KR20090020002A

KR20090020002A - 효소 또는 단백질의 안정화 방법 및 이에 의해 제공되는효소를 함유하는 외용제 조성물

Info

Publication number: KR20090020002A
Application number: KR1020070084361A
Authority: KR
Inventors: 김무성; 이상린
Original assignee: 충청북도
Priority date: 2007-08-22
Filing date: 2007-08-22
Publication date: 2009-02-26

Abstract

본 발명은 효소 또는 단백질의 안정화 방법 및 이에 의해 제공되는 효소를 함유하는 외용제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 안정화제로 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 사용하여 효소 또는 단백질을 안정화시키는 방법에 있어서, 상기 글루칸의 분자량을 조절한 다음, 알칼리 처리를 수행하는 전처리 단계를 포함하는 안정화 방법과, 이러한 방법에 의해 안정화된 외용제 조성물에 관한 것이다.

상기 방법은 종래 방법에 비하여 안정화 변화폭을 감소시켜 산업적으로 유용하게 균일화된 안정화 효소의 제조가 가능해진다. 또한 이러한 방법으로 안정화된 단백분해효소 및 리소짐을 함유하는 외용제 조성물은 각각의 효소가 갖는 각질제거, 세포재생 등 효과의 상승작용으로 주름제거, 노화방지의 효과를 장시간 동안 안정하게 제공할 수 있는 장점이 있다.

효소, 안정화, 분자량 조절, 알칼리, 글루칸, 외용제

Description

효소 또는 단백질의 안정화 방법 및 이에 의해 제공되는 효소를 함유하는 외용제 조성물{METHOD FOR STABILIZING ENZYMES OR PROTEINS, AND COMPOSITIONS FOR EXTERNAL APPLICATION CONTAINING ENZYMES STABILIZED THEREBY}

본 발명은 효소 또는 단백질의 안정화 방법 및 이에 의해 제공되는 효소를 함유하는 외용제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 안정화 변화폭을 감소시켜 산업적으로 유용하게 균일화된 안정화 효소의 제조를 가능케 하고, 효소가 갖는 효과를 장기간 동안 안정하게 제공할 수 있는 효소 또는 단백질의 안정화 방법 및 이에 의해 제공되는 효소를 함유하는 외용제 조성물에 관한 것이다.

효소는 모든 생체기작에 있어서 직접적 촉매 작용을 하거나 정보전달을 하는 물질로서, 그 종류 및 효과가 다양하므로, 의약, 식품, 섬유 등 여러 분야에서 광범위하게 사용되어 왔다.

그러나 이러한 기본적인 기능성에도 불구하고 구조적 불안정성에 의해 사용상 많은 제약을 받아왔다.

특히 화장품 등과 같은 외용제 분야에서는 장기간 보존의 문제, 피부자극의 문제, 피부에서의 작용성의 문제, 제조의 용이성 문제 등과 같은 문제점으로 인하 여 아직까지 충분히 활용되지 못하고 있는 실정이다.

이러한 문제해결의 일환으로 산업적으로 이용되는 고정화 방법 또는 화학적 변형 방법의 적용 및 개선이 진행되고 있다. 그러나 화장품 등과 같은 외용제에 적용하기에는 아직까지 미흡한 상태로 이를 개선하기 위한 적절한 재료 및 결합방법의 선정이 지속적으로 요구되고 있다.

현재까지 이러한 효소 또는 단백질을 고정화 또는 안정화시키는 방법으로 알려진 예는 다음과 같다.

미합중국특허 제4,556,554호는 효소를 기능성 폴리머에 고정 및 결합시키는 방법에 의해 고정화된 효소를 함유하는 피지 억제용 화장료 조성물을 개시하고 있다. 상기 특허에서 제시하는 고정화 방법은 일반적인 고정화 방법으로서, 실제 문제해결을 위한 특정적인 방법을 제시하지 못하고 있다.

또, T. Masunaga 등(IFSCC, Yokohama, A205, p483-501)에 단백분해효소에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)등을 화학 결합시켜 안정도 및 자극도를 개선하는 방법을 제안하고 있다. 이 방법은 장기간 보존하는데 있어서 문제가 있으며, 제조방법 또한 복잡하다.

미합중국특허 제5,230,891호는 덱스트란, 알긴산, 카라게닌 등의 폴리사카라이드와 삼염화시아누르(cyanuric trichloride)를 반응시켜 트리아진-링이 결합된 폴리사카라이드를 얻고, 이를 프로테아제와 반응시켜 프로테아제를 안정화시키는 방법을 언급하고 있다. 그러나 이러한 방법은 여전히 제조방법이 복잡한 문제를 해소하지는 못하였다.

유럽특허 제0,803,257 A2호와 일본특허공개 평 4-141097호에 각각 다당류산화에 의한 단백질결합방법으로 효소를 안정화시키고, 이를 의약용 기구의 개선, 반응기 표면의 흡착억제 등에 포괄적으로 응용한 것이 개시되어 있으나, 안정도의 제시가 미비하여 화장품 등과 같은 외용제로서의 직접적인 응용에는 무리가 있다.

대한민국등록특허 제10-0283848호는 베타-1,6-분지 베타-1,3 글루칸에 효소 또는 단백질을 결합하여 화장품에 적합한 안정화 효소를 제안하고 있다. 이 방법은 글루칸의 분자량, 3차구조 등 구조적 다양성에 의존하여 안정화 반응의 변화가 매우 심하며 따라서 산업적으로 균일한 안정화 효소를 제조하는 데에 단점을 가지고 있다.

이에, 본 발명자들은 효소 뿐만 아니라 단백질을 안정화시켜 화장품 등과 같은 외용제로서 사용하는데 있어서의 상기한 문제점을 해소하기 위하여 예의 연구하였으며, 그 결과 효소 또는 단백질에 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 안정화제로 사용하는 경우, 글루칸의 분자량을 조절하고 알칼리 처리하여 3중 나선구조를 분리하는 것이 안정도를 균일하고 효과적으로 제공한다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 효소 또는 단백질을 보다 효과적으로 안정도 변화가 적도록 안정화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 방법에 의해 안정화된 효소 또는 단백질을 포함하는 주름개선 및 노화방지용 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 안정화제로 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 사용하여 효소 또는 단백질을 안정화하는 방법에 있어서,

상기 글루칸의 분자량을 조절한 다음, 알칼리 처리에 의해 3중 나선구조를 단일 나선 또는 불규칙코일(random coil) 형태로 변형시키는 전처리 단계를 수행하는 효소 또는 단백질의 안정화 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법에 의해 안정화된 효소 또는 단백질을 포함하는 피부 개선 및 노화방지 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 이용하여 효소를 안정화시킬 때 글루칸의 분자량 조절 및 알칼리 처리에 의해 효소 또는 단백질의 안정화의 변화폭을 감소시켜 산업적으로 유용하게 적용이 가능하다.

이러한 안정화된 효소 또는 단백질을 함유하는 외용제 조성물은 각각의 효소가 갖는 효과를 장시간 동안 안정하게 제공할 수 있으며, 특히 단백분해효소와 리소짐을 혼합하여 사용할 경우 주름개선 및 피부노화방지에 효과적인 조성물을 제공할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 언급된 글루칸은 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 의미한다.

또한 본 명세서 전체에 걸쳐 기재된 %는 그 의미를 특정하지 않는 한 중량%를 의미한다.

또한 본 명세서 전체에 걸쳐 기재된 분자량은 그 의미를 특정하지 않는 한 중량평균분자량(Mw)을 의미한다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 안정화제로 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸(이하 '글루칸'이라 한다)을 사용하여 효소 또는 단백질을 안정화하는 방법에 있어서, 상기 글루칸을 전처리하여 효소 또는 단백질과 결합 반응을 수행하여 이들을 안정화시킨다.

글루칸은 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸으로, 그 종류가 특별히 한정되지 않지만, 대표적으로 치마버섯(Schizopyllum commune)에 의해 생산된 시조필란(schizophyllan), 스클레로티니아 속(Sclerotinia sp.) 균주에 의해 생산된 스클레로글루칸(scleroglucan) 등을 포함한다.

상기 글루칸은 수용액 상에서 중성이며, 3중 나선(triple helix) 구조를 갖는 견고한 형태이고, 화학반응 방법에 따라 베타-1,6-잔기에만 반응기를 만들어 효소를 결합시킬 수 있다.

이러한 글루칸은 기원 또는 가공방법에 따라 2,000,000∼6,000,000 (달톤) 정도의 다양한 분자량을 가질 수 있으며 3중 나선 구조의 상태에 따라 다양한 3차 구조 및 유연성을 갖게 된다. 즉, 다양한 구조의 글루칸을 사용하게 됨으로써 효소 또는 단백질과 결합시 안정도, 결합도, 작용성 등에 영향을 주어 산업적으로 균일한 안정화 효소를 생산하는 데에는 큰 제약을 받게 된다.

특히 본 발명에서는 글루칸을 전처리하는데, 이러한 전처리는 글루칸의 분자량을 조절한 다음, 상기 분자량이 조절된 글루칸을 알칼리 처리에 의해 3중 나선구조를 단일 나선 또는 불규칙코일(random coil) 형태로 변형시키는 단계를 거친다.

글루칸은 전술한 바와 같이 2,000,000∼6,000,000 (달톤)의 분자량을 가지는데, 본 발명에서 안정화제로 사용하고자 하는 글루칸은 분자량이 500,000∼800,000 (달톤)의 범위를 갖도록 한다.

글루칸은 분자량이 높을수록 점도나 견고성(rigidity)이 커지는데 이는 안정 화제로 사용시 안정화도에 영향을 준다. 본 발명에서는 상기와 같은 범위로 글루칸의 분자량을 조절하여 효소 또는 단백질 안정화시 안정화도를 최적화한다. 만약 상기 글루칸의 분자량이 상기 범위 미만이면 효소 또는 단백질 안정화시 안정화도가 떨어지는 단점이 있고, 상기 범위를 초과하면 본 특허의 주목적인 안정화 변화도가 커지는 단점이 있다.

상기 분자량 조절은 글루칸을 고압균질기(high pressure homogenizer)에 주입하여 반복통과하는 방법, 초음파 분쇄기로 처리하는 방법, 베타-글루카나제 효소로 처리하는 방법, 및 산 또는 알칼리로 처리하는 방법 중 1종의 방법이 가능하다.

일예로 고압균질기를 사용하는 경우 0.01∼2 중량%, 바람직하기로 0.5 중량% 농도의 글루칸 용액을 고압균질기에 주입한 후, 4∼60 ℃에서 바람직하게는 20∼40 ℃에서, 압력 10,000∼30,000 psi에서 바람직하게는 10,000∼20,000 psi로, 1∼5회 반복통과, 바람직하게는 2∼3회 처리하여 분자량을 조절한다.

이외에 상기 글루칸의 분자량 조절은 10,000∼100,000 rpm에서 초음파분쇄기(sonicator)를 사용하여 수행하거나, 0.1∼10% 농도의 베타-글루카나제(beta-glucanase) 효소를 사용하거나, 0.1N∼5N의 산, 알칼리 처리가 가능하다. 그러나 고압균질기 이외의 것은 글루칸 분자량 조절의 균일성이 떨어지는 단점이 있어 글루칸의 1차 구조에 영향이 적은 고압균질기를 사용하는 것이 바람직하다.

다음으로, 상기 분자량이 조절된 글루칸에 알칼리를 첨가하여 반응기 내 pH를 11∼13, 바람직하기로 12가 되도록한 다음, 교반한다.

상기 알칼리로는 NaOH, KOH 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 을 0.1∼10 N의 농도로 사용한다. 이러한 반응은 4∼25 ℃. 바람직하기로 7∼10℃에서 3∼24 시간, 바람직하기로 5∼7시간 동한 균일하게 교반한다.

이미 언급한 바와 같이 글루칸은 수용액상에서 부분적으로 3중 나선 구조를 가지는데 이는 글루칸에 견고성을 부여하나 유연성을 적게 하는 측면이 있다. 보다 균일한 반응기를 가지고 균일한 물리적 상황에서 효소와 반응하기 위해서는 3중 나선을 분리시키는 작업이 필요하며, 이에 본 발명에서는 상기와 같이 알칼리 처리를 수행하여 3중 나선구조의 글루칸을 단일 나선 또는 불규칙코일(random coil) 형태로 변형시킨다.

전술한 바의 전처리를 통해 얻어진 글루칸은 불규칙하고 견고한 구조에서 유연한 구조를 가져 이를 안정화제로서 효소 또는 단백질과 결합반응을 수행하는 경우 안정도의 변동이 훨씬 적은 균일한 안정화 효소 또는 단백질의 제조가 가능해진다.

이하 글루칸을 효소 또는 단백질을 안정화할 수 있는 안정화제로서의 사용은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 통상의 알데히드-아미노기 반응을 이용한 이 분야에서 공지된 방법에 적용될 수 있다.

대표적으로, 효소 또는 단백질의 안정화 방법은

S1) 본 발명에 의해 전처리된 글루칸을 과요오드산염류와 반응시키는 단계;

S2) 상기 반응액의 잔류 과요오드산염류를 제거하는 단계;

S3) 상기 단계의 용액에 효소 또는 단백질을 0.001∼10.0 중량%의 양으로 첨가하는 단계;

S4) 상기 단계의 용액에 0.0001∼1.0 중량%의 환원제를 첨가하는 단계;

S5) 상기 단계의 용액을 세척하는 단계를 포함한다.

먼저, 단계 S1)에서는 본 발명에 의해 전처리된 글루칸을 과요오드산염류와 반응시킨다.

본 단계는 글루칸중의 베타-1,6 잔기를 알데히드로 만들어 효소 또는 단백질과 결합시키기 위한 단계로서, 글루칸 용액을 중화시키고 즉시 과요오드산염류를 바람직하게는 2∼5 몰 당량으로 첨가한 후, 암소에서 교반하여 반응시킨다.

이때 과요오드산염류로는 특별히 한정되지 않지만, 예들 들면 과요오드산(HIO₄, H₅IO₆), 과요오드산나트륨(NaIO₄, Na₃H₂IO₄), 과요오드산칼륨(KIO₄)등을 사용할 수 있다.

추가로 상기 방법에서 글루칸을 과요오드산염류와 반응시킨 후, 산화반응을 정지시키기 위하여 에틸렌글리콜을 0.01∼10.0 중량%의 양으로 더 첨가할 수 있다.

다음으로, 단계 S2)에서는 이전 단계의 반응액 중에 글루칸과 반응하지 않고 남아 있는 과요오드산염류를 제거한다.

상기 과요오드산염류의 제거는 분자량 한계(molecular cut off)가 1,000∼500,000 (달톤), 바람직하게는 10,000∼100,000 (달톤)인 막을 사용하여 투석(dialysis) 또는 한외여과(ultrafiltration)하여 수행한다.

다음으로, 단계 S3)에서는 상기 단계에서 얻어진 글루칸 용액에 효소 또는 단백질을 전체 조성 중 0.001∼10.0 중량%, 바람직하게는 0.01∼5.0 중량%의 함량 으로 첨가한다.

그 결과 글루칸 중 베타-1,6-잔기의 알데히드와 효소 또는 단백질의 아미노기가 결합하여 쉬프 염기(schiff's base)가 형성된다.

본 발명에서 글루칸에 의해 안정화될 수 있는 효소 또는 단백질은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 효소로는 파파인(papain), 브로멜라인(bromelein), 키위(kiwi)유래 단백분해효소, 세균성 프로테아제(bactrial protease) 등과 같은 단백분해효소류; α-아밀라제(amylase), 글루코아밀라제(glucoamylase), 셀룰라제(cellulase), 펙티나제(pectinase), α-글루코시다제(glucosidase), β-글루코시다제, β-글루카나제(glucanase), 키티나아제(chitinase), 만난분해효소(mannannase) 등과 같은 탄수화물분해효소류; 포스포리파제(phospholipase), 트리아실글리세롤분해효소(triacylglycerol hydrolase)와 같은 지방분해효소류; 데옥시리보핵산분해효소(DNAase), 리보핵산분해효소(RNAase)와 같은 핵산분해효소류; 인산분해효소류(phosphatase); 리소짐(lysozyme); 카탈라제(catalase); 과산화물 디스뮤테이즈(superoxide dismutase); 퍼옥시다제(peroxidase); 또는 미생물 유래 복합효소류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소, 이들의 결합체 또는 이들의 펩타이드, 당 및 지방 복합체 등이 가능하다.

또한 단백질로는 사이토카인류(cytokines), 세포성장인자류(growth factors), 호르몬류(hormones), 항원(antigen) 및 항체(antibody), 면역글로블린(immunoglobulins), 락토페린(lactoferrin), 메탈로티오네인(metallothionein), 티오레독신(thioredoxin), 항균성 단백질 또는 항산화 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질, 이들의 결합체 또는 이들의 펩타이드, 당 및 지방 복합체 등이 있다.

다음으로, 단계 S4)에서는 상기 단계에서 얻어진 쉬프 염기를 환원시키는 단계로, 이전 단계에서 얻어진 용액 전체 조성 내에 환원제를 0.0001∼1.0 중량%, 바람직하게는 0.01∼0.1 중량% 함량으로 첨가한다.

상기 환원제로는 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면 붕수소화나트륨(NaBH₄), 소듐시아노보로하이드라이드(NaBH₃CN), 아민보란(amine borane)등을 사용할 수 있다.

이때 추가로 반응하지 않은 알데히드 반응기를 없애기 위하여 환원된 글루칸-효소(또는 단백질) 용액에 0.01∼10 중량%, 바람직하게는 0.1∼1.0 중량%의 리신(lysine)을 첨가할 수 있다.

다음으로, 단계 S5)에서는 글루칸으로 안정화된 효소 또는 단백질 용액을 세척한다.

상기 세척은 분자량 한계(cut off)가 1,000∼500,000 (달톤), 바람직하게는 10,000∼100,000 (달톤)인 막을 사용하여 투석 또는 한외여과하여 세척한다.

본 발명의 방법에 의해 안정화된 효소는 특성에 따라 다양한 효과를 갖는 외용제 조성물에 사용되는데, 그 사용량은 그 제형에 따라 적당량으로 선정될 수 있으며, 바람직하게는 외용제 조성물 총 중량에 대하여 0.001∼10 중량%의 양으로 함유된다.

특히 본 발명의 방법에 의해 안정화된 효소 중 단백분해효소와 리소짐은 2가지 효소를 병행하여 사용할 경우 주름개선 및 노화방지 효과가 우수한 것으로 나타나 복합 안정화효소로서 주름개선 및 노화방지 효과의 화장료 조성물을 완성하게 되었다.

이는 안정화된 단백분해효소가 자극 없이 피부의 불필요한 외각 각질을 지속적으로 제거하면서 리소짐이 세포증식을 유도하는 작용을 증가시키는 시너지 효과에 의한 것이다.

본 발명에 따른 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 메이크업 베이스, 립스틱, 팩, 젤, 삼푸, 린스, 헤어토닉, 비누 등의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형을 갖는 외용제 조성물일 수 있다. 이때 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 각 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 시조필란-브로멜라인 결합 용액인 SB-1의 제조

1) 분자량이 400만인 0.5 중량%의 시조필란 수용액 500㎖을 고압균질기(덴마크, APV)에서 12,000 psi의 압력에서 3회 통과시킴으로써 분자량을 600,000 달톤으 로 분자량을 조절하였다

2) 분자량 조절된 시조필란 용액에 1N NaOH를 이용하여 pH 12.0으로 조절하고, 10 ℃에서 6시간 교반하였다

3) pH를 중화시킨후 과요오드산나트륨(NaIO₄) 20g을 첨가하고, 4℃의 암소에서 1시간 동안 교반하였다.

4) 반응된 시조필란 용액을 분자량한계 100,000으로 한외여과하여 이온수로 세척하였다.

5) 상기 시조필란 용액에 0.1 중량%의 브로멜라인을 넣고, 3시간 동안 4℃의 암소에서 교반하였다.

6) 시조필란-브로멜라인 용액에 붕수소화나트륨(NaBH₄) 0.5g을 넣고 2시간 동안 교반한 후, 리신 1g을 넣고 4℃의 암소에서 1시간동안 교반하였다.

7) 시조필란-브로멜라인 용액을 상기에서와 같은 방법으로 한외여과하여 시조필란-브로멜라인 결합 용액인 SB-1을 얻었다.

<실시예 2> 시조필란-리소짐 결합체인 SL-1의 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로, 효소만 리소짐으로 교체하여 진행하였으며, 시조필란-리소짐 결합체인 SL-1을 얻었다.

<비교예 1> 시조필란-브로멜라인 결합 용액인 SB-2의 제조

상기 실시예 1의 1)번 분자량 조절과 2)번 알칼리 처리를 하지 않은 원래 상태의 글루칸을 가지고 진행한 것을 제외하고는 동일하게 제조하여 시조필란-브로멜 라인 결합 용액인 SB-2를 얻었다.

<비교예 2> 시조필란-브로멜라인 결합 용액인 SB-3의 제조

상기 실시예 1의 1)번 분자량 조절을 하지 않은 글루칸을 가지고 진행한 것을 제외하고는 동일하게 제조하여 시조필란-브로멜라인 결합 용액인 SB-3를 얻었다.

<비교예 3> 시조필란-브로멜라인 결합 용액인 SB-4의 제조

상기 실시예 1의 2)번 알칼리 처리를 하지 않은 글루칸을 가지고 진행한 것을 제외하고는 동일하게 제조하여 시조필란-브로멜라인 결합 용액인 SB-4를 얻었다.

<비교예 4> 시조필란-리소짐 결합 용액인 SL-2의 제조

상기 실시예 1의 1)번 분자량 조절과 2)번 알칼리 처리를 하지 않은 원래 상태의 글루칸을 가지고 진행한 것을 제외하고는 동일하게 제조하여 시조필란-리소짐 결합 용액인 SL-2를 얻었다.

<비교예 5> 시조필란-리소짐 결합 용액인 SL-3의 제조

상기 실시예 1의 1)번 분자량 조절을 하지 않은 글루칸을 가지고 진행한 것을 제외하고는 동일하게 제조하여 시조필란-리소짐 결합 용액인 SL-3를 얻었다.

<비교예 6> 시조필란-리소짐 결합 용액인 SL-4의 제조

상기 실시예 1의 2)번 알칼리 처리를 하지 않은 글루칸을 가지고 진행한 것을 제외하고는 동일하게 제조하여 시조필란-리소짐 결합 용액인 SL-4를 얻었다.

구분	결합용액	표시	전처리 여부
구분	결합용액	표시	분자량 조절	알칼리 처리
실시예 1	시조필란-브로멜라인	SB-1	○	○
실시예 2	시조필란-리소짐	SL-1	○	○
비교예 1	시조필란-브로멜라인	SB-2	×	×
비교예 2	시조필란-브로멜라인	SB-3	×	○
비교예 3	시조필란-브로멜라인	SB-4	○	×
비교예 4	시조필란-리소짐	SL-2	×	×
비교예 5	시조필란-리소짐	SL-3	×	○
비교예 6	시조필란-리소짐	SL-4	○	×

[ 시험예 1］ 브로멜라인 안정화 변화폭의 향상 관찰

상기에서 제조한 실시예 1의 SB-1과 비교예 1, 2, 3의 SB-2, SB-3, SB-4의 샘플을 각각 8개씩 제조하여 안정화 브로멜라인 활성도의 경시변화를 45℃에서 4주일간 보관 후 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이때 단백분해효소의 활성도 측정은 K. E. Erlanger 등의 방법(Arch. Biochem. Biophys., 95,p271-278, 1961년)에 의해 측정하였다.

도 1은 글루칸 전처리에 따른 브로멜라인 안정도 변화(variation)를 보여주는 그래프이다.

도 1에 나타난 바와 같이, 원래의 고분자, 3중 나선의 글루칸을 사용한 샘플들의 경우(비교예 2, SB-2) 평균 70%정도의 안정도를 나타내어 자연상태 효소보다는 우수하였으나 안정도의 변화폭이 커(±18) 산업적으로 균일한 안정도의 효소를 얻는 데는 어려움이 있었다.

그리고 SB-3 (비교예 3)의 시료와 같이 글루칸의 분자량만 조절한 경우는 변화폭(±14)의 감소폭이 미미하였다.

또한 SB-4 (비교예 4)의 시료과 같이 알칼리 처리로 글루칸의 3중 나선을 분리한 경우는 안정도가 10% 이상 향상되었으며 변화폭(±10)도 상당량 감소하였다.

본 발명에 따른 SB-1 (실시예 1)의 경우 글루칸의 분자량을 조절하고 알칼리 처리한 경우, 안정도도 가장 우수하였으며 특히 안정도 변화의 폭이 ±5 이내로서 원래의 글루칸에 비하여 상당히 균일한 변화폭을 나타내었다.

[시험예 2］리소짐 안정화 변화폭의 향상 관찰

상기에서 제조한 실시예 2의 SL-1과 비교예 4, 5, 6의 SL-2, SL-3, SL-4의 샘플을 각각 8개씩 제조하여 안정화 브로멜라인 활성도의 경시변화를 45℃에서 4주일간 보관후 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때 리소짐의 활성도 측정은 D. Shugar의 방법(Biochim. Biophys. Acta., 8, p302, 1952년)의 방법에 의해 측정하였다.

도 2는 글루칸 전처리에 따른 리소짐 안정도 변화(variation)를 보여주는 그래프이다.

도 2에 나타난 바와 같이, 원래의 고분자, 3중나선의 글루칸을 사용한 샘플들의 경우(실시예 2, SL-2) 평균 71%정도의 안정도를 나타내어 자연상태 효소보다는 우수하였으나 안정도의 변화폭이 커(±19) 브로멜라인의 경우와 마찬가지로 산업적으로 균일한 안정도의 효소를 얻는데는 어려움이 있었다.

그리고 SL-3 (비교예 4)와 같이 글루칸의 분자량만 조절한 경우는 변화폭(±13)의 감소가 미미하였다.

또한 SL-4 (비교예 5)과 같이 알칼리 처리로 글루칸의 3중 나선을 분리한 경우는 안정도가 10% 이상 향상되었으며 변화폭(±9)도 상당량 감소하였다.

브로멜라인과 마찬가지로 본 발명에 따른 실시예 2의 SL-1의 경우 글루칸의 분자량을 조절하고 알칼리 처리한 경우, 안정도도 가장 우수하였으며 특히 안정도 변화의 폭이 ±5 이내로서 원래의 글루칸에 비하여 상당히 균일한 변화폭을 나타내었다.

[시험예 3］세포증식능 관찰

상기 실시예 1 및 2에서 제조한 글루칸-효소 결합체인 SB-1과 SL-1, 그리고 이들의 혼합체의 효능을 섬유아세포증식능에 의해 비교하였다.

2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)배지에서 배양한 사람의 섬유아세포를 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 5,000세포/well가 되도록 분주하였다. 이때 시료를 글루칸-효소 결합체와 동일농도로 증류수에 용해한 자연상태 상피세포성장인자를 사용하여 전처리로서 각각 37℃ 온도에서 7일간 보존한 후, 새로 용해한 자연상태 상피세포성장인자와 함께 섬유아세포에 처리하고 다시 4일 동안 배양하였다.

상기 시료들의 배양을 완료한 후 0.2% MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltertazolium bromide) 용액을 각 well당 50㎕씩 첨가하고, 다시 37℃ 에서 4시간 동안 배양한 후 생성된 포르마잔(formazan)을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 사용하여 용해시켰다. 이때 용해된 포르마잔의 흡광도를 평판배양측정기(microplate reader)를 이용하여 570 nm에서 측정하였다. 이를 무처리군과 비교하여 섬유아세포의 증식여부를 판정하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

(단위: 생존세포 %)
희석배수	실시예 1(SB-1)	실시예 2(SL-1)	혼합체(SB-1 + SL-1)
10^-2	88.9	122.0	126,2
10^-3	99.5	121.8	129.7
10^-4	102.2	118.1	124.4
10^-5	102.8	110.7	111.5

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 안정화 단백분해효소의 경우 세포증식에 크게 영향이 없는 반면 리소짐의 경우 20% 내외의 세포증식효과를 나타내었고, 혼합체의 경우는 30% 가까운 세포증식 효과를 나타내었다.

[시험예 4］ 콜라겐 합성정도의 측정

상기 실시예 1 및 2에서 제조한 글루칸-효소 결합체인 SB-1과 SL-1를 혼합하여 얻어진 혼합체의 효능을 섬유아세포증식능에 의해 비교하였다.

먼저, 인체 섬유아세포를 24공 평판배양기에 배양한 후, 상기 시험예 1과 동일한 시료를 사용하여 배양배지에 1/10씩 순차적으로 희석하여 첨가하였다. 배양 3일째 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM배지를 각 well당 0.5㎖씩 첨가한 후 L[2, 3, 4, 5-3H]-프롤린 10μCi를 첨가하였다.

이어 24시간 후 각 well에 들어있는 배지와 세포들을 긁어모아 5% 트리클로로아세틱엑씨드(TCA; Trichloroacetic acid) 용액에 넣어 수세한 후 2개의 시험관에 분주하고, 1개의 시험관에는 타입 I 콜라게나제(type I collagenase) 1unit/㎕를 넣고 37℃ 온도에서 90분간 배양하였으며, 다른 시험관은 4℃에서 보관하였다.

그 후 모든 시험관에 50% TCA를 0.05㎖씩 첨가하고 4℃에서 20분간 방치한 후 각각 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 각각의 상등액과 침전물을 액체 신틸레이션 계수기(LSC; Liquid Scintillation Counter)로 디피엠(dpm; decay per minute) 값을 얻어 하기 수학식 1에 의거하여 콜라겐 생합성 값(RCB; Relative Collagen Biosynthesis)을 구하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

시험 물질	비타민 C	SB-1 + SL-1
유효 농도	10^-7 %	10^-4 %
콜라겐 합성능	106%	120%

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 양성대조군인 비타민 C를 처리한 섬유아세포는 최고 약 6% 정도의 콜라겐 합성증가를 보이나, 복합 효소를 처리한 섬유아세포는 최고 약 20% 정도 향상된 콜라겐 합성 증가를 나타냈다.

[시험예 5］ 피부조직의 변화 및 콜라겐 합성 측정

본 발명에 의해 제조된 안정화 효소 복합체에 의한 피부 조직학적인 변화를 관찰하기 위하여, 동물 실험을 통하여 피부의 변화를 관찰하였다.

이때 사용된 동물은 Guinea pig 이며, 피부 표면에 하기 표 4에 나타난 조성의 제형(각 효소 0.1% 농도)를 주기적으로 처리하였다. 일정 시간 경과 후, 피부를 박리하고 박편하여 염색하고 현미경으로 피부 단면의 변화를 관찰하였다.

안정화 효소의 화장품 제형 조성

성분	함량(중량%)
실시예 1의 SB-1	0.5
실시예 2의 SL-1	0.5
글리세린	3.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
PEG-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
정제수	to 100

도 3은 피부를 대상으로 한 피부주름 개선효과를 보여주는 사진으로, (a)는 처리 전의 기니아피그(Guinea pig) 피부 단면을, (b)는 5일 후의 피부 단면을, (c)는 10일 후의 피부 단면을 보여주는 사진이다. 이때 피부 상단의 보라색 얇은 층 부분이 각질이며, 그 아래 가장 진한 보라색 부분이 표피, 그리고 아래의 넓은 연한 보라색 부분이 진피이다.

도 3의 (a) 내지 (c)를 참조하면, 복합 효소처리 전의 피부 사진을 보면, 각질의 부분이 매우 두텁고 여러 각질층으로 구성된 것을 관찰할 수 있다. 복합 효소를 처리한 경우 각질이 고루 감소되어 피부 표면이 상당히 매끄러워졌음을 알 수 있다.

[시험예 6] 피부주름 개선효과

상기 표 4의 조성으로 제조된 화장품 제형을 이용하여 35∼45세의 안면주름이 있는 시험대상자 10명에 대해 피부주름 개선효과를 비교평가하게 하였다.

피검자의 안면 좌부에는 표 4의 조성을, 우부에는 효소가 첨가되지 않은 비교군을 3개월간 사용하도록 하였다. 이때 크림사용 이전의 안면 양쪽부의 피부상태를 측정해 놓은 후, 크림사용 3개월 후 동일부위를 재측정하여 피부주름의 변화를 측정하였다. 피부측정은 24℃ 온도, 상대습도 40%의 항온 항습실에서 하였으며, 눈꼬리 부위의 주름을 레플리카(replica)로 떠서 비시오메타 시스템(Visiometer system; C+K사)으로 피부주름을 측정하였다. 피부주름의 변화량은 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.

(상기 식에서, Tdi; 최종 주름깊이이고, Tdo; 초기 주름깊이이다)

상기 식에 따라 계산한 결과, 효소가 포함되지 않은 제형을 사용한 부위의 피부주름은 2.9 ㅁ 1.2%(평균ㅁ 표준편차)의 감소치를 나타낸 반면, 표 4의 조성을 가진 제형을 사용한 부위의 피부주름은 16 ㅁ 3.1%의 감소치를 보여 우수한 피부주름 개선효과를 나타냈다.

이하, 제형예 1∼9를 들어 상기 실시예 1∼2에서 제조된 안정화 효소를 모두 함유하는 화장료 조성물을 공지된 방법을 이용하여 제조하였다. 이때 하기에 기재된 화장료 조성물의 제형 및 조성은 일예를 보여주는 것으로, 본 발명의 조성물이 이들 제형예에 한정되는 것은 아니다.

(제형예 1) 유연화장수(스킨로션)

배합성분	중량%
실시예 1 + 실시예 2	1.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 2) 영양화장수(밀크로션)

배합성분	중량%
실시예 1 + 실시예 2	1.0
스쿠알란	4.0
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 3) 영양크림

배합성분	중량%
실시예 1 + 실시예 2	1.0
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 4) 마사지크림

배합성분	중량%
실시예 1 + 실시예 2	1.0
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알란	4.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 5) 팩

배합성분	중량%
실시예 1 + 실시예 2	1.0
폴리비닐알콜	12.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스	0.2
글리세린	5.0
알란토인	0.1
에탄올	6.0
핑지-12 노닐페닐에테르	0.3
폴리솔베이트 60	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 6) 젤

배합성분	중량%
실시예 1 + 실시예 2	1.0
에틸렌디아민초산나트륨	0.05
글리세린	5.0
카르복시비닐폴리머	0.3
에탄올	5.0
피이지-60 경화피마자유	0.5
트리에탄올아민	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 7) 연고

배합성분	중량%
실시예 1 + 실시예 2	1.0
밀납	10
폴리솔베이트 60	5.0
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
바셀린	5.0
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
쉐어버터	3.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	10.0
프로필렌글리콜	10.2
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

(제형예 8) 국소투여용 약제(겔 연고제)

배합성분	중량%
실시예 1 + 실시예 2	1.0
폴리아크릴산(Carbopol 940)	1.5
이소프로판올	5.0
헥실렌글리콜	25.0
트리에탄올아민	1.7
탈이온수	to 100

(제형예 9) 국소 투여용 약제(패취제)

배합성분	중량%
실시예 1 + 실시예 2	1.0
헥실렌글리콜	20.0
디에틸아민	0.7
폴리아크릴산(Carbopol 934P)	1.0
아황산나트륨	0.1
폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.O=9)	1.0
폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르 (Cetomacrogol 1000)	1.0
점성의 파라핀 오일	2.5
카프릴산에스테르/카프르산에스테르(Cetiol LC)	2.5
폴리에틸렌글리콜 400	3.0
탈이온수	to 100

본 발명에 따라 전처리된 글루칸은 효소 또는 단백질의 안정화제로서 사용가능하다. 또한 상기 전처리된 글루칸을 이용하여 안정화된 효소는 주름개선 및 피부노화방지에 효과적인 외용제 조성물로 적용된다.

도 2는 글루칸 전처리에 따른 리소짐의 안정도 변화(variation)를 보여주는 그래프이다.

도 3은 피부를 대상으로 한 피부주름 개선효과를 보여주는 사진으로, (a)는 처리 전의 기니아피그(Guinea pig) 피부 단면을, (b)는 5일 후의 피부 단면을, (c)는 10일 후의 피부 단면을 보여주는 사진이다.

Claims

베타-1,3-글루칸 주당쇄에 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸을 사용하여 효소 또는 단백질을 안정화하는 방법에 있어서,

상기 글루칸의 분자량을 조절한 다음, 알칼리 처리에 의해 3중 나선구조를 단일 나선 또는 불규칙코일(random coil) 형태로 변형시키는 전처리 단계

를 수행하는 단계를 포함하는 효소 또는 단백질의 안정화 방법.
제1항에 있어서,

상기 글루칸은 치마버섯(Schizopyllum commune)에 의해 생산된 시조필란(schizophyllan), 스클레로티니아 속(Sclerotinia sp.) 균주에 의해 생산된 스클레로글루칸(scleroglucan) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 안정화 방법.
제1항에 있어서,

상기 글루칸의 분자량 조절은 글루칸을 고압균질기에 주입하여 반복통과하는 방법, 초음파 분쇄기로 처리하는 방법, 베타-글루카나제 효소로 처리하는 방법, 및 산 또는 알칼리로 처리하는 방법 중 1종의 방법으로 수행하는 것인 안정화 방법.
제3항에 있어서,

상기 고압균질기를 이용한 글루칸의 분자량 조절은 0.01∼2 중량% 농도의 글루칸 용액을 고압균질기에 주입한 후, 4∼60 ℃ 및 10,000∼30,000 psi에서 1∼5회 반복통과하여 수행하는 것인 안정화 방법.
제1항에 있어서,

상기 분자량이 조절된 글루칸은 중량평균분자량이 500,000∼800,000 (달톤)인 것인 안정화 방법.
제1항에 있어서,

상기 알칼리 처리는 반응기에 NaOH, KOH 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종을 첨가하여 pH를 11∼13으로 조절한 후 4∼25 ℃에서 교반하여 수행하는 것인 안정화 방법.
제1항에 기재된 방법에 의해 안정화된 효소 또는 단백질을 조성물 총 중량에 대하여 0.001∼10.0 중량%의 함량으로 포함하는 외용제 조성물.
제7항에 있어서,

상기 효소는 파파인(papain), 브로멜라인(bromelein), 키위(kiwi)유래 단백분해효소, 세균성 프로테아제(bactrial protease)를 포함하는 단백분해효소류; α-아밀라제(amylase), 글루코아밀라제(glucoamylase), 셀룰라제(cellulase), 펙티나 제(pectinase), α-글루코시다제(glucosidase), β-글루코시다제, β-글루카나제(glucanase), 키티나아제(chitinase), 만난분해효소(mannannase)를 포함하는 탄수화물분해효소류; 포스포리파제(phospholipase), 트리아실글리세롤분해효소(triacylglycerol hydrolase)를 포함하는 지방분해효소류; 데옥시리보핵산분해효소(DNAase), 리보핵산분해효소(RNAase)를 포함하는 핵산분해효소류; 인산분해효소류(phosphatase); 리소짐(lysozyme); 카탈라제(catalase); 과산화물 디스뮤테이즈(superoxide dismutase); 퍼옥시다제(peroxidase); 미생물 유래 복합효소류; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 효소, 이들의 결합체, 이들의 펩타이드, 당 또는 지방 복합체이고,

상기 단백질은 사이토카인류(cytokines), 세포성장인자류(growth factors), 호르몬류(hormones), 항원(antigen), 항체(antibody), 면역글로블린(immunoglobulins), 락토페린(lactoferrin), 메탈로티오네인(metallothionein), 티오레독신(thioredoxin), 항균성 단백질, 항산화 단백질 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 단백질, 이들의 결합체, 이들의 펩타이드, 당 또는 지방 복합체인 것인 외용제 조성물.
제7항에 있어서,

상기 외용제 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 메이컵 베이스, 립스틱, 팩, 젤, 샴푸, 린스, 헤어토닉 또는 비누의 제형을 갖는 외용제 조성물.
제7항에 있어서,

상기 외용제 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 경피투여형 제형을 갖는 외용제 조성물.
제1항에 의해 안정화된 단백분해효소 및 리소짐을 포함하며, 주름방지 및 피부노화 방지 작용을 가지는 외용제 조성물.