JP2000014384A - 超耐熱性サイクロデキストリン生成酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 超耐熱性サイクロデキストリン生成酵素をコ
ードする遺伝子を提供すること。 【解決手段】 超好熱菌から超耐熱性サイクロデキスト
リン生成酵素をコードするDNAを単離する。このサイク
ロデキストリン生成酵素をコードは、サイクロデキスト
リン生成酵素の組換え生産における使用のために有用で
ある。生産された組換えサイクロデキストリン生成酵素
は、デンプン液化能およびサイクロデキストリン生成能
を有し、優れた耐熱性をもち、かつ主としてα-サイク
ロデキストリンを生成するサイクロデキストリン生成酵
素であり、工業的なサイクロデキストリン製造工程の工
程改善に有用な酵素である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はサイクロデキストリ
ン生成酵素をコードするDNA、このDNAを含む発現ベクタ
ー、この発現ベクターを含む組換え宿主細胞、この組換
え宿主細胞を培養する工程を包含するサイクロデキスト
リン生成酵素の生産方法、およびサイクロデキストリン
生成酵素を添加する工程を包含するサイクロデキストリ
ンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】サイクロデキストリンはグルコースがα
-１,4グルコシド結合で環状に結合した化合物であり、
各種の化合物をその構造内に取り込んで包接化合物を形
成する能力を有している。水溶液などの液体に難溶性の
化合物を安定的に溶解させることができるこの能力によ
り化粧品、食品、農薬、医薬品などの分野で利用されて
いる。

【０００３】現在、工業的に生産されているサイクロデ
キストリンは、主に、α-サイクロデキストリン、β-サ
イクロデキストリン、およびγ-サイクロデキストリン
の３種類であり、各々、グルコースが、６、７、および
８個環状に結合したものである。

【０００４】α-およびγ-サイクロデキストリンはその
環状の立体構造の利点から、より広範囲の分子量の化合
物、生理活性物質を包接できることが期待されているに
も係わらず、工業的には、β-サイクロデキストリンが
主に生産されているのが現状である。その理由は、化学
的性質の相違から、α-およびγ-サイクロデキストリン
は、分離精製が困難である一方、β-サイクロデキスト
リンは分離、精製が容易であるという点にある。

【０００５】このように従来から知られているサイクロ
デキストリン生成酵素は特異性が低く、α-サイクロデ
キストリン、β-サイクロデキストリン、およびγ-サイ
クロデキストリンの混合物として生産されるため、クロ
マトグラフィー等によって、各サイクロデキストリンを
分取する工程が必要である。この工程を省略し、容易に
いずれかのサイクロデキストリンを得るために、いずれ
かのサイクロデキストリンを優先的に生産できるサイク
ロデキストリン生成酵素が望まれている。

【０００６】他方で、耐熱性の高いサイクロデキストリ
ン生成酵素が望まれている。サイクロデキストリン生成
酵素は自然界に広く分布しており、これまでに種々の性
質のサイクロデキストリン生成酵素が単離され、産業上
利用されている。工業的なサイクロデキストリンの生産
においては、高温下でのデンプン液化工程を経た後、サ
イクロデキストリン生成酵素を添加している。工業的な
デンプンの液化においては、デンプン液の粘度が高く、
物質移動の問題があるため、できる限り高い温度で行わ
れる。

【０００７】しかし、従来の工業的に利用できるサイク
ロデキストリン生成酵素は、耐熱性が低いため、デンプ
ンの液化工程およびサイクロデキストリンの生成工程の
２工程を経る方法が採用されている。サイクロデキスト
リン生成酵素を高温下で作用させることができれば、上
記２工程を同時に行うことが可能となる。さらに、高温
下で作用させることによって、反応性の増大も期待でき
る。

【０００８】このために、従来から、優れた耐熱性を有
するサイクロデキストリン生成酵素を取得する試みがな
されてきた。

【０００９】耐熱性サイクロデキストリン生成酵素とし
ては、Thermoanaerobacter属またはThermoanaerobium属
由来のサイクロデキストリン生成酵素が得られた（米国
特許第5,501,968号）が、得られた酵素の熱安定性は、p
H5.0、90℃、40分間の熱処理後、20％弱の活性が残存す
る程度に過ぎなかった。さらにこの酵素は、pH5.0、100
℃、40分間の熱処理で、完全に失活した。

【００１０】しかし、この程度の耐熱性では不十分であ
る。デンプン溶液には、90℃近辺では溶解できない成分
（難溶性デンプン）が存在している。この成分は100℃
以上の高温状態で、ミセル構造が開裂して初めて溶解す
る。従って、このミセル構造を開裂し、ミセル構造を溶
解する100℃以上の温度で作用することができるサイク
ロデキストリン生成酵素があれば、デンプンからのサイ
クロデキストリンの生成収率が大幅に向上する。さら
に、デンプン糊は、アミログラム、プロストグラムによ
れば、100℃以上のほうが90℃よりも低粘度であること
が示されている。サイクロデキストリン生成酵素でデン
プンスラリーを処理するジェットクッカーなどの装置を
用いる際、デンプン糊の移送は、より低い粘度のほうが
移送効率の点で有利である。従って、至適温度が100℃
以上で、かつ耐熱性、安定性の優れたサイクロデキスト
リン生成酵素が望まれている。

【００１１】このように、サイクロデキストリンの製造
に関して、α-サイクロデキストリンを優先的に生産す
るサイクロデキストリン生成酵素と同時に、耐熱性に優
れたサイクロデキストリン生成酵素を必要とするという
２つの課題が存在する。

【００１２】さらに、サイクロデキストリン生成酵素を
コードする遺伝子を単離することにより、高純度かつ大
量のサイクロデキストリン生成酵素を工業的に組換え生
産することが所望されていた。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の課題
を解決することを目的とし、優れた耐熱性を有するサイ
クロデキストリン生成酵素をコードするDNA提供するこ
と、および優れた耐熱性を有し、かつ主としてα-サイ
クロデキストリンを生成するサイクロデキストリン生成
酵素の組換え生産方法を提供することを目的とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、デンプ
ンおよびカルシウムイオンの非存在下で、pH5.0、100
℃、40分間の熱処理後、少なくとも90％活性が残存す
る、サイクロデキストリン生成酵素が提供される。

【００１５】好適な実施態様においては、上記サイクロ
デキストリン生成酵素は、以下の理化学的性質を有す
る： （１）110℃での至適pHが5.0〜5.5である： （２）pH5.0における至適温度が110℃付近である： （３）SDS-PAGEおよびそれに続く活性染色での分子量が
約72,000である：および （４）等電点が3.5以下である。

【００１６】さらに好適な実施態様においては、上記サ
イクロデキストリン生成酵素の90℃での至適pHは、4.5
〜6.0である。

【００１７】さらに好適な実施態様においては、上記サ
イクロデキストリン生成酵素は、超好熱菌Thermococcus
属に属する微生物から得られる。

【００１８】さらに好適な実施態様においては、上記サ
イクロデキストリン生成酵素は、超好熱菌Thermococcus
sp. B-1001株から得られる。

【００１９】さらに好適な実施態様においては、上記サ
イクロデキストリン生成酵素は、デンプンからα-サイ
クロデキストリンを主として生成する。

【００２０】本発明によれば、上記サイクロデキストリ
ン生成酵素を産生する能力を有する超好熱菌を培養する
工程；培養物から該サイクロデキストリン生成酵素を採
取する工程を含む、サイクロデキストリン生成酵素の製
造方法が提供される。

【００２１】好適な実施態様においては、上記培養物か
らサイクロデキストリン生成酵素を採取する工程は、該
培養物を、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相
互作用クロマトグラフィー、およびアフィニティークロ
マトグラフィーからなる群から選択されるクロマトグラ
フィーを用いて精製する工程をさらに包含する。

【００２２】さらに好適な実施態様においては、超好熱
菌がThermococcus属に属する微生物である。

【００２３】さらに好適な実施態様では、Thermococcus
属に属する微生物がThermococcus sp. B-1001株であ
る。

【００２４】本発明によれば、上記サイクロデキストリ
ン生成酵素を40 W/V％以下の濃度のデンプンスラリーに
添加し、デンプンの液化とサイクロデキストリンの生産
とを同時に行う、サイクロデキストリンの製造方法が提
供される。

【００２５】好適な実施態様では、上記サイクロデキス
トリンは主としてα-サイクロデキストリンである。

【００２６】本発明によれば、サイクロデキストリン生
成酵素であって、配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸
28〜739、または配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸2
8〜739において１または数個の置換、欠失、もしくは付
加を有し、かつこのアミノ酸配列を有するサイクロデキ
ストリン生成酵素と等価なサイクロデキストリン生成酵
素活性を示す、酵素が提供される。

【００２７】１つの実施態様において、上記サイクロデ
キストリン生成酵素は超好熱菌Thermococcus属に属する
微生物から得られる。

【００２８】１つの実施態様において、上記サイクロデ
キストリン生成酵素は超好熱菌Thermococcus sp. B-100
1株から得られる。

【００２９】本発明によれば、上記のサイクロデキスト
リン生成酵素をコードするDNAが提供される。

【００３０】１つの実施態様において、上記DNAは、配
列番号６のヌクレオチド配列のヌクレオチド136〜2271
を有するか、または配列番号６のヌクレオチド配列のヌ
クレオチド136〜2271において１または数個の置換、欠
失、もしくは付加を有する。

【００３１】本発明によれば、上記のDNAを含む発現ベ
クターが提供される。

【００３２】本発明によれば、上記の発現ベクターを含
む組換え宿主細胞が提供される。

【００３３】本発明によれば、組換え宿主細胞を培養す
る工程、および培養物からサイクロデキストリン生成酵
素を回収する工程を包含する、サイクロデキストリン生
成酵素の生産方法が提供される。

【００３４】本発明によれば、上記のサイクロデキスト
リン生成酵素を40 W/V％以下の濃度のデンプンスラリー
に添加し、デンプンの液化とサイクロデキストリンの生
産を同時に行う、サイクロデキストリンの製造方法が提
供される。

【００３５】

【発明の実施の形態】以下において、本発明を詳しく説
明する。

【００３６】本明細書において「サイクロデキストリン
生成酵素」とは、D-グルコースがα-1,4結合で環状構造
を形成しているサイクロデキストリンを生成する酵素で
あると定義される。

【００３７】本発明のサイクロデキストリン生成酵素を
得るために利用され得る超好熱菌は、80℃以上に最適生
育温度を有する微生物であると定義される。超好熱菌の
例としては、Desulfurolobus属、Sulfolobus属、Acidia
nus属、Thermoproteus属、Thermofilum属、Thermodiscu
s属、Staphylothermus属、Archaeoglobus属、Pyrobacul
um属、Pyrococcus属、Thermotoga属、Theromococcus
属、Desulfurococcus属、Pyrodictium属などの菌が挙げ
られる。これらの超好熱菌は、例えば、「古細菌」（古
賀洋介著、東京大学出版会、UPバイオロジーシリーズ 7
3 ）に記載されている。この文献には、超好熱菌の分離
源、およびその性質が記載されている。

【００３８】本発明のサイクロデキストリン生成酵素を
産生する超好熱菌は以下のようにして取得され得る。高
温環境下の水、例えば温泉湧出口付近の温泉水（70℃）
を採取する。採取した温泉水の一部（例えば0.5ml）を
ネジつき試験管に入れた0.5×2216マリンブロース液体
培地、５mlに接種して、気相を窒素置換した後、85℃、
２日間、暗所にて静置培養する。濁りが発生した試験管
から培養液の一部を採取し、顕微鏡下で倍率600で観察
する。微生物の存在を確認した後、計数し、この培養液
を限界希釈法で希釈する。この希釈液を、0.2W／V％可
溶性デンプンを含む、0.5×2216マリンブロース液体培
地に、培地当たり１個の細胞を含むように添加し、85
℃、２日間、暗所にて静置培養する。細胞がサイクロデ
キストリン生成酵素を生産し得るか否かは、細胞が増殖
した培養液中にサイクロデキストリンが存在するか否か
を検定することで決定される。サイクロデキストリンか
否かは、当業者に周知の方法で決定され得る。培養液の
デンプン分解活性を測定し、次いで、同じ培養液の還元
糖生成の有無を3,5-ジニトロサリチル酸法で測定し、さ
らに培養液中のオリゴ糖を薄相クロマトグラフィーある
いは、高速液体クロマトグラフィーを用いて調製あるい
は分析して行い得る。このようにして、サイクロデキス
トリン生成酵素を生産し得る菌株を単離し得る。

【００３９】本発明のサイクロデキストリン生成酵素
は、上記超好熱菌から取得され得る。本発明者らは、上
記の方法により、温泉湧出地域で採取した温泉水から超
好熱菌を単離し、その株からサイクロデキストリン生成
酵素を分離した。本発明のサイクロデキストリン生成酵
素は、好ましくはThermococcus属に属する微生物に由来
するサイクロデキストリン生成酵素である。Thermococc
us属に属する微生物のうち、Thermococcus sp. B-1001
株と命名した株が、サイクロデキストリン生成酵素の生
産株として用いられ得る。この株は、工業技術院生命工
学工業技術研究所に、受託番号FERM P-16000号として寄
託されている。

【００４０】このThermococcus sp. B-1001株の菌学的
性質は以下の通りである。 （１）菌の形態は球菌である。 （２）絶対嫌気的に生育する。 （３）生育温度範囲は60℃〜95℃であり、最適生育温度
は85℃付近である。 （４）生育pH範囲はpH５から９であり、最適生育pHは７
付近である。 （５）最適生育NaCl濃度は２％である。 （６）DNAのGC含量は43.0％である。 （７）16S rRNAをコードする遺伝子は、保存性の高い配
列領域から設計したプライマーDNAを用いたPCR法で取得
され、ダイデオキシ法で塩基配列を決定した。決定した
B-1001株の16S rRNA遺伝子配列（1416bp）を配列表の配
列番号１に示す。B-1001株の16S rRNA遺伝子の取得に用
いたプライマーは、Forward primerである、5'-TTCCGGT
TGATCCYGCCGGA-3'（Yは、CまたはTを示す）（配列番号
２）、およびReverse primerである、5'-GGTTACCTTGTTA
CGACTT-3'（配列番号３）である。バイオデータベースC
D-ROM GENETYX-CD Ver.37（ソフトウエア開発株式会社
製）に入力されているGenBank（登録商標）Release 10
0.0 April, 1997とEMBL Release 50.0 March, 1997 (no
n redundancy)の登録データを用いた16S rRNA遺伝子配
列の比較によれば、B-1001株の16S rRNAの配列は、Ther
mococcus属に分類された種々の菌株と高い相同性がある
ことが示された。得られたB-1001株と各Thermococcus属
菌株との相同性を表１に示す。その内で、「バージェー
ズマニュアルオブディターミネイティブバクテリオロジ
ー第９版（1994年）」および「バージェーズマニュアル
オブシステマティックバクテリオロジー第３集（1989
年）」に記載されているThermococcus celerの16s rRNA
遺伝子配列とB-1001株の配列の比較を図１Ａおよび図１
Ｂに示す。ここで、上段は、B-1001株の16s rRNA遺伝子
配列を示し、下段は、Thermococcus celerの16s rRNA遺
伝子配列を示す。

【００４１】

【表１】

【００４２】以下、Thermococcus sp. B-1001株を例に
あげて説明する。

【００４３】Thermococcus sp. B-1001株を培養して、
本発明のサイクロデキストリン生成酵素を生産させるに
は、静置培養あるいは窒素ガスによる通気撹拌培養によ
り、連続あるいは、回分的に行うことができる。例え
ば、Thermococcus sp. B-1001株を、Appl. Environ. Mi
crobiol. 60(12), 4559-4566(1994)に記載の0.5×2216
マリンブロース培地（2216マリンブロース18.7g/L、PIP
ES 3.48g/L、CaCl₂・H₂O0.725g/L、0.4mL 0.2％レザズリ
ン、475mL 人工海水(NaCl 28.16g/L、KCl 0.7g/L MgCl₂
・６H₂O 5.5g/L、MgSO₄・7H₂O 6.9g/L)、蒸留水500mL、pH
7.0、最終濃度400μM Na₂S・９H₂O、硫黄 10g/L)に、最
終濃度0.2％になるように可溶性デンプンを添加した培
地10Lに接種して培養する。培養に際しては、例えば、
発酵槽内を窒素ガスに置換し、培養温度85℃にて16時間
培養する。この場合、培養は静置培養で行い、培養中窒
素ガスの通気および撹拌は行わない。なお、かかる微生
物を培養して、本発明の酵素タンパク質を生産させるた
めの培養条件は、微生物が生育する範囲内であれば特に
限定はない。

【００４４】このようにして培養した後、得られる培養
物から常法により酵素タンパク質を回収する。例えば培
養物を遠心分離または濾過することによって菌体を分離
して上澄を得、この上澄から通常の手段、例えば、塩析
法、溶媒沈澱法（例えば、エタノール、アセトン等）に
よって酵素タンパク質を沈澱あるいは限外濾過により濃
縮し、粗酵素を得る。塩析法、溶媒沈澱法で得られた粗
酵素を沈澱させ、濾過あるいは遠心分離、脱塩処理した
後、これを凍結乾燥粉末とすることもできる。

【００４５】得られた酵素がサイクロデキストリン生成
酵素であることは、以下のようにして決定し得る。ま
ず、デンプン分解活性を調べる。デンプン分解活性は、
基質溶液（例えば、馬鈴薯デンプン糊液）に供試酵素液
を加え、反応させた後、ヨード呈色によるBlue Valueの
減少率（％）を測定することにより決定し得る。次に、
サイクロデキストリンの生成活性は、酵素をデンプン溶
液（例えば、馬鈴薯デンプン糊液）と反応させた後、還
元糖を測定し、次いでオリゴ糖の生成パターンを高速液
体クロマトグラフィー（HPLC）で分離、検出することに
より決定することができる。

【００４６】また、生成された各種サイクロデキストリ
ンの生成比率は、生成するα-サイクロデキストリン、
β-サイクロデキストリン、γ-サイクロデキストリンの
各々に特異的に結合する色素を用いる定量法で決定する
こともできる。

【００４７】サイクロデキストリン生成酵素を有するタ
ンパク質画分は、上記で得られた粗酵素を、塩析、溶媒
沈澱、等電点沈澱、電気泳動、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、サイ
クロデキストリンを利用する）、晶出等の通常の酵素の
精製手段を適宜組合せて用いて精製することによって、
比活性のさらに向上した粗酵素ないし精製酵素とするこ
ともできる。アフィニティークロマトグラフィーを用い
る場合、例えば、サイクロデキストリンを結合させたア
フィニティーカラムを利用することができる。このよう
にして得られたサイクロデキストリン生成酵素を用いて
その性質を調べることができる。

【００４８】至適pHおよび至適温度は、馬鈴薯デンプン
糊液を基質として、各種pHまたは各種温度で酵素反応さ
せて調べることができる。

【００４９】熱安定性は、緩衝液中で酵素を、一定の温
度（例えば、90℃）で一定時間（例えば、30,60,120分
間）熱処理し、氷冷した後、残存活性を測定することに
より決定し得る。あるいは、緩衝液中で酵素を一定時間
（例えば、40分）、一定の温度（例えば、70、80、90、
95、100、105、110、115、および120℃）で熱処理し、
氷冷した後、残存活性を測定することにより決定し得
る。

【００５０】サイクロデキストリン生成酵素の分子量
は、酵素をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-P
AGE)した後、活性染色することにより測定し得る。即
ち、電気泳動後のゲルを可溶性デンプンを含む緩衝液に
浸漬し、インキュベートした後、ゲルを水洗し、水洗後
のゲルをＩ₂−KI水溶液に浸漬し、ゲル中に残存してい
るデンプンを発色させる。このときサイクロデキストリ
ン生成酵素のバンドは、無色のバンドとして検出され
る。なお、分子量が公知である標準タンパク質（例え
ば、レインボーマーカーであるカレコイドスコープスタ
ンダード（日本バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社
製）を分子量マーカーとして用い、サイクロデキストリ
ン生成酵素と同じ条件下で泳動させた後、分子量マーカ
ーの泳動度と、活性染色して検出されたサイクロデキス
トリン生成酵素の泳動度とを比較することにより、見か
けの分子量を決定し得る。

【００５１】本発明のサイクロデキストリン生成酵素の
酵素学的性質は、次の通りである； １）SDS-PAGEおよびそれに続く活性染色での分子量：約
72,000 ２）110℃での至適pH：5.0〜5.5 ３）90℃での至適pH：4.5〜6.0 ４）至適温度：110℃付近（pH5.0における） ５）残存活性：少なくとも90％以上活性保持（pH5.0、1
00℃、40分間の熱処理、デンプンおよびCa²⁺の非存在
下） ６）生成物：デンプンを基質とした場合、主としてα-
サイクロデキストリン ７）等電点(pI)：3.5以下。

【００５２】なお、等電点は、等電点電気泳動用ポリア
クリルアミドゲル（例えば、Ampholine PAG Plate pH3.
5-9.5（ファルマシアバイオテク株式会社製）を用い、
電気泳動後、クマシーブリリアントブルーによる染色
で、あるいは、活性染色法で、バンドを検出することに
行われ得る。活性染色による場合は、上記のSDS-PAGEと
同様に、電気泳動後のゲルを１W／V％可溶性デンプンを
含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液に浸漬し、85℃で１時間
インキュベートした後、適切な濃度（例えば、0.005％
〜0.05％KI）のKI-I₂水溶液に浸漬し、ゲル中に残存し
ているデンプンを発色させることにより行う。等電点
（pI）マーカーとなるタンパク質としては、等電点が既
知のタンパク質、例えば、pIキャリブレーションキット
（ファルマシアバイオテク株式会社製）が用いられ得
る。マーカータンパク質は、電気泳動後、クマシーブリ
リアントブルーによる染色を行い、サイクロデキストリ
ン生成酵素の移動度と比較して、等電点が決定され得
る。

【００５３】サイクロデキストリンおよびα-サイクロ
デキストリンの製造は基本的には以下のように実施し得
る：約40 W/V％濃度のデンプンスラリーに、サイクロデ
キストリン生成酵素５〜60 U/gDSを添加し、pHを4.5〜
6.0に調整する；90〜95℃で適切な時間、反応を行う。
反応は、HPLCを用いたサイクロデキストリンの定量によ
り評価し得る。ここでDSは乾燥デンプンを表す。

【００５４】また、精製された本発明のサイクロデキス
トリン生成酵素を用いて、本酵素の一部のアミノ酸配列
を決定することができる。アミノ酸配列の決定には、例
えば、Edman分解法を用いることができる。このように
して決定されたアミノ酸配列をもとにして、当該分野で
周知の種々の方法を用いることにより、本発明のサイク
ロデキストリン生成酵素をコードする遺伝子の単離を行
うことができる。さらに、このようにして得られるサイ
クロデキストリン生成酵素の遺伝子の配列に、１または
それ以上の欠失、付加、または置換などの改変を行っ
て、本発明のサイクロデキストリン生成酵素の特性を損
なわない程度に改変された機能的同等物をコードする遺
伝子を得ることもできる。上記のように単離されるサイ
クロデキストリン生成酵素遺伝子またはその機能的同等
物をコードする遺伝子を、適切なベクターに挿入して発
現させ得る。単離された遺伝子自身が転写調節配列およ
び翻訳調節配列を有する場合は単離されたそのままの形
で多コピー性のプラスミドに挿入することにより、利用
して発現させることができる。本発明に用いられる発現
ベクターは、市販の発現ベクターまたは市販の発現ベク
ターに由来する発現ベクターであり得、宿主においてサ
イクロデキストリン生成酵素を発現する発現ベクターで
あればよい。単離された遺伝子を大量に発現させるため
には、高発現ベクターの有する転写調節配列および翻訳
調節配列の制御下に、作動可能にインフレームで連結す
ることが好ましい。このようにして得られたベクターを
用いて任意の適切な宿主細胞を形質転換する。

【００５５】単離された遺伝子によりコードされる酵素
を産生する方法としては、形質転換された宿主細胞を適
切な条件下で培養し、その培養物から目的とする酵素を
精製する方法が挙げられる。培養に用いられる培地は、
例えばＬＢ培地、および２×ＹＴ培地のような通常微生
物の増殖に用いられる培地であってもよいし、宿主細胞
に適した特定の培地であってもよい。培養は、連続的あ
るいは回分的に行うことができる。なお、かかる微生物
を培養して、本発明のサイクロデキストリン生成酵素を
生産させるための培養条件は、微生物が生育する範囲内
であれば特に限定はない。

【００５６】このようにして得られる組換え型のサイク
ロデキストリン生成酵素も、本願発明の酵素とほぼ同等
の性質を有するものであれば、本願発明の範囲に含まれ
る。

【００５７】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００５８】＜実施例１＞ 超好熱菌の産生するサイク
ロデキストリン生成酵素の粗精製および粗酵素の特性 （Ａ）酵素の粗精製 Thermococcus sp. B-1001株を、Appl. Environ. Microb
iol. 60(12), 4559-4566(1994)に記載の0.5×2216マリ
ンブロース培地（2216マリンブロース18.7g/L、PIPES
3.48g/L、CaCl₂・H₂O 0.725g/L、0.4 mL 0.2％レザズリ
ン、475 mL人工海水(NaCl 28.16g/L、KCl 0.7g/L MgCl₂
・６H₂O 5.5g/L、MgSO₄・7H₂O 6.9g/L)、蒸留水500 mL、p
H7.0、最終濃度400μM Na₂S・９H₂O、硫黄 10g/L)に、最
終濃度0.2％になるように可溶性デンプンを添加した培
地10Lに接種して15リットルの発酵槽により培養した。
培養に際しては、発酵槽内を窒素ガスに置換し、培養温
度85℃にて16時間培養した。なお、培養は静置培養で実
施し、培養中窒素ガスの通気および撹拌は行わなかっ
た。培養終了後、培養液（約10L）を7,000rpmで30分間
の遠心分離により除菌し、限外濾過法（旭化成社製 限
外濾過モジュール AIP-1010）による濃縮、そしてそれ
に続く蒸留水による希釈（濃縮−洗浄処理）を３回繰り
返した後、最終的に約500mlまで濃縮した。この濃縮液
を凍結乾燥し、粗酵素サンプル0.75gを得た。デンプン
分解活性の測定法は以下の通りである：2.5mlの基質溶
液（最終濃度１％となるように馬鈴薯デンプンをpH4.0
の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液に溶解した液（馬鈴薯デン
プン糊液））に供試酵素液0.25mlを加え、50℃で120分
間反応する；次いで、反応液0.1mlを取り出して0.1N HC
l１ml中に入れて反応を止める。この液0.25mlに0.005％
Ｉ₂-0.05％KI液５mlを加えてよく振盪し、660nmの波長
で蒸留水を対照として比色する。この反応条件下で、１
％馬鈴薯デンプン糊液１mlのBlue Valueを50℃、１分間
に１％低下させる酵素量を１単位(U)とする。粗酵素サ
ンプルのデンプン分解酵素活性は14.93 U/gであり、総
活性は11.20 Uであった。得られた粗酵素を使用して本
発明のサイクロデキストリン生成酵素の酵素学的性質を
以下のように検討した。

【００５９】（Ｂ）作用 （Ａ）で得られた粗酵素を下記の酸性条件下でデンプン
に作用させオリゴ糖を生成させた。 ｌ）基質：１％馬鈴薯デンプン糊液 ２）pH：5.0（0.1M酢酸ナトリウム緩衝液） ３）温度（℃）：90 ４）作用時間（時間）：３または24 ５）酵素添加量（Unit）：0.04

【００６０】上記の条件で粗酵素を作用させた反応液を
（Ａ）に記載の方法でBlue Valueを測定したところ、Bl
ue Valueの減少がみられた。しかし還元糖を定量するDN
S法（3,5-ジニトロサリチル酸法）では、活性を検出す
ることはできなかった。従って、この粗酵素は環状のオ
リゴ糖を生成することが示唆された。そこで、環状オリ
ゴ糖の生成パターンを分析するために、上記反応液（５
μL）を（高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法で分
離し、液体クロマトグラムのパターンをえた。

【００６１】高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の分
離条件は次の通りである。 １）カラム：TSK gel Amide-80、東ソー株式会社製 ２）流速(ml/分)：1.0 ３）溶媒：アセトニトリル：水（60:40） ４）カラム温度（℃）：30 ５）検出方法：示差屈折(RI)

【００６２】このHPLCの結果、３時間および24時間目の
メインピークは、いずれも市販のα-サイクロデキスト
リンと同一のピークを示した。従って、本発明の酵素
は、３時間、および24時間の反応時間において、主とし
てα-サイクロデキストリンを生成するサイクロデキス
トリン生成酵素であることが確認された。

【００６３】（Ｃ）α-、β-およびγ-サイクロデキス
トリンの生成割合 生成した各種サイクロデキストリンの生成割合を、α-
サイクロデキストリン、β-サイクロデキストリン、お
よびγ-サイクロデキストリンの各々に特異的に結合す
る色素を用いた定量法で決定した。

【００６４】α-サイクロデキストリンは、Anal. Bioch
em. 181,6-11(1989)に記載のメチルオレンジを用いた方
法に準拠して行った。（Ｂ）の条件下で粗酵素を作用さ
せた反応液１mlに、50mMリン酸緩衝液（pH6.0）-1.895m
l、１mMメチルオレンジ溶液-0.105mlおよび6N HCl-0.15
0mlを加え、16℃で30分間室温で静置した後、505nmでの
吸光度を測定して定量した。

【００６５】β-サイクロデキストリンは、J. Jpn. So
c. Starch Sci., 34(1),45-48(1987)に記載のフェノー
ルフタレインを用いた方法に準拠して行った。（Ｂ）の
条件下で粗酵素を作用させた反応液１mlに、40mM NaOH-
3.5ml、0.02%フェノールフタレイン溶液-0.5mlを加え、
15分間室温で静置した後、550nmでの吸光度を測定して
定量した。

【００６６】γ-サイクロデキストリンは、Anal. Che
m., 56,1738-1740(1987)に記載のブロモクレゾールグリ
ーンを用いた方法に準拠して行った。（Ｂ）の条件下で
粗酵素を作用させた反応液１mlに、0.2Mクエン酸緩衝液
（pH4.0）-2mlに、5mMブロモクレゾールグリーン溶液-
0.1mlを加え、630nmでの吸光度を測定して定量した。

【００６７】これらの定量結果から、（Ｂ）の条件下で
粗酵素を作用させた反応液中の各種サイクロデキストリ
ン生成割合は、作用時間３時間の場合、α-サイクロデ
キストリン：β-サイクロデキストリン：γ-サイクロデ
キストリン＝82：８：10で、作用時間24時間の場合、α
-サイクロデキストリン：β-サイクロデキストリン：γ
-サイクロデキストリン＝73：15：12であった。

【００６８】（Ｄ）至適pH １％馬鈴薯デンプンを含む各pH（pH3.5、4.0、4.5、5.
0、5.5、および6.0）の0.1M酢酸ナトリウム緩衝液に0.0
4Uの（Ａ）で得られた粗精製のサイクロデキストリン生
成酵素を加え、90℃、15分間反応を行なった。最大活性
値を100％としたときの各pHでの相対活性を図２に示し
た。

【００６９】図２から明らかな如く、本発明のサイクロ
デキストリン生成酵素の至適pHは幅広く4.5-6.0であ
る。

【００７０】（Ｅ）至適温度 １％馬鈴薯デンプン糊液（pH5.0、0.1M酢酸ナトリウム
緩衝液）を基質溶液として、各温度（60、70、80、90、
95、100、105、110、115、および120℃）で25分間、
（Ａ）で得られた粗精製のサイクロデキストリン生成酵
素を反応させ、最大活性値を100％としたときの各温度
での相対活性を分析した。この結果を図３に示す。

【００７１】図３から明らかな如く、本発明のサイクロ
デキストリン生成酵素の至適温度は110℃付近であるこ
とがわかった。

【００７２】（Ｆ）熱安定性 0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）に（Ａ）で得られ
た粗精製のサイクロデキストリン生成酵素を加えて、90
℃で30、60、および120分間熱処理し、氷冷した後、１
％馬鈴薯デンプン糊液（pH5.0、0.1M酢酸ナトリウム緩
衝液）を基質溶液として残存活性を測定した。また、１
mM CaCl₂または１mM EDTAを熱処理時に添加し、これらが
熱安定性に及ぼす影響を調べた。これらの結果を図４に
示す。□は、CaCl₂およびEDTAを無添加、◆は、１mM Ca
Cl₂を添加、そして△は、１mMEDTA添加を表す。

【００７３】図４より明らかな如く、本発明のサイクロ
デキストリン生成酵素は、90℃、pH5.0の条件下で120分
間処理した後においても、少なくとも70％以上の活性が
残存していることがわかる。また、１mM CaCl₂または１
mM EDTAは熱安定性に影響を及ぼさない。

【００７４】また、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.
0）に（Ａ）で得られた粗精製のサイクロデキストリン
生成酵素を加え、70、80、90、95、100、105、110、11
5、および120℃で40分間熱処理し、氷冷した後、１W／V
％馬鈴薯デンプン糊液（pH5.0、0.1M酢酸ナトリウム緩
衝液）を基質溶液として残存活性を測定した。その結果
を、図５に示す。図５より明らかな如く、本発明のサイ
クロデキストリン生成酵素は、90℃、pH5.0の条件下で4
0分間処理した後においては、少なくとも90％以上の活
性が残存していた。従来のThermoanaerobacter属または
Thermoanaerobium属由来の耐熱性サイクロデキストリン
生成酵素（米国特許第5,501,968号）は、同条件で20％
弱の残存活性しか保持していないことから、本発明のサ
イクロデキストリン生成酵素は、優れた耐熱性を有する
サイクロデキストリン生成酵素であることを示してい
る。

【００７５】（Ｇ）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量の決定 ８W／V％のポリアクリルアミド濃度のSDS-ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により、（Ａ）で得られた粗精製の
サイクロデキストリン生成酵素の分子量を推定した。目
的のサイクロデキストリン生成酵素のバンドの検出は、
以下の条件での活性染色により行った。即ち、電気泳動
後のゲルを１％可溶性デンプンを含む0.1M酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH5.0）に浸漬し、85℃で１時間インキュベ
ート後、ゲルを水洗し、水洗後のゲルを0.0005％Ｉ₂-0.
05% KI水溶液に浸漬し、ゲル中に残存しているデンプン
を発色させた。サイクロデキストリン生成酵素のバンド
は、無色のバンドとして検出された。なお、標準タンパ
ク質としてカレコイドスコープスタンダード（日本バイ
オ・ラッドラボラトリーズ株式会社製）を用い、本発明
のサイクロデキストリン生成酵素と同条件で泳動後、分
子量マーカーとした。その結果、本発明のサイクロデキ
ストリン生成酵素の分子量は約72,000であることがわか
った。

【００７６】以上から、本発明のサイクロデキストリン
生成酵素は、高温条件下で優れたデンプン分解活性を発
揮し、かつ同条件下で高い安定性を示した。さらに、B-
1001株の生成するサイクロデキストリン生成酵素は、主
にα-サイクロデキストリンを生成した。したがって、
本発明のサイクロデキストリン生成酵素は、デンプン液
化能およびサイクロデキストリン生成能を有する優れた
耐熱性を持つサイクロデキストリン生成酵素であること
が明らかとなった。

【００７７】（Ｈ）等電点電気泳動による等電点の決定 等電点電気泳動用ポリアクリルアミドゲルとして、Amph
oline PAG Plate pH3.5-9.5（ファルマシアバイオテク
株式会社製）を用いた電気泳動により、本発明のサイク
ロデキストリン生成酵素の等電点を求めた。バンドの検
出は、活性染色法でおこなった。電気泳動後のゲルを１
W／V％可溶性デンプンを含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液
に浸漬し、85℃で１時間インキュベートした後、0.005
％Ｉ₂ -0.05％ KI 水溶液に浸漬し、ゲルのなかに残存
しているデンプンを発色させた。なお、等電点（pI）マ
ーカーとなるタンパク質として、pIキャリブレーション
キット（ファルマシアバイオテク株式会社製）を用い、
サイクロデキストリン生成酵素と同じ条件で泳動の後、
クマシーブリリアントブルーR-250(CBB)により染色し、
pIマーカーとした。その結果、本発明の酵素のバンドは
pIが3.5であるアミノグルコシダーゼのバンドの位置よ
り陽極側で検出された。従って、本発明のサイクロデキ
ストリン生成酵素の等電点（pI）は、3.5以下であるこ
とがわかった。

【００７８】＜実施例２＞ サイクロデキストリン生成
酵素の精製および精製された酵素の特性 （Ａ）酵素の精製 ここでは、精製酵素を用いたサイクロデキストリン生成
酵素の活性測定は、以下の通りに行った。１W/V％馬鈴
薯デンプン糊液（pH5.0、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液）6
0μLに適当に希釈した精製酵素液を６μL加え、90℃で1
0分間反応させた。反応液は、氷水中で急冷した後、10
μLを取り出して0.1N HCl 100μL中に入れて反応を停止
した。この液100μLに0.005% I₂-0.05% KI液を２mL加え
て良く撹拌し、660nmの波長で蒸留水を対照として比色
した。この反応条件下で、上記実施例１（Ａ）と同様
に、Blue Valueを１分間に１％低下させる酵素量を１単
位(U)とした。

【００７９】実施例１の（Ａ）で得た粗酵素サンプル５
ｇを50mL蒸留水に溶解し、これに固形硫酸アンモニウム
を80％飽和濃度となるように添加し、４℃で一夜放置し
た。生じた沈澱を遠心分離により回収し、25mM酢酸ナト
リウム緩衝液pH5.0（緩衝液１）40mLに溶解させた後、
緩衝液１に対して一夜４℃で透析した。透析後の粗酵素
溶液を、緩衝液１で平衡化した陰イオン交換クロマトグ
ラフィー用カラム（ResourceQ、ファルマシアバイオテ
ク社製）に添加した。緩衝液１で同カラムを充分洗浄し
た後、０Ｍから１ＭのNaClを含む緩衝液１の濃度勾配に
より溶出を行った。上記の方法により、デンプン分解活
性を示す溶出画分を決定した。溶出したデンプン分解活
性画分に固形硫酸アンモニウムを80％飽和濃度となるよ
うに添加して、４℃で一夜放置した。次いで、生じた沈
澱を遠心分離により回収し、12％飽和濃度の固形硫酸ア
ンモニウムを含む25mM Tris-塩酸緩衝液pH7.0（緩衝液
２）に溶解した。この溶解液を緩衝液２で平衡化した疎
水性相互作用クロマトグラフィー用カラム（Phenyl Sup
erose HR5/5、ファルマシアバイオテク株式会社製）に
添加した。次いで、緩衝液２で同カラムを充分洗浄した
後、25mM Tris-塩酸緩衝液pH7.0により溶出を行った。
上記と同様にデンプン分解活性を示す溶出画分を決定し
た。溶出したデンプン分解活性画分を、100mM NaClを含
む25mM Tris-塩酸緩衝液pH7.0（緩衝液３）で平衡化し
たアフィニティークロマトグラフィー用カラム（α-サ
イクロデキストリンを結合したEpoxy-Sepharose 6B、フ
ァルマシアバイオテク社製）に添加した。ここで、Epox
y-Sepharose 6B担体へのα−サイクロデキストリンの結
合は、製品の取扱説明書に従って行った。次いで、900m
M NaClを含む緩衝液３で同カラムを充分洗浄した後、１
W/V％α-サイクロデキストリンを含む緩衝液３により溶
出を行った。上記と同様にデンプン分解活性を示す溶出
画分を決定した。溶出したデンプン分解活性画分は、蒸
留水に対して３日間４℃で透析した後、平均分画分子量
１万の限外濾過膜を用いて0.9mLに濃縮した。この濃縮
液を用いてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
った後、実施例１の（Ｇ）に記載の活性染色、およびク
マシーブリリアントブルーR250によるタンパク質の染色
を行った。活性染色の結果、実施例１の（Ｇ）において
粗酵素サンプルを用いた測定結果と同様に分子量約72,0
00の位置に活性バンドが認められた。また、クマシーブ
リリアントブルーR250によるタンパク質の染色の結果、
分子量約72,000と約83,000の２本のバンドが確認され
た。通常、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に用い
るサンプルは、等量の試料用緩衝液（4.6％ SDS、10％
2-メルカプトエタノール、20％グリセロール、125mM Tr
is塩酸緩衝液（pH6.8）、0.01％ブロモフェノールブル
ー）と混合後に煮沸処理を５分間行うことで、タンパク
質の変性を行なう。しかし、本発明のサイクロデキスト
リン生成酵素は非常に熱安定性に優れているため、この
熱処理では完全に変性していないことが考えられ、この
ことは活性染色が可能であることからも推測された。そ
こで、酵素濃縮液と試料用緩衝液を等量混合後に120℃
で５分間熱処理を行なった後、SDS-ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行なった結果、分子量約83,000のタンパ
ク質バンドのみが認められ、活性染色はされなかった。
以上の結果より、本発明のサイクロデキストリン生成酵
素は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単一に
精製されたと判断した。

【００８０】精製酵素サンプルのサイクロデキストリン
生成酵素活性は、7.86 U/mlであり、総活性は7.07Ｕで
あった。

【００８１】（Ｂ）精製酵素による至適pHの測定 至適pHの測定は、１W/V％馬鈴薯デンプンを含む各pH（p
H4.0、4.5、5.0、5.5、および6.0)の0.1M酢酸ナトリウ
ム緩衝液に精製酵素を加え、90℃および110℃で10分間
反応を行った。最大活性値を100％としたときの各pHで
の相対活性を図６に示す。黒三角は90℃での相対活性を
示し、そして黒丸は110℃での相対活性を示す。

【００８２】図６から明らかなように、本発明のサイク
ロデキストリン生成酵素の至適pHは、90℃で測定して4.
5〜6.0であった。これは、粗酵素サンプルを用いた実施
例１の結果と同じである。110℃での測定では、至適pH
は5.0〜5.5である。

【００８３】（Ｃ）精製酵素による至適温度の測定 １W/V％馬鈴薯デンプン糊液（pH5.0、0.1M酢酸ナトリウ
ム緩衝液）を基質溶液として、各温度（80、90、100、1
10、および120℃）で10分間、精製酵素を反応させた。
最大活性値を100％としたときの各温度での相対活性を
図７に示す。図７から明らかなように、本発明のサイク
ロデキストリン生成酵素の至適温度は、実施例１におい
て粗酵素サンプルを用いた測定結果と同様に、110℃付
近であった。

【００８４】（Ｄ）精製酵素による熱安定性の測定 0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に精製酵素を加え、
各温度（20、70、80、90、100、110、および120℃）で4
0分間熱処理し、氷冷した後、１W/V％馬鈴薯デンプン糊
液（pH5.0、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液）を基質溶液と
して残存活性を測定した。その結果を図８に示す。

【００８５】図８から明らかなように、本発明のサイク
ロデキストリン生成酵素は、90℃、pH5.0の条件下で40
分間処理した後においては、100％の活性を残存してい
た。さらに、100℃、pH5.0の条件下で40分間処理した後
においては、少なくとも90％以上の活性を残存してい
た。この結果は、実施例１において粗酵素を用いて得ら
れた結果（図５）に類似しているが、精製酵素は、粗酵
素酵素よりも幾分熱安定性に優れているようである。

【００８６】（Ｅ）精製酵素による反応産物のHPLC分析 ５W/V％の可溶性デンプン溶液を含む0.1M酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH 5.0）50μLに精製酵素を50μL（0.04 U）
加え、全量を100μLとして90℃で０〜24時間反応させ
た。生成したサイクロデキストリン以外のオリゴ糖また
は未反応デンプン等を分解するために、酵素反応液50μ
Lに2M酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）8.75μL、２Ｕの
グルコアミラーゼ（グルコアミラーゼGLA-III、東洋紡
績株式会社製）および蒸留水を加えて全量100μLとし、
40℃で１時間反応させた。この反応生成物を孔径0.45μ
mのメンブレンフィルターにより濾過した後、得られた
濾液を実施例１の(B)に示した条件によりHPLC分析し
た。また、各サイクロデキストリンスタンダードの種々
の濃度をHPLC分析し、標準曲線を作成することにより、
生成した各サイクロデキストリンの定量を行なった。HP
LC分析の結果を図９に示す。各曲線は、それぞれ、０時
間、４時間、および24時間反応を行った反応液、ならび
にスタンダードにおけるディテクター応答を示す。スタ
ンダードは、α-CD（α-サイクロデキストリン）、β-C
D（β-サイクロデキストリン）、γ-CD（γ-サイクロデ
キストリン）の等モル量混合物である。

【００８７】図９から明らかなように、精製酵素をデン
プンに作用させた反応液は、α-、β-、およびγ-サイ
クロデキストリンに相当するピークを示した。24時間の
反応により生成した総サイクロデキストリンの収率は30
％であった。

【００８８】総サイクロデキストリンにおけるそれぞれ
のサイクロデキストリンの割合を求めた結果、α-サイ
クロデキストリン：β-サイクロデキストリン：γ-サイ
クロデキストリン＝79：14：7であった。この結果は実
施例１（Ｃ）の結果とほぼ同様であり、本発明のサイク
ロデキストリン生成酵素は、主としてα-サイクロデキ
ストリンを生成するサイクロデキストリン生成酵素であ
ることが確認された。

【００８９】＜実施例３＞ デンプンスラリーを原料と
してのサイクロデキストリン製造 デンプン濃度40W/V％、実施例１で得た粗精製酵素（30U
/gDS）、PH5.0、反応温度90℃の条件で24時間、反応を
行った。HPLCを用いて反応を評価した結果、生成物は主
としてα-サイクロデキストリンであり、その収率は24
時間で40％であった。

【００９０】この結果から、スターチスラリーから、デ
ンプン液化とサイクロデキストリンの生成とを同時に行
うことが可能であることが示された。従って、本発明の
サイクロデキストリン生成酵素は、デンプン液化能
（力）も併せて有しているように思われた。

【００９１】＜実施例４＞ pH無調整のコーンスターチ
スラリーを原料としてのサイクロデキストリン製造 pH無調整のコーンスターチスラリーからのサイクロデキ
ストリン製造を以下のように実施した。30W/V％濃度の
コーンスターチスラリーに、本発明のサイクロデキスト
リン生成酵素（実施例１で得た粗酵素）15U/gDSを添加
した。コーンスターチスラリーのpHは4.5であり、本発
明のサイクロデキストリン生成酵素の至適pHは4.5〜6.0
の酸性域にあるので、特にpHを調整する必要もなく反応
を行うことができた。90〜95℃で24時間、デンプンの液
化およびサイクロデキストリンの生成を行った。HPLCを
用いて反応を評価した結果、生成物は主としてα-サイ
クロデキストリンであり、その収率は、24時間の反応で
34.4％であった。

【００９２】この結果から、pH無調整のコーンスターチ
スラリーから、デンプンの液化とサイクロデキストリン
の生成とを同時に行うことができる、サイクロデキスト
リンの連続製造方法が可能であることが示された。

【００９３】＜実施例５＞ サイクロデキストリン生成
酵素のＮ末端アミノ酸配列の決定 精製酵素をSDSポリアクリルアミトゲル電気泳動により
分離した後、これをPVDF膜（バイオラッド社製）にセミ
ドライブロッティング装置（ファルマシア社製）を用い
て転写した。転写方法は、セミドライブロッティング装
置の取扱い説明書に従った。この膜をクマシーブリリア
ントブルー染色し、サイクロデキストリン生成酵素バン
ドに相当する断片をアミノ酸配列自動分析装置（アプラ
イドバイオシステムズ社製プロテインシーケンサー473
A）を用いて分析した。その結果、配列番号４に示され
る21アミノ酸の配列を決定した。

【００９４】＜実施例６＞ ＤＮＡプローブの作製 決定したＮ末端アミノ酸配列の６番目のトリプトファン
から21番目のイソロイシンまでのアミノ酸配列に対応す
る塩基配列を有するDNA、5'-TAYCCIGCIGGIGAYCCICARACI
TGGGTIATHTAYCARATDGTIAT-3'（ＹはＴまたはＣを、Ｒは
ＡまたはＧを、ＨはＡまたはＣまたはＴを、ＤはＡまた
はＴまたはＧを、Ｉはイノシンを示す） （配列番号５）を合成した。配列番号５において、イノ
シンに相当するヌクレオチドをＮとして表記する。

【００９５】合成DNAをDNA 5'末端ラベリングキット
（プロメガ社製）を用いて、添付取扱い説明書に従って
［γ-³²Ｐ]ATPで標識し、これをDNAプローブとした。

【００９６】＜実施例７＞ サイクロデキストリン生成
酵素遺伝子の前半部分のクローニング 10μｇのB-1001株染色体DNAを制限酵素SacIで完全分解
し、これを１％アガロースゲル電気泳動で分離後、ナイ
ロンメンブラン（HybondＮ＋、アマシャム社製）に転写
した。転写方法は、添付取扱い説明書に従って行った。
DNA断片を転写したナイロンメンブランを用いて、上記
実施例６で得たDNAプローブによりサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。その結果、約３kbの位置にシグナ
ルが認められた。

【００９７】1.4μgのB-1001株染色体DNAを制限酵素Sac
Iで完全分離し、これを１％アガロースゲル電気泳動し
た。泳動位置から約３kbのDNA断片を含むと考えられる
ゲル部分を切り出し、GENECLEAN IIキット（バイオ101
社製）によりSacI切断DNAを抽出した。このSacI切断DNA
とSacIで分解したプラスミドpUC19を混合し、T4 DNAリ
ガーゼにより連結反応後、反応液を用いて大腸菌JM109
株を形質転換した。この結果、B-1001株染色体DNAを連
結したプラスミドpUC19を含む形質転換体を約350株得
た。これら形質転換体について、上記実施例６で得たDN
Aプローブによりコロニーハイブリダイゼーションを行
った。その結果、６個の陽性コロニーを得た。陽性コロ
ニーから抽出したプラスミドのSacI挿入DNA断片の塩基
配列を決定したところ、サイクロデキストリン生成酵素
のＮ末端アミノ酸配列に対応する塩基配列部分を含むオ
ープンリーデイングフレーム（ORF）が認められた。し
かし、このORFは途中で途切れていたため、サイクロデ
キストリン生成酵素遺伝子の一部分しかクローニングで
きなかた。

【００９８】＜実施例８＞ サイクロデキストリン生成
酵素遺伝子の後半部分のクローニング サイクロデキストリン生成酵素遺伝子の全領域を得るた
め、上記＜実施例７＞で得た部分的サイクロデキストリ
ン生成酵素遺伝子を含むDNA断片（PstI-SacI断片、約45
0bp）を［γ−³²Ｐ]ATPで標識し、これをDNAプローブと
した。標識は、レディプライムDNAラベリングシステム
（アマシャム社製）を使用し、取扱い説明書に従って行
った。

【００９９】10μｇのB-1001株染色体DNAを制限酵素Hin
d IIIで完全分解し、これを１％アガロースゲル電気泳
動で分離後、ナイロンメンブラン（HybondＮ+、アマシャ
ム社製)に転写した。DNA断片を転写したナイロンメンブ
ランを用いて、上記のDNAプローブによりサザンハイブ
リダイゼーションを行った。その結果、約４kbの位置に
シグナルが認められた。

【０１００】2.5μｇのB-1001株染色体DNAを制限酵素Hi
nd IIIで完全分解し、これを１％アガロースゲル電気泳
動した。泳動位置から約４kbのDNA断片を含むと考えら
れるゲル部分を切り出し、GENECLEAN IIキット（バイオ
101社製）によりHind III切断DNAを抽出した。このHind
III切断DNAとHind IIIで分解したプラスミドpUC19を混
合し、T4 DNAリガーゼにより連結反応後、反応液を用い
て大腸菌JM109株を形質転換した。この結果、B-1001株
染色体DNAを連結したプラスミドpUC19を含む形質転換体
を約200株得た。これら形質転換体について、DNAプロー
ブによりコロニーハイブリダイゼーションを行った。そ
の結果、１個の陽性コロニーを得た。陽性コロニーから
抽出したプラスミドは、4.1 kbのHind III断片を含んで
いた。この4.1 kbのHind III断片をサブクローニングし
た後、上記同様のサザンハイブリダイゼーションを行っ
た結果、シグナルを有する2.0 kbのSphI- Hind III断片
を得た。

【０１０１】＜実施例９＞ サイクロデキストリン生成
酵素遺伝子の塩基配列決定 3.0 kbのSacI断片および2.0 kbのSphI-Hind III断片の
塩基配列をオートリードシーケンシングキット（ファル
マシア社製）を用い、ALF DNAシーケンサーII（ファル
マシア社製）により決定した。方法は、それぞれの取扱
い説明書に従った。

【０１０２】その結果、塩基配列決定を行ったDNA断片
のうち2340 bpの塩基配列は、配列番号６に示す通りで
あった。この塩基配列中、実施例５で決定したＮ末端ア
ミノ酸配列（配列番号４）をコードする配列は、136番
目から認められること、及び2272番目から2274番目の３
塩基TGAが終止コドンになっていることが認められた。
従って、サイクロデキストリン生成酵素の全アミノ酸を
コードするORFは、55番目（55番目から57番目の３塩基A
TGは開始コドンである）から2274番目までの2220塩基か
らなる。

【０１０３】また、この塩基配列（配列番号６）から決
定したサイクロデキストリン生成酵素のアミノ酸配列を
配列番号７に示した。上記実施例５で決定したＮ末端ア
ミノ酸配列（配列番号４）から、成熟型酵素はアミノ酸
配列中28番目のグリシンから739番目のアルギニンまで
の712アミノ酸からなり、その分子量は80,174ダルトンと
計算された。配列番号７に示されるアミノ酸配列の１番
目のメチオニンから27番目のアラニンまでの27アミノ酸
は、分泌の際に切断されるシグナルペプチドである。

【０１０４】＜実施例１０＞ 相同性検索 バイオデータベースCD-ROM GENETYX-CD Ver.39（ソフト
ウエア開発株式会社製）に入力されている NBRF（Nati
onal Biomedical Research Foundation）（Release 50.
O September, 1996）とSWISS-PROT（European Bioinfor
matics Institute）（Release 35.0 November, 1997）
の登録データを用いて、サイクロデキストリン生成酵素
アミノ酸配列との相同性検索を行った。その結果、既存
のサイクロデキストリン生成酵素と約40％の相同性が認
められた。

【０１０５】また、サイクロデキストリン生成酵素アミ
ノ酸配列中に、既知のα−アミラーゼファミリー（α−
アミラーゼ、プルラナーゼ、およびサイクロデキストリ
ン生成酵素などが含まれる）の酵素に保存されている相
同性の高い４領域（配列番号７において、162番目から1
67番目の６アミノ酸、260番目から268番目の９アミノ
酸、292番目から295番目の４アミノ酸、および359番目
から364番目の６アミノ酸）が存在することが示され
た。

【０１０６】＜実施例１１＞ サイクロデキストリン生
成酵素のEscherichia coliにおける発現 サイクロデキストリン生成酵素をEscherichia coli内で
発現させるために以下を実施した。決定されたヌクレオ
チド配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用して、サイクロデキストリン生成酵素成
熟タンパク質コード領域全体を含むフラグメントを得
た。このフラグメントをプラスミドpUC19のlacZ遺伝子
の翻訳開始コドンのすぐ下流に挿入して発現ベクタープ
ラスミドを構築した。このプラスミドを用いてEscheric
hia coli JM109株を形質転換した。

【０１０７】出現したアンピシリン耐性形質転換体をア
ンピシリン（50μg/ml）を含有するLB培地（１％バクト
トリプトン、0.5％イーストエキス、１％Nacl）に接種
し、37℃でOD₆₆₀が0.3になるまで培養し、次いでイソプ
ロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG、0.1 mM）
を添加し、さらに37℃で培養を継続した。培養終了後、
細胞を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し
て抽出物を得た。抽出物をドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に供したとこ
ろ、予想された約80 kDaのバンドが検出された。

【０１０８】上記の抽出物中にサイクロデキストリン生
成酵素活性が検出された。従って、上記で取得されたク
ローンが活性なサイクロデキストリン生成酵素をコード
することが確認された。

【０１０９】

【発明の効果】サイクロデキストリン生成酵素遺伝子を
含むDNAが提供される。このDNAを用いることにより、こ
のサイクロデキストリン生成酵素を大量に生産する宿主
細胞を作製して、サイクロデキストリン生成酵素を安価
に大量生産することができる。さらに、このDNAは、部
位特異的変異導入法等により、酸性条件下や高温条件下
で安定性の増大した酵素を創製するための材料にもなり
得る。高温条件下で優れたデンプン分解活性を発揮し、
かつサイクロデキストリン、例えば主としてα-サイク
ロデキストリンを生成する組換えサイクロデキストリン
生成酵素が提供される。本発明の組換えサイクロデキス
トリン生成酵素は、デンプン液化能およびサイクロデキ
ストリン生成能を有する優れた耐熱性をもつサイクロデ
キストリン生成酵素であり、工業的なサイクロデキスト
リン製造工程の工程改善に有用な酵素である。

【０１１０】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：1416 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：Thermococcus sp. 株名：B-1001 配列 AGGCCACTGC TATCGGGGTC CGACTAAGCC ATGCGAGTCA AGGGGGTGTC CCTCTGGGAC 60 ACGACCGGCG GACGGCTCAG TAACACGTCG GTAACCTACC CTCGGGAGGG GGATAACCCC 120 GGGAAACTGG GGCTAATCCC CCATAGGCCT GAGGTACTGG AAGGTCCTCA GGCCGAAAGG 180 GGCTTTGCCC GCCCGAGGAT GGGCCGGCGG CCGATTAGGT AGTTGGTGGG GTAACGGCCC 240 ACCAAGCCGA AGATCGGTAC GGGCTGTGAG AGCAGGAGCC CGGAGATGGA CACTGAGACA 300 CGGGTCCAGG CCCTACGGGG CGCAGCAGGC GCGAAACCTC CGCAATGCGG GAAACCGCGA 360 CGGGGGGACC CCGAGTGTCG TGGCACCGCC ACGGCTTTTC CGGAGTGTAA AAAGCTCCGG 420 GAATAAGGGC TGGGCAAGGC CGGTGGCAGC CGCCGCGGTA ATACCGGCGG CCCGAGTGGT 480 GGCCGCTATT ATTGGGCCTA AAGCGTCCGT AGCCGGGCCC GTAAGTCCCT GGCGAAATCC 540 CACGGCTCAA CCGTGGGGCT TGCTGGGGAT ACTGCGGGCC TTGGGACCGG GAGAGGCGGG 600 GGGTACCCCT GGGGTAGGGG TGAAATCCTA TAATCCCAGG GGGACCGCCA GTGGCGAAGG 660 CGCCCCGCTG GAACGGGTCC GACGGTGAGG GACGAAGGCC AGGGGAGCAA ACCGGATTAG 720 ATACCCGGGT AGTCCTGGCT GTAAAGGATG CGGGCTAGGT GTCGGGTGAG CTTCGAGCTC 780 GCCCGGTGCC GTAGGGAAGC CGTTAAGCCC GCCGCCTGGG GAGTACGGCC GCAAGGCTGA 840 AACTTAAAGG AATTGGCGGG GGAGCACTAC AAGGGGTGGA GCGTGCGGTT TAATTGGATT 900 CAACGCCGGG AACCTCACCG GGGGCGACGG CAGGATGAAG GCCAGGCTGA AGGTCTTGCC 960 GGACACGCCG AGAGGAGGTG CATGGCCGCC GTCAGCTCGC ACCGTGAGGC GTCCACTTAA 1020 GTGTGGTAAC GAGCGAGACC CGCGCCCCCA GTTGCCAGCC CTTCCCGTTG GGAAGGGGGC 1080 ACTCTGGGGG GACTGCCGGC GATAAGCCGG AGGAAGGAGC GGGCGACGGT AGGTCAGTAT 1140 GCCCCGAAAC CCCCGGGCTA CACGCGCGCT ACAATGGGCG GGACAATGGG ATCCGACCCC 1200 GAAAGGGGAA GGGAATCCCC TAAACCCGCC CCCAGTTCGG ATCGCGGGCT GCAACTCGCC 1260 CGCGTGAAGC TGGAATCCCT AGTACCCGCG TGTCATCATC GCGCGGCGAA TACGTCCCTG 1320 CTCCTTGCAC ACACCGCCCG TCACTCCACC CGAGCGGGGT CTGGATGAGG CTCCGTCCTC 1380 TGGGCGGGGT CGAGTCCGGG CTCCGTGAGG GGGGAG 1416

【０１１１】 配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTCCGGTTGA TCCYGCCGGA 20

【０１１２】 配列番号：３ 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGTTACCTTG TTACGACTT 19

【０１１３】 配列番号：４ 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Gly Val Ser Pro Ser Tyr Pro Ala Gly Asp Pro Gln Thr Trp Val Ile 1 5 10 15 Tyr Gln Ile Val Ile 20

【０１１４】 配列番号：５ 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TAYCCNGCNG GNGAYCCNCA RACNTGGGTN ATHTAYCARA TDGTNAT 47

【０１１５】 配列番号：６ 配列の長さ：2340 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：Thermococcus sp. 株名：B-1001 配列 TATCATTAAT AGTGATACAT TATTAATAGT GATACATTTT TGGAGGGAGA TGACATGAGA 60 AGCAGAAAGA TTTATATGCT TGTTGTATTG CTTCTTTTTT TAGGATTTAG TGAACAAATT 120 TCAACAGTAG CTGCAGGGGT CAGTCCCTCA TATCCAGCAG GGGATCCCCA GACATGGGTT 180 ATCTACCAAA TAGTCATTGA TAGATTTTAC GATGGGAACA CCTCAAACAA TGATCCATTA 240 AAAAGTCCAG GATTATATGA TCCAAACAAA GAGAACTGGA AGCTTTATTG GGGCGGTGAT 300 TTAGAGGGCA TCATAGCAAA GCTGCCCTAC TTATATGAAC TTGGAGTGAG TGCCATATGG 360 ATTTCTCCAG TGTTTGATAA TATAGATGTT CCTATCAATG GAAGCAATGG TCTAGAGGCG 420 GGGTATCATG GGTATTGGCC AAAGGACTTT AAGGTTATAG AAGAGCACTT TGGGACATGG 480 GAAATATTCC GCAGACTTAG TCAAGAAGCA GCCAAGTACA ATATCACGAT TATAATTGAC 540 TTCGTTCCAA ACCACAGCAA TCCCAATGAT GCGGGCGAGT ATGGAGCTCT ATATGATAAT 600 GGCACGTTTG TTATTGATTA TCCAACGGAT GCAAATTATG CGACTGTTCA CCCAATAACA 660 AAGAGTTTAT CGTACATATA CAATCACAAT GGAGGAATAA CAAATTGGAA TGATAGATGG 720 GAAGTCAGAT ATAAAAATCT CTTTAATCTG GCTGATCTTA ATCAGTTGAA TCCATGGGTG 780 GACAATTATC TTAAAGAATC GACAGTATCT TACTTAGAAG CTGGAATTGG AGGAATAAGA 840 ATAGATGCAG TTAAACACTT AGAGCCTGGA TGGCTCAAAA CTTATGCAGA CTATGTATAT 900 GCAAGAAAGA ACGTATTTAT GTTTGGAGAA TGGTACCAGG GCTTTAACGA TGAGATGTAC 960 TGGGATATGG TTAAGTTTGC AAACTATACG GGGATAGGCC TTATTAACAT CCCACTCCAA 1020 CAAGTTCTCG TTGATGTTTT TGCTTATGAT ACAAAGACTA TGTGGGACTT GGAAAGCGCT 1080 GTTAATAAAT ATACCATTGA CTTTATGTGG CAAAATAAAC TAACTATATT CGTAGACAGC 1140 CACGATGTTC CAAGATTTCT GTCCTTGAGA AATGACTTAA TAAGATTTCA CCAAGCTCTT 1200 GCTTTTGTTC TAACCGCTCC TGGAATTCCA ATAATCTATT ACGGTGATGA ACAATATCTT 1260 CACAATGATA CTGTAAATGA CTTTGGTCAA GTTGGAGGTG ACCCATATAA TAGACCTATG 1320 ATGAAAACTT GGAACACATC AACAACCGCT TTTAAACTAA TAAAGACTCT CGCAAGTCTG 1380 AGACGCTATA ATCCTGCTTT AGCTTATGGA TTGATCGCGA CAAGGTATGT AAGCGATGAC 1440 ATTTACATCT TTGAAAGAAA GTTCTTTGAT AACGTTGTTC TCGTAGCAAT AAATCGCAAT 1500 TTAAATTCTC CATATGTGGT CTCTAACGTT TACACCTCCC TACCAGATGG AAGTTACAAT 1560 GACTACCTTG GAGGACTTTT GAACGGAGTT GGAATAACGG TTTCATCTGG TACATTCTCT 1620 GTAGAGTTAC CTGCAGGTTC AGTATCAGTA TGGCAGTACA AAGCAACGCC GACTGATCCA 1680 TGGGTAGGAG CAATTGATCC AGTTATGGGA AGAGCTGGAA ACATTGTCAC AGTTAGTGGA 1740 GAAGGGTTTG GGGATGTTCC GGGAAGAGTC TTAATAACAA ATGGACAAGA TTACTGGACT 1800 GCAGAAGTTA CATATTGGAG CGATAAAAGC GTAGAGTTCA TAGTTCCTTC AGGAATAACT 1860 ACCCAACTAA ACGAAAATCA TGTTGAAGTC AGAATTGAAA GGGCTGATGG GGCTACATCA 1920 AATGGAATAG CCTTTGAATA TCTAACGAAC AAACAAATTC CAGCTATTTT TGAAGTTAGG 1980 AACACTCAAG GTACAAATTT AGAAACCCAA GTTGGAGAAT TTTTATGGCT AACAGGTAGT 2040 GTTCCAGAGT TGAGCTATTG GAGTCCAGAA ACAATAAAAG CTGTTGGACC AATGTTGTGT 2100 CCAGGATGGC CTGATTGGTT TGTTGTAGCA AGTGTCCCGG CGGATACCTA TATAGAGTTC 2160 AAGTTCTTAA AGGCACCGCT TGGAGGCACT GGAATCTGGG AAGTAGGAAG CAATCACGCA 2220 TACCTAACAC CTTCAAGCGG AATAGGGGAA GTTTCAGTTG AAGCCAACCG TTGATATTCT 2280 TTTTTATTAT TCTTATTGCA TCTATTTGAC ATTATTGTAT TGTTTAGTTC ATATGTCAAT 2340

【０１１６】 配列番号：７ 配列の長さ：739 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Arg Ser Arg Lys Ile Tyr Met Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Leu 1 5 10 15 Gly Phe Ser Glu Gln Ile Ser Thr Val Ala Ala Gly Val Ser Pro Ser 20 25 30 Tyr Pro Ala Gly Asp Pro Gln Thr Trp Val Ile Tyr Gln Ile Val Ile 35 40 45 Asp Arg Phe Tyr Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Asp Pro Leu Lys Ser 50 55 60 Pro Gly Leu Tyr Asp Pro Asn Lys Glu Asn Trp Lys Leu Tyr Trp Gly 65 70 75 80 Gly Asp Leu Glu Gly Ile Ile Ala Lys Leu Pro Tyr Leu Tyr Glu Leu 85 90 95 Gly Val Ser Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Phe Asp Asn Ile Asp Val 100 105 110 Pro Ile Asn Gly Ser Asn Gly Leu Glu Ala Gly Tyr His Gly Tyr Trp 115 120 125 Pro Lys Asp Phe Lys Val Ile Glu Glu His Phe Gly Thr Trp Glu Ile 130 135 140 Phe Arg Arg Leu Ser Gln Glu Ala Ala Lys Tyr Asn Ile Thr Ile Ile 145 150 155 160 Ile Asp Phe Val Pro Asn His Ser Asn Pro Asn Asp Ala Gly Glu Tyr 165 170 175 Gly Ala Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Phe Val Ile Asp Tyr Pro Thr Asp 180 185 190 Ala Asn Tyr Ala Thr Val His Pro Ile Thr Lys Ser Leu Ser Tyr Ile 195 200 205 Tyr Asn His Asn Gly Gly Ile Thr Asn Trp Asn Asp Arg Trp Glu Val 210 215 220 Arg Tyr Lys Asn Leu Phe Asn Leu Ala Asp Leu Asn Gln Leu Asn Pro 225 230 235 240 Trp Val Asp Asn Tyr Leu Lys Glu Ser Thr Val Ser Tyr Leu Glu Ala 245 250 255 Gly Ile Gly Gly Ile Arg Ile Asp Ala Val Lys His Leu Glu Pro Gly 260 265 270 Trp Leu Lys Thr Tyr Ala Asp Tyr Val Tyr Ala Arg Lys Asn Val Phe 275 280 285 Met Phe Gly Glu Trp Tyr Gln Gly Phe Asn Asp Glu Met Tyr Trp Asp 290 295 300 Met Val Lys Phe Ala Asn Tyr Thr Gly Ile Gly Leu Ile Asn Ile Pro 305 310 315 320 Leu Gln Gln Val Leu Val Asp Val Phe Ala Tyr Asp Thr Lys Thr Met 325 330 335 Trp Asp Leu Glu Ser Ala Val Asn Lys Tyr Thr Ile Asp Phe Met Trp 340 345 350 Gln Asn Lys Leu Thr Ile Phe Val Asp Ser His Asp Val Pro Arg Phe 355 360 365 Leu Ser Leu Arg Asn Asp Leu Ile Arg Phe His Gln Ala Leu Ala Phe 370 375 380 Val Leu Thr Ala Pro Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln 385 390 395 400 Tyr Leu His Asn Asp Thr Val Asn Asp Phe Gly Gln Val Gly Gly Asp 405 410 415 Pro Tyr Asn Arg Pro Met Met Lys Thr Trp Asn Thr Ser Thr Thr Ala 420 425 430 Phe Lys Leu Ile Lys Thr Leu Ala Ser Leu Arg Arg Tyr Asn Pro Ala 435 440 445 Leu Ala Tyr Gly Leu Ile Ala Thr Arg Tyr Val Ser Asp Asp Ile Tyr 450 455 460 Ile Phe Glu Arg Lys Phe Phe Asp Asn Val Val Leu Val Ala Ile Asn 465 470 475 480 Arg Asn Leu Asn Ser Pro Tyr Val Val Ser Asn Val Tyr Thr Ser Leu 485 490 495 Pro Asp Gly Ser Tyr Asn Asp Tyr Leu Gly Gly Leu Leu Asn Gly Val 500 505 510 Gly Ile Thr Val Ser Ser Gly Thr Phe Ser Val Glu Leu Pro Ala Gly 515 520 525 Ser Val Ser Val Trp Gln Tyr Lys Ala Thr Pro Thr Asp Pro Trp Val 530 535 540 Gly Ala Ile Asp Pro Val Met Gly Arg Ala Gly Asn Ile Val Thr Val 545 550 555 560 Ser Gly Glu Gly Phe Gly Asp Val Pro Gly Arg Val Leu Ile Thr Asn 565 570 575 Gly Gln Asp Tyr Trp Thr Ala Glu Val Thr Tyr Trp Ser Asp Lys Ser 580 585 590 Val Glu Phe Ile Val Pro Ser Gly Ile Thr Thr Gln Leu Asn Glu Asn 595 600 605 His Val Glu Val Arg Ile Glu Arg Ala Asp Gly Ala Thr Ser Asn Gly 610 615 620 Ile Ala Phe Glu Tyr Leu Thr Asn Lys Gln Ile Pro Ala Ile Phe Glu 625 630 635 640 Val Arg Asn Thr Gln Gly Thr Asn Leu Glu Thr Gln Val Gly Glu Phe 645 650 655 Leu Trp Leu Thr Gly Ser Val Pro Glu Leu Ser Tyr Trp Ser Pro Glu 660 665 670 Thr Ile Lys Ala Val Gly Pro Met Leu Cys Pro Gly Trp Pro Asp Trp 675 680 685 Phe Val Val Ala Ser Val Pro Ala Asp Thr Tyr Ile Glu Phe Lys Phe 690 695 700 Leu Lys Ala Pro Leu Gly Gly Thr Gly Ile Trp Glu Val Gly Ser Asn 705 710 715 720 His Ala Tyr Leu Thr Pro Ser Ser Gly Ile Gly Glu Val Ser Val Glu 725 730 735 Ala Asn Arg

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】B-1001株とThermococcus celerとの相同性を
示す図面である。

【図１Ｂ】B-1001株とThermococcus celerとの相同性を
示す図面である。

【図２】本発明の粗精製酵素の各pHにおける相対活性を
表すグラフである。

【図３】pH5.0での各温度における粗精製酵素の相対活
性を表すグラフである。

【図４】pH5.0、90℃にて種々の時間保温した後の粗精
製酵素の残存活性を示すグラフである。

【図５】pH5.0にて40分間、種々の温度で保温した後の
粗精製酵素の残存活性を示すグラフである。

【図６】本発明の精製酵素の各pHにおける相対活性を表
すグラフである。

【図７】pH5.0での各温度における精製酵素の相対活性
を表すグラフである。

【図８】pH5.0にて40分間、種々の温度で保温した後の
精製酵素の残存活性を示すグラフである。

【図９】HPLC分析の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 倉村 昭子 兵庫県神戸市西区室谷２丁目２番３号 長 瀬産業株式会社研究開発センター内 (72)発明者 藤原 伸介 兵庫県西宮市田近野町３番 仁川合同宿舎 ６−302号 (72)発明者 高木 昌宏 大阪府吹田市青山台１−３ Ｃ58−207 (72)発明者 今中 忠行 大阪府吹田市藤白台２丁目28番11号 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA10 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA20 4B050 CC03 DD02 EE03 FF05E LL01 LL02 LL05 4B064 AF15 CA02 CA19 CA21 CC03 CC06 CC07 CC24 CD19 DA01 DA10 DA11 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC02 AC14 BA02 BA22 CA31 CA41 CA44 CA47 CA50

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サイクロデキストリン生成酵素であっ
   て、配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸28〜739、ま
   たは配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸28〜739にお
   いて１または数個の置換、欠失、もしくは付加を有し、
   かつこのアミノ酸配列を有するサイクロデキストリン生
   成酵素と等価なサイクロデキストリン生成酵素活性を示
   す、酵素。
2. 【請求項２】 超好熱菌Thermococcus属に属する微生物
   から得られる、請求項１に記載のサイクロデキストリン
   生成酵素。
3. 【請求項３】 超好熱菌Thermococcus sp. B-1001株か
   ら得られる、請求項１または２に記載のサイクロデキス
   トリン生成酵素。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のサイク
   ロデキストリン生成酵素をコードする、DNA。
5. 【請求項５】 配列番号６のヌクレオチド配列のヌクレ
   オチド136〜2271を有するか、または配列番号６のヌク
   レオチド配列のヌクレオチド136〜2271において１また
   は数個の置換、欠失、もしくは付加を有する、請求項４
   に記載のDNA。
6. 【請求項６】 請求項４または５に記載のDNAを含む、
   発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の発現ベクターを含む、
   組換え宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の組換え宿主細胞を培養
   する工程、および培養物からサイクロデキストリン生成
   酵素を回収する工程を包含する、サイクロデキストリン
   生成酵素の生産方法。
9. 【請求項９】 請求項１〜３のいずれかに記載のサイク
   ロデキストリン生成酵素を40 W/V％以下の濃度のデンプ
   ンスラリーに添加し、デンプンの液化とサイクロデキス
   トリンの生産を同時に行う、サイクロデキストリンの製
   造方法。