KR960013463B1 - α-CG타아제 - Google Patents

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Abstract

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Description

γ-CG타아제
제1도는 호알칼리성 균주 바실러스 293-3의 γ-CG타아제에 대한 β- 및 γ-시클로덱스트린의 생산속도를 나타낸 그래프.
제2도는 호알칼리성 균주 바실러스 293-3의 γ-CG타아제의 전사해독프레임(open reading frams)배열도.
제3도는 γ-CG타아제의 과잉발현에 사용된 tac 프로모터 플라스미드 pTF 118u.
제4도는 합성 올리고뉴클레오티드 M8 및 M9 배열도.
제5도는 발현 플라스스미드 pCM750.
제6도는 합성 올리고뉴클레오티드 M10,M11,M12 및 M13 배열도.
제7도는 플라스미드 pCM720.
이 발명은 γ-시클로덱스트린을 생산하는 시클로덱스트린 글리코실 트랜스페라아제에 관한 것으로, 그 트랜스페라아제는 기질로서 전분에 의해 1차적으로 γ-시클로 덱스트린을 형성하고 2차 생성물로서 거의 전적으로 환식 올리고삭카라이드를 형성한다. 효소 시클로헥스트린 글리코실 트랜스페라아제(아래에서는 약어로 CG타아제라함 : CGTase)E.C. 2.4.1.19는 전분으로부터 시클로덱스트린의 형성을 촉매에 의해 촉진시킨다.
시클로덱스트린(CD)을 구성하는 글루코오스 단위의 수에 따라 α-CD(6-클루코오스 단위), γ-CD(7 글루코오스 단위) 및 β-CD(8 글루코오스 단위)로 분류된다.
종래의 두가지 타입의 CG타아제가 아래와 같이 공지되어 있다.
a) 예로서 바실러스 마세란스(Bacillus macerans)(영국특허 제2169902호), 클레브시엘라 프노이모니애(klebsiella pneumoniae)(유럽특허공개 제220714호) 및 바실러스 스테아로테르모필러스(Bacillus stearothermophilus)(영국 특허제 2169902호)의 CG타아제 등 α-시클로 덱스트린을 형성하는 CG타아제, α-CG타아제 라고도 함.
b) 예로서 바실러스 시르쿨란스(Bacillus circulans)(미국특허 제 4,477,568호), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)(미국특허제 3812011호). 바실러스 오벤시스(Bacillus ohbensis)(일본특허제 74 124285호), 미크로콕커스 sp.(micrococcus sp). 유럽특허공개 제017 242호) 및 호알칼리성 바실러스 sp. (Bacillus sp). U.Gen. Microhiol. 1988, 134, 87-104 ; Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987, 26, 148-153)의 CG타아제 등 β-시클로덱스트린을 형성하는 CG타아제 또는 β-CG타아제 γ-CG타아제에 대하여 종래에는 문헌중에서 2가지가 기재되어 있다 :
a) 바시러스 sp의 시클로덱스트린 글리코실트란스페라아제에는 EtOH를 첨가할때 주로 β- 및 γ-시클로 덱스트린(10.4~18.7%)의 혼합물을 제조하였다(일본특허에 63,133,998호). 그 효소는 그 동력학적 특성에 대하여 특징이 없기 때문에 특별한 타입으로 분류할 수 없었다.
b) 2종의 논문(Agric. Biol. chem., 1986, 50, (8), 2161-2162 및 Denpun. kagaku 1986, 33, 13)에서서는 바실러스 섭틸리스(Bacilles subtilis)NO. 313의 γ-CG타아제에 대하여 기재되어 있다.
이 CG타아제는 γ-시클로덱스트린과 선형 올리고삭카라이드의 형성에 그 특징이 있다. CG타아제은 전분에서 환식생성물만을 생성하기 때문에 이 CG타아제는 α-아밀라아제(전분에서 선형올리고삭카라이드를 생성) 및 CG타아제의 전이형(transitional form)이 해당된다.
이 γ-CG타아제는 낮은 수율만을 얻을 수 있기 때문에 γ-시클로덱스트린의 제조에 적합하지 않다(유럽특허공개 제327 099호, 2쪽 40-43행 참조). 따라서, 이 발명의 목적은 주로 γ-CD를 생산하는 효소를 제조하는데 있다. 이 목적은 세균을 γ-CG타아제의 분비에 대해서 스크리닝(screening)하고, 이들의 세균의 특서을 명백하게 하며, 또 이 세균의 γ-CG타아제를 정제하고 생화학적으로 특성을 명백하게 함으로써 달성되었다.
이 발명에 의한 γ-시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제는 주로 γ-시클로덱스트린을 생산하는 γ-시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제이며, 그 트랜스페라아제는 기질로서 전분에 의해 일차적으로 γ-시클로덱스트린을 형성하고, 이차생성물로서 거의 전적으로 환식 올리고삭카라이드를 형성한다. 세균을 γ-CG타아제의 생산에 대하여 스크리닝(screening)하는데는 바람직하게는 전분-분해세균, 특히 바람직하게는 호알칼리성 전분분해 세균을 사용한다. 그 γ-CG타아제를 생산하는 세균특성을 명백하게 하기 위해서는 그 세균의 형상, 폭, 길이 및 운동성(motility)을 측정한다.
또, 그램반응에 의한 착색성(stainability), 카탈라아제(catalase)의 형성능력 및 GC함량을 측정한다.
더 나아가서, 서로 다른 온도, 서로 다른 pH 및 서로 다른 NaCl 농도에서 성장행동(growth behavior)을 측정한다.
그 효소는 γ-CG타아제를 정제한 후 생화학적 특성을 명백하게 한다.
예로서, 효소의 분자량, 최저 pH, pH 안정성, 최적온도 및 온도안정성을 측정한다. γ-CG타아제의 수율을 증가시키기 위하여 이것을 엔코딩하는 유전자(encoding gene)를 유전자공학적으로 수식하여(modify), 분비형 돌연변이체(secretor mutants)중에서 발현시킨다. 이를 위해 그 유전자를 에.콜리(E.Coli)중에서 클론화하는 것이 바람직하다. 그 다음 동정한 유전자(identified gene)를 프로모터(promoter), 바람직하게는 조절할 수 있는 프로모터(예로서, λP1,trp,lac 또는 trc 프로모터), 특히 바람직하게는 락토오스를 유도할 수 있는 tac 프로모터의 제어하에 배치한다.
이것에 의해 γ-CG타아제의 조절할 수 있는 과잉발현(over-expression)이 가능하다. 최적 분비를 위해서는 시그널 펩티드(signal peptide)의 사용이 바람직하다. 고유의 시그널 펩티드의 사용은 γ-CG 타아제 분비에 가장 적합하다. γ-CG타아제를 엔코딩하는 유전자 및 리더배열(leader sequence)과 함께, 조절성 요소, 예로서 tac 프로모터를 함유한는 벡터(vector)를, γ-CG타아제를 제조하기 위하여 미생물, 바람직하게는 에. 콜리(E.Coli), 특히 바람직하게는 에. 콜리의 분비형 돌연변이체중에 도입한다. 적합한 분비형 돌연변이체는 유럽특허 공개 제 338410허호에 기재되어 있는 방법에 의해 제조할 수 있다.
그 프로모터의 유도에 의해 락토오스 또는 IPTG에 관련되는 tac프로모터의 경우, 배지중에 그 γ-CG타아제의 과잉생산 또는 분비를 얻을 수 있다.
이 발명에 의한 단백질은 공지의 방법으로 분비형 돌연변이체(Secretor mutant)의 상중액(supernatant)에서 정제할 수 있다.
이 발명 명세서에 기재된 효소에 의해 초기에 γ-시클로덱스트린을 생산하고 기질로서 전분에 의해 처음에 γ-시클로덱스트린을 형성하며 2차 생성물로서 거의 전적으로 환식 올리고삭카라이드를 생산하는 CG타아제를 제조할 수 있다.
이 효소는 위에서 설명한 유전자공학적방법에 의해, 천연에서 유래하는 미생물보다 다량으로 얻을 수 있다.
이 효소를 사용하여, 미국특허 제4,822,874호의 방법에 의해 γ-시클로덱스트린의 제조시간을 현저하게 단축시킬 수 있다.
γ-시클로덱스트린은 수용액중에서 소수성물질의 용해도를 높이며, 불안정물질을 안정화하며(예로서 UV보호, 산화보호), 휘발성물질을 결합한다.
γ-시클로덱스트린은 처방화제(formulation agent)로서 사용할 수 있다.
γ-시클로덱스트린은 다음분야에 사용된다.
제제공업
식품공업
화장품
식물보호
화학공업
실시예에서는 이 발명에 의한 γ-CG타아제의 분리, 유전자공학적 수식(modification) 및 이 γ-CG타아제를 호알칼리성 세균 바실러스 290-3(DSM 5850 ; 1990년 3월 19일 독일 미생물 및 세포배양물 보호기관 DSM에 기탁)에서 과잉발현(over expression)하는 것에 대하여 기재한다.
γ-CG타아제-생산 호알칼리성 세균 스크리닝(screening)
광범위한 지역에서 토양시료를 채취하였다.
토양 0.1-0.2g을 평량하여 멸균용기내에서 멸균생리식염용액 1ml에 현탁시켰다. 거친 성분을 침전시켜 제거한 다음, 각각의 경우 0.1ml씩 전분한 천판(ctarch agar plate)(배지 1 : 10g/ℓ 가용성전분 : 5g/ℓ 펩톤 : 5g/ℓ 효모엑스 : 1g/ℓ KH2PO4: 0.2g/ℓ MgSO47H2O : 10g/ℓ Na2CO3: 15g/ℓ한천 : PH 10.4)상에 피복시켰다.
그 전분한천판을 2-3일간 30℃에서 배양하였다. 전분-분해 세균의 콜로니(colonies)는 자분자량의 전분분자의 열화(retrogradation)에 의해 생성한 현탁된 할로(cloudy halo)를 나타내었다. 그 콜로니를 분리시켜 전분한천판상에서 2회 정제하였다. 그 다음, 위조성의 액상배지 2ml중에 배양하였다. 30℃, 48시간 배양한후, 그 세포(cells)를 원심분리시켜 그 상승액을 γ-CG타아제 활성에 대하여 시험하였다. 상중액 20μl를 20mM 트리스/ HCl PH 9.0 ; 5mMCaCl2중에서 20% 전분용액 20μl와 함께 1-5시간 40℃에서 배양하였다. 효소반응을 메타놀 600μl를 첨가하여 정지시켰으며, 상증액을 원심분리시켜 HPLC에 의해 분석하였다.
다수의 분리체(solates)로부터 동력학적으로 우선적으로 γ-시클로덱스트린을 형성하는 CG타아제를 배지중에 석출하는 균주 바실러스 290-3을 분리하였다(제1도 참조).
[실시예 2]
균주 바실러스 290-3의 분류학적특성 명시
분류학적분류는 종래에 정확하게 특성을 나타낼 수 없었던 바실러스 퍼머스/렌터스(bacillus firmus/lentus)복합체로 분류할 수 있는 그람양성의 포자형성세균에 해당하는 것으로 나타내었다(표 1 참조).
[실시예 3]
γ-CG타아제의 정제
균주 바실러스 290-3을 초기에 배지 1(실시예 1)중에 배양하였다. 48시간 성장시킨 다음 그 세포(cell)를 원심분리에 이해 제거시킨 다음, (NH)2SO를 포화도 66%가 될때까지 그 배지상증액에 첨가하였다.
그 혼합물을 1시간 동안 4℃에서 저정한 다음 그 침전물을 원심분리에 의해 제거하였다. (10,000g, 20분). 그 침전물을 완충용액(buffer) A(20mM Tris/Cl-PH8.5 5mM CaCl, 0.05% γ-CD)의 초기용량의에 재현탁시키고, 또 동일하게 완충액에 대하여 투석하였다.
원심분리후(10분 ; 10,000g), 그 효소용액을 친화성컬럼(affinity column)(γ-시클로덱스트린이 세파로오스 6-B에 부틸디글리시딜에테르를 통하여 결합)에 처리하였다. 1%의 γ-시클로덱스트린 함유완충용액 A로 용리시켰다. 암모늄 설페이트 침전에 의해 용리단백질을 농축시켜, 다시 투석하였다. 그 단백질의 순도는 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(elec rophoresis)에 의해 조절하였다.
[실시예 4]
γ-CG 타아제의 생화학적 특성명시
그 γ-CG타아제의 생화학적 특성명시에 의해 다음의 결과를 얻었다.
분자량 75,000Da
최적 PH 6.0~8.0
PH안정성 5.0~1.0
최적온도 60℃
온도안정성 50℃이내
[실시예 5]
γ-CG타아제의 유전자의 클론화(cloning) 및 배열결정(sequencing)
클론화 : 균주 바실러스 290-3의 염색체 DNA를 부분적으로 제한효소 Sau 3A로 절단을 하였다(cleaved).
아가로오스 겔 전기영동에 의해 단편의 크기(fractionation)을 분획한 다음 이들의 DNA단편을 pUC18(BamHI-절단)중에 클론화하였다. 이 유전자뱅크(gene bank)의 2×104개의 클론(clones)을, 클로니-히브리디제이션 실험(colony-hybridization test)(Maniatis etal 1982, cold spring Harbor laboratory)에서 바실러스 1-1(Proc, 4th Int, symposium β-CG타아제의 코팅영역의 방사성표지를 한 1.6kb 크기의 DNA 프라그멘트(BgⅢ-PstⅠ)을 사용하여 분석하였다.
이때, 클론 P19및 P43이 고정되어, 이들의 플라스미든 γ-CG타아제 유전자를 포함하였다.
배열과정(squencing) :
γ-CG타아제 구조유전자의 뉴클레오티드 배열을 측정하기 위하여 DNA단편을 플라스미드 PUC18PUC19중에서 섭클론화(subcloning)하였다.
엑소뉴클리아제(exonuclease)Ⅲ를 사용하여 이들의 플라스미드 삽입단편중에 생거 디데옥시 연쇄개열법(sager dideoxy chain-termination method)에 의한 DNA 배열결정이 오버래핑(overlapping)하는 배열에 안내하도록 결실(deletions)을 발생시켰다(DNA, 1985, 生 165-170, γ-CG타아제를 코팅하는 전사해독프레임(open reading frame)은 2097개의 뉴크레오티드를 포함한다(제2도). 여기서 유도되는 단백질은 분자량(78,000Da를 가진 699개의 아미노산으로 구성된다. 시그날 펩티드를 절단한 후 분바량 75,000Da를 얻었다.
[실시예 6]
에. 콜리(E.Coli)중에서 γ=CG타아제의 발현 및 분비
tac프로모터 플라스미드 pJF118u(제3도)를 γ-CG타아제의 파잉발현에 사용하였다. 그 플라스미드를 제한효소 ECOR1와 HindⅢ으로 절단하고 아가로오스겔 전기영동을 통하여 그 작은 DNA단편을 폴리-링커(poly-linker)에서 분리하였다. 그 플라스미드 p19(실시예 5참조)를 제한효소 Accl 및 HindⅢ으로 절단시켰다. 또, 아가로오스겔 전기영동을 통하여 크기가 2.4kb인 DNA 단편을 분리하였으며, 이것은 γ-CG타아제의 구조 유전자를 거의 완전히 갖고 있다. 그 유전자의 5' 말단에서(제2도의 AccⅠ 사이트 참조) 시그널 펩티드를 코딩하는 단영역(short region)이 결손되어 있다. pJF118u의 EcoRⅠ-HindⅢ 프라그멘트와 p19의 올리고뉴클레오티드 페어(pair) M8과 M9 및 AccⅠ-HindⅢ 프라그멘트의 연결에 의해 발현 플라스미드 pCM750(제5도)이 생성되었다.
분비형 돌연변이체 에.콜리 WCM100을 플라스미드 PCM750에 의해 형질전환하여 그 형질전환한 균주를 완전배지(10g/ℓ펩톤 : 5g/ℓ 효모엑스 : 5g/ℓ NaCl : 10g/ℓCaCl2: 100mg/ℓ 암피실린)중에 30℃에서 배양하여 균주 바실러스 290-3에 의한 효소수율과 비교하여 500배 높은 γ-CG타아제 수율이 가능하였다.
[실시예 7]
γ-CG타아제의 수직(modification)
포스포르아미다이트(phosphoramidite)방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드페어 M10 및 M11,M12 및 M13을 합성하였다(제6도). 올리고 뉴클레오티드의 DNA 배열은 바실러스 1-1의 β-CG타아제의 N-말단아미노산배열을 코드화하며 Proc, 4th Int. symposium on cyclodextrins(HuberO, Szeitly J, des)1988. PP71-76, Kluwer Academic,) 또 SspⅠ절단부위까지의 DNA영역을 포함하는 γ-CG타아제의 N-말단범위와 동일하다(제2도 참조).
그 플라스미드 pCM750은 부분적으로 제한효소 ACCI으로 절단하였다. 그 다음 SSPI로 절단하였다. 크기 7.3kb의 DNA단편을 아가로오스겔 전기영동에 의해 분리하였다. 이 DNA단편과 2개의 스트랜드(strand)를 가진 올리고뉴클레이티드 M10, M11 및 M12, M13의 연결에 의해 카메라(chimeric) γ-CG타아제를 코팅하는 플라스미드 pCM720(제7도)이 생성되었다. 실시예 6에서와 같이 분비형 돌연변이체 에. 콜리 WCM100의 형질전환과 배양에 의해 γ-CG타아제수율은 실시예 6의 결과와 비교하여 2배 높았다.
[실시예 8]
γ-CG타아제를 사용하는 γ-시클로덱스트린의 제조
가용성전분 10g을 완충용액(10mmol/ℓ tris/HCl PH8.0 및 5mMMCaCl2)100ml에 넣어 그 전분을 95℃에서 5분간 가열하여 용해시켰다.
50℃로 냉각시킨 다음 γ-시클로덱스트린의 선택적인 착제(complexing agent)로서 시클로헥사데세논 1g을 첨가하였다. 그다음 γ-CG타아제 100u를 피페트(pipet)로 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 격열하게 교반시켜 반응온도를 50℃로 유지시켰다. 8시간의 반응시킨 후 사용한 전분에 대하여 γ-시클로덱스트린 48%의 최적수율을 얻었다.
대비 실시예 :
γ-CG타아제 대신 바실러스 마세란(bacillus macerans)의 γ-CG타아제 100U를 사용하는 것을 제외하고 실시예 5에서와 같이 실험을 하였다.
32시간 후 γ-시클로덱스트린의 최대수율 43%를 얻었다.

Claims (14)

  1. 바실러스(Bacillus)290-3(DSM 5850)의 γ-시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제(γ-cyclodextrin glycosyltransferase).
  2. 천연에서 유래되는 미생물에서 가능한 것보다 다량으로 취득할 수 있음을 특징으로 하는 제1항의 γ-시클로 덱스트린 글리코실트랜스페라아제의 아미노말단영역에서 수식된 유도체(modified derivatives).
  3. 바실러스(Bacillus)1-1의 β-CG타아제의 동일 아미노산을 엔코딩하는 DNA영역에 5'영역에서 치환되는 제1항에 의한 γ-시클로 덱스트린글리코실트랜스페라아제의 유전자에 의해 엔코팅시킴을 특징으로 하는 γ-시클로덱스트린글리코실트랜스 페라아제.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 의해 얻어지는 시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제를 엔코딩하는 발현 플라스미드(expression plasmids).
  5. a) 호알칼리성 전분분해 세균을 γ-CG타아제의 분비에 대하여 스크리닝(Screening)하고, b) 이들 세균을 분류학적 특성으로 명백히게 하며 (taxonomic characterization), c) 그 세균의 γ-CG타아제를 정제하고 생화학적으로 특성을 명백하게 하고, d) 그 γ-CG타아제의 유전자를 클론화(choning)하여 배열측정하며, e) 이 유전자를 충분히 성장한 단백질의 5' 영역을 엔코팅하는 영역에서 수식하고(modify), f) 이와 같이하여 수식된 유전자를 조절할 수 있는 프로모터(controllable promotor)의 제어하에 배치하여 세균에 도입시키고 그 유전자를 세균으로 증식시켜 유전자 생성물이 분리될 수 있도록 하고, g) 그 효소를 유도 및 발현 후 배지상증액으로부터 취득함을 특징으로 하는 γ-시클로헥스트린 글리코실트랜스페라아제의 취득방법.
  6. 제5항에 있어서, 위 e) 공정에서, 5' 영역을 엔코팅하는 영역은 또 다른 CG타아제의 동일영역을 엔코팅하는 역에 의해 대치시킴을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 사용한 또 다른 CG타아제의 동일 영역을 엔코팅하는 영역은 바실러스(Bacillus)1-1의 대응하는 영역을 엔코팅하는 영역임을 특징으로 하는 방법.
  8. γ-시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제의 조절할 수 있는 과잉발현(over expression)을 할 수 있게, 시그널 펩티드(siqnal peptide)를 사용하여 γ-시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제에 대하여 코딩하는 유전자를 유전자공학적으로 수식하여, 이와 같이 수식시킨 유전자를 분비형 돌연변이체중에서 발현시킴을 특징으로 하는 γ-시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 사용되는 γ-시클로덱스트린 글리코실 트랜스페라아제에 대하여 코딩하는 유전자는 제1항에 의한 γ-시클로 덱스트린 글리코실 트랜스페라아제에대한 유전자임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2도에 나타낸 아미노산 배열을 엔코팅하는 DNA.
  11. 제2도의 아미노산 75에서 아미노산배열을 포함하는 γ-시클로덱스트린 글리코실츠랜스페라아제를 엔코딩하는 DNA.
  12. 제2도에서 나타낸 아미노산 198에서 아미노산 214까지 및/또는 아미노산 238에서 아미노산 247까지 및/또는 아미노산 267에서 아미노산 275까지 및/또는 아미노산 336에서 아미노산 343까지의 아미노산 영역을 포함하는 γ-시클로덱스트린 글리코실트랜스페라아제를 엔코팅하는 DNA.
  13. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 의한 γ-CG타아제를 사용함을 특징으로 하는 γ-시클로덱스트린의 제조방법.
  14. 균주 바실러스(Bacterial strain Bacillus)290-3(DSM 5850).
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