα−シクロデキストリンを生成し
、そしていくつかのCGTアーゼは主にβ−シクロデキストリンを生成するが、CGT
アーゼは通常、α−、β−及びγ−シクロデキストリンの混合物を形成する。有
機溶媒による選択的沈殿段階が、別々のα−、β−及びγ−シクロデキストリン
の単離のために使用され得る。高価な及び環境的に有害な方法を回避するために
は、特にα−、β−又はγ−シクロデキストリンに関して、高められた割合の1
つの特定タイプのシクロデキストリンを生成することができるCGTアーゼの有用
性が所望される。
性を示すCGTアーゼ変異体を記載する。位置 47, 145, 146, 147, 196 又は371で
の突然変異により生成されるCGTアーゼ変異体は記載されているが、本発明の特
定のCGTアーゼ変異体は決して記載されておらず、又は提案されてさえもいない
。
高められた生成物特異性のCGTアーゼ変異体は従来技術(WO 96/33267 号)に記
載されているが、本発明のCGTアーゼ変異体はこれまで決して記載されても又は
提案されてもいない。
素に比較される場合、高められた生成物特異性を示す限定された数の変異体の発
見に成功している。 従って、本発明は、高められた生成物特異性のCGTアーゼ変異体を提供し、こ
こで下記位置の対応するアミノ酸残基の1又は複数の残基が置換及び/又は挿入
により導入されている(CGTアーゼ番号付け):
7T;47V; 47W; もしくは 47Y; (ii) 位置 145: 145D; 145H; 145I; 145N; 145Q; もしくは145V; (iii) 位置 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V; もしくは146Y; (iv) 位置 147: 147C; 147D; 147E; 147N; もしくは147Q; (v) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 1
96P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は (vi) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M;371Q; 3
71R; 371T; 371V; もしくは 371W。
使用される: A = Ala = アラニン C = Cys = システイン D = Asp = アスパラギン酸 E = Glu = グルタミン酸 F = Phe = フェニルアラニン G = Gly = グリシン H = His = ヒスチジン I = Ile = イソロイシン K = Lys = リジン L = Leu = ロイシン M = Met = メチオニン N = Asn = アスパラギン P = Pro = プロリン Q = Gln = グルタミン R = Arg = アルギニン S = Ser = セリン T = Thr = トレオニン V = Val = バリン W = Trp = トリプトファン Y = Tyr = チロシン B = Asx = Asp又は Asn Z = Glx = Glu 又は Gln X = Xaa = いずれかのアミノ酸 ★ = 欠失又は不在のアミノ酸。
を有する、CGTアーゼ変異体又は突然変異誘発されたCGTアーゼである。本発明の
CGTアーゼ変異体又は突然変異誘発されたCGTアーゼは、前駆体CGTアーゼ酵素(
すなわち、天然、親又は野生型酵素)の機能的誘導体であると思われ、そして前
駆体酵素をコードする、前駆体遺伝子又はその誘導体のDNA又はヌクレオチド配
列の変更により得られる。
ードするDNAヌクレオチド配列が適切な宿主生物における適切なベクター中に挿
入される場合、発現され、そして生成され得る。宿主生物は、前駆体遺伝子が起
因する生成物と必ずしも同一である必要はない。文献においては、酵素変異体は
また、変異株又はムテインとしても言及されて来た。
けが使用される。種々の既知CGTアーゼのアミノ酸配列の整列により、アミノ酸
配列が知られているいずれかのCGTアーゼ酵素におけるいずれかのアミノ酸残基
位置にCGTアーゼアミノ酸位置を明白に割り当てることが可能である。
ランス 251株から得られるCGTアーゼのアミノ酸配列に起因する番号付けシステ
ムを用いて、CGTアーゼ酵素におけるアミノ酸残基の位置を明白に示すことが可
能である。 このCGTアーゼ番号付けシステムは、WO 96/33267 に記載されており、表1、
ページ9−31(この表においては、バチルス・サーキュランス 251株がaとし
て表されている)を参照のこと。WO96/33267 の表1はまた、多くの相当のCGTア
ーゼのタンパク質配列を示し、そして引用により本明細書に組み込まれる。
場合、次の命名法が参照を容易にするために適合される: [元のアミノ酸;位置;置換されたアミノ酸]。従って、位置145 におけるアラ
ニンによるセリンの置換は、S145Aとして命名される。 バチルス・サーキュランス 251株からのCGTアーゼのアミノ酸配列に関して挿
入を表すアミノ酸残基は、前のCGTアーゼ番号、たとえばサーモアナエロバクタ
ー sp. ATCC53627 からのCGTアーゼのアミノ酸配列の位置91でのThr と位置92で
のGlyとの間の“挿入体”Pheのための位置91aFに、アルファベット順に文字の追
加により番号付けられる;表1を参照のこと(1)。
存在しない、位置147と148との間の挿入は、位置147aにおけるアスパラギン酸の
挿入のためには・147aDとして示される。 複数の突然変異は、スラッシュ記号("/”)、たとえばS145A/D147Lにより分
離され、それは、それぞれアラニンによりセリンを及びロイシンによりアスパラ
ギン酸を置換する位置145及び147での突然変異を表す。
る突然変異により行われる場合、その生成物は、たとえば“B.サーキュランス/S
145A”として命名される。 CGTアーゼ番号付けによる本出願において言及されるすべての位置は、上記CGT
アーゼ番号を意味する。
酸配列を有するCGTアーゼ変異体を提供する。形式的には、本発明のCGTアーゼ変
異体は、前駆体酵素の1又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入及び/又は欠失に
よる前駆体CGTアーゼ酵素(すなわち、天然、親又は野生型酵素)の機能的誘導
体として見なされ得る。
素に比較される場合、高められた割合の1つの特定タイプのシクロデキストリン
を生成できるCGTアーゼ変異体である。 本発明のCGTアーゼ変異体においては、次の位置に対応する1又は複数のアミ
ノ酸残基が、置換/又は挿入により導入されている(CGTアーゼ番号付け):
7T;47V; 47W; もしくは 47Y; (ii) 位置 145: 145D; 145H; 145I; 145N; 145Q; もしくは145V; (iii) 位置 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V; もしくは146Y; (iv) 位置 147: 147C; 147D; 147E; 147N; もしくは147Q; (v) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 1
96P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は (vi) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M;371Q; 3
71R; 371T; 371V; もしくは 371W。
生成物特異性を示すCGTアーゼ変異体が提供され、ここでその変異体においては
、次の位置に対応する1又は複数のアミノ酸残基が置換及び/又は挿入により導
入されている(CGTアーゼ番号付け):
96P;196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは196Y 、及び/又は (vi) 位置 371: 371C; 371H; 371K; 371R; もしくは 371T。 好ましい態様においては、β−シクロデキストリンの生成に関して高められた
生成物特異性を示すCGTアーゼ変異体が提供され、ここでその変異体においては
、次の位置に対応する1又は複数のアミノ酸残基が置換及び/又は挿入により導
入されている(CGTアーゼ番号付け):
W; もしくは 47Y; (ii) 位置 145: 145D; 145I; 145N; もしくは 145V; (iii) 位置 147:147E; (iv) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M;
196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は (v) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M; 371Q; 3
71R; 371T; 371V; もしくは 371W。
生成物特異性を示すCGTアーゼ変異体が提供され、ここでその変異体においては
、次の位置に対応する1又は複数のアミノ酸残基が置換及び/又は挿入により導
入されている(CGTアーゼ番号付け):
7W; もしくは 47Y; (ii) 位置 145: 145D; 145I; 145N; もしくは 145V; (iii) 位置 147: 147E; (iv) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M;
196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は (v) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371K; 371M; 371Q; 371R; 371T;
もしくは 371W。
素から誘導され得る。しかしながら、本発明のCGTアーゼ変異体は好ましくは、
微生物酵素、好ましくは細菌酵素から誘導され、そして好ましくは、CGTアーゼ
変異体は、バチルス(Bacillus)の株、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)
の株、クロストリジウム(Clostridium)の株、コリネバクテリウム(Corynebac
terium)の株、クレブシエラ(Klebsiella)の株、ミクロコーカス(Micrococcu
s)の株、サーモアナエロビウム(Thermoanaerobium)の株、サーモアナエロバ
クテリウム(Thermoanaerobacterium)の株、サーモアナエロバクター(Thermoa
naerobacter)の株、又はサーモアクチノミセス(Thermoactinomyces)の株から
誘導される。
トリチカス(Bacillus autolyticus)の株、バチルス・セレウス(Bacillus cer
eus)の株、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)の株、バチルス
・サーキュランス var. アルカロフィラス(Bacillus circulans var. alkalo
philus)の株、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans )の株、バチ
ルス・フィルマス(Bacillus firmus )の株、バチルス・ハロフィラス(Bacill
us halophilus)の株、バチルス・マセランス(Bacillus macerans)の株、バチ
ルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)の株、
ーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)の株、バチルス・スブチリス(
Bacillus subtilis)の株、クレビシエラ・プネウモニ (Klebsiella pneumonia
)の株、サーモアナエロバクター・エタノエイカス(Thermoanaerobacter etha
nolicus )の株、サーモアナエロバクター・フィニイ(Thermoanaerobacter fin
nii)の株、クロストリジウム・サーモアミロリチカム(Clostridium thermoamy
lolyticum)の株、クロストリジウム・サーモサッカロリチカム(Clostridium t
hermosaccharolyticum)の株、又はサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフ
リゲネス(Thermoanaerobacterium thrmosulfurigenes)の株から誘導される。
株, バチルス sp.38-2株, バチルス sp.17-1株, バチルス sp.1-1株, バチルス
sp.B1018株、バチルス・サーキュランス8株もしくはバチラス・サーキュランス
251株, 又はそれらの変異株もしくは変異体から誘導される。
合、次の位置に対応する1又は複数のアミノ酸残基が導入され得る: (i) 位置 R47: R47C; R47D; R47E; R47F; R47G; R47I; R47K; R47N; R47P; R
47S; R47T; R47V; R47W; もしくは R47Y; (ii) 位置 S145: S145D; S145H; S145I; S145N; S145Q; もしくは S145V; (iii) 位置 S146: S146H; S146K; S146L; S146T; S146V; もしくは S146Y; (iv) 位置 D147: D147C; D147E; D147N; もしくはD147Q; (v) 位置 D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I; D196K; D196L
; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W; もしくはD196Y 、及び/
又は (vi) 位置 D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K; D371L; D371
M; D371Q; D371R; D371T; D371V; もしくは D371W。
の変異株もしくは変異体から誘導される。 CGTアーゼ変異体がサーモアナエロバクター sp. の株から誘導される場合、次
の位置に対応する1又は複数のアミノ酸残基が導入されえる:
47S; K47T; K47V; K47W; もしくは K47Y; (ii) 位置 S145: S145D; S145H; S145I; S145N; S145Q; もしくは S145V; (iii) 位置 E146: E146H; E146K; E146L; E146T; E146V; もしくは E146Y; (iv) 位置 T147: T147C; T147D; T147E; T147N; もしくはT147Q; (v) 位置 D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I; D196K; D196L
; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W; もしくはD196Y 、及び/
又は (vi) 位置 D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K; D371L; D371
M; D371Q; D371R; D371T; D371V; もしくは D371W。 好ましくは、CGTアーゼ変異体は、サーモアエロバクター sp. ATCC 53627, 又
はその変異株もしくは変異体から誘導される。
ルフルゲネスCGTアーゼ変異体Asp196His (D196H) 及びAsp371Arg (D371R) の構
成を記載しており、ここにおいて、特定部位の突然変異誘発が活性部位分解のサ
ブサイトにおける変更された数の水素結合を誘導されている。変異体は、Haecke
l and Bahl [ Haeckel, K., and Bahl, H. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60,
333-338 又はKnegtel R.M.A., Wind R.D., Rozeboom H.J., Kelk K.H., Buitela
ar R.M., Dijkhuizen L., Dijkstra B.W.J. Mol. Biol. 256: 611-622 (1996) ]
により記載のようにして得られたサーモアナエロバクター・サーモスルフリゲ
ネスEM1 CGTアーゼ(すなわち野生型)から誘導される。 もう1つの態様においては、本発明のCGTアーゼ変異体は、1又は複数の次の
アミノ酸残基を含んで成る(CGTアーゼ番号付け):
は複数の次のアミノ酸残基が導入されている: (i) R47K/S145E/S146V/D147N; (ii) R47K/S145E/S146E/D147N; (iii) R47K/S145D/S146R; (iv) R47K/S145D/S146E; (v) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H; (vi) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H; (vii) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H/D371R; (viii) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H/D371R; (ix) R47K/S145D/S146R/D196H; (x) R47K/S145D/S146E/D196H;
の変異株もしくは変異体から誘導される。 CGTアーゼ変異体がサーモアナエロバクター sp. の株から誘導される場合、1
又は複数の次のアミノ酸残基が導入され得る:
又はその変異株もしくは変異体から誘導される。 さらなる観点においては、本発明は、シクロデキストリン工程の最終シクロデ
キストリン生成物のα又はβ又はγ−シクロデキストリン含有率を高めるためへ
の本発明のCGTアーゼ変異体の使用に関する。 最終の観点においては、本発明は、α又はβ又はγ−シクロデキストリンの生
成に関して生成物特異性を高めるための方法に関し、ここで上記で言及された本
発明のCGTアーゼ変異体の位置に対応する1又は複数のアミノ酸残基が、置換及
び/又は挿入により導入されている。
hsdR17 (rk-, mK+) relA1 supE4 (lac-proAB) ] [ F' traD36 proAB lacIgZ M1
5 ] (Yanish-Rerron など.1985 Gene 33, 103-109) を、組換えDNA操作のために
使用した。そのtalB 遺伝子座における突然変異のために、上清液中にペリプラ
ズムタンパク質を漏出することが知られているエスシェリチア・コリPC 1990 (L
azzaroni and Portalier 1979 FEMS Microbiol. Lett. 5, 411-416) を、CGTア
ーゼ(変異体)タンパク質の生成のために使用した。
ウムEM1を含むpUC18の誘導体(Knegtel R.M.A., Wind R.D., Rozeboom H.J., Ka
lk., Buitelaar R.M., Dikhuizen L., Dijkstra B.W., J. Mol. Biol. 256: 611
-622 (1996) を、CGTアーゼ(変異体)タンパク質の特定部位の突然変異誘発、
配列決定及び発現のために使用した。プラスミド担持の菌株を、100μg/mgのア
ンピシリンの存在下でLB培地上で増殖した。適切な場合、IPTG(イソプロピル−
β−D−チオガラクトピラノシド)を、タンパク質発現の誘発のために、0.1mMの
濃度で添加した。
, J., Fritsch, E.J., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, cold spring Harbor Laboratory Press, New York ] により実質
的に記載の通りであった。エレクトロポレーションによるエスシェリチア・コリ
の形質転換を、Bio-Rad 遺伝子パルサー装置(Bio-Rad, Veenendaal, The Nethe
rlands )を用いて実施した。選択された条件は、2.5kV, 25μF 及びΩであった
。
s)からのpfu DNA ポリメラーゼを用いての二重PCR方法を通して構成した。最初
のPCR反応を、コーバ鎖のための突然変異誘発プライマー、及び鋳型鎖上の195〜
715bp 下流のプライマーを用いて実施した。
第2PCR反応においてプライマーとして使用した。最終反応の生成物を、NcoI及
びMunIにより切断し、そしてベクターpCT2からのその対応するフラグメント(9
00bp)により交換した。その得られる(変異体)プラスミドを、配列決定のため
にエスシェリチア・コリJM109に対して、及び(変異体)タンパク質の生成のた
めのエスシェリチア・コリpc1990に対して形質転換した。
する下線の制限部位(D196HのためのBgl II 及びD371RのためのAatII)をもたら
した。突然変異を、DNA配列決定により確かめた(Sanger など., 1977, Proc. N
atl. Sci. USA 74, 5463-5467)。PCRにより得られたMunI-NcoIフラグメント上
のすべての900bpを、DNA−配列決定により調べた。
及び30℃で、2Lの発酵器において増殖した。培地は、2%(w/w)のトリプシン
(Oxoid, Boom BV, Meppel, the Netherlands)、1%(w/w)の酵母抽出物(Oxo
id), 1%(w/w)の塩化ナトリウム、1%(w/w)のカゼイン加水分分解物(Merc
k, Darmstadt, Germany)、100μg/lのアンピシリン及び0.1nM のIPTGを含んだ
。
光学密度が2〜3に達した場合、50gの追加量のトリプインを、発行器に添加した
。細胞を、8〜12の光学密度で、20〜24時間の増殖( 8,000g, 30, 4℃ )の後、
収穫し、そして上清液を、CGTアーゼのさらなる精製のために使用した。上清液
を、α−CD−セファロース−6FF 親和性カラム(Monma など., 1988, Biotechno
l. Bioeng. 32, 404-407)に直接的に適用した。
1%(w/w)のαCDにより補充された同じ緩衝液により溶出した。CGTアーゼ(変
異体)タンパク質の純度及び分子量を、SDS-PAGE(Wind など., 1995, APPl. En
viron. Microb. 61, 1257-1265)上で調べた。タンパク質濃度を、Pierce (Pier
ce Europe bv, Oud-Beijerland, The Netherlands ) のクーマシータンパク質ア
ッセイ試薬を用いて、Bradford の方法により決定した。
セイを、Penninga など., ( Penninga, D., Strokopytov, B., Rozeboom, H.J.,
Lawson, C.L., Dijkstra, B.W., Bergsma, J., and Dijkhuizen, L. (1995) Bi
ochemistry 34, 3368-3376) により記載のようにして実施した。異なった反応の
ための単位は、pH6.0及び50℃で1μモルの基質で生成する酵素の量として定義さ
れた。
おいて、0.1U/ml のCGTアーゼ(β−CD形成活性)及び10%のPaselli;WA4(高
い程度の重合を有するプレゲル化され、ドラム−乾燥されたスターチ;AVEBE, T
he Netherlands)と共に、60℃で45時間、インキュベートすることによって、産
業的工程条件下で測定した。サンプルを規則的な時間間隔で採取し、そして10分
間、煮沸した。
る、25−cmのEconosil-NH2 10-μmカラム(Alltech Netherland bv, Breda, The
Netherlands)を用いてのHPLCにより分析した。生成物を、屈折率検出器(Wate
rs 410, Waters Chromatography Division, Milford, USA)により検出した。流
動細胞及びカラムの温度を50℃で設定し、スターチの可能性ある沈殿を回避した
。線状生成物の形成を直接的に分析した。CDの形成を、適切な量のβ−アミラー
ゼ(サツマイモからのタイプ・I−B, Sigma, Boom BV, Meppel, The Netherland
s)と共にサンプルをインキュベートした後、分析した。
明者は、HisによりAps196を置換し(D196H)、そしてArgによりAps371を置換し
た(D371R)。変異体D196Hにおいては、α−CDの生成が、野生型CGTアーゼに比
較して、β−CDの生成を犠牲にして高められた(図2)。シクロデキストリン生
成物比を、野生型CGTアーゼについての28:58:14(α:β:γ)から変異体D19
6Hについての35:49:16に変更した(表1)。
、より大きな残基が導入され、これは、いわゆる直線基質結合態様を阻止する。
さらに、His197はまた、たぶん、“湾曲(bent)”態様で結合される基質と水素
結合を形成することができる。それらの結果は、湾曲形状がα−シクロデキスト
リン生成と相互関係している理論により強く傾向し、そしてそれが所望する生成
物特異性を有するCGTアーゼを合理的に構築するために使用され得ることを示す
。
0及び60℃で45時間インキュベートした。 Asp371は、BC251及びTabium CGTアーゼの両者において、サブサイト2での基質
結合において非常に重要な役割を有する。ArgによるASP371の置換は、サブサイ
ト2でのすべての種類の基質の結合性を重度にたぶん妨害する非常に大きなアミ
ノ酸の導入をもたらし、それにより、活性の全体的な低下を説明する。この低い
活性とは異なって、生成物比は、野生型酵素についての28:58:14から変異体D371
Hについての6:68:26に変更した(表1、図2)。
371により一層、妨害されることを示唆する。たぶん、この大きな残基は、“湾
曲”形状を立体的に妨害している。それらの結果は、Tabium CGTアーゼが、わず
か1つの突然変異によりα/β−シクロデキストリン生成体からβ/γ−シクロデ
キストリン生成体に変更したことを示す、これはCGTアーゼタンパク質構築の実
行可能性を例示する。 本発明は、例によって例示されてきたが、但しそれらは本発明を制限するもの
ではない。
示す。点線は、酵素(水)と基質との間だの水素結合を示す。分解点は、グルコ
ース残基 −1と1との間に定義される。
の(変異体)CGTアーゼタンパク質のインキュベーションの間に形成されるシク
ロデキストリンを示す。A.野生型(図2);B.変異体D196H(図3);C.変異体D
371R(図4)。
Claims (28)
- 【請求項1】 高められた生成物特異性のCGTアーゼ変異体であって、次の
位置に対応するアミノ酸残基(CGTアーゼ番号付け): (i) 位置 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47K; 47N; 47P; 47R; 47S; 4
7T;47V; 47W; もしくは 47Y; (ii) 位置 145: 145D; 145H; 145I; 145N; 145Q; もしくは145V; (iii) 位置 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V; もしくは146Y; (iv) 位置 147: 147C; 147D; 147E; 147N; もしくは147Q; (v) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 1
96P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は (vi) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M;371Q; 3
71R; 371T; 371V; もしくは 371W 、 中の1又は複数の残基が、置換及び/又は挿入により導入されているCGTアーゼ
変異体。 - 【請求項2】 K47Rである請求項1記載のCGTアーゼ変異体。
- 【請求項3】 D196Hである請求項1記載のCGTアーゼ変異体。
- 【請求項4】 D371Rである請求項1記載のCGTアーゼ変異体。
- 【請求項5】 次の位置に対応するアミノ酸残基(CGTアーゼ番号付け): (i) 位置 47: 47F; 47K; 47R; 47W; もしくは 47Y; (ii) 位置 145: 145D; 145H; 145N; もしくは 145Q; (iii) 位置 146: 146H; 146K; 146L; 146T; 146V; もしくは146Y; (iv) 位置 147: 147C; 147D; 147E; 147N; もしくは147Q; (v) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M; 1
96P;196Q; 196R; 196T; 196V; 196W;もしくは196Y 、及び/又は (vi) 位置 371: 371C; 371H; 371K; 371R; もしくは 371T 、 中の1又は複数の残基が、置換及び/又は挿入により導入されている、α−シ
クロデキストリンの生成に関して高められた生成物特異性を示す請求項1記載の
CGTアーゼ変異体。 - 【請求項6】 次の位置に対応するアミノ酸残基( CGTアーゼ番号付け): (i) 位置 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I 47N; 47P; 47S; 47T; 47V; 47
W; もしくは 47Y; (ii) 位置 145: 145D; 145I; 145N; もしくは 145V; (iii) 位置 147:147E; (iv) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M;
196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は (v) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371I; 371K; 371L; 371M; 371Q; 3
71R; 371T; 371V; もしくは 371W 、 中の1又は複数の残基が、置換及び/又は挿入により導入されている、β−シ
クロデキストリンの生成に関して高められた生成物特異性を示す請求項1記載の
CGTアーゼ変異体。 - 【請求項7】 次の位置に対応するアミノ酸残基(CGTアーゼ番号付け): (i) 位置 47: 47C; 47D; 47E; 47F; 47G; 47I; 47N; 47P; 47S; 47T; 47V; 4
7W; もしくは 47Y; (ii) 位置 145: 145D; 145I; 145N; もしくは 145V; (iii) 位置 147: 147E; (iv) 位置 196: 196C; 196E; 196F; 196G; 196H; 196I; 196K; 196L; 196M;
196P; 196Q; 196R; 196T; 196V; 196W; もしくは 196Y 、及び/又は (v) 位置 371: 371C; 371E; 371F; 371H; 371K; 371M; 371Q; 371R; 371T;
もしくは 371W 、 中の1又は複数の残基が、置換及び/ 又は挿入により導入されている、γ−シ
クロデキストリンの生成に関して高められた生成物特異性を示す請求項1記載の
CGTアーゼ変異体。 - 【請求項8】 バチルス(Bacillus)の株、ブレビバクテリウム(Brevibac
terium)の株、クロストリジウム(Clostridium)の株、コリネバクテリウム(C
orynebacterium)の株、クレブシエラ(Klebsiella)の株、ミクロコーカス(Mi
crococcus)の株、サーモアナエロビウム(Thermoanaerobium)の株、サーモア
ナエロバクテリウム(Thermoanaerobacterium)の株、サーモアナエロバクター
(Thermoanaerobacter)の株、又はサーモアクチノミセス(Thermoactinomyces
)の株に由来する請求項1〜7のいずれか1項記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項9】 バチルス・オートリチカス(Bacillus autolyticus)の株、
バチルス・セレウス(Bacillus cereus)の株、バチルス・サーキュランス(Bac
illus circulans)の株、バチルス・サーキュランス var. アルカロフィラス(
Bacillus circulans var. alkalophilus)の株、バチルス・コアギュランス(B
acillus coagulans )の株、バチルス・フィルマス(Bacillus firmus )の株
、バチルス・ハロフィラス(Bacillus halophilus)の株、バチルス・マセラン
ス(Bacillus macerans)の株、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium
)の株、バチルス・オーベンシス(Bacillus ohbensis)の株、バチルス・ステ
アロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)の株又はバチルス・スブ
チリス(Bacillus subtilis)の株に由来する請求項8記載のCGTアーゼ変異体
。 - 【請求項10】 バチルスsp.1011株, バチルス sp.38-2株, バチルス sp.1
7-1株, バチルス sp.1-1株, バチルス sp.B1018株, バチルス・サーキュランス
8株もしくはバチラス・サーキュランス251株, 又はそれらの変異株もしくは変
異体に由来する請求項9記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項11】 バチルス・サーキュランス251株, 又はその変異株もしく
は変異体に由来する請求項10記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項12】 クレブシエラ・プネウモニア (Klebsiella pneumonia)の
株、サーモアナエロバクター・エタノリカス(Thermoanaerobacter ethanolicus
)の株、サーモアナエロバクター・フィニイ(Thermoanaerobacter finnii)の
株、クロストリジウム・サーモアミロリチカム(Clostridium thermoamylolytic
um)の株、クロストリジウム・サーモサッカロリチカム(Clostridium thermosa
ccharolyticum)の株、又はサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネ
ス(Thermoanaerobacterium thrmosulfurigenes)の株に由来する請求項8記載
のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項13】 サーモアナエロバクター sp. ATCC53627、又はその変異株
もしくは変異体に由来する請求項8記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項14】 バチル・サーキュランスの株に由来し、そして次の位置に
対応するアミノ酸残基(CGTアーゼ番号付け): (i) 位置 R47: R47C; R47D; R47E; R47F; R47G; R47I; R47K; R47N; R47P; R
47S; R47T; R47V; R47W; もしくは R47Y; (ii) 位置 S145: S145D; S145H; S145I; S145N; S145Q; もしくは S145V; (iii) 位置 S146: S146H; S146K; S146L; S146T; S146V; もしくは S146Y; (iv) 位置 D147: D147C; D147E; D147N; もしくはD147Q; (v) 位置 D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I; D196K; D196L
; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W; もしくはD196Y 、及び/
又は (vi) 位置 D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K; D371L; D371
M; D371Q; D371R; D371T; D371V; もしくは D371W 、中の1又は複数の残基が、
その変異体において、置換及び/又は挿入により導入されている請求項1〜7の
いずれか1項記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項15】 バチルス・サーキュランス 251株、又はその変異株もしく
は変異体に由来する請求項11記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項16】 サーモアナエロバクター sp. の株に由来し、そして次の
位置に対応するアミノ酸残基(CGTアーゼ番号付け): (i) 位置 K47: K47C; K47D; K47E; K47F; K47G; K47I; K47N; K47P; K47R; K
47S; K47T; K47V; K47W; もしくは K47Y; (ii) 位置 S145: S145D; S145H; S145I; S145N; S145Q; もしくは S145V; (iii) 位置 E146: E146H; E146K; E146L; E146T; E146V; もしくは E146Y; (iv) 位置 T147: T147C; T147D; T147E; T147N; もしくはT147Q; (v) 位置 D196: D196C; D196E; D196F; D196G; D196H; D196I; D196K; D196L
; D196M; D196P; D196Q; D196R; D196T; D196V; D196W; もしくはD196Y 、及び/
又は (vi) 位置 D371: D371C; D371E; D371F; D371H; D371I; D371K; D371L; D371
M; D371Q; D371R; D371T; D371V; もしくは D371W 、 中の1又は複数の残基が、その変異体において、置換及び/又は挿入により導
入されている請求項1〜7のいずれか1項記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項17】 サーモアナエロバクター sp. ATCC53627、又はその変異株
もしくは変異体に由来する請求項16記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項18】 次のアミノ酸残基(CGTアーゼ番号付け): (i) 47K/145E/146V/147N; (ii) 47K/145E/146E/147N; (iii) 47K/145D/146R/147D; (iv) 47K/145D/146E/147D; (v) 47K/145E/146V/147N/196H; (vi) 47K/145E/146E/147N/196H; (vii) 47K/145E/146V/147N/196H/371R; (viii) 47K/145E/146E/147N/196H/371R; (ix) 47K/145D/146R/147D/196H; (x) 47K/145D/146E/147D/196H; (xi) 47K/145D/146R/147D/196H/371R; (xii) 47K/145D/146R/147D/196H/371R; (xiii) 47K/196H; (xiv) 47R/196H; (xv) 145E/146V/147N; (xvi) 145E/146E/147N; (xvii) 145D/146R/147D; (xviii) 145D/146E/147D; (xix) 47K/371R 、及び/又は (xx) 47R/371R 、 の1又は複数の残基を含んで成る請求項1〜13のいずれか1項記載のCGTア
ーゼ変異体。 - 【請求項19】 バチルス・サーキュランスの株に由来し、そして次のアミ
ノ酸残基(CGTアーゼ番号付け): (i) R47K/S145E/S146V/D147N; (ii) R47K/S145E/S146E/D147N; (iii) R47K/S145D/S146R; (iv) R47K/S145D/S146E; (v) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H; (vi) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H; (vii) R47K/S145E/S146V/D147N/D196H/D371R; (viii) R47K/S145E/S146E/D147N/D196H/D371R; (ix) R47K/S145D/S146R/D196H; (x) R47K/S145D/S146E/D196H; (xi) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R; (xii) R47K/S145D/S146R/D196H/D371R; (xiii) R47K/D196H; (xiv) S145E/S146V/D147N; (xv) S145E/S146E/D147N; (xvi) S145D/S146R; (xvii) S145D/S146E; (xviii) R47K/D371R 、 の1又は複数の残基を含んで成る請求項18記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項20】 バチルス・サーキュランス 251株、又はその変異株もしく
は変異体に由来する請求項19記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項21】 サーモアナエロバクター sp. の株に由来し、そして次の
アミノ酸残基(CGTアーゼ番号付け): (i) S145E/E146V/T147N; (ii) SI45E/T147N; (iii) S145D/E146R/T147D; (iv) S145D/T147D; (v) S145E/E146V/T147N/D196H; (vi) S145E/T147N/D196H; (vii) S145E/E146V/T147N/D196H/D371R; (viii) S145E/T147N/D196H/D371R; (ix) S145D/E146R/T147D/D196H; (x) S145D/T147D/D196H; (xi) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R; (xii) S145D/E146R/T147D/D196H/D371R; (xiii) S145E/E146V/T147N; (xiv) S145E/T147N; (xv) S145D/E146R/T147D; (xvi) S145D/T147D; (xvii) K47R/D371R; 及び/又は (xviii) K47R/D196H 、 の1又は複数の残基を含んで成る請求項18記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項22】 サーモアナエロバクター sp. ATCC 53627、又はその変異
株もしくは変異体に由来する請求項21記載のCGTアーゼ変異体。 - 【請求項23】 シクロデキストリン工程の最終シクロデキストリン生成物
中のα−シクロデキストリン含有率を高めるための請求項1〜22のいずれか1
項記載のCGTアーゼ変異体の使用。 - 【請求項24】 シクロデキストリン工程の最終シクロデキストリン生成物
中のβ−シクロデキストリン含有率を高めるための請求項1〜22のいずれか1
項記載のCGTアーゼ変異体の使用。 - 【請求項25】 シクロデキストリン工程の最終シクロデキストリン生成物
中のγ−シクロデキストリン含有率を高めるための請求項1〜22のいずれか1
項記載のCGTアーゼ変異体の使用。 - 【請求項26】 請求項1〜22のいずれか1項の変異体中の位置に対応す
る1又は複数のアミノ酸残基が、置換及び/又は挿入により導入されている、α
−シクロデキストリンの生成に関して生成物特異性を高めるための方法。 - 【請求項27】 請求項1〜22のいずれか1項の変異体中の位置に対応す
る1又は複数のアミノ酸残基が、置換及び/又は挿入により導入されている、β
−シクロデキストリンの生成に関して生成物特異性を高めるための方法。 - 【請求項28】 請求項1〜22のいずれか1項の変異体中の位置に対応す
る1又は複数のアミノ酸残基が、置換及び/又は挿入により導入されている、γ
−シクロデキストリンの生成に関して生成物特異性を高めるための方法。
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